一種川芎內(nèi)酯的分離制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高純度川芎內(nèi)酯的分離制備方法，其利用高速逆流色譜技術(shù)，包括如下步驟：川芎用溶劑提取得到川芎提取物浸膏；川芎提取物浸膏用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯部分；乙酸乙酯部分采用高速逆流色譜法同時(shí)分離得到多個(gè)川芎內(nèi)酯類化合物，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定分別為洋川芎內(nèi)酯N、洋川芎內(nèi)酯R、洋川芎內(nèi)酯S和洋川芎內(nèi)酯I，純度達(dá)98％以上。本發(fā)明的川芎內(nèi)酯的分離制備方法具有操作簡(jiǎn)單，溶劑用量少，無樣品吸附、損失和污染，效率高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種川芎內(nèi)酯的分離制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥提取分離【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種川芎內(nèi)酯的分離制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]川彎是傘形科蒿本屬植物川彎(LigusticumchuanxiongHort.)的根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性溫，味辛。微苦，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛功效；主治血瘀氣滯所致月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)經(jīng)閉，肝郁氣滯而致血行不暢的胸脅疼痛、頭痛、風(fēng)寒濕痹、跌打腫痛等。川芎中主要含有川芎內(nèi)酯類、生物堿和有機(jī)酸類等化學(xué)成分，其中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明川芎藥材能夠進(jìn)入大鼠血漿中的主要成分是川芎內(nèi)酯類化合物和阿魏酸，而阿魏酸廣泛存在于植物界，并不是川芎的特征性成分。而川芎內(nèi)酯類化合物的藥理作用研究與川芎傳統(tǒng)應(yīng)用的臨床效果一致，所以川芎內(nèi)酯類化合物是川芎的特征性成分和主要有效成分。故近年來對(duì)川芎中川芎內(nèi)酯的分離及藥理作用研究越來越多。
[0003]目前，從川芎中分離川芎內(nèi)酯主要采用組合色譜法(包括反復(fù)硅膠柱色譜、半制備高效液相色譜法)、高速逆流色譜法等方法進(jìn)行分離純化。國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)川芎中內(nèi)酯類化學(xué)成分進(jìn)行了研究，王普善等從 川芎中分得藁本內(nèi)酯、新川芎內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯、3-丁基苯酞、3-亞丁基苯酞。北京制藥工藝研究所的研究人員分離得到4-羥基-3-丁基苯酞，SP川彎酹(chuanxiongol)。溫月筌等分離得到3-丁基-3-羥基-4，5-二氫苯酞。王文祥等從川芎中首次分離得到4，7- 二羥基-3- 丁基苯酞。NatioTakashi等先后從川芎中分離得到洋川芎內(nèi)酯B, C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，J，M，N，O, P，Q，R，S。KobayashiM等從中分得洋川芎內(nèi)酯K、L。Kaouadji等從川芎中分得藁本內(nèi)酯二醇。肖永慶等分離得到Z，Z’_6，6’，7，3’ α - 二聚藁本內(nèi)酯、Ζ-6, 8，，7，3’ - 二聚藁本內(nèi)酯、V -3, 8- 二氫-6，6’，7，3’ α - 二聚藁本內(nèi)酯。金燈萍等先從川芎中提取揮發(fā)油，然后用反復(fù)硅膠柱色譜法進(jìn)行分離，得到蒿本內(nèi)酯純品。文章“應(yīng)用高速逆流一次性分離川芎中的蛇床內(nèi)酯A和Z-蒿本內(nèi)酯”，作者應(yīng)用高速逆流色譜技術(shù)分離川芎中內(nèi)酯類成分，結(jié)果得到了蛇床內(nèi)酯A和Z-蒿本內(nèi)酯兩個(gè)單體。上述分離方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，組合色譜法不僅操作復(fù)雜，溶劑用量大，而且在分離過程中有吸附、損失和污染等現(xiàn)象，使整個(gè)分離過程效率不高。
[0004]高速逆流色譜(High-SpeedCounter-CurrentChromatography，HSCCC)是近幾十年來發(fā)展起來的液-液色譜分離技術(shù)，利用溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同，將不同物質(zhì)進(jìn)行有效分離。此項(xiàng)技術(shù)不需要固相載體，只需要被分離物在兩相中分配，避免了固相載體帶來的大量樣品吸附、損失與污染等問題，樣品回收率高，預(yù)處理及后處理都簡(jiǎn)單易行，已廣泛應(yīng)用于分離。與其它分離方法相比，它不使用固相載體作固定相，能采用不同的溶劑系統(tǒng)和正反相洗脫方式，克服了固相載體帶來的樣品吸附、損失、污染、峰形拖尾等缺點(diǎn)。HSCCC可采用不同物化特性的溶劑體系和多樣性的操作條件，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，為從復(fù)雜的天然產(chǎn)物粗制品中提取不同特性(如不同極性)的有效成分提供了有利條件。
[0005]劉雯等應(yīng)用高速逆流色譜法一次性分離)I丨芎中的蛇床內(nèi)酯A和Z-蒿本內(nèi)酯，稱取川芎生藥材100g，粉碎成細(xì)粉，加入600mL乙醇，加熱回流提取，提取3次，每次2h，過濾，減壓蒸干，得39g棕黃色浸膏備用。根據(jù)分配系數(shù)測(cè)定的結(jié)果，兩相溶劑系統(tǒng)采用正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(1: 1:1:1)，臨用前分開上下相，超聲30min。以溶劑系統(tǒng)的上相為固定相，下相為流動(dòng)相，以9mL/min的流速將上相泵入管路，待固定相充滿整個(gè)管路后，停泵，啟動(dòng)主機(jī)，把轉(zhuǎn)速調(diào)至892RPM，然后以1.2mL/min的流速泵入流動(dòng)相。當(dāng)上下相平衡時(shí)，記錄固定相流出的體積，計(jì)算得到固定相保留值0.53。供試品IOOmg溶解于50mL流動(dòng)相,濃度為10mg/mL，進(jìn)樣量為10mL，以1.2mL/min的流速泵入流動(dòng)相。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，根據(jù)紫外檢測(cè)譜圖，收集各峰的組分，將各峰對(duì)應(yīng)的收集液分別濃縮，干燥。用HPLC及TLC檢測(cè)。
[0006]中國(guó)發(fā)明專利第200810208206.8號(hào)公開了一種高純度Z-蒿本內(nèi)酯和蛇床內(nèi)酯A的制備方法，其采用高速逆流色譜技術(shù)，制備川芎或當(dāng)歸粗提物作為進(jìn)樣物；配制構(gòu)成固定相和流動(dòng)相同時(shí)泵入柱內(nèi)，再轉(zhuǎn)主機(jī)；由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；根據(jù)檢測(cè)器圖譜接收目標(biāo)成分，經(jīng)分離后可得到Z蒿本內(nèi)酯和蛇床內(nèi)酯A。
[0007]目前川芎中川芎內(nèi)酯類成分的分離方法主要有組合色譜法，包括反復(fù)硅膠柱層析、ODS柱層析、Sephadex-LH20柱色譜、制備薄層色譜、半制備高效液相色譜等方法,這些方法不僅操作復(fù)雜，溶劑用量大，而且在分離過程中有吸附、損失和污染等現(xiàn)象，使整個(gè)分離過程效率不高。分離方法還有高速逆流色譜方法，其中劉雯等應(yīng)用高速逆流色譜法分離到川芎中的Z-藁本內(nèi)酯和蛇床內(nèi)酯A。利用高速逆流色譜法同時(shí)分離洋川芎內(nèi)酯N、洋川芎內(nèi)酯R、洋川芎內(nèi)酯S和洋川芎內(nèi)酯I多種川芎內(nèi)酯的方法未見報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對(duì)以上問題，本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單，溶劑用量少，無樣品吸附、損失和污染，效率高的川彎內(nèi)酯的分離方法。高速逆流色譜(High-SpeedCounter-CurrentChromatography, HSCCC)利用溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同,將不同物質(zhì)進(jìn)行有效分離。此項(xiàng)技術(shù)不需要固相載體，只需要被分離物在兩相中分配，避免了固相載體帶來的大量樣品吸附、損失與污染等問題，樣品回收率高，預(yù)處理及后處理都簡(jiǎn)單易行，與其它分離方法相比，它不使用固相載體作固定相，能采用不同的溶劑系統(tǒng)和正反相洗脫方式，克服了固相載體帶來的樣品吸附、損失、污染、峰形拖尾等缺點(diǎn)。
[0009]本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0010]本發(fā)明的川芎內(nèi)酯的分離制備方法的具體步驟如下:
[0011](I)川芎提取物的制備:
[0012]稱取川芎，然后加入5-12倍體積的溶劑，提取，靜置，過濾，藥渣用上述方法再提取2次，合并提取液，然后在水浴中減壓蒸餾回收溶劑，制得川芎提取物浸膏，川芎提取物浸膏用水分散，再用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物；
[0013](2)高速逆流色譜法分離制備川芎內(nèi)酯:
[0014]兩相溶劑系統(tǒng)由A、B、C、D四個(gè)組分組成，A組分為烷烴，B組分為脂肪酯或醚，C組份為脂肪醇或脂肪酮，D組分為水，所述的烷烴為正己烷或環(huán)己烷，所述的脂肪酯為乙酸乙酯或乙酸甲酯，所述的醚為乙醚或石油醚，所述的脂肪醇為甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇；所述脂肪酮為丙酮，所述體系A(chǔ)、B、C、D四個(gè)組分的體積比依次為3-5:3-6:4_6:5_6，將該溶劑系統(tǒng)混勻靜置后，分開上下相，超聲20-40min，溶劑系統(tǒng)的上相為固定相，下相為流動(dòng)相，以2-40ml/min的流速將上相泵入管路，待固定相充滿整個(gè)管路后，停泵，啟動(dòng)主機(jī)，然后以
0.6-3ml/min的流速泵入流動(dòng)相，當(dāng)上下相平衡時(shí)，記錄固定相流出的體積，計(jì)算得到固定相的保留值，取步驟(1)制備的乙酸乙酯萃取物，溶解于固定相中，進(jìn)樣，根據(jù)檢測(cè)器檢測(cè)譜圖，收集各峰的組分，將各峰對(duì)應(yīng)的收集液分別濃縮，干燥。
[0015]步驟(1)中所述的提取方法為加熱回流提取、閃式提取或者超聲提取。
[0016]步驟(1)中所述的提取溶劑為甲醇、乙醇、水或者其混合物。
[0017]步驟⑵中所述的A組分為正己烷，B組分為乙酸乙酯，C組分為乙醇，D組分為水。
[0018]步驟⑵中所述的A組分為環(huán)己烷，B組分為石油醚，C組分為乙醇，D組分為水。
[0019]步驟⑵中，兩相溶劑系統(tǒng)采用正己烷:乙酸乙酯:乙醇:水體積比為4.5:5.5:4:6。
[0020]步驟⑵中，兩相溶劑系統(tǒng)采用正己烷:乙酸乙酯:乙醇:水體積比為4.5:5.5:4:6。
[0021]步驟(2)中，兩相溶劑系統(tǒng)臨用前分開上下相，超聲30min，以溶劑系統(tǒng)的上相為固定相，下相為流動(dòng)相，以30ml/min的流速將上相泵入管路，待固定相充滿整個(gè)管路后，停泵，啟動(dòng)主機(jī)，把轉(zhuǎn)速調(diào)到892.5r/min，然后以1.2ml/min的流速泵入流動(dòng)相，進(jìn)樣量為20ml，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，根據(jù)紫外檢測(cè)譜圖，收集各峰的組分，將各峰對(duì)應(yīng)的收集液分別濃縮，干燥。
[0022]本發(fā)明的積極效果如下:
[0023]本發(fā)明的川芎內(nèi)酯的分離制備方法具有操作簡(jiǎn)單，溶劑用量少，無樣品吸附、損失和污染，效率高等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的川芎內(nèi)酯的分離制備方法可一次性分離得到4個(gè)川芎內(nèi)酯類化合物，經(jīng)檢測(cè)純度達(dá)98%以上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是本發(fā)明制備的川芎內(nèi)酯化合物的紫外檢測(cè)圖譜。
[0025]1-川芎內(nèi)酯N、2_洋川芎內(nèi)酯R、3_洋川芎內(nèi)酯S、4_洋川芎內(nèi)酯I。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0027]實(shí)施例1
[0028](I)川芎提取物的制備:
[0029]稱取川芎，然后加入5倍體積的乙醇，加熱回流提取lh，靜置，過濾，藥渣用上述方法再提取2次，合并提取液，然后在水浴中減壓蒸餾回收溶劑，制得川芎提取物浸膏，川芎提取物浸膏用7倍體積的水分散，再用乙酸乙酯萃取5次，得到乙酸乙酯萃取物；
[0030](2)高速逆流 色譜法分離制備川芎內(nèi)酯:
[0031]兩相溶劑系統(tǒng)采用正己烷:乙酸乙酯:乙醇:水體積比為4:5:4:5，臨用前分開上下相，超聲20min，以溶劑系統(tǒng)的上相為固定相，下相為流動(dòng)相，以20ml/min的流速將上相泵入管路，待固定相充滿整個(gè)管路后，停泵，啟動(dòng)主機(jī)，把轉(zhuǎn)速調(diào)到860r/min,然后以Iml/min的流速泵入流動(dòng)相，當(dāng)上下相平衡時(shí)，記錄固定相流出的體積，計(jì)算得到固定相的保留值，取步驟(1)制備的乙酸乙酯萃取物，溶解于固定相中，進(jìn)樣量為20ml，以lml/min流速泵入流動(dòng)相，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，根據(jù)紫外檢測(cè)譜圖，收集各峰的組分，將各峰對(duì)應(yīng)的收集液分別濃縮，干燥。
[0032]實(shí)施例2
[0033](I)川芎提取物的制備:
[0034]稱取川芎，然后加入12倍體積的乙醇，加熱回流提取3h，靜置，過濾，藥渣用上述方法再提取2次，合并提取液，然后在水浴中減壓蒸餾回收溶劑，制得川芎提取物浸膏，川芎提取物浸膏用13倍體積的水分散，再用乙酸乙酯萃取5次，得到乙酸乙酯萃取物；
[0035](2)高速逆流色譜法分離制備川芎內(nèi)酯:
[0036]兩相溶劑系統(tǒng)采用環(huán)己烷:乙酸乙酯:乙醇:水體積比為5:6:5:6，臨用前分開上下相，超聲40min，以溶劑系統(tǒng)的上相為固定相，下相為流動(dòng)相，以40ml/min的流速將上相泵入管路，待固定相充滿整個(gè)管路后，停泵，啟動(dòng)主機(jī)，把轉(zhuǎn)速調(diào)到950r/min，然后以
1.5ml/min的流速泵入流動(dòng)相，當(dāng)上下相平衡時(shí)，記錄固定相流出的體積，計(jì)算得到固定相的保留值，取步驟(1)制備的乙酸乙酯萃取物，溶解于固定相中，進(jìn)樣量為20ml，以1.5ml/min流速泵入流動(dòng)相， 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，根據(jù)紫外檢測(cè)譜圖，收集各峰的組分，將各峰對(duì)應(yīng)的收集液分別濃縮，干燥。
[0037]實(shí)施例3
[0038](I)川芎提取物的制備
[0039]取川芎藥材lOOOg，加入按藥材8倍體積的95%乙醇，加熱回流提取2小時(shí)，靜置，濾過；藥渣用同樣方法再提取2次，合并提取液，85°C水浴減壓回收溶劑，得川芎提取物浸膏；川芎提取物浸膏用10倍體積水分散后，用乙酸乙酯萃取5次，即得乙酸乙酯萃取物作為供試品。
[0040](2)高速逆流色譜法(HSCCC)分離制備川芎內(nèi)酯
[0041]根據(jù)分配系數(shù)測(cè)定的結(jié)果，兩相溶劑系統(tǒng)采用環(huán)己烷:石油醚:乙醇:水(4.5:
5.5:4:6)，臨用前分開上下相，超聲30min。以溶劑系統(tǒng)的上相為固定相，下相為流動(dòng)相，以30ml/min的流速將上相泵入管路，待固定相充滿整個(gè)管路后，停泵，啟動(dòng)主機(jī)，把轉(zhuǎn)速調(diào)到892.5r/min,然后以1.2ml/min的流速泵入流動(dòng)相。當(dāng)上下相平衡時(shí)，記錄固定相流出的體積，計(jì)算得到固定相的保留值0.68。取供試品0.5921g溶解于20ml固定相中，進(jìn)樣量為20ml，以1.2ml/min流速泵入流動(dòng)相。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，根據(jù)紫外檢測(cè)譜圖，收集各峰的組分，將各峰對(duì)應(yīng)的收集液分別濃縮，干燥。
[0042](3)川芎內(nèi)酯結(jié)構(gòu)鑒定
[0043]紫外檢測(cè)圖譜如圖1所示，分別為洋川芎內(nèi)酯N、洋川芎內(nèi)酯R、洋川芎內(nèi)酯S和洋川芎內(nèi)酯I，結(jié)構(gòu)式如下:
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種川芎內(nèi)酯的分離制備方法，其特征在于:所述方法的具體步驟如下: (1)川芎提取物的制備: 稱取川芎，然后加入5-12倍體積的溶劑，提取，靜置，過濾，藥渣用上述方法再提取2次，合并提取液，然后在水浴中減壓蒸餾回收溶劑，制得川芎提取物浸膏，川芎提取物浸膏用水分散，再用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物； (2)高速逆流色譜法分離制備川芎內(nèi)酯: 兩相溶劑系統(tǒng)由A、B、C、D四個(gè)組分組成，A組分為烷烴，B組分為脂肪酯或醚，C組份為脂肪醇或脂肪酮，D組分為水，所述的烷烴為正己烷或環(huán)己烷，所述的脂肪酯為乙酸乙酯或乙酸甲酯，所述的醚為乙醚或石油醚，所述的脂肪醇為甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇；所述脂肪酮為丙酮，所述體系A(chǔ)、B、C、D四個(gè)組分的體積比依次為3-5:3-6:4_6:5_6，將該溶劑系統(tǒng)混勻靜置后，分開上下相，超聲20-40min，溶劑系統(tǒng)的上相為固定相，下相為流動(dòng)相，以2-40ml/min的 流速將上相泵入管路，待固定相充滿整個(gè)管路后，停泵，啟動(dòng)主機(jī)，然后以0.6-3ml/min的流速泵入流動(dòng)相，當(dāng)上下相平衡時(shí)，記錄固定相流出的體積，計(jì)算得到固定相的保留值，取步驟(1)制備的乙酸乙酯萃取物，溶解于固定相中，進(jìn)樣，根據(jù)檢測(cè)器檢測(cè)譜圖，收集各峰的組分，將各峰對(duì)應(yīng)的收集液分別濃縮，干燥。
2.如權(quán)利要求1所述的川芎內(nèi)酯的分離制備方法，其特征在于:步驟(1)中所述的提取方法為加熱回流提取、閃式提取或者超聲提取。
3.如權(quán)利要求1所述的川芎內(nèi)酯的分離制備方法，其特征在于:步驟(1)中所述的提取溶劑為甲醇、乙醇、水或者其混合物。
4.如權(quán)利要求1所述的川芎內(nèi)酯的分離制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述的A組分為正己烷，B組分為乙酸乙酯，C組分為乙醇，D組分為水。
5.如權(quán)利要求1所述的川芎內(nèi)酯的分離制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述的A組分為環(huán)己烷，B組分為石油醚，C組分為乙醇，D組分為水。
6.如權(quán)利要求4所述的川芎內(nèi)酯的分離制備方法，其特征在于:步驟(2)中，兩相溶劑系統(tǒng)采用正己烷:乙酸乙酯:乙醇:水體積比為4.5:5.5:4:6。
7.如權(quán)利要求5所述的川芎內(nèi)酯的分離制備方法，其特征在于:步驟(2)中，兩相溶劑系統(tǒng)采用正己烷:乙酸乙酯:乙醇:水體積比為4.5:5.5:4:6。
8.如權(quán)利要求1所述的川芎內(nèi)酯的分離制備方法，其特征在于:步驟(2)中，兩相溶劑系統(tǒng)臨用前分開上下相，超聲30min，以溶劑系統(tǒng)的上相為固定相，下相為流動(dòng)相，以.30ml/min的流速將上相泵入管路，待固定相充滿整個(gè)管路后，停泵，啟動(dòng)主機(jī)，把轉(zhuǎn)速調(diào)到.892.5r/min，然后以1.2ml/min的流速泵入流動(dòng)相，進(jìn)樣量為20ml，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，根據(jù)紫外檢測(cè)譜圖，收集各峰的組分，將各峰對(duì)應(yīng)的收集液分別濃縮，干燥。
【文檔編號(hào)】C07D307/88GK104003963SQ201410238826
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月30日
【發(fā)明者】劉向前, 鄒親朋, 戴玲, 潘燁 申請(qǐng)人:長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)博海生物科技有限公司