一種糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分離方法
【專利摘要】一種糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分離方法，將含有糖基化蛋白的非糖基化蛋白樣品或含有非糖基化蛋白的糖基化蛋白樣品采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行分離，該分離所用的緩沖液中含有Ba2+，Ba2+在緩沖液中的濃度至少為5mM。本發(fā)明可用于胰島素及其類似物的純化，可顯著提高純化效率。
【專利說明】一種糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及糖基化蛋白或前體與非糖基化蛋白或前體的色譜分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在蛋白質(zhì)生產(chǎn)過程中，糖基化蛋白及前體和非糖基化蛋白及前體的分離是一個獨特的研究領(lǐng)域。在去除糖基化雜質(zhì)或者非糖基化雜質(zhì)時往往會遇到比較大的困難。
[0003]蛋白或蛋白前體可以表達自酵母或者CHO、NSO或者昆蟲細胞等真核細胞表達系統(tǒng)。特別是在酵母中，隨著表達量的增高，糖基化的蛋白亦會較高的表達。這樣就需要有較好的方法來進行非糖基化蛋白中糖基化蛋白的去除。
[0004]在酵母表達系統(tǒng)中，目的蛋白可以表達在胞內(nèi)或者分泌到胞外，通過構(gòu)建不同的載體，以得到不同的目的蛋白或前體；在哺乳細胞表達系統(tǒng)中，蛋白亦可以通過不同的表達載體進行胞內(nèi)或者胞外表達。
[0005]在前期的純化中，需要進行蛋白質(zhì)的初純，主要利用多種色譜層析介質(zhì)進行，如酵母細胞表達蛋白利用離子交換層析進行捕獲及利用鹽離子梯度或者PH進行洗脫，或者利用親和標簽的親和層析。通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行糖基化和非糖基化蛋白的分離，層析緩沖液可以包括有機溶劑和其它常用的鹽離子如NaCl、KCl、(NH4)2SO4等。但是現(xiàn)有技術(shù)中，各種鹽的加入對蛋白的分離影響，除了 US6180757專利中所提到的Ca2+的添加外，對其它二價陽離子在這方面的應用上沒有提及。
[0006]例如，在現(xiàn)有的胰島素及其類似物的純化工藝中，糖基化的雜質(zhì)去除主要靠RP-HPLC及緩沖液中Ca2+的添加，這雖然能有效去除糖基化蛋白，但是其上樣量仍然不高，分離純化效率仍有待于進一步提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的主要目的是提供一種糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分離方法，通過添加特定的離子，實現(xiàn)樣品中糖基化蛋白和非糖基化蛋白的高效分離的目標。
[0008]以下對本發(fā)明進行一般性的描述。
[0009]蛋白或蛋白前體及類似物主要來自于酵母表達系統(tǒng)、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)及昆蟲細胞表達系統(tǒng)。在蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)過程中，色譜層析應用廣泛。在表達或者后期的改造過程中，蛋白往往會發(fā)生一系列的修飾，一系列的色譜層析及其它純化步驟也被廣泛應用，比如疏水層析、反相高效液相層析、離子交換、親和層析、(NH4)2SO4沉淀、PI沉淀、結(jié)晶等。本發(fā)明主要應用在糖基化蛋白和非糖基化蛋白的柱層析步驟。在糖基化和非糖基化蛋白的分離純化中，緩沖液中至少含有5mM的Ba2+，從而達到糖基化和非糖基化蛋白的有效分離。
[0010]色譜層析進行蛋白質(zhì)分離的基本原則是在一定的流動相緩沖液中不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)和固定相的層析介質(zhì)的相互作用不同，采用不同的流動相和固定相，蛋白質(zhì)在層析柱上的保留時間不同，從而達到不同種類或者不同結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的有效分離。
[0011]色譜層析可以選用多種不同性質(zhì)的層析介質(zhì)和層析方法，最好選用反相高效液相色譜(RP-HPLC)層析。
[0012]在樣品的選擇上，蛋白樣品至少應該含有一定量的糖基化蛋白，其可以是單糖基化、二糖基化或者多糖基化或者它們的混合物。
[0013]和不含Ba2+緩沖液進行糖基化與非糖基化蛋白的分離相比較，含有Ba2+，其至少可以增加60%的上樣量，同時亦顯著增加目的蛋白的純度。與含有Ca2+的緩沖液比較，其也可以在相同的純度及得率下提高10% -40%的上樣量，或者在同樣的上樣量下大大提高目的蛋白的純度。蛋白純度也和層析介質(zhì)基質(zhì)材料及孔徑及顆粒大小有關(guān)。不同大小的蛋白需要不同孔徑的介質(zhì)與其相匹配，胰島素或者胰島素類似物孔徑應該為120-200A，層析蛋白上樣量可以達到250-350mg/cm2 (柱長250_300mm)。
[0014]層析柱溫可以4-35 °C，最好是20-35 V，溫度低于最佳范圍，其分離效率會大大降低。
[0015]利用本發(fā)明可以比不加Ba2+的工藝顯著地提高產(chǎn)率，其產(chǎn)物中目的蛋白純度亦顯著提高，利用Ba2+則可以在使用較低的離子濃度的情況下比US6180757所述的Ca2+有更高的效率，同樣上樣量的情況下有更高的純度，同樣純度要求下可以增加10% -40%的上樣量，這樣就可以大大提高胰島素及其類似物的純化效率，其可以在后續(xù)步驟添加SO/—來進行Ba2+的有效去除或者通過緩沖液置換予以去除。
[0016]應用本方法，既可以獲得非糖基化的蛋白，亦可純化獲得糖基化蛋白，兩種形式都可以顯著提高效率。
[0017]在分離糖基化與非糖基化蛋白方面，本發(fā)明具有特別的優(yōu)勢，若是在非糖基化蛋白中去除糖基化的雜質(zhì)，如進行胰島素類蛋白的純化，其糖基化的胰島素類蛋白可以去除至0.15%以下，甚至0.1%以下。這可以使樣品中糖基化蛋白的濃度降低20倍以上。如果在樣品中也加入Ba2+,其分尚效率 會更進一步提聞。
[0018]利用本發(fā)明分離的樣品，可以是任何含有糖基化的非糖基化蛋白，或者是含有非糖基化的糖基化蛋白。這些蛋白可以來自于酵母表達系統(tǒng)，亦可以是哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，如CH0、NS0表達系統(tǒng)，亦可以是昆蟲細胞表達系統(tǒng)或者原核表達系統(tǒng)。這些樣品可以直接亦可以經(jīng)過幾步初純后應用本方法進行分離。
[0019]Ba2+的加入，其在分離糖基化和非糖基化蛋白方面所起的作用勝于任何常見一價陽離子的加入所起的作用，這些一價陽離子可以是Na+、NH4+、K+、Li+等單獨或者混合。這些結(jié)果說明Ba2+具有一價離子所沒有的特性，其可以顯著改變糖基化和非糖基化蛋白的疏水差異性。三價陽離子亦可能具有相似的性質(zhì)，只是三價陽離子如Fe3+在一般的溶液中比較容易沉淀，應用起來不方便。Ba2+的提供可以應用其鹽酸鹽、硝酸鹽、醋酸鹽等，只要能穩(wěn)定可溶于緩沖液中即可。
[0020]Ba2+的應用亦可以聯(lián)合應用一價陽離子鹽，其一價陽離子的加入的濃度和Ba2+加入的濃度具有交互影響作用，Ba2+的濃度達到5-10mM已經(jīng)足以達到分離效果，亦可以多加直至達到溶解度，一價陽離子的濃度可以是100-400mM，最好是200_300mM，其加入量一般是Ba2+的10-50倍以上。在各種一價陽離子聯(lián)合應用的選擇上，Na+、NH4+、K+、Li+等濃度具有相似性?？梢詥为毷褂靡嗫梢月?lián)合應用。
[0021]進行分離時，一般pH越高越好，可以選擇6-8.5，在不影響層析介質(zhì)壽命和蛋白活性的情況下選擇偏高的PH，比如應用到7-8。[0022]進行糖基化蛋白的分離，其可以利用等梯度洗脫亦可以進行梯度洗脫，一般情況進行5-15CV的柱保留可以進行較好的分離。
[0023]利用RP-HPLC進行層析分離，可以包含任何有機溶劑，其可以是乙腈、乙醇、甲醇、異丙醇等。在本發(fā)明中所述實例中有機溶劑的濃度占30% -40%體積。
[0024]利用本發(fā)明可以進行胰島素類蛋白的純化，其可以有效去除糖基化的胰島素或其類似物，得到純度較高的非糖基化胰島素或其類似物。利用本發(fā)明，可以使胰島素類蛋白中的糖基化蛋白濃度降低到0.15%以下，一般可以降低到0.1%以下。
[0025]在純化非糖基化蛋白方面，特別是胰島素及其類似物的純化方面，可以具有廣泛的應用，例如在醫(yī)藥方面胰島素對糖尿病的治療，在生物制藥方面培養(yǎng)基中胰島素及其相關(guān)促生長因子的添加等，應用十分廣泛。
[0026]在糖蛋白的分離上，本發(fā)明中所涉及的蛋白為所有的糖基化蛋白及其前體，尤其是胰島素及其類似物或者前體蛋白。
[0027]另一點需要明確指出的是在胰島素及其類似物類蛋白上，所收集的是不含糖基化的目的蛋白。
[0028]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種較好的分離糖基化與非糖基化蛋白的方法。通過本發(fā)明使用含有Ba2+的溶液在RP-HPLC上可以將糖基化與非糖基化蛋白進行很好地分離，進行組分收集可以得到較純的糖基化蛋白及非糖基化蛋白。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]以下是本發(fā)明附圖的簡要描述。色譜峰進行了標記。
`[0030]圖1為胰島素類蛋白純化前的RP-UPLC(反相超高效液相色譜)的檢測圖譜，箭頭所指示的各組分的含量為:1271:89.84%,mgl271:2.11%, dgl271:0.10%,
[0031]desamido:2.64%, 1271 ester:4.61 %。
[0032]圖2為胰島素類蛋白純化后的RP_UPLC(反相超高效液相色譜)檢測圖譜，箭頭所指示的各組分的含量為:1271:98.76%, mgl271:0.04%, dgl271:0.00%, desamido:
0.69%, 1271 polymer:0.39%。
[0033]圖3為緩沖液中含有2mM BaCl2進行的胰島素類蛋白RP-HPLC純化圖譜。
[0034]圖4為緩沖液中含有5mM BaCl2進行的胰島素類蛋白RP-HPLC純化圖譜，其中糖基化的蛋白和非糖基化的蛋白基本上進行了基線分離。
[0035]圖5為緩沖液中含有20mM BaCl2的胰島素類蛋的RP-HPLC純化圖譜。
[0036]圖6為緩沖液中含有20mM BaCl2并提高40%上樣量的胰島素類蛋白RP-HPLC純化圖譜。
[0037]圖7為緩沖液中含有20mM CaCl2的胰島素類蛋白RP-HPLC純化圖譜。
[0038]圖8為緩沖液中含有IOmM BaCl2的胰島素RP-HPLC純化圖譜。
[0039]圖9為緩沖液中未添加任何二價陽離子時胰島素類蛋白純化的RP-HPLC圖譜。
【具體實施方式】
[0040]以下實施例、實驗例僅僅對本發(fā)明進行進一步說明，不應構(gòu)成對本發(fā)明的限制。[0041 ] 下述實施例、實驗例中的原材料如果沒有特別說明，均為市售。[0042]通用方法:
[0043]所用樣品為胰島素類似物1271或者胰島素，1271為B28ASP胰島素，除了 B鏈28位氨基酸和胰島素不同外，其余皆為相同。
[0044]所有純度單位為質(zhì)量百分比。
[0045]檢測方法:
[0046]不同組分均采用藥典相關(guān)蛋白檢測方法轉(zhuǎn)換成UPLC方法，使用RP-UPLC C18柱進行檢測，用面積歸一法進行標記目的蛋白和糖基化蛋白的含量。純化儀:
[0047]所有的純化操作使用AKTApurifier層析系統(tǒng)，280nm紫外吸收作為檢測波長。層析介質(zhì)，采用150A孔徑C1810um反相硅膠顆粒作為層析介質(zhì)，溫度采用28°C，柱參數(shù)為10X 250mm半制備柱，再生液為IM甲酸+75%乙醇。
[0048]緩沖液配制:
[0049]所用水為WFI (注射用水)，所有的試劑均為分析純試劑,緩沖液pH用鹽酸或者醋酸調(diào)至7.6±0.3，洗脫液采用50mMTris+250mM KCl添加不用種類及濃度的二價陽離子配制而成，有機溶劑乙醇含量為35% (V/V)左右，保留時間為8-12CV實施例一:分離糖基化與非糖基化蛋白純化緩沖液中添加BaCl2，在對照組中加入CaCl2
[0050]具體分組如下:
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分離方法，其特征在于:將含有糖基化蛋白的非糖基化蛋白樣品或含有非糖基化蛋白的糖基化蛋白樣品采用反相高效液相色譜進行分離，該分離所用的緩沖液中含有Ba2+，Ba2+在緩沖液中的濃度至少為5mM。
2.如權(quán)利要求1所述的一種糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分離方法，其特征在于:所述緩沖液的PH值為6-8.5，優(yōu)選pH值為7-8。
3.如權(quán)利要求1所述的一種糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分離方法，其特征在于:該分離的層析溫度為20-35°C。
4.如權(quán)利要求1所述的一種糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分離方法，其特征在于:所述糖基化蛋白為單糖基化、二糖基化、多糖基化蛋白或者它們的任意混合物。
5.如權(quán)利要求1所述的一種糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分離方法，其特征在于:所述緩沖液中還含有一價陽離子，其在緩沖液中的濃度為Ba2+的10-50倍。
6.如權(quán)利要求1所述的一種糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分離方法，其特征在于:該分離的柱保留時間為5-15CV。
7.如權(quán)利要求1所述的一種糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分離方法，其特征在于:所述樣品為含有糖基化蛋白的胰島素或其類似物。
8.如權(quán)利要求1所述的一種糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分離方法，其特征在于:在所述樣品中也含有Ba2+。
9.如權(quán)利要求1所述的一 種糖基化蛋白和非糖基化蛋白的分離方法，其特征在于:所述Ba2+為鹽酸鹽、醋酸鹽或硝酸鹽形式。
10.一種含有糖基化蛋白的胰島素或其類似物的分離方法，其特征在于:將含有糖基化蛋白的胰島素或其類似物樣品采用反相高效液相色譜進行分離，該分離所用的緩沖液中含有Ba2+，Ba2+在緩沖液中的濃度至少為5mM，緩沖液的pH值為6-8.5，優(yōu)選pH值為7-8,分離的層析溫度為20-35°C，緩沖液中還含有一價陽離子，其在緩沖液中的濃度為Ba2+的10-50倍，分離的柱保留時間為5-15CV，Ba2+為鹽酸鹽、醋酸鹽或硝酸鹽形式。
【文檔編號】C07K1/20GK103509082SQ201210199152
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月15日
【發(fā)明者】顧娜娜, 郭懷祖 申請人:郭懷祖