專利名稱：用于絡(luò)合金屬離子的多氮大環(huán)化合物的制作方法
本申請是1989年5月25日向美國申請的序號為07/357193和1988年12月28日申請的序號為07/291053的專利申請的部分續(xù)申請，這兩個申請在此結(jié)合作為參考。而07/291053申請是1987年1月27日申請的007729號申請的部分續(xù)申請，而后者又是1984年10月18日申請的序號為662076號申請(已批準(zhǔn)，專利號為4639365)的部分續(xù)申請。
本發(fā)明涉及一系列新的含磷大環(huán)螯合物，它們結(jié)合一定的生物離子而具有相對的特性。當(dāng)金屬離子占據(jù)螯合物的空位時，這些螯合物的31P共振在核磁共振譜(NMR)中漂移到一個新位置，并且這種結(jié)合整合物的NMR化學(xué)漂移對每個金屬離子都不一樣。這種性質(zhì)對于利用31P NMR來監(jiān)視某些生物陽離子的胞間濃度應(yīng)是有用的，該陽離子包括如Mg2+、Ca2+和Zn2+。還有幾種商業(yè)可用的、可測量胞間陽離子濃度的螢光螯合物和可用于NMR目的的含1或2個氟的螯合物。螢光螯合物不可能用于人體研究，而19F螯合物也不可能象本發(fā)明的31P螯合物那樣用于臨床。此外，某些螯合劑結(jié)合Gd3+后具有的性質(zhì)使其成為安全有效的磁共振圖的對比劑。
很多的生物體系需要抗磁陽離子，如Ca2+、Mg2+和Zn2+來調(diào)節(jié)各種反應(yīng)。Ca2+作為一種胞間信息離子在很多類型細(xì)胞中的作用已被很好地確認(rèn)[1]。實際上對所有包括ATP的生物反應(yīng)而言Mg2+是一種所需的輔因子，并在較多的各種生物反應(yīng)的緩沖過程中廣泛地起作用[2]。Zn2+被相當(dāng)緊密地結(jié)合在幾種酶的活性位置上，它的作用看來似乎包括化學(xué)鍵的極化，以助于鍵的水解、氧化還原或基團轉(zhuǎn)移反應(yīng)。然而，在某些細(xì)胞如腦細(xì)胞中，游離的Zn2+可以起更廣泛的作用，并認(rèn)為游離的Zn2+象存貯顆粒一樣被存于神經(jīng)元中，并在電生理活化期間可以移動[3]。
利用現(xiàn)有測量細(xì)胞和充盈器官中游離陽離子濃度的直接方法來評價兩價陽離子在細(xì)胞功能中的作用是受限制的。目前可用的測量兩價陽離子的方法包括基于平衡反應(yīng)的間接計算[4]，離子選擇的微電極[5，6]，和用金屬顯色染料的零點測量，該染料既可顯微注入細(xì)胞[7]又可置于胞外隨后溶解在細(xì)胞的空間內(nèi)[8，9]。實際上所有這些方法實質(zhì)上是侵入型的，且在分析前需損壞樣品。與此相反，NMR作為一種非侵入型的工具有顯著優(yōu)點，尤其是測量充盈器官和完整無損的細(xì)胞中胞間游離的兩價陽離子濃度。
最近，氟化的螯合物已被有效地以19FNMR用來測量細(xì)胞和充盈器官中胞間游離的Ca2+[10，11]和Mg2+[12，13]。這些螯合物在分離的細(xì)胞體系中可適當(dāng)良好地工作，而用在充盈器官時則遇到意外的界限(line)變寬[13，14]。這些體系的另一缺點是合成這些化合物的路線限制了可能的螯合結(jié)構(gòu)，因此也限制了可設(shè)計螯合物的金屬離子的選擇性。本發(fā)明的目的包括合成和開展一系列的三氮和四氮大環(huán)膦酸單酯和烷基亞膦酸酯作為31PNMR指示劑來檢測生物體系中胞間游離陽離子。
本發(fā)明還涉及活體的NMR圖，有時稱作MRI(磁共振圖)。特別涉及一種試劑，它可用來增強這些物體中NMR的對比度。
核磁共振(NMR)作為一種化學(xué)分析手段已應(yīng)用多年了。NMR是種射頻譜的類型，它的基礎(chǔ)是帶電原子核的自旋平行或逆平行于所加磁場而產(chǎn)生的小能量差別。當(dāng)射頻能量施加到樣品時，這些自旋原子核改變了自旋狀態(tài)，正因如此則吸收一些射頻能量。在同樣的分子內(nèi)化學(xué)環(huán)境稍有差別的原子核以稍有不同的能量改變了自旋狀態(tài)，這就產(chǎn)生了有助于鑒別分子結(jié)構(gòu)的特征吸收或共振。
NMR用于人體檢查的時間要更近一些。如計算機軸向斷層照象(CAT掃描)的其他方法過去是現(xiàn)在仍然是用來檢查人體。然而，由于NMR不使用電離輻射，可以認(rèn)為它在安全性方面的優(yōu)點超過CAT。因此在制備人體橫截面圖象方面NMR是種優(yōu)越的方法。
NMR掃描獲得圖象的質(zhì)量取決于兩個性質(zhì)各種組織的質(zhì)子密度和質(zhì)子松馳速度的差別。組織的質(zhì)子密度不能輕易改變，而質(zhì)子松馳速度可通過加入順磁松馳劑來調(diào)節(jié)，它通常叫作“對比劑”(contrast agent)。對比劑增大了磁性相似但組織學(xué)上不相似的組織之間NMR圖象的對比度。
過去常把釓當(dāng)對比劑用來進(jìn)行試驗，因它有個大磁慣量，可有效地松馳磁性原子核。釓的強順磁性質(zhì)歸因于它的七個未成對的電子。
釓作為對比劑的一個缺點是它對動物的毒性。對這個問題的一個可能的補求辦法是將釓結(jié)合成化合物，以化合物通過體內(nèi)并被排泄而不釋放有毒的釓離子。遺憾的是象釓那樣的稀土元素并不能與有機分子形成穩(wěn)定的共價鍵，所以，這種分子會在體內(nèi)分解并釋出有毒離子。
這就需要一種有效的對比劑能避開前述使用釓時的毒性問題。進(jìn)面需一種新型更好的對比劑，不管它們包括釓還是其他順磁金屬。
本發(fā)明涉及一種新型多氮大環(huán)化合物或其鹽及其用途。該化合物通式為
其中x是2，3或P2(s)和q3(s)的結(jié)合。這里的p+q＝y(tǒng)；y是3或4；R是(CH2)zP(＝0)OR′R2，R1是R3或OR3，R3是烷基，環(huán)烷基或芳基；R2是H，烷基或
；R4是烷基，環(huán)烷基或芳基；(R3和R4在同樣分子中可相同或不相同)，Z是1-3。
一個優(yōu)選的烷基是CnH1+2n，這里的n是1-20；優(yōu)選的環(huán)烷基是CnH2m-1，其中m是1-20；優(yōu)選的芳基是苯基。
在一個重要的實施方案中，這種化合物與金屬絡(luò)合變成多氮大環(huán)化合物-金屬絡(luò)合物，其化學(xué)式為
其中x是2，3或P2(s)和q3(s)的結(jié)合。這里的p+q＝y(tǒng)；y是3或4；R是(CH2)zP(＝0)OR′R2，R1是R3或OR3，R3是烷基，環(huán)烷基或芳基；R2是H，烷基或
；z是1-3；r是2或3；且Me是一金屬離子。
y設(shè)計表征為象三氮或四氮大環(huán)那樣的化合物。雖然在許多情況里x有可能為3但優(yōu)選2。對x的P2(s)和q3(s)之結(jié)合當(dāng)然容易得到，但在多氮大環(huán)中眾多單元而言p+q之和必是y。
在化合物或其金屬絡(luò)合物的一個優(yōu)選實施方案中，y是3，p是1且q是2或者p是2而q是1。
在化合物或其金屬絡(luò)合物的另一優(yōu)選實施方案中y是4，p是1且q是3，p是2且q是2或p是3而q是1，z最佳為1，n優(yōu)選為2。
在一更佳的實施方案中x是2，y是4，z是1，且R1是R3。
在另一個優(yōu)選實施方案中x是2，y是3，z是1，R1是OR2且n是2。
Me+r最好是Ca2+，Mg2+，Zn2+或Gd3+。其他特性的兩價或三價金屬離子，特別是順磁的鑭也可如此被絡(luò)合。
本發(fā)明包括一種測定胞間一種或多種兩價金屬離子濃度的方法。該方法包括在促進(jìn)多氮大環(huán)化合物或其鹽的胞間定位條件下處理細(xì)胞，該化合物的化學(xué)式為
其中x是2，3或p2(s)和q3(s)的結(jié)合且q+p＝y(tǒng)；y是3或4；R是(CH2)zP(＝0)OR1R2；R1是R3或OR3；R3是烷基，環(huán)烷基或芳基。R2是H，烷基或
；R4是烷基、環(huán)烷基或芳基；z是1-3；然后測量在31PNMR譜中的漂移，所說的漂移與胞間兩價金屬濃度成比例關(guān)系。在一實施方案中，用本發(fā)明化合物的酸酐(即其中R2是
)形式來處理細(xì)胞，將其通入細(xì)胞，在那里水解成酸的形式(即R2是H)并與胞間金屬離子絡(luò)合。最適合于這種測量的金屬通常是鈣，鎂或鋅，優(yōu)選鎂。
在一個重要應(yīng)用中，本發(fā)明包括可增強某種物質(zhì)的磁共振圖譜的方法。該方法包括施予該物質(zhì)一種多氮大環(huán)化合物-金屬絡(luò)合物，然后得出該物質(zhì)的磁共振圖，所說的絡(luò)合物化學(xué)式為
其中x是2，3或p2(s)和q3(s)的結(jié)合且p+q＝y(tǒng)；y是3或4；R是(CH2)zP(＝0)OR1R2；R1是R3或OR3；R3是烷基，環(huán)烷基或芳基；R2是H，烷基或
；R4是烷基，環(huán)烷基或芳基；z是1-3；r是2或3且Me是順磁金屬(優(yōu)選釓)。


圖1示意說明NOTPME的結(jié)構(gòu)(其中R是CH2CH3且R1是H)。
圖2說明2mM的NOTPME(a)和存在等當(dāng)量Ca2+(b)，Mg2+(c)和Zn2+(d)時所得出的電位滴定曲線。
圖3表示5mM的NOTPME的31PNMR譜與所添加鎂(總數(shù))的函數(shù)關(guān)系。從底部到頂部Mg2+濃度分別是0，0.5，1.5和3mM。樣品構(gòu)成和光譜參數(shù)見方法部分的敘述。
圖4表明存在(A)2.05mM ZnCl2和(B)38.5mM CaCl2時5mM NOTPME的31PNMR譜圖。樣品組成和光譜參數(shù)在方法部分中給出。
圖5說明5mM NOTPME(a)，Ca(NOTPME)(b)，Zn(NOTPME)(c)和Mg(NOTPME)(d)的31PNMR化學(xué)漂移和PH的依賴關(guān)系。
圖6顯示正常RBCs(a)和負(fù)載NOTPME的RBCs(b)的31PNMR譜圖。
圖7示意說明DOTEP的結(jié)構(gòu)。
圖8呈現(xiàn)DOTEP和DOTEP-鈣絡(luò)合物的31PNMR譜圖。
圖9敘述了釓-DOTA和釓-DOTEP在0.1NHCl中的分解速度。
圖10示意說明1，5，9-三氮環(huán)十二烷化合物。
圖11示意說明1，4，8，12-四氮環(huán)十五烷化合物。
圖12示意說明1，4，8，11-四氮環(huán)十四烷化合物。
實施例1三氮大環(huán)化合物合成1，4，7-三氮環(huán)壬烷-N，N′，N″-三(亞甲基磷酸單乙酯)(NOTPME)，將其特征化并分析以用作胞間Mg2+和Zn2+離子的31PNMR指示劑。這種螯合物在存在金屬離子的31PNMR譜圖顯示游離螯合物，Mg(NOTPME)，Zn(NOTPME)和Ca(NOTPME)的特性共振。通過電勢分析法和NMR得到Ca2+和Mg2+絡(luò)合NOTPME的穩(wěn)定常數(shù)，以及通過電勢分析法得其與Zn2+的穩(wěn)定常數(shù)。這種螯合物在生理PH值時對Mg2+的親合力高于對Ca2+的十倍。對Zn2+的親合力如此之高使得實際的結(jié)合常數(shù)不能以NMR來測定。在Mg2+存在下，NOTPME很容易被載入血紅細(xì)胞。游離螯合物和它的金屬絡(luò)合物的31P化學(xué)漂移位于生物體系中對常規(guī)含磷代謝產(chǎn)物觀察到的很遠(yuǎn)的下區(qū)域(downfield)，因而使得能夠監(jiān)測細(xì)胞間陽離子濃度和同時發(fā)生的細(xì)胞力能。原料從Aldrich化學(xué)公司購買1，4，7一三氮環(huán)壬烷，多氮甲醛，二乙基亞磷酸鹽和活性炭Darco G-60。從Mallickrodt購買MgS-O4，從J.T.Baker購氫氧化鈉和苯，從Fisher Scientific買二乙醚。所有化學(xué)藥劑皆為高純物，無需進(jìn)一步純化。配制標(biāo)準(zhǔn)的ZnCl2，CdCl2，MgCl2和CaCl2溶液。合成NOTPME將1，4，7-三氮環(huán)壬烷(1.91克，14.71mmol)和二乙基亞磷酸鹽(7.018克，16.94mmol，過量15％)溶在125ml苯中并回流加熱。將無水多聚甲醛(1.727克，30％過量)以小部分加到上述回流混合物中，同時以蒸餾除去苯水共沸混合物。加入多聚甲醛后就是復(fù)合體，整個溶液沸騰30分鐘，然后蒸發(fā)得到黃色粘狀油。將該油溶于150ml無水二乙基醚并用無水MgSO4干燥過夜。隨著白色沉淀的形成將MgSO4濾掉并丟棄。濾液以活性炭脫色并過濾。再將此濾液真空蒸發(fā)得到1，4，7-三氮環(huán)壬烷-N，N’，N”-三(亞甲基磷酸二乙酯)(NOTPDE)粘性油。得到純NOTPDE的產(chǎn)率為96％(9.21克，14.17mmol)并用它來合成NOTPDE(結(jié)構(gòu)見圖1)而無需進(jìn)一步純化。NOTPDE在CDCl3中的1H NMR數(shù)據(jù)如下(TMS為零)δ(ppm)1.33(t，18H，-CH3)，2.97(s，12H，N-CH2)，3.00(d，6H，O-CH2)，4.13(P，12H，O-CH2)。
將9.20克(14.15mmol)NOTPDE與2.50克NaOH(在9ml水中)混和，2小時后將整個反應(yīng)混合物沸騰，直至得到清液(大約5分鐘)。溶液冷卻到室溫并讓它靜置過夜。用帶有粗孔級濾盤的壓力過濾漏斗從粘性母液中濾出形成的晶體。用冷無水乙醇將晶體洗滌一次，再用無水乙醇-二乙醚(1∶1)混合物洗滌三次，最后用二乙醚洗滌。把Na2NOTPME晶體在干燥氮氣流中于25℃干燥2小時。于50℃將NOTPME真空(10mmHg)干燥5小時除去微量的水和乙醇。而后得到純的NOTPME白色晶體，極易吸潮，易溶于水并頗溶于氯紡。純NOTPME的產(chǎn)率是40.8％(3.24克，5.77mmol)。
1H NMR(參照位于4.90ppm的D2O、HDO峰)，δ(ppm)1.23(t，9H，-CH3)，2.54(s，寬峰，6H，p-CH2)，2.79(2，寬峰，12H，N-CH2，3.91(P，6H，o-CH2)。NMR測量在JEOL FX-200型NMR能譜儀上用10mm探頭室溫操作得到1H NMR數(shù)據(jù)。用通用電子公司GN-500型NMR能譜儀對NOTPME和其絡(luò)合物溶液進(jìn)行研究。對31P探測時將10mm寬帶探頭擰到202.4MHg。到85％的H3PO4作外標(biāo)測量NOTPME和其絡(luò)合物的漂移。探頭溫度精確到±0.5℃。
以NMR進(jìn)行KD測定所用的NOTPME樣品的構(gòu)成為115mM的KCl，20mM的NaCl和10mM的HEPES，用Tris堿(氨基丁三醇)將其緩沖，PH為7.4。變化Mg2+，Ca2+或Zn2+的濃度(通常0.5-10mM)加到樣品中，得到所導(dǎo)致的31PNMR譜圖。使用GE軟件以將各峰積分的方式測定共振面積。電位測量25℃下使用Corning離子分析儀(250型)和MetrohmDorsimat自動滴定管(Brinkman儀器公司)進(jìn)行電位滴定。按照Irving等人〔15〕建議的方法從所測PH值得到氫離子濃度。將Na3NOTPME溶于0.1M四甲基銨氯化物中，用HCl調(diào)節(jié)PH到低值并用0.098M的KOH來滴定。以針對鄰苯二甲酸氫鉀的電位滴定方式將KOH標(biāo)樣并在氮氣氛下貯存。在同樣的鹽溶液中分別測定氫離子活度系數(shù)和Kw。以電位滴定金屬和配位體之比為1∶1的溶液方式測定Zn(NOTPME)，Mg(NOTPME)和Ca(NOTPME)的穩(wěn)定常數(shù)。所有的滴定中，樣品用環(huán)己烷薄層遮蓋以排除CO2。
質(zhì)子化作用常數(shù)(KHiL)和穩(wěn)定常數(shù)(KML和KMHL)由下面等式限定KHiL＝[HiL]/{[Hi-L][H+]}(1)KML＝[ML]/{[M][L]} (2)KMHL＝[MHL]/{[ML][H+]} (3)在IBM PC上用單形非線性算法運算電位數(shù)據(jù)得到質(zhì)子化作用和穩(wěn)定常數(shù)。NOTPME的紅血細(xì)胞載荷取新鮮的全血放入抗凝結(jié)化的試管中在3000g離心機上分離6分鐘，以除去血沉棕黃色層。然后在5mM磷酸鹽緩沖鹽水(PH＝7.4)中將RBC5洗滌三次。將存在于50％紅血細(xì)胞中的RBC5懸浮在負(fù)荷介質(zhì)(loading medium)中，該介質(zhì)含有120mMNaCl，5mM MgCl2，10mM pH為7.4的HEPES，10mM葡萄糖和10mM NOTPME，然后于37℃培育12小時。負(fù)荷過程中沒有觀察到RBC5的溶解。離心分離RBC5，棄掉上清液。在以等滲壓介質(zhì)懸浮前用PH＝7.4的磷酸鹽緩沖鹽水將RBC5洗滌兩次。質(zhì)子化作用研究圖2說明25℃時NOTPME在0.1M四甲銨氯化物中的電位滴定曲線。從這些數(shù)據(jù)可得三個質(zhì)子化作用常數(shù)(PK1＝11.8，pK2＝3.65，pK3＝1.4)。還測量了NOTPME的31PNMR譜圖隨PH而變化的函數(shù)關(guān)系(數(shù)據(jù)未示出)，從這些數(shù)據(jù)得到的質(zhì)子化作用常數(shù)通常與電位得到的那些相一致。在多氮環(huán)中磷的漂移對氮的質(zhì)子化作用非常敏感，類似于母體NOTP磷酸鹽所觀察到的那樣〔17〕。第一個雙質(zhì)子化作用(logK＝11.8，3.65)導(dǎo)致了31P漂移到低頻，這和雙環(huán)氮的質(zhì)子化作用相一致〔17〕。這表明在NOTP與NOTPME相比較時第一個氮的質(zhì)子化作用十分類似(分別是logK1＝12.1與11.8相比較)，而第二個氮的質(zhì)子化作用引人注目的不同(logK2＝9.4與3.65相比較)。這些pK2的差別反映了磷酸鹽與磷酸鹽單酯側(cè)鏈形成內(nèi)部氫結(jié)合質(zhì)子化氮能力方面的差別，這就與下面的結(jié)論相一致，即，NOTP(質(zhì)子化作用常數(shù)在6.0-7.5之間)中膦酸酯氧的堿性大大超過了NOTPME(質(zhì)子化作用常數(shù)低于1.4)中膦酸酯氧的堿性。NOTPME的31PNMR譜展示單個共振覆蓋了整個PH范圍，表明在所有質(zhì)子化的種類中的快速轉(zhuǎn)變。絡(luò)合研究圖2還顯示了存在一種兩價的Mg2+，Ca2+或Zn2+時NOTPME的電位滴定數(shù)據(jù)。由這些數(shù)據(jù)得到的Mg(NOTPME)，Ca(NOTPME)和Zn(NOTPME)的穩(wěn)定常數(shù)概括在表I中。
表INOTPME與Ca2+，Mg2+和Zn2+絡(luò)合的穩(wěn)定常數(shù)。金屬離子KD(在25°x) KD(在37℃)logKMLCa2+50mM 47.62mM5.1Mg2+5.77mM 4.66mM 6.3Zn2+(10-11M)4— 15.4KD值由NMR數(shù)據(jù)得到而1ogK值在25℃以電位測定。KD值由熱力學(xué)值(logKML＝15.4)來建立，同時要考慮配位體的pK值和pH＝7.4時的質(zhì)子濃度。
與Mg2+或Ca2+相比，Zn2+和NOTPME形成的絡(luò)合物要穩(wěn)定的多。大大地反映出Zn2+比其他離子Mg2+和Ca2+有更強的形成M2+-N鍵的傾向。Mg(NOTPME)和Ca(NOTPME)兩者分別與其NOTP絡(luò)合物相比，穩(wěn)定性要弱一些[18]，再次反映出膦酸酯側(cè)鏈配位體更為酸性。然而，NOTPME和NOTE一樣，金屬越小，與之形成的絡(luò)合物越穩(wěn)定，Mg2+小于Ca2+則Mg2+的更穩(wěn)定。這反映出在這兩者情況下三氮環(huán)壬烷大環(huán)的尺寸選擇性。
圖3演示了含5mMNOTPME溶液的31PNMR譜對添加的Mg2+的函數(shù)關(guān)系。該譜圖表示出結(jié)合Mg2+的NOTPME是慢慢地與“游離”NOTPME互換的。圖4表明存在2.05mMZn2+和38.5mM Ca2+時5mM NOTPME的31PNMR譜圖。正如予料的基于電位滴定測定穩(wěn)定常數(shù)的情況，這種溶液與含Mg2+的等效溶液相比存在更多的Zn(NOTPME)。令人感興趣的是Mg2+和Zn2+結(jié)合NOTPME的化學(xué)漂移十分不同，確實，在含有兩者金屬離子的混合物中能夠得到Zn(NOTPME)和Mg(NOTPME)的特征共振。正如予料的那樣，Ca2+結(jié)合得更弱一些，在加入32mM的Ca2+后僅僅能分辨出Ca(NOTPME)的特征共振。Ca(NOTPME)的化學(xué)漂移(22.1ppm)也不同于Mg(NOTPME)(23.5ppm)和Zn(NOTPME)(23.1)所形成的。這也許反映出Ca2+比Mg2+或Zn2+有較大的尺寸，它不適于進(jìn)入環(huán)壬烷內(nèi)腔。
通過積分和估算其濃度可得相符于游離和結(jié)合金屬NOTPME的共振面積。以Mg2+和Ca2+絡(luò)合物于25℃的NMR獲得KD值分別是5.77mM和50mM.和氟化的螯合物MF-APTRA相比較，其他人所報導(dǎo)的〔12〕對Mg2+的KD是1mM，對Ca2+是12μm。
表1也顯示出NMR在37℃得到的Mg(NOTPME)和Ca(NOTPME)的KD。顯然，37℃時Mg(NOTPME)和Ca(NOTPME)在穩(wěn)定度方面的差別等級維持不變。這就可以確定在生理溫度下NOTPME對Mg2+的親合力高于Ca2+。從NMR數(shù)據(jù)不能得到Zn(NOTPME)的KD，因為在所有的真實測量條件下滴定的Zn2+完全與NOTPME相結(jié)合。
圖5呈現(xiàn)出Ca2+，Mg2+和Zn2+的NOTPME絡(luò)合物的31PNMR化學(xué)漂移與PH為6-10之間的函數(shù)關(guān)系。在金屬離子和配位體為1∶1的溶液中，可見到的Zn(NOTPME)共振特性覆蓋了這個PH范圍，Mg(NOTPME)的特征共振僅在PH為6.4以上時才能檢測出，而Ca(NOTPME)的特征則只有PH在7.8以上時才看得見。這些差別清楚地說明在生理PH(大約7.4)時NOTPME對Mg2+的選擇性大于對Ca2+的。如上所示，結(jié)合金屬類的化學(xué)漂移實際上在上面PH值范圍內(nèi)與PH值無關(guān)。人體紅細(xì)胞中胞間游離Mg2+濃度的測定圖6說明應(yīng)用NOTPME檢測RBC5中胞間游離的Mg2+。首先通過在含有含5mMMgCl2的NOTPME負(fù)荷介質(zhì)中于37℃將RBC5培育12小時而制備載有NOTPME的RBC5(圖6b)。負(fù)荷介質(zhì)中無MgCl2時則不能觀察到NOTPME載入了RBC5中。圖6a示出了對比的RBC5。
如同在體內(nèi)研究，在RBC5中觀察到兩個相應(yīng)于游離和Mg2+結(jié)合的NOTPME的共振情況。用下面公式估算RBC5中胞間游離的Mg2+濃度[Mg2+]＝KD[MgNOTPME]/[NOTPME]在該特殊實例中得到的胞間游離Mg2+濃度為1.71mM。因為RBC5中胞間游離Mg2+的含量范圍通常在0.2-O.3mM之間[12，19，20]，所以該實驗觀察到胞間游離Mg2+的高濃度一定是Mg2+以和NOTPME的絡(luò)合物形式輸運的結(jié)果。于懸浮介質(zhì)中外加兩價陽離子的離子載體A23187后，則觀察到胞間游離Mg2+濃度增大(至1.90mM)(未出數(shù)據(jù))。這些結(jié)果表明NOTPME可很容易地檢測出完整細(xì)胞中游離Mg2+含量的微小變化。
第一個質(zhì)子化作用常數(shù)非常高的數(shù)值以及所需三氮環(huán)的構(gòu)造和尺寸，可強烈影響NOTPME絡(luò)合物的形成特性。使用常規(guī)電位滴定方法可以研究NOTPME與Zn2+，Mg2+及Ca2+絡(luò)合物，這個事實表明溶液中形成絡(luò)合物相當(dāng)快。表I所見，Zn2+比Mg2+或Ca2+兩者與NOTPME形成更穩(wěn)定的絡(luò)合物。對三氮環(huán)壬烷三乙酸酯絡(luò)合物(即NOTA)與這些金屬離子絡(luò)合時也觀察到同一傾向；報導(dǎo)的logK值分別是Zn(NOTA)18.3；Mg(NOTA)，9.69；及Ca(NOTA)是8.92〔21〕。因此，羧酸酯與所有三種金屬離子形成更穩(wěn)定的絡(luò)合物也許是由于羧酸酯氧配位體的堿度大于膦酸鹽氧配位體的。母體膦酸鹽NOTP在其與Zn2+，M2+和Ca2+的金屬絡(luò)合能力方面也顯示同一傾向，但在此情況中，所得給合物的穩(wěn)定常數(shù)與相應(yīng)的NOTPME或NOTA的數(shù)值都要高出幾個數(shù)量級。報導(dǎo)的logK值對Zn(NOTP)4-，Mg(NOTP)4-和Ca(NOTP)4-分別是24.9，11.0和6.4〔18〕。因為NOTP中氮和膦酸鹽氧比NOTPE中的那些堿性更強，則與這些金屬離子所得的穩(wěn)定常數(shù)也都大。其傾向依然保持為Zn2+＞＞Mg2+＞Ca2+。
生物體系中測量胞間Mg2+方面，NOTPME有幾個優(yōu)于氟化絡(luò)合物如BAPTA和APTRA的優(yōu)點。這些優(yōu)點包括(a)容易合成，(b)對Mg2+的親合力大于對Ca2+的，(c)對于結(jié)合的和游離的配位體共振沒有明顯的互換影響，以及(d)因可以同時測量細(xì)胞力能，該螯合物中三個磁性等效的31P核能提供對生物組織有親合力的NMR核。NOTPME在生理PH方面展示對Mg2+優(yōu)于對Ca2+的顯著選擇性有個大優(yōu)點，即在生物體系中監(jiān)測Mg2+而不受Ca2+的影響。強調(diào)下面這點很重要，即NOTPME及其與鎂絡(luò)合物的共振并不與組織內(nèi)含磷代謝物的相重疊。因此，在用31PNMR測量胞間游離鎂的改變以及各種生理事件期間代謝物的改變方面，NOTPME提供了萬能手段。在許多生物體系中，生理PH處KDMg(NOTPME)對測量胞間Mg2+方面落入所需要的范圍，雖然這點是偶然的，卻可證明能夠精細(xì)調(diào)節(jié)NOTPME對Mg2+的親合力，其方法是改變膦酸鹽氧上的烷基取代基，或者將一個烷基加在膦酸鹽基團連接三氮環(huán)所連的碳原子上。
實施例2四氮大環(huán)化合物DOTEP的合成圖7顯示的DOTEP制備如下。將2ml二氯乙基膦慢慢地與冰混和，生成相應(yīng)的乙次膦酸。暖到室溫后加入390mg的1，4，7，10-四氮環(huán)十二烷的鹽酸鹽(亞環(huán)基四鹽酸)(Parrish化學(xué)公司，Ogden，Utah)，在氮氣氛下將混合物加熱至沸。將溶在10m16MHCl中的含157mg多聚甲醛溶液以0.5nl/hr的速度加入混合物中，同時繼續(xù)進(jìn)行回流。將最終混合物另外回流4小時，然后冷卻到室溫。真空下濃縮溶液成粘狀油，用6ml水再溶解，放進(jìn)Dowex50W×4(氫形式)型陽離子交換柱(床容積7.5ml)。用水將交換柱洗滌到中性，再用60ml 0.66MHCl洗脫產(chǎn)物。含有DOTEP的餾分被結(jié)合，將其蒸發(fā)，用無水乙醇再溶解后蒸發(fā)成白色固體。在無水乙醚中分散該固體，過濾，氮氣下予干燥后于60-70℃真空干燥得白色非常吸潮的固體(360mg，產(chǎn)率44％)。該固體要封在安瓿內(nèi)貯存。元素分析和電位滴定表明它是DOTEP·2H2O。DOTEP的應(yīng)用A.Ca(DOTEP)作[Ca2+]游離的31PNMR指示劑圖9所示31P的譜圖是含大約1mMCa2+和3mMDOTEP于生理PH時水溶液所得的。顯然，游離的和結(jié)合形式的DOTEP的31P共振具有各自清楚的化學(xué)漂移，兩者與組織內(nèi)觀察到的正常代謝物的31P共振都不重疊。這表明以制備合適的水解酯方式將DOTEP載入細(xì)胞時，使用簡單的關(guān)系式使細(xì)胞內(nèi)俘獲的NOTEP直接給出[Ca2+]游離的測量，游離＝KD·[Ca(DOTEP)]/[DOTEP]游離這里的KD＝11μM(此時PH＝7.4)。
上面報導(dǎo)的PH＝7.4時KD的值是用31PNMR和PH電位滴定所測定的(31PNMR測量游離和結(jié)合的積分在含有已知量的[Ca2+]總和和]DOTEP]總和溶液中是PH的函數(shù))。這個KD值表明DOTEP用來測量[Ca2+]游離可覆蓋的范圍大約為1-50μM。B.Gd(DOTEP)作MRI對比劑DOTEP可與Gd3+形成穩(wěn)定絡(luò)合物(logK大約等于16)。所得絡(luò)合物有個有利的水質(zhì)子松馳度(R＝5.1S-1mM-1)，且絡(luò)合物有許多相同的動力學(xué)優(yōu)點，如圖10的數(shù)據(jù)所示的Gd(DOTA)。在該實驗中，Gd(DOTEP)和Gd(DOTA)溶在0.1MHCl中，它們分解成游離Gd3+和游離配位體并隨后進(jìn)行水松馳測量。如示，兩種絡(luò)合物在強酸中分解的半存留期(half-lives)對Gd(DOTA)大約是110小時，對Gd(DOTEP)是30小時。這表明在PH為7.4時兩個絡(luò)合物的分解速度比這(大約106小時)要大幾個數(shù)量級，因而用于人體是十分安全的。
實施例3 多氮大環(huán)N-烷基膦酸鹽或膦酸酐NOTPME-AC的合成[NOTPME-AC是1，4，7-三氮環(huán)壬烷-N，N′N”-三(亞甲基膦酸單乙酯乙酸酐)將NOTPME三鈉鹽(178.63mg，0.318mM)溶在4.0ml無水氯仿中(新從過量P4O10中蒸餾的)，加入120毫升乙酰氯。溶液在密閉容器中于室溫攪拌24小時。然后在干燥氮氣氛下將溶液蒸發(fā)成黃色的非常粘的油。向該油加無水乙醚，濾出NOTPME-AC(以氯化鈉加合物形式沉淀)，在干燥氮氣下于35原子上。
實施例2四氮大環(huán)化合物DOTEP的合成圖7顯示的DOTEP制備如下。將2ml二氯乙基膦慢慢地與冰混和，生成相應(yīng)的乙次膦酸。暖到室溫后加入390mg的1，4，7，10-四氮環(huán)十二烷的鹽酸鹽(亞環(huán)基四鹽酸)(Parrish化學(xué)公司，Ogden，Utah)，在氮氣氛下將混合物加熱至沸。將溶在10m16M HCl中的含157mg多聚甲醛溶液以0.5ml/hr的速度加入混合物中，同時繼續(xù)進(jìn)行回流。將最終混合物另外回流4小時，然后冷卻到室溫。真空下濃縮溶液成粘狀油，用6ml水再溶解，放進(jìn)Dowex50W×4(氫形式)型陽離子交換柱(床容積7.5ml)。用水將交換柱洗滌到中性，再用60ml 0.66M HCl洗脫產(chǎn)物。含有DOTEP的餾分被結(jié)合，將其蒸發(fā)，用無水乙醇再溶解后蒸發(fā)成白色固體。在無水乙醚中分散該固體，過濾，氮氣下予干燥后于60-70℃真空干燥得白色非常吸潮的固體(360mg，產(chǎn)率44％)。該固體要封在安瓿內(nèi)貯存。元素分析和電位滴定表明它是DOTEP·2H2O。DOTEP的應(yīng)用A.Ca(DOTEP)作[Ca2+]游離的31P NMR指示劑圖9所示31P的譜圖是含大約1mMCa2+和3mMDOTEP于生理PH時水溶液所得的。顯然，游離的和結(jié)合形式的DOTEP的31P共振具有各自清楚的化學(xué)漂移，兩者與組織內(nèi)觀察到的正常代謝物的31P共振都不重疊。這表明以制備合適的水解酯方式將DOTEP載入細(xì)胞時，使用簡單的關(guān)系式使細(xì)胞內(nèi)俘獲的NOTEP直接給出[Ca2+]游離的測量，新鮮的全血放入抗凝試管中，在3000g條件下離心分離3分鐘，除去血沉棕黃色層。然后將(離心機)甩密的血紅細(xì)胞用PH＝7.4的磷酸鹽生理鹽水5mM洗滌三次。在含有負(fù)荷介質(zhì)的NOTPME衍生物中懸浮50％壓積細(xì)胞的血紅細(xì)胞。負(fù)荷介質(zhì)含有130mM NaCl，5mMNOTPME衍生物(苯甲?；蛞阴；苌?，1mM腺嘌呤，10mM葡萄糖和10mM HEPES，PH＝7.4。上述負(fù)荷介質(zhì)中的紅細(xì)胞于25℃培育1小時。在負(fù)荷步驟期間沒有觀察到血紅細(xì)胞的溶解。用NOTPME衍生物載荷1小時后，離心分離紅細(xì)胞懸浮液并丟棄上清液。在以等滲壓的鹽水懸浮前將紅細(xì)胞用PH＝7.4的5mM磷酸鹽生理鹽水洗滌兩次，以用于NMR測量。31PNMR測量表明這些NOTPME的衍生物已載入紅細(xì)胞內(nèi)并水解成NOTPME。NMR測量后將樣品離心分離，分析上清液中殘留NOTPME。在NMR測量的歷時期間內(nèi)沒有觀察到殘留的NOTPME。因此，十分清楚，這些NOTPME衍生物進(jìn)入了紅細(xì)胞，并已水解成NOTPME留存在紅細(xì)胞內(nèi)。
實施例4 予言合成同屬的多氮大環(huán)N-烷基膦酸鹽，多氮大環(huán)N-烷基膦類或其酸酐有機合成化學(xué)領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可將實施例1，2和3的步驟很容易地適用于各種適宜的穩(wěn)定的多氮大環(huán)化合物。適宜的多氮大環(huán)化合物包括下列三氮和四氮大環(huán)化合物，并在Aldrich化學(xué)公司(Milwaukee，Wisconsin)有售1，5，9-三氮環(huán)十二烷(見圖10)；1，4，8，12-四氮環(huán)十五烷(見圖11)；和1，4，8，11-四氮環(huán)十四烷(見圖12)。
下列引證文獻(xiàn)此處結(jié)合參照，引證緣由不言而喻。
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權(quán)利要求
1.一種合成1，4，7-三氮環(huán)壬烷-N，N′，N″-三(亞甲基磷酸單乙酯)(NOTPME)的方法，該方法包括下列步驟(1)使1，4，7-三氮環(huán)壬烷、亞磷酸二乙酯和無水多聚甲醛反應(yīng)形成1，4，7-三氮環(huán)壬烷-N，N′，N″-三(亞甲基磷酸二乙酯)；(2)使該產(chǎn)物與氫氧化鈉反應(yīng)直至產(chǎn)生清液，然后結(jié)晶得到1，4，7-三氮環(huán)壬烷-N，N′，N″-三(亞甲基磷酸單乙酯)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的多氮大環(huán)化合物或其鹽及其用途。化合物的化學(xué)式為(右式),其中X是2,3或P
文檔編號C07F9/6515GK1193625SQ96122080
公開日1998年9月23日 申請日期1996年10月31日 優(yōu)先權(quán)日1984年10月18日
發(fā)明者舍利·A·狄恩, 伊凡·拉薩爾, 拉·拉韋山德蘭, 布·艾爾諾 申請人:德克薩斯州立大學(xué)董事會