專利名稱：用于絡合金屬離子的多氮大環(huán)化合物的制作方法
本申請是1989年5月25日向美國申請的序號為07/357193和1988年12月28日申請的序號為07/291053的專利申請的部分續(xù)申請，這兩個申請在此結合作為參考。而07/291053申請是1987年1月27日申請的007729號申請的部分續(xù)申請，而后者又是1984年10月18日申請的序號為662076號申請(已批準，專利號為4639365)的部分續(xù)申請。
本發(fā)明涉及一系列新的含磷大環(huán)螯合物，它們結合一定的生物離子而具有相對的特性。當金屬離子占據(jù)螯合物的空位時，這些螯合物的31P共振在核磁共振譜(NMR)中漂移到一個新位置，并且這種結合螯合物的NMR化學漂移對每個金屬離子都不一樣。這種性質(zhì)對于利用31P NMR來監(jiān)視某些生物陽離子的胞間濃度應是有用的，該陽離子包括如Mg2+、Ca2+和Zn2+。還有幾種商業(yè)可用的、可測量胞間陽離子濃度的螢光螯合物和可用于NMR目的的含1或2個氟的螯合物。螢光螯合物不可能用于人體研究，而19F螯合物也不可能象本發(fā)明的31P螯合物那樣用于臨床。此外，某些螯合劑結合Gd3+后具有的性質(zhì)使其成為安全有效的磁共振圖的對比劑。
很多的生物體系需要抗磁陽離子，如Ca2+、Mg2+和Zn2+來調(diào)節(jié)各種反應。Ca2+作為一種胞間信息離子在很多類型細胞中的作用已被很好地確認[1]。實際上對所有包括ATP的生物反應而言Mg2+是一種所需的輔因子，并在較多的各種生物反應的緩沖過程中廣泛地起作用[2]。Zn2+被相當緊密地結合在幾種酶的活性位置上，它的作用看來似乎包括化學鍵的極化，以助于鍵的水解、氧化還原或基團轉移反應。然而，在某些細胞如腦細胞中，游離的Zn2+可以起更廣泛的作用，并認為游離的Zn2+象存貯顆粒一樣被存于神經(jīng)元中，并在電生理活化期間可以移動[3]。
利用現(xiàn)有測量細胞和充盈器官中游離陽離子濃度的直接方法來評價兩價陽離子在細胞功能中的作用是受限制的。目前可用的測量兩價陽離子的方法包括基于平衡反應的間接計算[4]，離子選擇的微電極[5，6]，和用金屬顯色染料的零點測量，該染料既可顯微注入細胞[7]又可置于胞外隨后溶解在細胞的空間內(nèi)[8，9]。實際上所有這些方法實質(zhì)上是侵入型的，且在分析前需損壞樣品。與此相反，NMR作為一種非侵入型的工具有顯著優(yōu)點，尤其是測量充盈器官和完整無損的細胞中胞間游離的兩價陽離子濃度。
最近，氟化的螯合物已被有效地以19FNMR用來測量細胞和充盈器官中胞間游離的Ca2+[10，11]和Mg2+[12，13]。這些螯合物在分離的細胞體系中可適當良好地工作，而用在充盈器官時則遇到意外的界限(line)變寬[13，14]。這些體系的另一缺點是合成這些化合物的路線限制了可能的螯合結構，因此也限制了可設計螯合物的金屬離子的選擇性。本發(fā)明的目的包括合成和開展一系列的三氮和四氮大環(huán)膦酸單酯和烷基亞膦酸酯作為31P NMR指示劑來檢測生物體系中胞間游離陽離子。
本發(fā)明還涉及活體的NMR圖，有時稱作MRI(磁共振圖)。特別涉及一種試劑，它可用來增強這些物體中NMR的對比度。
核磁共振(NMR)作為一種化學分析手段已應用多年了。NMR是種射頻譜的類型，它的基礎是帶電原子核的自旋平行或逆平行于所加磁場而產(chǎn)生的小能量差別。當射頻能量施加到樣品時，這些自旋原子核改變了自旋狀態(tài)，正因如此則吸收一些射頻能量。在同樣的分子內(nèi)化學環(huán)境稍有差別的原子核以稍有不同的能量改變了自旋狀態(tài)，這就產(chǎn)生了有助于鑒別分子結構的特征吸收或共振。
NMR用于人體檢查的時間要更近一些。如計算機軸向斷層照象(CAT掃描)的其他方法過去是現(xiàn)在仍然是用來檢查人體。然而，由于NMR不使用電離輻射，可以認為它在安全性方面的優(yōu)點超過CAT。因此在制備人體橫截面圖象方面NMR是種優(yōu)越的方法。
NMR掃描獲得圖象的質(zhì)量取決于兩個性質(zhì)各種組織的質(zhì)子密度和質(zhì)子松弛速度的差別。組織的質(zhì)子密度不能輕易改變，而質(zhì)子松弛速度可通過加入順磁松弛劑來調(diào)節(jié)，它通常叫作“對比劑”(contrast agent)。對比劑增大了磁性相似但組織學上不相似的組織之間NMR圖象的對比度。
過去常把釓當對比劑用來進行試驗，因它有個大磁慣量，可有效地松弛磁性原子核。釓的強順磁性質(zhì)歸因于它的七個未成對的電子。
釓作為對比劑的一個缺點是它對動物的毒性。對這個問題的一個可能的補救辦法是將釓結合成化合物，以化合物通過體內(nèi)并被排泄而不釋放有毒的釓離子。遺憾的是象釓那樣的稀土元素并不能與有機分子形成穩(wěn)定的共價鍵，所以，這種分子會在體內(nèi)分解并釋出有毒離子。
這就需要一種有效的對比劑能避開前述使用釓時的毒性問題。進而需一種新型更好的對比劑，不管它們包括釓還是其他順磁金屬。
本發(fā)明涉及一種新型多氮大環(huán)化合物或其鹽及其用途。該化合物通式為
其中x是2，3或P2(s)和q3(s)的結合。這里的p+q＝y(tǒng);y是3或4;R是(CH2)zP(＝0)OR′R2，R1是R3或OR3，R3是烷基，環(huán)烷基或芳基;R2是H，烷基或
，R4是烷基，環(huán)烷基或芳基;(R3和R4在同樣分子中可相同或不相同)，Z是1-3。
一個優(yōu)選的烷基是CnH1+2n，這里的n是1-20;優(yōu)選的環(huán)烷基是CnH2m-1，其中m是1-20;優(yōu)選的芳基是苯基。
在一個重要的實施方案中，這種化合物與金屬絡合變成多氮大環(huán)化合物-金屬絡合物，其化學式為
其中x是2，3或p2(s)和q3(s)的結合，這里的p+q＝y(tǒng);y是3或4;R是(CH2)zP(＝0)OR1R2;R1是R3或OR3;R3是烷基，環(huán)烷基或芳基;R2是H，烷基或
;z是1-3;r是2或3;且Me是一金屬離子。
y設計表征為象三氮或四氮大環(huán)那樣的化合物。雖然在許多情況里x有可能為3但優(yōu)選2。對x的P2(s)和q3(s)之結合當然容易得到，但在多氮大環(huán)中眾多單元而言p+q之和必是y。
在化合物或其金屬絡合物的一個優(yōu)選實施方案中，y是3，p是1且q是2或者p是2而q是1。
在化合物或其金屬絡合物的另一優(yōu)選實施方案中y是4，p是1且q是3，p是2且q是2或p是3而q是1，z最佳為1，n優(yōu)選為2。
在一更佳的實施方案中x是2，y是4，z是1，且R1是R3。
在另一個優(yōu)選實施方案中x是2，y是3，z是1，R1是OR2且n是2。
Me+r最好是Ca2+，Mg2+，Zn2+或Gd3+。其他特性的兩價或三價金屬離子，特別是順磁的鑭也可如此被絡合。
本發(fā)明包括一種測定胞間一種或多種兩價金屬離子濃度的方法。該方法包括在促進多氮大環(huán)化合物或其鹽的胞間定位條件下處理細胞，該化合物的化學式為
其中x是2，3或p2(s)和q3(s)的結合且q+p＝y(tǒng);y是3或4;R是(CH2)zP(＝0)OR1R2;R1是R3或OR3;R3是烷基，環(huán)烷基或芳基。R2是H，烷基或
，R4是烷基、環(huán)烷基或芳基;z是1-3;然后測量在31P NMR譜中的漂移，所說的漂移與胞間兩價金屬濃度成比例關系。在一實施方案中，用本發(fā)明化合物的酸酐(即其中R2是
)形式來處理細胞，將其通入細胞，在那里水解成酸的形式(即R2是H)并與胞間金屬離子絡合。最適合于這種測量的金屬通常是鈣，鎂或鋅，優(yōu)選鎂。
在一個重要應用中，本發(fā)明包括可增強某種物質(zhì)的磁共振圖譜的方法。該方法包括施予該物質(zhì)一種多氮大環(huán)化合物-金屬絡合物，然后得出該物質(zhì)的磁共振圖，所說的絡合物化學式為
其中x是2，3或p2(s)和q3(s)的結合且p+q＝y(tǒng);y是3或4;R是(CH2)zP(＝0)OR1R2;R1是R3或OR3;R3是烷基，環(huán)烷基或芳基;R2是H，烷基或
;R4是烷基，環(huán)烷基或芳基;z是1-3;r是2或3且Me是順磁金屬(優(yōu)選釓)。


圖1示意說明NOTPME的結構(其中R是CH2CH3且R1是H)。
圖2說明2mM的NOTPME(a)和存在等當量Ca2+(b)，Mg2+(c)和Zn2+(d)時所得出的電位滴定曲線。
圖3表示5mM的NOTPME的31P NMR譜與所添加鎂(總數(shù))的函數(shù)關系。從底部到頂部Mg2+濃度分別是0，0.5，1.5和3mM。樣品構成和光譜參數(shù)見方法部分的敘述。
圖4表明存在(A)2 0.3mM ZnCl2和(B)38.5mM CaCl2時5mM NOTPME的31P NMR譜圖。樣品組成和光譜參數(shù)在方法部分中給出。
圖5說明5mM NOTPME(a)，Ca(NOTPME)(b)，Zn(NOTPME)(c)和Mg(NOTPME)(d)的31P NMR化學漂移和PH的依賴關系。
圖6顯示正常RBCs(a)和負載NOTPME的RBCs(b)的31P NMR譜圖。
圖7示意說明DOTEP的結構。
圖8呈現(xiàn)DOTEP和DOTEP-鈣絡合物的31P NMR譜圖。
圖9敘述了釓-DOTA和釓-DOTEP在0.1N HCl中的分解速度。
圖10示意說明1，5，9-三氮環(huán)十二烷化合物。
圖11示意說明1，4，8，12-四氮環(huán)十五烷化合物。
圖12示意說明1，4，8，11-四氮環(huán)十四烷化合物。
實施例1 三氮大環(huán)化合物合成1，4，7-三氮環(huán)壬烷-N，N′，N″-三(亞甲基磷酸單乙酯)(NOTPME)，將其特征化并分析以用作胞間Mg2+和Zn2+離子的31P NMR指示劑。這種螯合物在存在金屬離子的31P NMR譜圖顯示游離螯合物，Mg(NOTPME)，Zn(NOTPME)和Ca(NOTPME)的特性共振。通過電勢分析法和NMR得到Ca2+和Mg2+絡合NOTPME的穩(wěn)定常數(shù)，以及通過電勢分析法得其與Zn2+的穩(wěn)定常數(shù)。這種螯合物在生理PH值時對Mg2+的親合力高于對Ca2+的十倍。對Zn2+的親合力如此之高使得實際的結合常數(shù)不能以NMR來測定。在Mg2+存在下，NOTPME很容易被載入血紅細胞。游離螯合物和它的金屬絡合物的31P化學漂移位于生物體系中對常規(guī)含磷代謝產(chǎn)物觀察到的很遠的下區(qū)域(downfield)，因而使得能夠監(jiān)測細胞間陽離子濃度和同時發(fā)生的細胞力能。
原料從Aldrich化學公司購買1，4，7-三氮環(huán)壬烷，多氮甲醛，二乙基亞磷酸鹽和活性炭Darco G-60。從Mallickrodt購買MgSO4，從J.T.Baker購氫氧化鈉和苯，從Fisher Scientific買二乙醚。所有化學藥劑皆為高純物，無需進一步純化。配制標準的ZnCl2，CdCl2，MgCl2和CaCl2溶液。
合成NOTPME將1，4，7-三氮環(huán)壬烷(1.91克，14.71m mol)和二乙基亞磷酸鹽(7.018克，16.94m mol，過量15%)溶在125ml苯中并回流加熱。將無水多聚甲醛(1.727克，30%過量)以小部分加到上述回流混合物中，同時以蒸餾除去苯水共沸混合物。加入多聚甲醛后就是復合體，整個溶液沸騰30分鐘，然后蒸發(fā)得到黃色粘狀油。將該油溶于150ml無水二乙基醚并用無水MgSO4干燥過夜。隨著白色沉淀的形成將MgSO4濾掉并丟棄。濾液以活性炭脫色并過濾。再將此濾液真空蒸發(fā)得到1，4，7-三氮環(huán)壬烷-N，N′，N″-三(亞甲基磷酸二乙酯)(NOTPDE)粘性油。得到純NOTPDE的產(chǎn)率為96%(9.21克，14.17m mol)并用它來合成NOTPDE(結構見圖1)而無需進一步純化。NOTPDE在CDCl3中的1H NMR數(shù)據(jù)如下(TMS為零)δ(ppm)1.33(t，18H，-CH3)，2.97(s，12H，N-CH2)，3.00(d，6H，O-CH2)，4.13(P，12H，O-CH2)。
將9.20克(14.15mmol)NOTPDE與2.50克NaOH(在9ml水中)混和，2小時后將整個反應混合物沸騰，直至得到清液(大約5分鐘)。溶液冷卻到室溫并讓它靜置過夜。用帶有粗孔級濾盤的壓力過濾漏斗從粘性母液中濾出形成的晶體。用冷無水乙醇將晶體洗滌一次，再用無水乙醇-二乙醚(1∶1)混合物洗滌三次，最后用二乙醚洗滌。把Na3NOTPME晶體在干燥氮氣流中于25℃干燥2小時。于50℃將NOTPME真空(10mmHg)干燥5小時除去微量的水和乙醇。而后得到純的NOTPME白色晶體，極易吸潮，易溶于水并頗溶于氯紡。純NOTPME的產(chǎn)率是40.8%(3.24克，5.77m mol)。
1H NMR(參照位于4.90ppm的D2O、HDO峰)，δ(ppm)1.23(t，9H，-CH3)，2.54(s，寬峰，6H，p-CH2)，2.79(s，寬峰，12H，N-CH2，3.91(P，6H，o-CH2)。
NMR測量在JEOL FX-200型NMR能譜儀上用10mm探頭室溫操作得到1H NMR數(shù)據(jù)。用通用電子公司GN-500型NMR能譜儀對NOTPME和其絡合物溶液進行研究。對31P探測時將10mm寬帶探頭擰到202.4M Hg。以85%的H3PO4作外標測量NOTPME和其絡合物的漂移。探頭溫度精確到±0.5℃。
以NMR進行KD測定所用的NOTPME樣品的構成為115mM的KCl，20mM的NaCl和10mM的HEPES，用Tris堿(氨基丁三醇)將其緩沖，PH為7.4。變化Mg2+，Ca2+或Zn2+的濃度(通常0.5-10mM)加到樣品中，得到所導致的31P NMR譜圖。使用GE軟件以將各峰積分的方式測定共振面積。
電位測量25℃下使用Corning離子分析儀(250型)和Metrohm Dorsimat自動滴定管(Brinkman儀器公司)進行電位滴定。按照Irving等人[15]建議的方法從所測PH值得到氫離子濃度。將Na3NOTPME溶于0.1M四甲基銨氯化物中，用HCl調(diào)節(jié)PH到低值并用0.098M的KOH來滴定。以針對鄰苯二甲酸氫鉀的電位滴定方式將KOH標樣并在氮氣氛下貯存。在同樣的鹽溶液中分別測定氫離子活度系數(shù)和Kw。以電位滴定金屬和配位體之比為1∶1的溶液方式測定Zn(NOTPME)，Mg(NOTPME)和Ca(NOTPME)的穩(wěn)定常數(shù)。所有的滴定中，樣品用環(huán)己烷薄層遮蓋以排除CO2。
質(zhì)子化作用常數(shù)(KHiL)和穩(wěn)定常數(shù)(KML和KMHL)由下面等式限定KHiL＝[HiL]/｛[Hi-LL][H+]｝ (1)KML＝[ML]/｛[M][L]｝ (2)KMHL＝[MHL]/｛[ML][H+]｝ (3)在IBM PC上用單形非線性算法運算電位數(shù)據(jù)得到質(zhì)子化作用和穩(wěn)定常數(shù)。
NOTPME的紅血細胞載荷取新鮮的全血放入抗凝結化的試管中在3000g離心機上分離6分鐘，以除去血沉棕黃色層。然后在5mM磷酸鹽緩沖鹽水(PH＝7.4)中將RBC3洗滌三次。將存在于50%紅血細胞中的RBC3懸浮在負荷介質(zhì)(loading medium)中，該介質(zhì)含有120mM NaCl，5mM MgCl2，10mM pH為7.4的HEPES，10mM葡萄糖和10mM NOTPME，然后于37℃培育12小時。負荷過程中沒有觀察到RBC3的溶解。離心分離RBC3，充掉上清液。在以等滲壓介質(zhì)懸浮前用PH＝7.4的磷酸鹽緩沖鹽水將RBC3洗滌兩次。
質(zhì)子化作用研究圖2說明25℃時NOTPME在0.1M四甲銨氯化物中的電位滴定曲線。從這些數(shù)據(jù)可得三個質(zhì)子化作用常數(shù)(PK1＝11.8，pK2＝3.65，pK3＝1.4)。還測量了NOTPME的31P NMR譜圖隨PH而變化的函數(shù)關系(數(shù)據(jù)未示出)，從這些數(shù)據(jù)得到的質(zhì)子化作用常數(shù)通常與電位得到的那些相一致。在多氮環(huán)中磷的漂移對氮的質(zhì)子化作用非常敏感，類似于母體NOTP磷酸鹽所觀察到的那樣[17]。第一個雙質(zhì)子化作用(logK＝11.8，3.65)導致了31P漂移到低頻，這和雙環(huán)氮的質(zhì)子化作用相一致[17]。這表明在NOTP與NOTPME相比較時第一個氮的質(zhì)子化作用十分類似(分別是logK1＝12.1與11.8相比較)，而第二個氮的質(zhì)子化作用引人注目的不同(logK2＝9.4與3.65相比較)。這些pK2的差別反映了磷酸鹽與磷酸鹽單酯側鏈形成內(nèi)部氫結合質(zhì)子化氮能力方面的差別，這就與下面的結論相一致，即，NOTP(質(zhì)子化作用常數(shù)在6.0-7.5之間)中膦酸酯氧的堿性大大超過了NOTPME(質(zhì)子化作用常數(shù)低于1.4)中膦酸酯氧的堿性。NOTPME的31P NMR譜展示單個共振覆蓋了整個PH范圍，表明在所有質(zhì)子化的種類中的快速轉變。
絡合研究圖2還顯示了存在一種兩價的Mg2+，Ca2+或Zn2+時NOTPME的電位滴定數(shù)據(jù)。由這些數(shù)據(jù)得到的Mg(NOTPME)，Ca(NOTPME)和Zn(NOTPME)的穩(wěn)定常數(shù)概括在表Ⅰ中。
表ⅠNOTPME與Ca2+，Mg2+和Zn2+絡合的穩(wěn)定常數(shù)。
金屬離子 KD(在25°x) KD(在37℃) logKMLCa2+50mM 47.62mM 5.1Mg2+5.77mM 4.66mM 6.3Zn2+(10-11M)a- 15.4KD值由NMR數(shù)據(jù)得到而logK值在25℃以電位測定。aKD值由熱力學值(logKML＝15.4)來建立，同時要考慮配位體的pK值和pH＝7.4時的質(zhì)子濃度。
與Mg2+或Ca2+相比，Zn2+和NOTPME形成的絡合物要穩(wěn)定的多。大大地反映出Zn2+比其他離子Mg2+和Ca2+有更強的形成M2+-N鍵的傾向。Mg(NOTPME)和Ca(NOTPME)兩者分別與其NOTP絡合物相比，穩(wěn)定性要弱一些[18]，再次反映出膦酸酯側鏈配位體更為酸性。然而，NOTPME和NOTE一樣，金屬越小，與之形成的絡合物越穩(wěn)定，Mg2+小于Ca2+則Mg2+的更穩(wěn)定。這反映出在這兩者情況下三氮環(huán)壬烷大環(huán)的尺寸選擇性。
圖3演示了含5mMNOTPME溶液的31P NMR譜對添加的Mg2+的函數(shù)關系。該譜圖表示出結合Mg2+的NOTPME是慢慢地與“游離”NOTPME互換的。圖4表明存在2.05mMZn2+和38.5mM Ca2+時5mM NOTPME的31P NMR譜圖。正如予料的基于電位滴定測定穩(wěn)定常數(shù)的情況，這種溶液與含Mg2+的等效溶液相比存在更多的Zn(NOTPME)。令人感興趣的是Mg2+和Zn2+結合NOTPME的化學漂移十分不同，確定，在含有兩者金屬離子的混合物中能夠得到Zn(NOTPME)和Mg(NOTPME)的特征共振。正如予料的那樣，Ca2+結合得更弱一些，在加入32mM的Ca2+后僅僅能分辨出Ca(NOTPME)的特征共振。Ca(NOTPME)的化學漂移(22.1ppm)也不同于Mg(NOTPME)(23.5ppm)和Zn(NOTPME)(23.1)所形成的。這也許反映出Ca2+比Mg2+或Zn2+有較大的尺寸，它不適于進入環(huán)壬烷內(nèi)腔。
通過積分和估算其濃度可得相符于游離和結合金屬NOTPME的共振面積。以Mg2+和Ca2+絡合物于25℃的NMR獲得KD值分別是5.77mM和50mM。和氟化的螯合物MF-APTRA相比較，其他人所報導的[12]對Mg2+的KD是1mM，對Ca2+是12μm。
表1也顯示出NMR在37℃得到的Mg(NOTPME)和Ca(NOTPME)的KD。顯然，37℃時Mg(NOTPME)和Ca(NOTPME)在穩(wěn)定度方面的差別等級維持不變。這就可以確定在生理溫度下NOTPME對Mg2+的親合力高于Ca2+。從NMR數(shù)據(jù)不能得到Zn(NOTPME)的KD，因為在所有的真實測量條件下滴定的Zn2+完全與NOTPME相結合。
圖5呈現(xiàn)出Ca2+，Mg2+和Zn2+的NTOPME絡合物的31P NMR化學漂移與PH為6-10之間的函數(shù)關系。在金屬離子和配位體為1∶1的溶液中，可見到的Zn(NOTPME)共振特性覆蓋了這個PH范圍，Mg(NOTPME)的特征共振僅在PH為6.4以上時才能檢測出，而Ca(NOTPME)的特征則只有PH在7.8以上時才看得見。這些差別清楚地說明在生理PH(大約7.4)時NOTPME對Mg2+的選擇性大于對Ca2+的。如上所示，結合金屬類的化學漂移實際上在上面PH值范圍內(nèi)與PH值無關。
人體紅細胞中胞間游離Mg2+濃度的測定圖6說明應用NOTPME檢測RBC3中胞間游離的Mg2+。首先通過在含有含5mMMgCl2的NOTPME負荷介質(zhì)中于37℃將RBC3培育12小時而制備載有NOTPME的RBC3(圖6b)。負荷介質(zhì)中無MgCl2時則不能觀察到NOTPME載入了RBC3中。圖6a示出了對比的RBC3。
如同在體內(nèi)研究，在RBC3中觀察到兩個相應于游離和Mg2+結合的NOTPME的共振情況。用下面公式估算RBC3中胞間游離的Mg2+濃度
在該特殊實例中得到的胞間游離Mg2+濃度為1.71mM。因為RBC3中胞間游離Mg2+的含量范圍通常在0.2-0.3mM之間[12，19，20]，所以該實驗觀察到胞間游離Mg2+的高濃度一定是Mg2+以和NOTPME的絡合物形式輸運的結果。于懸浮介質(zhì)中外加兩價陽離子的離子載體A23187后，則觀察到胞間游離Mg2+濃度增大(至1.90mM)(未出數(shù)據(jù))。這些結果表明NOTPME可很容易地檢測出完整細胞中游離Mg2+含量的微小變化。
第一個質(zhì)子化作用常數(shù)非常高的數(shù)值以及所需三氮環(huán)的構造和尺寸，可強烈影響NOTPME絡合物的形成特性。使用常規(guī)電位滴定方法可以研究NOTPME與Zn2+，Mg2+及Ca2+絡合物，這個事實表明溶液中形成絡合物相當快。表Ⅰ所見，Zn2+比Mg2+或Ca2+兩者與NOTPME形成更穩(wěn)定的絡合物。對三氮環(huán)壬烷三乙酸酯絡合物(即NOTA)與這些金屬離子絡合時也觀察到同一傾向;報導的logK值分別是Zn(NOTA)18.3;Mg(NOTA)，9.69;及Ca(NOTA)是8.92[21]。因此，羧酸酯與所有三種金屬離子形成更穩(wěn)定的絡合物也許是由于羧酸酯氧配位體的堿度大于膦酸鹽氧配位體的。母體膦酸鹽NOTP在其與Zn2+，Mg2+和Ca2+的金屬絡合能力方面也顯示同一傾向，但在此情況中，所得絡合物的穩(wěn)定常數(shù)與相應的NOTPME或NOTA的數(shù)值都要高出幾個數(shù)量級。報導的logK值對Zn(NOTP)4-，Mg(NOTP)4-和Ca(NOTP)4-分別是24.9，11.0和6.4[18]。因為NOTP中氮和膦酸鹽氧化NOTPE中的那些堿性更強，則與這些金屬離子所得的穩(wěn)定常數(shù)也都大。其傾向依然保持為Zn2+＞＞Mg2+＞Ca2+。
生物體系中測量胞間Mg2+方面，NOTPME有幾個優(yōu)于氟化絡合物如BAPTA和APTRA的優(yōu)點。這些優(yōu)點包括(a)容易合成，(b)對Mg2+的親合力大于對Ca2+的，(c)對于結合的和游離的配位體共振沒有明顯的互換影響，以及(d)因可以同時測量細胞力能，該螯合物中三個磁性等效的31P核能提供對生物組織有親合力的NMR核。NOTPME在生理PH方面展示對Mg2+優(yōu)于對Ca2+的顯著選擇性有個大優(yōu)點，即在生物體系中監(jiān)測Mg2+而不受Ca2+的影響。強調(diào)下面這點很重要，即NOTPME及其與鎂絡合物的共振并不與組織內(nèi)含磷代謝物的相重疊。因此，在用31P NMR測量胞間游離鎂的改變以及各種生理事件期間代謝物的改變方面，NOTPME提供了萬能手段。在許多生物體系中，生理PH處KDMg(NOTPME)對測量胞間Mg2+方面落入所需要的范圍，雖然這點是偶然的，卻可證明能夠精細調(diào)節(jié)NOTPME對Mg2+的親合力，其方法是改變膦酸鹽氧上的烷基取代基，或者將一個烷基加在膦酸鹽基團連接三氮環(huán)所連的碳原子上。
實施例2 四氮大環(huán)化合物DOTEP的合成圖7顯示的DOTEP制備如下。將2ml二氯乙基膦慢慢地與冰混和，生成相應的乙次膦酸。暖到室溫后加入390mg的1，4，7，10-四氮環(huán)十二烷的鹽酸鹽(亞環(huán)基四鹽酸)(Parrish化學公司，Ogden，Utah)，在氮氣氛下將混合物加熱至沸。將溶在10ml6MHCl中的含157mg多聚甲醛溶液以0.5ml/hr的速度加入混合物中，同時繼續(xù)進行回流。將最終混合物另外回流4小時，然后冷卻到室溫。真空下濃縮溶液成粘狀油，用6ml水再溶解，放進Dowex50W×4(氫形式)型陽離子交換柱(床容積7.5ml)。用水將交換柱洗滌到中性，再用60ml0.66MHCl洗脫產(chǎn)物。含有DOTEP的餾分被結合，將其蒸發(fā)，用無水乙醇再溶解后蒸發(fā)成白色固體。在無水乙醚中分散該固體，過濾，氮氣下予干燥后于60-70℃真空干燥得白色非常吸潮的固體(360mg，產(chǎn)率44%)。該固體要封在安瓿內(nèi)貯存。元素分析和電位滴定表明它是DOTEP·2H2O。
DOTEP的應用A.Ca(DOTEP)作[Ca2+]游離的31P NMR指示劑圖9所示31P的譜圖是含大約1mMCa2+和3mMDOTEP于生理PH時水溶液所得的。顯然，游離的和結合形式的DOTEP的31P共振具有各自清楚的化學漂移，兩者與組織內(nèi)觀察到的正常代謝物的31P共振都不重疊。這表明以制備合適的水解酯方式將DOTEP載入細胞時，使用簡單的關系式使細胞內(nèi)俘獲的NOTEP直接給出[Ca2+]游離的測量，
這里的KD＝11μM(此時PH＝7.4)。
上面報導的PH＝7.4時KD的值是用31P NMR和PH電位滴定所測定的(31P NMR測量游離和結合的積分在含有已知量的[Ca2+]總和和[DOTEP]總和溶液中是PH的函數(shù))。這個KD值表明DOTEP用來測量[Ca2+]游離可覆蓋的范圍大約為1-50μM。
B.Gd(DOTEP)作MRI對比劑DOTEP可與Gd3+形成穩(wěn)定絡合物(logK大約等于16)。所得絡合物有個有利的水質(zhì)子松馳度(R＝5.1S-1mM-1)，且絡合物有許多相同的動力學優(yōu)點，如圖10的數(shù)據(jù)所示的Gd(DOTA)。在該實驗中，Gd(DOTEP)和Gd(DOTA)溶在0.1MHCl中，它們分解成游離Gd3+和游離配位體并隨后進行水松馳測量。如示，兩種絡合物在強酸中分解的半存留期(half-lives)對Gd(DOTA)大約是110小時，對Gd(DOTEP)是30小時。這表明在PH為7.4時兩個絡合物的分解速度比這(大約106小時)要大幾個數(shù)量級，因而用于人體是十分安全的。
實施例3 多氮大環(huán)N-烷基膦酸鹽或膦酸酐NOTPME-AC的合成[NOTPME-AC是1，4，7-三氮環(huán)壬烷-N，N′N″-三(亞甲基膦酸單乙酯乙酸酐)將NOTPME三鈉鹽(178.63mg，0.318mM)溶在4.0ml無水氯仿中(新從過量P4O10中蒸餾的)，加入120毫升乙酰氯。溶液在密閉容器中于室溫攪拌24小時。然后在干燥氮氣氛下將溶液蒸發(fā)成黃色的非常粘的油。向該油加無水乙醚，濾出NOTPME-AC(以氯化鈉加合物形式沉淀)，在干燥氮氣下于35原子上。
實施例2 四氮大環(huán)化合物DOTEP的合成圖7顯示的DOTEP制備如下。將2ml二氯乙基膦慢慢地與冰混和，生成相應的乙次膦酸。暖到室溫后加入390mg的1，4，7，10-四氮環(huán)十二烷的鹽酸鹽(亞環(huán)基四鹽酸)(Parrish化學公司，Ogden，Utah)，在氮氣氛下將混合物加熱至沸。將溶在10m 16M HCl中的含157mg多聚甲醛溶液以0.5ml/hr的速度加入混合物中，同時繼續(xù)進行回流。將最終混合物另外回流4小時，然后冷卻到室溫。真空下濃縮溶液成粘狀油，用6ml水再溶解，放進Dowex50W×4(氫形式)型陽離子交換柱(床容積7.5ml)。用水將交換柱洗滌到中性，再用60ml 0.66M HCl洗脫產(chǎn)物。含有DOTEP的餾分被結合，將其蒸發(fā)，用無水乙醇再溶解后蒸發(fā)成白色固體。在無水乙醚中分散該固體，過濾，氮氣下予干燥后于60-70℃真空干燥得白色非常吸潮的固體(360mg，產(chǎn)率44%)。該固體要封在安瓿內(nèi)貯存。元素分析和電位滴定表明它是DOTEP·2H2O。
DOTEP的應用A.Ca(DOTEP)作[Ca2+]游離的31P NMR指示劑圖9所示31P的譜圖是含大約1mMCa2+和3mMDOTEP于生理PH時水溶液所得的。顯然，游離的和結合形式的DOTEP的31P共振具有各自清楚的化學漂移，兩者與組織內(nèi)觀察到的正常代謝物的31P共振都不重疊。這表明以制備合適的水解酯方式將DOTEP載入細胞時，使用簡單的關系式使細胞內(nèi)俘獲的NOTEP直接給出[Ca2+]游離的測量，新鮮的全血放入抗凝試管中，在3000g條件下離心分離3分鐘，除去血沉棕黃色層。然后將(離心機)用密的血紅細胞用PH＝7.4的磷酸鹽生理鹽水5mM洗滌三次。在含有負荷介質(zhì)的NOTPME衍生物中懸浮50%壓積細胞的血紅細胞。負荷介質(zhì)含有130mM NaCl，5mM NOTPME衍生物(苯甲?；蛞阴；苌?，1mM腺嘌呤，10mM葡萄糖和10mM HEPES，PH＝7.4。上述負荷介質(zhì)中的紅細胞于25℃培育1小時。在負荷步驟期間沒有觀察到血紅細胞的溶解。用NOTPME衍生物載荷1小時后，離心分離紅細胞懸浮液并丟棄上清液。在以等滲壓的鹽水懸浮前將紅細胞用PH＝7.4的5mM磷酸鹽生理鹽水洗滌兩次，以用于NMR測量。31P NMR測量表明這些NOTPME的衍生物已載入紅細胞內(nèi)并水解成NOTPME。NMR測量后將樣品離心分離，分析上清液中殘留NOTPME。在NMR測量的歷時期間內(nèi)沒有觀察到殘留的NOTPME。因此，十分清楚，這些NOTPME衍生物進入了紅細胞，并已水解成NOTPME留存在紅細胞內(nèi)。
實施例4 予言合成同屬的多氮大環(huán)N-烷基膦酸鹽，多氮大環(huán)N-烷基膦類或其酸酐有機合成化學領域內(nèi)技術人員可將實施例1，2和3的步驟很容易地適用于各種適宜的穩(wěn)定的多氮大環(huán)化合物。適宜的多氮大環(huán)化合物包括下列三氮和四氮大環(huán)化合物，并在Aldrich化學公司(Milwaukee，Wisconsin)有售1，5，9-三氮環(huán)十二烷(見圖10);
1，4，8，12-四氮環(huán)十五烷(見圖11);和1，4，8，11-四氮環(huán)十四烷(見圖12)。
下列引證文獻此處結合參照，引證緣由不言而喻。
參考文獻1.E.Carafoli and J.T.Penniston，Sci.Amer.25370(1985).
2.R.D.Grubbs and M.E.Maguire，Magnesium 6113(1983).
3.G.Charton，G.Rovira，Y.Ben-Ari and V.Leviel，Brain Res.58202(1985)4.D.Veloso，R.W.Gwynn，M.Oskarsson，and R.L.Veec J.Biol Chem 2484811(1973).
5.J.R.Lopez，L.Alamo，C.Caputo，J.Vergara，and Di Polo，Biochim.Biophys.Acta 8041(1984)6.C.H.Fry，Magnesium 5306(1986)7.F.J.Brinkley and A.Scarpa，F(xiàn)EBS Lett 5082(1975)8.T.J.Rink，R.Y.Tsien，and T.Pozzan，J.Cell.Bio 95189(1982).
9.B.E.Corkey，J.Duszynski，T.L.Rich，B.Matschinsky，and J.R.Williamson，J.Biol.Chem.25814294(1986).
10.G.A.Smith，T.R.Hesketh，J.C.Metcalfe，J.Feeney，and P.G.Morris，Proc.Natl.Acad.Sci.US 807178(1983).
11.J.C.Metcalfe，T.R.Hesketh，and G.A.Smith，Ce Calcium 6183(1985).
12.L.A.Levy，E.Murphy，B.Raju，and R.E.London Biochemistry 274041(1988).
13.E.Murphy，C.Steenbergen，L.A.Levy，B.Raju，R.E.London，J.Biol Chem.2645622(1989).
14.E.Marban，M.Kitakaze，H.Kusuoka，J.K.Poterf D.T.Yue，and V.P.Chacko，Proc.Natl.Acad.Sc USA 846005(1987).
15.H.M.Irving，M.C.Miles，and L.D.Petit，Anal.Acta 38 475
(1967).
16.M.S.Cacei and W.P.Cacheris，Byte 5340(1984).
17.(a)C.F.G.C.Geraldes，A.D.Sherry，and W.P.Cacheris，Inorg.Chem.28336(1989).(b)S.Cortes，E.Brucher，C.F.G.C.Geraldes，and A.D.Sherry Inorg.Chem.295(1990).
18.M.I.Kabachnik，T.Ya.Medved，Yu.M.Polikarpov，Scherbakov，F(xiàn).I.Belskii，E.I.Matrosov，and M.Pasechnik，Izv.Akad.Nauk.SSSR Ser Khim 769(1984).
19.R.K.Gupta，J.L.Benovic，and Z.B.Rose，J.Bio Chem.2536472(1978).
20.P.W.Flatman and V.L.Lew，Nature(London)2673(1977).
21.A.Bevilacqua，R.T.Gelb，W.B.Hobard，and L.F.Zompa，Inorg.Chem.262699(1987).
權利要求
1.一種多氮大環(huán)化合物或其鹽，化合物的化學式為
其中x是2，3或p2(s)和q3(s)的結合，p+q=y；y是3或4；R是(CH2)2P(=O)R1R2；R1是R3或OR3，R3是烷基，環(huán)烷基或芳基；R2是H，烷基或者
而R4是烷基，環(huán)烷基或芳基；且z是1-3。
2.一種多氮大環(huán)化合物-金屬絡合物，其化學式為
其中x是2，3或p2(s)和q3(s)的結合，p+q＝y(tǒng);y是3或4;R是(CH2)zP(＝0)R1R2;R1是R3或OR3而R3是烷基，環(huán)烷基或芳基;R2是H，烷基或
，而R4是烷基，環(huán)烷基或芳基;且z是1-3;r是2或3;Me是金屬離子。
3.根據(jù)權利要求1或2的化合物，其中y是3。
4.根據(jù)權利要求1或2的化合物，其中y是4。
5.根據(jù)權利要求1或2的化合物，其中y是3而x是2。
6.根據(jù)權利要求1或2的化合物，其中y是4而x是2。
7.根據(jù)權利要求1或2的化合物，其中y是3，p是1而q是2或p是2而q是1。
8.根據(jù)權利要求1或2的化合物，其中y是4，p是1而q是3，p是2且q是2或者p是3而q是1。
9.根據(jù)權利要求1或2的化合物，其中z是1。
10.根據(jù)權利要求1或2的化合物，其中R1是R2。
11.根據(jù)權利要求1或2的化合物，其中R1是OR2。
12.根據(jù)權利要求1或2的化合物，其中n是2。
13.根據(jù)權利要求1或2的化合物，其中x是2，y是4，z是1且R1是R2。
14.根據(jù)權利要求1或2的化合物，其中x是2，y是4，z是1，R1是R2且n是2。
15.根據(jù)權利要求1或2的化合物，其中x是2，y是3，z是1，R1是OR2且n＝2。
16.根據(jù)權利要求2的絡合物，其中M+r是Ca2+，Mg2+，Zn+2或Gd+3。
17.一種化合物或其鹽，化合物結構式為
其中R是CnH2n+1;R1是H，烷基或
而R4是烷基，環(huán)烷基或芳基。
18.根據(jù)權利要求17的化合物，其中n是1-20。
19.一種化合物或其鹽，化合物結構式為
其中R1是CnH2n+1;R2是H，烷基或
而R4是烷基，環(huán)烷基或芳基。
20.根據(jù)權利要求19的化合物，其中n是1-20。
21.一種化合物或其鹽，化合物結構式為
22.一種測算胞間兩價金屬離子濃度的方法，包括處理細胞，在促進胞間定位的條件下，用一種多氮大環(huán)化合物或其鹽處理細胞，化合物的化學式為
其中x是2，3或p2(s)和q3(s)的結合而p+q＝y(tǒng);y是3或4;R是(CH2)zP(＝0)R1R2;R1是R3或OR3、而R3是烷基，環(huán)烷基或芳基;R2是H，烷基或
而R4是烷基，環(huán)烷基或芳基;z是1-3;然后測量在31P NMR譜中的改變，所說的改變與胞間兩價金屬濃度有比例關系。
23.根據(jù)權利要求22的方法，其中金屬是鈣，鎂或鋅。
24.根據(jù)權利要求22的方法，其中金屬是鎂。
25.根據(jù)權利要求22的方法，其中x是2，y是3，z是1，R1是OR2且n是2。
26.根據(jù)權利要求22的方法，其中x是2，y是4，z是1，R1是R2且n是2。
27.一種增強某種物質(zhì)的磁共振圖譜的方法，包括施予該物質(zhì)一種多氮大環(huán)化合物-金屬絡合物，然后得到所說物質(zhì)的磁共振圖譜，所說絡合物化學式為
其中x是2，3或p2(s)和q3(s)的結合而p+q＝y(tǒng);y是3或4;R是(CH2)zP(＝0)R1R2;R1是R3或OR3而R3是烷基，環(huán)烷基或芳基;R2是H，烷基或
而R4是烷基，環(huán)烷基或芳基;z是1-3;Me是順磁金屬且r是2或3。
28.根據(jù)權利要求27的方法，其中金屬是鑭。
29.根據(jù)權利要求27的方法，其中金屬是釓并且r是3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的多氮大環(huán)化合物或其鹽及其用途?；衔锏幕瘜W式為其中X是2，3或P在一個重要實施方案中，該化合物與金屬絡合成多氮大環(huán)化合物——金屬絡合物，其化學式為
文檔編號C07F9/6515GK1066073SQ9110759
公開日1992年11月11日 申請日期1991年11月19日 優(yōu)先權日1984年10月18日
發(fā)明者舍利·A·狄恩, 伊凡·拉薩爾, 拉·拉韋山德蘭, 布·艾爾諾 申請人:德克薩斯州立大學董事會