專利名稱：鼠源dcf1特異性多克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種新的鼠源DCFl特異性多克隆抗體及其制備方法。
背景技術(shù)：
樹突狀細(xì)胞因子(dendritic cell factor I, DCFl)又名跨膜蛋白59(transmembrane protein 59, TMEM59),首先發(fā)現(xiàn)于免疫系統(tǒng)的樹突細(xì)胞中，是一個表達(dá)范圍比較普遍的單次跨膜蛋白。根據(jù)UniProt對其的注釋信息，DCFl主要定位在高爾基體上。目前對于該蛋白的功能研究報道還比較少，其功能可能與物質(zhì)的運輸相關(guān)，已有報道和文章表明DCFl與其同源蛋白TMEM59-like能夠抑制淀粉樣前體蛋白APP向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運以及進(jìn)一步的剪切，而APP與阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease, AD)的形成相關(guān),說明DCFl與神經(jīng)退行性疾病存在某種聯(lián)系。
根據(jù)目前已有的信息，DCFl商品化的相關(guān)抗體只有抗人的多克隆抗體，雖然其說明上指出也能抗鼠源的DCF1，但是在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)這種識別效果非常不好；而抗鼠源DCFl商品化的抗體還沒有。隨著DCFl研究的深入，相關(guān)功能的報道肯定會越來越多，而且為了深入研究，必然會借助一些模式動物如小鼠、果蠅等。所以，制備一種新的抗鼠源DCFl的特異性抗體進(jìn)行后續(xù)研究具有迫切性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一在于提供一種鼠源DCFl特異性多克隆抗體。本發(fā)明的目的之二在于提供該克隆抗體的制備方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種鼠源DCFl特異性多克隆抗體，其特征在于所述的特異性多克隆抗體是將SEQ IDNO: 2的第44位到76位氨基酸殘基組成的多肽特異性結(jié)合。上述的特異性多克隆抗體是將SEQ ID NO: 2的第44位到76位氨基酸殘基對應(yīng)的cDNA序列構(gòu)建到原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-l中，得到重組質(zhì)粒pGEX_4Tl_59a，再將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，得到可溶表達(dá)帶有鼠源DCFl第44位到76位氨基酸殘基的多肽融和蛋白。上述的特異性多克隆抗體是將多肽融和蛋白作為抗原免疫動物而獲得。一種制備上述的鼠源DCFl特異性多克隆抗體的方法，其特征在于該方法的具體步驟為
a.對DCFl氨基酸序列進(jìn)行了蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，其中第I到239位氨基酸為胞外段結(jié)
構(gòu)；
b.用PCR處于胞外段第44到76位氨基酸殘基對應(yīng)的cDNA，重組入pGEX_4T_l中，構(gòu)建成 pGEX-4Tl-59a 載體；
c.將載體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中，原核可溶表達(dá)表達(dá)得到包含目的DCFl多肽的可溶性融合蛋白；d.將融合蛋白為抗原免疫動物燥，得到以上述制備的蛋白，按照多抗免疫方案進(jìn)行動物免疫，得到特異性多克隆抗體。利用Western Blot和Immunohistochemical技術(shù)對制備得到的多克隆抗體進(jìn)行特異性評測。同時利用制備的上述多克隆抗體檢測小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1及正常小鼠乳腺組織DCFl的蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)4T1中DCFl的表達(dá)高于正常組織。為了更加確認(rèn)這種結(jié)果，通過在4T1細(xì)胞的培養(yǎng)基中JNK inhibitor II，而JNK信號通路已被證實與多種疾病相關(guān)，因此，JNK被認(rèn)為是可以調(diào)節(jié)疾病狀態(tài)細(xì)胞恢復(fù)到正常狀態(tài)的一個潛在靶點。當(dāng)4T1細(xì)胞受到JNK inhibitor II的抑制后，出現(xiàn)增殖速度變慢這種癌細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生改變的現(xiàn)象，再通過上述制備的多克隆抗體檢測DCFl的表達(dá)變化后發(fā)現(xiàn)，DCFl在4T1中的表達(dá)量隨著其 癌細(xì)胞狀態(tài)受抑制程度的加深而降低。用該抗體能檢測到小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1與正常的小鼠乳腺組織中DCFl的表達(dá)差異，將4T1的癌細(xì)胞狀態(tài)通過JNK inhibitor II抑制后，通過制備的多克隆抗體也檢測到了 DCFl的蛋白表達(dá)減少，說明制備的多克隆抗體可以用來檢測小鼠乳腺癌不同狀態(tài)下DCFl的表達(dá)水平。


圖I為TMHMM Server V. 2. O預(yù)測的DCFl跨膜結(jié)構(gòu)
圖2為擴增的抗原序列cDNA片段及重組質(zhì)粒pGEX-4Tl-59a經(jīng)BamHI和SalI雙酶切的電泳圖(A-擴增到的抗原序列cDNA片段；B-重組質(zhì)粒pGEX-4Tl-59a酶切產(chǎn)物)，說明目的片段已經(jīng)插入到PGEX-4T-1載體中。圖3為擴增的Elisa底物篩選序列cDNA片段及重組質(zhì)粒pET-30a_59c經(jīng)
和&7I雙酶切的電泳圖(A-Elisa底物篩選序列cDNA片段；B_重組質(zhì)粒pET-30a_59c酶切產(chǎn)物)，說明目的片段已經(jīng)插入到pET-30a載體中。圖4 A為pGEX-4Tl-59a轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破碎后的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析(I-Marker ;2_菌體超聲破碎后的上清液；3_菌體超聲破碎后的沉淀)，說明目的蛋白主要分布在可溶相；B為A中得到的上清液經(jīng)Glutathione Resin純化后的SDS-PAGE分析(I-PBS稀釋的菌體破碎上清，即樣品；2_樣品經(jīng)Glutathione Resin后的流出液；3_PBS洗滌流出液；4_洗脫流出液；5-Marker)，說明目的蛋白主要在洗脫液中，可以用作抗原。圖5 A為pET-30a-59c轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破碎后的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析(I-菌體超聲破碎后的上清液；2_菌體超聲破碎后的沉淀；3-Marker)，說明目的蛋白主要分布在可溶相；B為A中得到的上清液經(jīng)Ni柱純化后的SDS-PAGE分析(I上樣樣品；2_樣品經(jīng)Ni柱后的流出液；3-PBS洗滌流出液；4、5_洗脫流出液；6_Marker)，說明目的蛋白主要在洗脫液中，可以用作Elisa篩選用底物。圖6為在哺乳動物細(xì)胞HEK293T過表達(dá)鼠的DCF1，對制備的多克隆抗體進(jìn)行Western Bolt分析(A-HEK293T白光照片；B-對HEK293T轉(zhuǎn)染pEGFP_N2質(zhì)粒后的熒光照片；C對-HEK293T轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-DCFl質(zhì)粒后的熒光照片；D_抽提A，B, C蛋白進(jìn)行的WesternBolt)，說明制備的多克隆抗體對內(nèi)源DCFl的特異性結(jié)合能力。圖7為在哺乳動物細(xì)胞U251轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-DCFl質(zhì)粒后，對制備的多克隆抗體進(jìn)行熒光共定位分析。(A，E)EGFP，綠色；(B，F(xiàn))本發(fā)明制備的抗DCFl多克隆抗體，紅色；(C，G)DAPI，藍(lán)色；(D，H)Merge。說明制備的多克隆抗體能與細(xì)胞內(nèi)的DCFl共定位，具有特異性結(jié)合能力。圖8為使用制備的多克隆抗體對小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1與正常小鼠乳腺組織進(jìn)行的DCFl表達(dá)水平分析，Western Bolt結(jié)果顯示在4T1中DCFl表達(dá)水平要高于正常組織。圖9為通過CCK-8檢測在4T1細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入JNK inhibitor II后細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示加入抑制劑4T1的增殖受到明顯抑制，說明4T1細(xì)胞在JNK受到抑制后的癌癥狀態(tài)發(fā)生改變，增殖能力顯著減弱。圖10為不同抑制劑濃度及作用時間下4T1細(xì)胞的生長狀態(tài)照片以及對應(yīng)條件下4T1細(xì)胞內(nèi)DCFl的表達(dá)情況，結(jié)果表明制備的多克隆抗體能夠檢測到4T1在癌癥狀態(tài)發(fā)生改變后引起細(xì)胞內(nèi)DCFl表達(dá)的變化。
具體實施例方式實施例一 pGEX-4Tl_59a與pET-30a_59c原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
用TMHMM Server v. 2. O對DCFl氨基酸序列進(jìn)行的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測,利用Premier5. O軟件以及表達(dá)的融合蛋白不發(fā)生移碼突變的原理設(shè)計DCFl膜外段抗原序列及Elisa底物用蛋白序列的上游和下游引物，在其上游和下游引物中分別引入和&7I的酶切位點及相應(yīng)的保護堿基，并且在上下游引物中分別加入起始密碼和終止密碼，引物由上海英濰捷基公司合成。其中抗原序列的上游引物為5’ -CGCGGATCCatgGACACAGCGTCCTGTCAC-3’，下游引物為5’ -CAAGACGTCGACctaCAGCCTGCAGCCTCTCTGG-3’ ； Elisa 底物用蛋白序列的上游引物為5’ -CGCGGATCCatgGACACAGCGTCCTGTCAC-3，下游引物為5’ - CAAGACGTCGACctaTCCAGAGTTMGAGATAG -3’。以小鼠腦cDNA為模板，用上下游引物擴增抗原序列和Elisa底物用蛋白序列，將抗原序列插入到PGEX-4T-1載體中，將Elisa底物用蛋白序列插入到pET-30a載體中。酶切，PCR鑒定，測序正確，見圖2、圖3。載體構(gòu)建完成后可以用于后續(xù)實驗。實施例二 抗原多肽融合蛋白的可溶性表達(dá)及純化
將pGEX-4Tl-59a載體熱激轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)感受態(tài)中，待平板上長出菌落后，用滅菌牙簽挑單菌落至裝有5mL LB培養(yǎng)基的試管中，37°C、220rpm振蕩培養(yǎng)過夜，按1%的接種量即2mL菌液加至裝有200mL LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37°C振蕩培養(yǎng)之0D_為O. 8時，加入IPTG至終濃度為O. 5mM進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，37°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4h后，6000rpm離心5min將菌體收集到50 mL離心管中。將收集有菌體的50 mL離心管置于冰上，加入預(yù)冷的菌體超聲破碎緩沖液10mL，300W，30s超聲，15s暫停，持續(xù)30min。破碎完全后，將離心管放到離心機當(dāng)中，4°C、IIOOOrpm離心15min，收集上清，純化前上清保存于一 80°C冰箱中。分別取少量上清與沉淀作為樣本，進(jìn)行SDS-PAGE融合蛋白可溶性表達(dá)分析，見圖4-A。結(jié)果顯示目的蛋白主要存在于上清相中，達(dá)到了可溶性表達(dá)抗原多肽融合蛋白的目的。利用GST標(biāo)簽對上清中的目的蛋白進(jìn)行純化，具體流程參照GenScipt的Glutathione Resin產(chǎn)品說明書，并取純化過程中各組分進(jìn)行SDS-PAGE分析，見圖4-B。結(jié)果表明目的蛋白主要存在于洗脫液當(dāng)中，純化成功，可以用作后續(xù)免疫的抗原。實施例三=Elisa底物用蛋白的表達(dá)及純化
將pET-30a-59c載體熱激轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)感受態(tài)中，后續(xù)擴大培養(yǎng)、誘導(dǎo)發(fā)酵和超聲破碎同實施例二中的方法。分別取少量上清與沉淀作為樣本，進(jìn)行SDS-PAGE融合蛋白可溶性表達(dá)分析，見圖5-A。結(jié)果顯示目的蛋白存在于上清相中。利用His標(biāo)簽對上清中的目的蛋白進(jìn)行純化，具體流程參照AmershamBiosciences的Ni Sepharose 6 Fast Flow產(chǎn)品說明書，并取純化過程中各組分進(jìn)行SDS-PAGE分析，見圖5-B。結(jié)果表明目的蛋白主要存在于洗脫液當(dāng)中，純化成功，可以用作后續(xù)Elisa檢測用底物包被蛋白。實施例四多克隆抗體制備
實施例二制備得到的融合蛋白可以作為抗原用于動物免疫，本發(fā)明主要以新西蘭大白兔(購于復(fù)旦大學(xué)實驗動物中心)為免疫對象進(jìn)行抗體制備，免疫過程如下取2kg重的新西蘭大白兔，免疫前耳靜脈取血作為對照。首次免疫抗原量為400μ g蛋白，注射體積為500 μ L,佐劑為弗式完全佐劑,乳化完全后兔背部4點注射。15天后進(jìn)行第二次免疫,抗原量為400 μ g蛋白，注射體積為500 μ L,佐劑為弗式不完全佐劑，乳化完全后兔背部4點注 射。此后第10和20天分別進(jìn)行第三和四次免疫，免疫操作與第二次相同。第四次免疫一周后用Elisa法檢測抗血清效價，當(dāng)效價未達(dá)到IO6時，繼續(xù)進(jìn)行免疫，當(dāng)效價達(dá)到IO6后，不再進(jìn)行免疫，2周后可以進(jìn)行取血和抗血清的收集。抗血清的收集將收集的血置于37°C半小時，4°C，IlOOOrpm離心15min，收集上清分裝保存于一80°C。實施例五間接Elisa法檢測抗血清效價
I.將實施例二制得的pET-30a-59c表達(dá)的蛋白用包被緩沖液稀釋成10 μ g/mL,吸取包被抗原到Elisa板中，100 μ L/孔，4°C過夜。說明此處以pET-30a_59c表達(dá)蛋白作為底物的目的是排除GST標(biāo)簽引起的免疫反應(yīng)(即假陽性)，因為pET-30a帶的標(biāo)簽是His標(biāo)簽，而插入的片段包括了用作抗原GST標(biāo)簽蛋白的全部序列。2.倒掉Elisa板中的液體，PBST洗板3次，200 μ L/孔，拍干。3.用封閉液進(jìn)行封閉，300 μ L/孔，37 °C、2h，封閉完后倒掉封閉液，PBST洗板3次，200 μ L/孔，拍干。4.抗血清用PBST稀釋成濃度梯度分別為1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:12800、1:256000、1:512000、1:1024000，每孔加入不同濃度
一抗100 μ L。對照為免疫前小鼠血清，稀釋梯度如上，37°C孵育2h。5.倒掉一抗，PBST洗板3次，200 μ L/孔，拍干。6.羊抗兔 IgG-HRP 用 PBST 稀釋成 1:10000，每孔加樣 100yL，37°C 孵育 lh。7.倒掉二抗，PBST洗板3次，200 μ L/孔，拍干。8.底物OPD用底物稀釋液稀釋成50 μ g/mL,每孔加樣100 μ L，37°C孵育30min。9.每孔加50 μ L終止液終止反應(yīng)。10.在自動酶聯(lián)檢測儀上選擇490nm測0D，進(jìn)行分析，結(jié)果見表I。結(jié)果顯示兔血清效價足夠強，可以用于后續(xù)檢測。表I間接Elisa法檢測兔多抗血清效價
OD 11000X [2000X I4000X [8000X I16000X [32000X I64000X 1128000X [256000X I512000X 11024000XCON ~0.085 ). 160 O. 078~ O. 080 O. 079 07083 O. 124 ~0. 107 ' O. 131 O. 103 O. 128兔血清 |l.328 |l.320 |l. 297 |l. 261 |l.239 |l. 121 |l. 061 |θ. 880 |θ. 630 |θ. 405 |θ. 302注0D > O. 2即為陽性
實施例六:Western Blot檢測多克隆抗體的特異性
在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-DCFl質(zhì)粒，以轉(zhuǎn)染pEGFP_N2空載體及不轉(zhuǎn)質(zhì)粒的細(xì)胞為對照，質(zhì)粒在細(xì)胞中的發(fā)光情況見圖6-A，B，C。通過發(fā)光情況可以說明細(xì)胞中已經(jīng)表達(dá)了內(nèi)源的DCF1，此時對細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行抽提。將制備的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜在Bio-Rad半干轉(zhuǎn)印槽中進(jìn)行，首先根據(jù)膠的大小剪濾紙和NC膜，剪好后在轉(zhuǎn)膜液中平衡lOmin。然后準(zhǔn)備好半干轉(zhuǎn)印槽，按濾紙、NC膜、膠、濾紙的順序放好，為避免氣泡產(chǎn)生，用拿玻璃棒碾幾下。之后開始轉(zhuǎn)膜，恒壓25V，時間lh。轉(zhuǎn)完膜后取出膜用PBS洗一下，然后將NC膜置于封閉液中(含1% BSA的PBS)封閉過夜。用封閉液將本發(fā)明制備的多抗血清按一定比例稀釋，室溫?fù)u2h，吸出一抗，PBS洗3次，每次5min。用PBS稀釋紅外染料標(biāo)記的Odyssey 二抗，稀釋比例為1:10000，室溫?fù)ulh，吸出二抗，PBS洗3次，每 次5min。將膜晾干后,在Odyssey雙色紅外突光掃描系統(tǒng)掃描成像,結(jié)果見6_D。WesternBlot結(jié)果說明本發(fā)明制備的多克隆抗體與在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合，且效果明顯。實施例七細(xì)胞免疫組化對多克隆抗體進(jìn)行共定位分析
在24孔板上種植的U251細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-DCFl質(zhì)粒，以轉(zhuǎn)染pEGFP_N2空載的細(xì)胞作為對照。待熒光顯微鏡下觀察發(fā)光后，進(jìn)行細(xì)胞免疫組化實驗，操作如下將種植到24孔板上U251細(xì)胞用PBS漂洗三次，用4%多聚甲醛固定15min，2次，吸除固定液，PBS漂洗三次，邊洗邊輕輕振蕩，用5%正常山羊血清37 °C封閉2h，PBS漂洗三次，再加入一抗(本發(fā)明制備的多克隆抗體)，4°C下孵育過夜，次日PBS漂洗三次，每次lOmin。然后加入二抗(TRITC-con jugated goat anti-rabbit antibodies),室溫孵育 lh,棄二抗，PBS 漂洗三次，加入DAPI顯色5min，棄掉DAPI，加入200 μ LPBS后，熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖7。免疫組化結(jié)果顯示本發(fā)明制備的多克隆抗體可以有效地和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的DCFl進(jìn)行特異性結(jié)合，達(dá)到共定位的目的。實施例八用本抗體檢測小鼠乳腺癌細(xì)胞中DCFl的表達(dá)情況
抽提小鼠乳腺癌細(xì)胞4Τ1與正常小鼠乳腺組織的總蛋白，按照實施例六的操作進(jìn)行Western Blot檢測，一抗為本發(fā)明制備的多克隆抗體，結(jié)果見圖8。說明本發(fā)明制備的抗體不僅可以特異性結(jié)合外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞中過表達(dá)得到的DCF1，而且可以特異性結(jié)合哺乳動物本身表達(dá)的DCF1，同時更為重要的是發(fā)現(xiàn)了 DCFl在小鼠乳腺癌細(xì)胞和正常小鼠乳腺組織的蛋白表達(dá)差異，這為建立DCFl與癌癥的聯(lián)系打下了基礎(chǔ)。實施例九用JNK inhibitor II改變4T1的癌癥狀態(tài)
在4T1細(xì)胞的培養(yǎng)基加入不同量的JNK inhibitor II，使其終濃度分別為O μ Μ、22. 5 μ Μ、45 μ Μ、67· 5 μ Μ,通過CCK-8檢測細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果如圖9所示，在22. 5 μ Μ、45 μ Μ、67. 5 μ M的抑制劑濃度下，抑制劑加入24h后4T1的增殖受到顯著抑制，說明JNK受到抑制后能夠改變4T1的癌細(xì)胞狀態(tài)，可以進(jìn)行后續(xù)研究。同時看到45 μ M、67. 5 μ M條件下增殖抑制情況差別不大，因此選擇以O(shè) μ Μ、22. 5 μ Μ、45 μ M的抑制劑濃度為最終工作濃度。實施例十使用本抗體檢測在4Τ1不同狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)DCFl的表達(dá)情況
根據(jù)實施例九中能改變4Τ1癌癥狀態(tài)的條件設(shè)置，在4Τ1細(xì)胞的培養(yǎng)基加入相應(yīng)濃度的抑制劑，分別以O(shè)h、12h、24h和36h為時間節(jié)點提取細(xì)胞的總蛋白，進(jìn)行Western Blot檢測，一抗為本發(fā)明制備的多克隆抗體。結(jié)果如圖10所示，當(dāng)抑制劑的終濃度為45 μ M，加入24h后，4Τ1中表達(dá)DCFl的水平發(fā)生變化。當(dāng)抑制劑的終濃度為22. 5 μ M時，加入36h后，4T1中DCFl的表達(dá)水平發(fā)生變化。結(jié)果不僅說明本發(fā)明制備的抗體可以檢測到4T1內(nèi)DCFl 的表達(dá)隨著4T1癌細(xì)胞狀態(tài)的改變而發(fā)生變化，說明了 DCFl可以用來作為診斷乳腺癌的一個新標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種鼠源DCFl特異性多克隆抗體，其特征在于所述的特異性多克隆抗體是將SEQID NO:2的第44位到76位氨基酸殘基組成的多肽特異性結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鼠源DCFl特異性多克隆抗體，其特征在于所述的特異性多克隆抗體是將SEQ ID NO: 2的第44位到76位氨基酸殘基對應(yīng)的cDNA序列構(gòu)建到原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-l中，得到重組質(zhì)粒pGEX-4Tl-59a，再將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，得到可溶表達(dá)帶有鼠源DCFl第44位到76位氨基酸殘基的多肽融和蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鼠源DCFl特異性多克隆抗體，其特征在于所述的特異性多克隆抗體是將多肽融和蛋白作為抗原免疫動物而獲得。
4.一種制備根據(jù)權(quán)利要求I、2或3所述的鼠源DCFl特異性多克隆抗體的方法，其特征在于該方法的具體步驟為 a.對DCFl氨基酸序列進(jìn)行了蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，其中第I到239位氨基酸為胞外段結(jié)構(gòu)； b.用PCR處于胞外段第44到76位氨基酸殘基對應(yīng)的cDNA，重組入pGEX_4T_l中，構(gòu)建成 pGEX-4Tl-59a 載體； c.將載體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中，原核可溶表達(dá)表達(dá)得到包含目的DCFl多肽的可溶性融合蛋白； d.將融合蛋白為抗原免疫動物燥，得到以上述制備的蛋白，按照多抗免疫方案進(jìn)行動物免疫，得到特異性多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鼠源DCF1特異性多克隆抗體及其制備方法。該特異性多克隆抗體是將SEQIDNO:2的第44位到76位氨基酸殘基組成的多肽特異性結(jié)合。用該抗體能檢測到小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1與正常的小鼠乳腺組織中DCF1的表達(dá)差異，將4T1的癌細(xì)胞狀態(tài)通過JNKinhibitorII抑制后，通過制備的多克隆抗體也檢測到了DCF1的蛋白表達(dá)減少，說明制備的多克隆抗體可以用來檢測小鼠乳腺癌不同狀態(tài)下DCF1的表達(dá)水平。
文檔編號C07K16/24GK102702356SQ201210162998
公開日2012年10月3日 申請日期2012年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月18日
發(fā)明者文鐵橋, 程華 申請人:上海大學(xué)