一種沃尼妙林卵黃抗體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種沃尼妙林卵黃抗體的制備方法。本發(fā)明公開一種制備沃尼妙林卵黃抗體的方法，包括如下步驟：通過碳二亞胺將鹽酸沃尼妙林與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，得到免疫原；用免疫原免疫蛋雞，得到免疫蛋雞的雞卵；提取雞卵卵黃中的沃尼妙林卵黃抗體。利用本發(fā)明公開的方法制備沃尼妙林抗體具有制備過程簡單、經(jīng)濟(jì)，產(chǎn)量高等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，在獸藥殘留檢測中具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種沃尼妙林卵黃抗體的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種沃尼妙林抗體的制備方法；特別涉及一種沃尼妙林卵黃抗體的制 備方法，屬于抗體制備領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 沃尼妙林（Valnemulin，VAL)為新一代截短側(cè)耳類（Pleuromutilin)半合成抗生 素，具有安全性較高、抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、耐藥性低等特點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注，目前該藥主 要用于畜禽支原體及腸道螺旋體感染的預(yù)防與治療。但是由于應(yīng)用比較廣泛，其在動(dòng)物組 織內(nèi)的殘留現(xiàn)象較為嚴(yán)重，可能會(huì)引起一些不良反應(yīng)，此外，沃尼妙林還可以與聚醚類藥物 作用導(dǎo)致動(dòng)物中毒。因此，歐洲醫(yī)藥評價(jià)局（EMEA)規(guī)定，沃尼妙林在豬組織中的最大殘留 限量（MRL):肌肉，50 iig/kg;肝臟，500 iig/kg;腎臟，IOOii g/kg。
[0003] 卵黃抗體（Egg yolk antibody)是從免疫禽蛋卵黃中提取的特異性抗體，為禽類 所特有，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，生產(chǎn)制備過程簡單、經(jīng)濟(jì)，產(chǎn)量高，適合大規(guī)模生產(chǎn)。制備卵黃抗 體時(shí)無需對動(dòng)物進(jìn)行采血，便于采集，不會(huì)對動(dòng)物造成損傷，符合現(xiàn)代動(dòng)物保護(hù)要求。但是 目前卵黃抗體在獸藥殘留檢測領(lǐng)域應(yīng)用較少，并且未見沃尼妙林卵黃抗體制備的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種沃尼妙林卵黃抗體的制備方法。
[0005] 本發(fā)明提供一種制備沃尼妙林卵黃抗體的方法，包括如下步驟：通過碳二亞胺將 鹽酸沃尼妙林與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，得到免疫原；用免疫原免疫蛋雞，得到免疫蛋雞的雞 卵；提取雞卵卵黃中的沃尼妙林卵黃抗體。
[0006] 上述方法中，所述載體蛋白為牛血清白蛋白。
[0007] 上述任一所述的方法中，所述用免疫原免疫蛋雞的方法如下：將所述免疫原用等 體積的弗氏完全佐劑乳化后首次免疫蛋雞，再將首次免疫中所用的免疫原劑量減半，并用 等體積的弗氏不完全佐劑乳化后對首次免疫的蛋雞進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
[0008] 上述任一所述的方法中，所述免疫的方式為背部多點(diǎn)免疫。
[0009] 上述任一所述的方法中，所述免疫原用PBS溶液溶解；
[0010] 所述PBS溶液的濃度具體為0? 01mol/L。
[0011] 上述任一所述的方法中，所述首次免疫的所述免疫原的劑量為300-400ug ;
[0012] 所述加強(qiáng)免疫的次數(shù)為7-8次，具體為7次；
[0013] 所述加強(qiáng)免疫具體為在首次免疫后第15天、29天、43天、55天、79天、91天以及 121天各進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫。
[0014] 上述任一所述的方法中，所述提取雞卵卵黃中的沃尼妙林卵黃抗體的方法為飽和 硫酸銨沉淀法，步驟如下：
[0015] 1)將免疫蛋雞的雞卵中的卵黃與純水混勻，調(diào)節(jié)pH至5. 0-5. 2,放置，得溶液1 ;
[0016] 2)將溶液1離心，收集上清，加入pH7. 2-7. 4的飽和（NH4) 2S04水溶液，使飽和 (NH4) 2S04水溶液的體積占總體積的30-40%，放置，得溶液2 ;
[0017] 3)將溶液2離心，取沉淀即得。
[0018] 上述任一所述的方法中，所述卵黃和所述純水的體積比為1:5-6,具體為1:6 ;
[0019] 所述放置的條件為4°C -KTC放置12-20h，具體為4°C放置12-20h ;
[0020] 所述飽和（NH4) 2S04水溶液占總體積的體積百分含量為40% ;
[0021] 所述調(diào)節(jié)pH至5. 0-5. 2所用的試劑為鹽酸。
[0022] 由上述任一所述的方法制備得到的沃尼妙林抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0023] 上述沃尼妙林抗體在制備具有結(jié)合沃尼妙林的活性的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍；
[0024] 或，
[0025] 上述沃尼妙林抗體在制備檢測沃尼妙林的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
[0026] 本發(fā)明的有益效果在于，利用本發(fā)明提供的方法制備的沃尼妙林抗體產(chǎn)量高，在 整個(gè)試驗(yàn)周期（43周）內(nèi)收集卵黃抗體的量大約為20g。在免疫后前10周，抗體效價(jià)上升 速度較快，然后慢慢趨向穩(wěn)定，抗體效價(jià)可在一個(gè)較高的水平維持15周以上，并且抗體的 最高效價(jià)達(dá)1 :218?？贵w靈敏度較高，隨著免疫的進(jìn)行，各抗體靈敏度不斷提高，所制標(biāo)準(zhǔn) 曲線的IC5tl逐漸下降，并且最低可降至21. 77ng/mL?？贵w特異性良好，除與泰妙菌素存在 383. 9%的交叉反應(yīng)率外，與其它結(jié)構(gòu)相似的抗生素類藥物均不存在顯著的交叉反應(yīng)。
[0027] 利用本發(fā)明提供的方法制備沃尼妙林抗體具有制備過程簡單、經(jīng)濟(jì)，產(chǎn)量高等獨(dú) 特優(yōu)點(diǎn)，在獸藥殘留檢測中具有良好的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1為沃尼妙林免疫原結(jié)構(gòu)圖。
[0029] 圖2為沃尼妙林卵黃抗體效價(jià)變化趨勢圖。
[0030] 圖3為沃尼妙林卵黃抗體靈敏度變化趨勢圖。

【具體實(shí)施方式】
[0031] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0032] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0033] 鹽酸沃尼妙林標(biāo)準(zhǔn)品購自歐洲藥典委員會(huì)BP907-F67029，產(chǎn)品目錄號為 Y0000584。
[0034] 泰妙菌素標(biāo)準(zhǔn)品購自歐洲藥典委員會(huì)BP907-F67029。
[0035] 紅霉素和阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品均購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。
[0036] 替米考星和泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品均購自中國獸藥監(jiān)察所。
[0037] 弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號分別為F-5881和 F-5506。
[0038] 蛋雞購自北京市西苑農(nóng)貿(mào)市場
[0039] Proclin 300生物防腐劑購自sigma公司
[0040] 〇? 05M的碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)的組成成分及含量為：

【權(quán)利要求】
1. 一種制備沃尼妙林卵黃抗體的方法，包括如下步驟：通過碳二亞胺將鹽酸沃尼妙林 與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，得到免疫原；用免疫原免疫蛋雞，得到免疫蛋雞的雞卵；提取雞卵卵 黃中的沃尼妙林卵黃抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述載體蛋白為牛血清白蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述用免疫原免疫蛋雞的方法如下： 將所述免疫原用等體積的弗氏完全佐劑乳化后首次免疫蛋雞，再將首次免疫中所用的免疫 原劑量減半，并用等體積的弗氏不完全佐劑乳化后對首次免疫的蛋雞進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述免疫的方式為背部多點(diǎn)免疫。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述免疫原用PBS溶液溶解； 所述PBS溶液的濃度具體為0. Olmol/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述首次免疫的所述免疫原的劑 量為 300-400ug ; 所述加強(qiáng)免疫的次數(shù)為7-8次，具體為7次。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述提取雞卵卵黃中的沃尼妙林 卵黃抗體的方法為飽和硫酸銨沉淀法，步驟如下： 1) 將免疫蛋雞的雞卵中的卵黃與純水混勻，調(diào)節(jié)pH至5. 0-5. 2,放置，得溶液1 ; 2) 將溶液1離心，收集上清，加入pH 7. 2-7. 4的飽和（NH4) 2S04水溶液，使飽和 (NH4) 2S04水溶液的體積占總體積的30-40%，放置，得溶液2 ; 3) 將溶液2離心，取沉淀即得。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述卵黃和所述純水的體積比為 1:5-6,具體為 1:6 ; 所述放置的條件為4°C -10°C放置12-20h，具體為4°C放置12-20h ; 所述飽和（NH4) 2S04水溶液占總體積的體積百分含量為40%。
9. 由權(quán)利要求1-8任一所述的方法制備得到的沃尼妙林抗體。
10. 權(quán)利要求9所述的沃尼妙林抗體在制備具有結(jié)合沃尼妙林的活性的產(chǎn)品中的應(yīng) 用； 或， 權(quán)利要求9所述的沃尼妙林抗體在制備檢測沃尼妙林的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K1/30GK104277107SQ201410535384
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月11日
【發(fā)明者】王戰(zhàn)輝, 沈建忠, 史為民, 張素霞, 江海洋, 溫凱, 張會(huì)艷, 盛雅潔 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)