一種多手段協(xié)同提取大分子活性膠原蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多手段協(xié)同提取大分子活性膠原蛋白的方法，包括以下步驟：1）新鮮魚皮的預處理；2）活性膠原蛋白的提?。簩㈩A處理的魚皮投入去離子水中，加入如0.5～1.0M的乙酸，在冰浴條件下，進行超聲1；然后加入復合蛋白酶，酶解5～8h，離心處理后取上清液，得到膠原蛋白溶液；3）活性膠原蛋白的純化：將上述膠原蛋白溶液進行鹽析和沉淀后，得到的沉淀再次用乙酸溶解，離心并取上清液，并進行脫鹽處理，最后得到濃度為20～50%的大分子活性膠原蛋白溶液。本發(fā)明通過超聲波、乙酸和復合酶的協(xié)同作用提取膠原蛋白，并綜合運用鹽析、透析和超濾技術(shù)制得大分子活性膠原蛋白溶液，并能穩(wěn)定存在。
【專利說明】一種多手段協(xié)同提取大分子活性膠原蛋白的方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于生物化學領(lǐng)域，尤其涉及膠原蛋白的提取方法。

【背景技術(shù)】
[0003]膠原蛋白是具有獨特結(jié)構(gòu)的一族蛋白質(zhì)，廣泛存在于哺乳動物組織中，約占總蛋白質(zhì)的30%以上。膠原蛋白為骨、皮膚、肌腱和韌帶提供生物力學性能、控制發(fā)育中的細胞基因表型。膠原蛋白的結(jié)構(gòu)呈三股螺旋結(jié)構(gòu)，由三條多肽鏈組成，每一條膠原鏈都是左手螺旋構(gòu)型，三條左手螺旋α-鏈又互相纏成右手螺旋結(jié)構(gòu)一即超螺旋結(jié)構(gòu)。單個α-鏈含有至少一個Gly-X-Y序列。每三個氨基酸就有一個甘氨酸殘基。膠原蛋白的特有結(jié)構(gòu)和化學組成使其具有許多獨特性質(zhì)和功能。這些性質(zhì)和功能使其在各個領(lǐng)域得到了廣泛應用，如生物醫(yī)學材料、藥物輸送載體、組織工程、化妝品和食品等領(lǐng)域。
[0004]目前，國內(nèi)活性膠原蛋白雖有科研單位進行了研究和開發(fā)，并有一些活性膠原蛋白提取工藝方面的專利與報道，但目前離產(chǎn)業(yè)化水平仍有一定差距，只限于少數(shù)幾家公司能夠進行中試或小規(guī)模試生產(chǎn)。由于活性膠原蛋白產(chǎn)業(yè)化水平較低，限制了它的下游產(chǎn)品開發(fā)與應用。目前，活性膠原蛋白在保健食品、化妝品領(lǐng)域中的應用有大量報道和銷售，但對于醫(yī)用級大分子量活性膠原蛋白的提取技術(shù)僅處于小規(guī)模水平。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:針對上述現(xiàn)有存在的問題和不足，本發(fā)明的目的是提供了一種大分子活性膠原蛋白的制備方法，其特點是通過超聲波、乙酸和復合酶的協(xié)同作用提取膠原蛋白，并綜合運用鹽析、透析和超濾技術(shù)制得大分子活性膠原蛋白溶液，并能穩(wěn)定存在。
[0006]技術(shù)方案:為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:一種多手段協(xié)同提取大分子活性膠原蛋白的方法，包括以下步驟:
O新鮮魚皮的預處理:取100重量份的魚肉水洗后，加入NaCl和TriS-HCl的溶液中均質(zhì)5~1min ;并用高速冷凍離心機離心10~25min,取襯墊,重復上述步驟直到?jīng)]喲浮游脂肪和氣泡產(chǎn)生，然后用去離子水清洗；
2)活性膠原蛋白的提取:將預處理的魚皮投入去離子水中，加入如0.5~1.0M的乙酸，在冰浴條件下，進行超聲10~25min ;然后加入0.1~0.5重量份的復合蛋白酶，進行酶解
5~8h，離心處理后取上清液，得到膠原蛋白溶液；
3)活性膠原蛋白的純化:將上述膠原蛋白溶液進行鹽析和沉淀后，得到的沉淀再次用乙酸溶解，離心并取上清液，并進行脫鹽處理，最后用超濾膜去除小分子物質(zhì)和多肽，得到濃度為20~50%的大分子活性膠原蛋白溶液。
[0007]作為優(yōu)選，步驟3)選孔徑為10_50nm的超濾膜濃縮上述膠原蛋白溶液，加入NaCl至終濃度為0.5-1.3M，鹽析過夜，然后離心10-30min，取沉淀；沉淀再次用0.5-1M乙酸溶解后，離心1-2h，取上清，對0.1-0.2M乙酸透析脫鹽，用100-200nm孔徑的超濾膜去除小分子物質(zhì)和多肽，得到濃度為20-50%的大分子活性膠原蛋白溶液。
[0008]作為優(yōu)選，步驟I)所述NaCl和Tris-HCl的溶液中NaCl濃度為20~30%，pH為7~8，其中魚肉與該溶液的重量比為1:20~40。
[0009]作為優(yōu)選，步驟2)中立新處理后得到的沉淀加入去離子水，并條pH為中性，加入復合蛋白酶酶解3~6h后，離心，獲得第二份上清液，該上清液與之前獲得的上清液合并進入到后續(xù)步驟。
[0010]作為優(yōu)選，所述復合蛋白酶為胃蛋白酶、酸性酶3350和木瓜蛋白酶中的一種或多種的混合。
[0011]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:本發(fā)明通過超聲波、乙酸和復合酶的協(xié)同作用提取膠原蛋白，并綜合運用鹽析、透析和超濾技術(shù)制得大分子活性膠原蛋白溶液，并能穩(wěn)定存在。

【具體實施方式】
[0012]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明，應理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。
[0013]實施例1:
選取新鮮魚皮，100重量份，水洗去肉后，加入20% NaCI (0.05M Tris-HCI,pH7.5)溶液中(1:20, w/v)均質(zhì)5min,用轉(zhuǎn)速為1000rpm高速冷凍離心機離心1min,取沉淀,重復上述操作，直到?jīng)]有浮游脂肪和氣泡產(chǎn)生，然后用去離子水清洗。將預處理后的魚皮加入預冷的去離子水中(1: 50，w/v)，冰浴，加入乙酸至0.5M超聲1min,超聲波功率300W。加入0.1重量份胃蛋白酶，酶解5h，離心，取上清。所得沉淀加去離子水(1:50)，調(diào)pH值至中性，加入0.1重量份中性蛋白酶，酶解3h，離心，取上清。合并兩份上清，得膠原蛋白溶液。選孔徑為1nm的超濾膜濃縮上述膠原蛋白溶液，加入NaCl至終濃度為0.5M，鹽析過夜，然后離心1min,取沉淀。沉淀再次用0.5M乙酸溶解后，離心Ih,取上清,對0.1M乙酸透析脫鹽，用10nm孔徑的超濾膜去除小分子物質(zhì)和多肽，得到濃度為20%的大分子活性膠原蛋白溶液。
[0014]實施例2:
選取新鮮魚皮，100重量份，水洗去肉后，加入30% NaCI (0.05M Tris-HCI,pH7.5)溶液中(1:40, w/v)均質(zhì)1min,用轉(zhuǎn)速為15000rpm高速冷凍離心機離心25min,取沉淀,重復上述操作，直到?jīng)]有浮游脂肪和氣泡產(chǎn)生，然后用去離子水清洗。
[0015]2.活性膠原蛋白的提取
將預處理后的魚皮加入預冷的去離子水中(1: 100，w/v)，冰浴，加入乙酸至1.0M超聲25min，超聲波功率600W。加入0.5重量份胃木瓜蛋白酶，酶解8h，離心，取上清。所得沉淀加去離子水(1:100)，調(diào)pH值至中性，加入0.5重量份菠蘿蛋白酶，酶解6h，離心，取上清。合并兩份上清，得膠原蛋白溶液。選孔徑為50nm的超濾膜濃縮上述膠原蛋白溶液，加ANaCl至終濃度為1.3M，鹽析過夜，然后離心30min，取沉淀。沉淀再次用IM乙酸溶解后，離心2h，取上清，對0.2M乙酸透析脫鹽，用200nm孔徑的超濾膜去除小分子物質(zhì)和多肽，得到濃度為50%的大分子活性膠原蛋白溶液。
【權(quán)利要求】
1.一種多手段協(xié)同提取大分子活性膠原蛋白的方法，包括以下步驟: 1)新鮮魚皮的預處理:取100重量份的魚肉水洗后，加入NaCl和TriS-HCl的溶液中均質(zhì)5~1min ;并用高速冷凍離心機離心10~25min,取襯墊,重復上述步驟直到?jīng)]喲浮游脂肪和氣泡產(chǎn)生，然后用去離子水清洗； 2)活性膠原蛋白的提取:將預處理的魚皮投入去離子水中，加入如0.5~1.0M的乙酸，在冰浴條件下，進行超聲10~25min ;然后加入0.1~0.5重量份的復合蛋白酶，進行酶解5~8h，離心處理后取上清液，得到膠原蛋白溶液； 3)活性膠原蛋白的純化:將上述膠原蛋白溶液進行鹽析和沉淀后，得到的沉淀再次用乙酸溶解，離心并取上清液，并進行脫鹽處理，最后用超濾膜去除小分子物質(zhì)和多肽，得到濃度為20~50%的大分子活性膠原蛋白溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述多手段協(xié)同提取大分子活性膠原蛋白的方法，其特征在于:步驟3)選孔徑為10-50nm的超濾膜濃縮上述膠原蛋白溶液，加入NaCl至終濃度為0.5-1.3M，鹽析過夜，然后離心10-30min，取沉淀；沉淀再次用0.5-1M乙酸溶解后，離心l_2h，取上清，對0.1-0.2M乙酸透析脫鹽，用100-200nm孔徑的超濾膜去除小分子物質(zhì)和多肽，得到濃度為20-50%的大分子活性膠原蛋白溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述多手段協(xié)同提取大分子活性膠原蛋白的方法，其特征在于:步驟I)所述NaCl和Tris-HCl的溶液中NaCl濃度為20~30%，pH為7~8，其中魚肉與該溶液的重量比為1:20~40。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述多手段協(xié)同提取大分子活性膠原蛋白的方法，其特征在于:步驟2)中立新處理后得到的沉淀加入去離子水，并條pH為中性，加入復合蛋白酶酶解3~6h后，離心，獲得第二份上清液，該上清液與之前獲得的上清液合并進入到后續(xù)步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述多手段協(xié)同提取大分子活性膠原蛋白的方法，其特征在于:所述復合蛋白酶為胃蛋白酶、酸性酶3350和木瓜蛋白酶中的一種或多種的混合。
【文檔編號】C07K14/78GK104073536SQ201310096758
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月25日
【發(fā)明者】程張軍, 郁帥陸, 黃榮醒, 陳美娟 申請人:林琳