專利名稱：大豆生育期e1-b3a基因及其編碼蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大豆生育期el_b3a基因及其編碼蛋白。
背景技術(shù)：
El基因位于著絲點(diǎn)附近，自Bernard (1971)年報(bào)道以來，人們一直沒有克隆出其功能基因。由于該基因位于近著絲點(diǎn)(pericentromeric region),遺傳重組率較低，不利于采用圖位克隆法克隆出該基因，在發(fā)明專利名稱ー種大豆生育期El基因及其編碼蛋白，專利申請(qǐng)?zhí)枮?01210112662.9中，公布出El基因序列及其相應(yīng)的蛋白序列后，證明大豆生育期El基因具有強(qiáng)烈抑制大豆開花的生理功能。其蛋白質(zhì)序列雖然并不能鑒定出B3結(jié)構(gòu)域，但是與B3結(jié)構(gòu)域基因具有遠(yuǎn)緣的關(guān)系。B3結(jié)構(gòu)域基因是ー類較為保守的植物特有的 轉(zhuǎn)錄因子，一般只有100-120氨基酸，常與其他結(jié)構(gòu)域共同起作用。B3結(jié)構(gòu)域中含有與DNA相結(jié)合的特殊位點(diǎn)，一般與DNA分子的大溝起作用。在含有B3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)對(duì)抗逆性反應(yīng)、植物的生長(zhǎng)與發(fā)育等諸多方面起重要作用。同吋，El基因具有ー個(gè)核定位信號(hào)，其特征為親核蛋白一般都含有的能保證整個(gè)蛋白質(zhì)能夠通過核孔復(fù)合體被運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)的特殊的短肽氨基酸序列。在大豆栽培品種中，其El基因的突變?nèi)绾斡绊懼蠖股?開花期及成熟期)是ー個(gè)非常重要的科學(xué)問題，目前還沒有在分子水平上的相關(guān)研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了大豆生育期el_b3a基因及其編碼蛋白。本發(fā)明的大 生育期el-b3a基因的基因序列如序列表Seq ID No:l所不。本發(fā)明的大豆生育期el_b3a基因的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No 2所示。本發(fā)明的大豆生育期el_b3a基因是大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?01210112662. 9)的突變型基因。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明是在克隆出大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?01210112662.9)的基礎(chǔ)上，進(jìn)ー步對(duì)El基因序列進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。由于在大豆中具有典型的B3基因結(jié)構(gòu)域基因，本基因是代表ー類新型的基因家族，我們已證實(shí)El基因可以代表著El位點(diǎn)的功能，即具有抑制大豆開花的功能。本發(fā)明對(duì)不同品種及近等基因系中El基因序列進(jìn)行了研究，并確定了 el-b3a基因，其對(duì)大豆生開花具有促進(jìn)作用。大豆生育期El基因在氨基酸序列55 174區(qū)域存在著ー個(gè)與B3結(jié)構(gòu)域遠(yuǎn)緣相似的區(qū)域，大豆生育期el_b3a基因的核苷酸序列在33Γ336處發(fā)生3個(gè)堿基突變及在337 338處有2個(gè)堿基缺失，在蛋白質(zhì)的C未端發(fā)生移碼，在氨基酸序列中fill處與大豆生育期基因El相同，112^147處為錯(cuò)位氨基酸序列，因移碼(frameshift)而形成了終止子(見Seq ID No :2)，而且在148位產(chǎn)生了終止密碼子，因而本發(fā)明的大豆生育期el_b3a基因在氨基酸65位從蘇氨酸改變?yōu)楫惲涟彼?，改變了大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?01210112662. 9)的B3結(jié)構(gòu)域的完整性，從而使大豆開花提前，說明El基因中類似于B3的結(jié)構(gòu)域的改變，引發(fā)了大豆El基因功能的改變。具有該基因的品種煙黃3號(hào)表現(xiàn)為早花特性。


圖I為el_b3a電泳圖，其中，I號(hào)為中黃13,2號(hào)為合豐55,3號(hào)為Jack,4號(hào)為煙黃3號(hào),5號(hào)為墾豐18,6號(hào)為合豐50 ；圖2具el_b3a基因的大豆品種煙黃3號(hào)在長(zhǎng)日照16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗條件下，出苗后45天照片，其中，箭頭所指的是已開放的大豆花朵；圖3具大豆生育期El基因的大豆品種Harosoy-El在長(zhǎng)日照16小時(shí)光照/8小時(shí) 黑暗條件下，出苗后45天的照片。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式的大豆生育期el_b3a基因的突變基因序列如序列表 Seq IDNo 1 所示。本實(shí)施方式是在克隆出大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?01210112662.9)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)El基因序列進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。由于在大 中具有典型的Β3基因結(jié)構(gòu)域基因，本基因是代表ー類新型的基因家族，我們已證實(shí)EI基因可以代表著EI位點(diǎn)的功能，即具有抑制大豆開花的功能。本實(shí)施方式對(duì)不同品種及近等基因系中El基因序列進(jìn)行了研究，并確定了 el-b3a基因，其對(duì)大豆生開花具有促進(jìn)作用。大豆生育期El基因在氨基酸序列55 174區(qū)域存在著ー個(gè)與B3結(jié)構(gòu)域遠(yuǎn)緣相似的區(qū)域，大豆生育期el_b3a基因的核苷酸序列在33Γ336處發(fā)生3個(gè)堿基突變及在337 338處有2個(gè)堿基缺失，在蛋白質(zhì)的C未端發(fā)生移碼，在氨基酸序列中fill處與大豆生育期基因El相同，112^147處為錯(cuò)位氨基酸序列，因移碼(frameshift)而形成了終止子(見Seq ID No :2)，而且在148位產(chǎn)生了終止密碼子，因而本實(shí)施方式的大豆生育期el_b3a基因的氨基酸65位從蘇氨酸改變?yōu)楫惲涟彼?，改變了大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?01210112662.9)的B3結(jié)構(gòu)域的完整性，從而使大豆開花提前，說明El基因中類似于B3的結(jié)構(gòu)域的改變，引發(fā)了大豆El基因功能的改變。具有該基因的品種煙黃3號(hào)表現(xiàn)為早花特性。
具體實(shí)施方式
ニ 本實(shí)施方式的大豆生育期el_b3a基因的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No 2所示。本實(shí)施方式是在克隆出大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?01210112662.9)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)El基因序列進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。由于在大 中具有典型的Β3基因結(jié)構(gòu)域基因，本基因是代表ー類新型的基因家族，我們已證實(shí)EI基因可以代表著EI位點(diǎn)的功能，即具有抑制大豆開花的功能。本實(shí)施方式對(duì)不同品種及近等基因系中El基因序列進(jìn)行了研究，并確定了 el-b3a基因，其對(duì)大豆生開花具有促進(jìn)作用。大豆生育期El基因在氨基酸序列55 174區(qū)域存在著ー個(gè)與B3結(jié)構(gòu)域遠(yuǎn)緣相似的區(qū)域，大豆生育期el_b3a基因的核苷酸序列在33Γ336處發(fā)生3個(gè)堿基突變及在337 338處有2個(gè)堿基缺失，在蛋白質(zhì)的C未端發(fā)生移碼，在氨基酸序列中fill處與大豆生育期基因El相同，112^147處為錯(cuò)位氨基酸序列，因移碼(frameshift)而形成了終止子(見Seq ID No :2)，而且在148位產(chǎn)生了終止密碼子，因而本實(shí)施方式的大豆生育期el_b3a基因的氨基酸65位從蘇氨酸改變?yōu)楫惲涟彼?，改變了大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?01210112662.9)的B3結(jié)構(gòu)域的完整性，從而使大豆開花提前，說明El基因中類似于B3的結(jié)構(gòu)域的改變，引發(fā)了大豆El基因功能的改變。具有該基因的品種煙黃3號(hào)表現(xiàn)為早花特性。通過以下試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的效果(I)本發(fā)明的el_b3a基因是通過如下方法得到的取長(zhǎng)至三葉真葉期煙黃3號(hào)大豆品種的葉片，采用CTAB法提取葉片基因組DNA ；以提取的DNA為模板通過Kl與K2引物，采用購買自Takara公司的高保真酶primerSTARHS擴(kuò)增el-b3a基因，PCR反應(yīng)條件如下94°C預(yù)變性10min，94°C變性30s，60°C退火15s，72°C延伸lmin，共30循環(huán)，再72°C延伸7min，將PCR產(chǎn)物在ABI3130測(cè)序儀(ABI公司)上進(jìn)行測(cè)序。 測(cè)序結(jié)果表明大豆生育期el_b3a基因具有序列表中Seq ID No :1的核苷酸序列，序列表中的Seq ID No 1由522個(gè)堿基組成，并編碼具有序列表中Seq ID No 2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。(2)大豆El基因中el_b3a基因鑒定一、取長(zhǎng)至三葉真葉期待測(cè)品種的葉片，采用CTAB法提取葉片基因組DNA ;ニ、以步驟ー提取的基因組DNA為模板，F(xiàn)l和F2為引物，采用購買自Takara公司的rTaq酶進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件如下95°C預(yù)變性3min ;95°C變性20s，58°C退火30s，72°C延伸40s，共32個(gè)循環(huán)，再72°C延伸7min ;三、取經(jīng)步驟ニ PCR后的8 μ I (其濃度約為300ng/μ I)，稀釋I倍后，經(jīng)BfuI限制性內(nèi)切酶(購買自Takara公司)，在37° C溫度下，消化3h ;四、然后將步驟三酶切后的產(chǎn)物，采用13%非變性PAGE膠電泳進(jìn)行檢測(cè)；其中，步驟一所述的待測(cè)品種中黃13，合豐55，Jack，煙黃3號(hào)，墾豐18和合豐50。電泳檢測(cè)結(jié)果如圖I所示，由圖I可知，4號(hào)煙黃3號(hào)品種出現(xiàn)2條條帶(如BC所示)，即為el-b3a基因型，而1、2、3、5和6號(hào)只有一條條帶(如A所示)，即沒有并不能被BfuI消化，則為El的其它基因型。(3) el_b3a基因的功能驗(yàn)證一、大豆品種帶有el_b3a基因的表型分析為進(jìn)ー步驗(yàn)證el_b3a基因型的功能，將含有el_b3a基因的煙黃3號(hào)與含有大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?01210112662.9)的Harosoy-El品種，種植在人工培養(yǎng)箱中(人工控制日照長(zhǎng)度長(zhǎng)日照為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，中等長(zhǎng)照為13. 5小時(shí)/9. 5小時(shí)，短日照條件為12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗)，光源為熒光燈與白熾燈，其光強(qiáng)為235^270 μ mo I · s^1 ·πΓ2，同時(shí)，在自然光照的田間種植，觀察含有el_b3a基因煙黃3號(hào)品種與含有大豆生育期El基因(發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?01210112662. 9)的Harosoy-El品種從出苗到開花的天數(shù)。結(jié)果如表I所示，從表I中可以看出，大豆為短日照作物，在短日照(12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗)條件下，含有大豆生育期El基因的Harosoy-El品種與含有el_b3a基因的煙黃3號(hào)種開花天數(shù)(從播種到開花)相當(dāng)，大約30天左右；而在長(zhǎng)日照條件(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)下，含有大豆生育期El基因的Harosoy-El品種的開花天數(shù)超過70天，而含有el-b3a基因的煙黃3號(hào)品種為43天左右，在中等日照條件下，含有el_b3a基因的煙黃3號(hào)品種在45天時(shí)已經(jīng)開花(圖2)，而含有大豆生育期El基因的Harosoy-El品種則處于營養(yǎng)生長(zhǎng)狀況(圖3)。el_b3a基因是在我國自己培育的大豆品種煙黃3號(hào)中發(fā)現(xiàn)的，說明el_b3a基因代表著一個(gè)極其重要的一類變異，對(duì)于全面了解El基因的機(jī)理起決定作用。表I品種帶有el_b3a基因與帶有El基因型的比較
權(quán)利要求
1.大豆生育期el-b3a基因，其特征在于大豆生育期el-b3a基因的基因序列如序列表SeqID No 1 所示。
2.如權(quán)利要求I所述的大豆生育期el_b3a基因的編碼蛋白，其特征在于大豆生育期el-b3a基因編碼蛋白的氣基酸序列如序列表Seq ID No:2所不。
全文摘要
大豆生育期e1-b3a基因及其編碼蛋白，它涉及大豆生育期e1-b3a基因及其編碼蛋白。本發(fā)明提供了大豆生育期e1-b3a基因及其編碼蛋白。本發(fā)明的大豆生育期e1-b3a基因的基因序列如序列表Seq ID No1所示。本發(fā)明的大豆生育期e1-b3a基因的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No2所示。本發(fā)明通過品種的相關(guān)的遺傳及分子功能驗(yàn)證，e1-b3a基因與E1基因相比，具有促進(jìn)開花的功能。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102690831SQ20121016217
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月23日
發(fā)明者劉寶輝, 呂世翔, 吳紅艷, 夏正俊, 翟紅, 邱麗娟 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所