專利名稱：禽流感病毒H5N1亞型Re-5株陽性血清和陰性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種禽流感病毒H5m亞型Re-5株的陽性血清和陰性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及 制備方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
英國藥典(BP)的化學(xué)對照物質(zhì)是從1963年才開始提出，由于WHO在英國建立了 國際生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，所以英國一直沿用國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，而其本國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立較晚，至 1970年后，歐洲藥典問世，英國除引用國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)外，也用歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，少量使用 本國的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。即使如此，BP1968年版及其增補(bǔ)本再加英國藥典(1968年)收載的數(shù)量 已超過260個(gè)，1980年版已超過300個(gè)，BP1993版收載了 371個(gè)。美國藥典委員會(huì)可提供 約1805多種藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；歐洲藥典委員會(huì)有2098種，其中生物制品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有319種。目前，我國已研制出國家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1262種，二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1739種，涉及鋼鐵、 地質(zhì)、石油、核材料、環(huán)境、食品以及臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域。獸用生物制品的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究較滯 后，目前只有192種，而獸用生物制品檢驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)幾乎為零。獸用生物制品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是控制和確定獸用生物制品產(chǎn)品質(zhì)量、校準(zhǔn)驗(yàn)證檢驗(yàn)儀器 和方法是否準(zhǔn)確的物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，是正確診斷傳染病、準(zhǔn)確監(jiān)測免疫情況的物質(zhì)基礎(chǔ)。禽流感(Al)是我國重點(diǎn)防控的重大動(dòng)物疫病，禽流感病毒(AIV)H5亞型屬于高致 病性病毒，AIV H5N1亞型Re-5株是針對我國當(dāng)前流行的高致病性禽流感病毒而研制的。用 該毒株研制的禽流感滅活疫苗是我國目前禽流感防制中應(yīng)用最廣泛的首選疫苗，這個(gè)疫苗 在實(shí)際應(yīng)用中取得了十分顯著的免疫效果，因此近年來我國的禽流感防制非常令人滿意。 但是目前我國尚無禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其相關(guān)研究的報(bào)道，國 外國際動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)等參考實(shí)驗(yàn)室也沒有，嚴(yán)重影響了前后不同時(shí)期檢測數(shù)據(jù)的一 致性和不同實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的可比性。近年各級(jí)實(shí)驗(yàn)室對禽流感標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的需求越來越多，特 別是H5亞型和H9亞型相關(guān)的診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，因此研制禽流感病毒H5W亞型血凝抑制 抗原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)尤為迫切，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是禽流感H5W亞型準(zhǔn)確診斷、對AIV H5N1亞型Re_5 株免疫監(jiān)測及對其疫苗免疫效果進(jìn)行正確評(píng)價(jià)的根本保障，提高禽流感的防控水平。目前我國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制主要參考和遵循1987年7月10日國家計(jì)量局發(fā)布實(shí)施 的《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理辦法》以及一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范(JJG 1006-94)，但是這個(gè)技術(shù)規(guī)范是 適用于化學(xué)成分、物理化學(xué)特性及工程技術(shù)特性一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制，對于生物制品標(biāo)準(zhǔn) 物質(zhì)，特別是獸用生物制品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制目前尚無技術(shù)規(guī)范可循。因此獸用生物制品標(biāo)準(zhǔn) 物質(zhì)研制是一項(xiàng)無基礎(chǔ)的研究，填補(bǔ)了該項(xiàng)研究領(lǐng)域的空白。

發(fā)明內(nèi)容
本方面涉及一種禽流感病毒H5m亞型Re-5株陽性血清和陰性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)， 陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有強(qiáng)陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和弱陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，此兩種陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)只與禽流感病毒H5W亞型Re-5株抗原呈陽性反應(yīng)，強(qiáng)陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的HI價(jià)為 彡81og2,弱陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的HI價(jià)為< 81og2而彡41og2 ；此兩種陽性血清與H7和H9 亞型禽流感、雞新城疫、減蛋綜合征病毒抗原均應(yīng)為陰性反應(yīng)；陰性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在同一條 件下，分別與禽流感、雞新城疫、減蛋綜合征病毒抗原進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)，血清對禽 流感H5、H7、H9亞型、雞新城疫、減蛋綜合征病毒抗原均為陰性反應(yīng)。本發(fā)明的技術(shù)方案(1)禽流感病毒H5W亞型Re-5株陽性血清和陰性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物1)按常規(guī)方法用禽流感病毒H5W亞型Re-5株病毒制備的油乳劑滅活疫苗。2)陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物系用青年或成年SPF雞，經(jīng)肌肉注射禽流感病毒 H5N1亞型R5株油乳劑滅活疫苗，制備強(qiáng)陽性血清候選物，經(jīng)2次免疫后，選取HI抗體效價(jià) ^ 81og2的免疫雞只，分別采集雞血清并進(jìn)行半成品檢驗(yàn)后混合，加入適宜穩(wěn)定劑后凍干； 制備弱陽性血清候選物僅1次免疫，選取HI抗體效價(jià)< 81og2而> 41og2的免疫雞只，分 別采集雞血清并進(jìn)行半成品檢驗(yàn)后混合，加入適宜穩(wěn)定劑后凍干。3)陰性血清系采自SPF雞血，分離血清并進(jìn)行半成品檢驗(yàn)，凍干。(2)以上制備的強(qiáng)陽性血清、弱陽性血清和陰性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物經(jīng)檢驗(yàn)、均一 性檢驗(yàn)及穩(wěn)定性檢驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)定、定值等一系列的工藝過程而成為強(qiáng)陽性血清、弱 陽性血清和陰性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。本發(fā)明技術(shù)方案的詳細(xì)闡述一、禽流感病毒H5W亞型Re-5株陽性血清、弱陽性血清和陰性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制 備1免疫用疫苗的制備(1)病毒液的制備及檢驗(yàn)按照禽流感病毒H5W亞型Re-5株標(biāo)準(zhǔn)血凝抑制抗原 的制備方法繁殖病毒液，對病毒液進(jìn)行檢驗(yàn)1)無菌檢驗(yàn)每瓶雞胚液分別取樣，按中華人民共和國獸藥典(中國獸藥典委員 會(huì).中華人民共和國獸藥典二〇〇五年版(三部).中國農(nóng)業(yè)出版社，2006，本發(fā)明簡稱 《中國獸藥典》)規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，無細(xì)菌或霉菌或支原體生長也無外源病毒。2) HA價(jià)測定每瓶雞胚液分別取樣，樣品對雞紅細(xì)胞凝集價(jià)不低于91og2。(2)病毒液的滅活及檢驗(yàn)1)滅活將上述檢驗(yàn)合格的胚液以滅菌多層紗布濾過，混合于一個(gè)大容器內(nèi)，按 最終濃度為0. 03%的量加入β-丙內(nèi)酯，充分混勻，置于4°C滅活24h后取出再置于37°C水 浴終止滅活lh。滅活后將胚液置于2 8°C條件下保存。2)滅活檢驗(yàn)取10 11日齡SPF雞胚5個(gè)，各尿囊腔內(nèi)接種滅活胚液0. Iml, 37°C孵育72h，收獲雞胚液，測定血凝性(詳見本說明書附錄，下稱《附錄》)，為陰性，并盲傳 1代，測定血凝性，無血凝現(xiàn)象，判為滅活完全。(3)佐劑的選擇選用符合生物制品規(guī)定的進(jìn)口佐劑，如德國產(chǎn)的Marcol52白 油、新加坡產(chǎn)的80和司盤80等為乳化佐劑。(4)保護(hù)劑的處理將司盤和白油按6 94的比例混合后加熱至130°C30min，無 菌冷卻后備用；吐溫經(jīng)高壓滅菌后備用。(5)疫苗的制備先將滅菌后的吐溫按8%的比例加入滅活檢驗(yàn)合格的病毒液中，將其混勻；將冷卻的白油佐劑定量加入組織搗碎機(jī)內(nèi)，低速開啟組織搗碎機(jī)，將混勻吐 溫的病毒液按白油佐劑1/2的量緩慢加入組織搗碎機(jī)內(nèi)，然后將組織搗碎機(jī)的轉(zhuǎn)速提高至 8000r/min運(yùn)轉(zhuǎn)lOmin。將制備的油包水型疫苗分裝于疫苗瓶內(nèi)備用。2陽性血清制備(1)免疫選用3 4月齡SPF雞飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器內(nèi)，用制備的禽流感滅活疫苗 以胸部肌肉注射方式2次接種疫苗，第一次接種劑量為1.0ml/只，間隔21日后進(jìn)行第二次 接種，劑量為1. 5ml/只，且分點(diǎn)注射。(2)試血于第2次免疫接種后觀日，用翅下靜脈采血方式采集血清，采血同時(shí)對 雞和血清對應(yīng)編號(hào)，分別測定HI抗體效價(jià)(按《附錄》進(jìn)行)，挑選HI抗體效價(jià)> Qlog2的 SPF雞備用。(3)血清的分離選HI抗體效價(jià)彡Qlog2的SPF雞用20ml無菌注射器在負(fù)壓隔 離器內(nèi)進(jìn)行心臟采血，血液采集完畢后先置于37°C 4h，然后再置于4°C冰箱內(nèi)過夜，在無菌 室超凈工作臺(tái)內(nèi)提取血清，若血清中混有紅血球，應(yīng)對其進(jìn)行無菌離心后混合于同一滅菌 后的容器內(nèi)。(4)血清半成品的檢驗(yàn)1)無菌檢驗(yàn)對混合后的血清取樣，按《中國獸藥典》規(guī)定方法進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì) 菌或霉菌生長。若有雜菌污染，應(yīng)用0.22 μ的濾膜對其進(jìn)行過濾除菌。2) HI抗體價(jià)的測定按《中國獸藥典》紅細(xì)胞凝集抑制法進(jìn)行HI抗體價(jià)的測定，結(jié) 果應(yīng)彡91〇由。3)特異性鑒定將待檢血清在同一條件下分別與Η5、Η7和Η9亞型禽流感、雞新城 疫、減蛋綜合征病毒抗原進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)(按《附錄》進(jìn)行)，僅與禽流感病毒Η5 亞型抗原呈陽性反應(yīng)(HI彡71og2)，與H7和H9亞型禽流感、雞新城疫、減蛋綜合征病毒抗 原均應(yīng)為陰性反應(yīng)(HI ( 41og2)。4)血清的配制經(jīng)檢驗(yàn)合格的血清按總量的3%加入海藻糖(由北京拜爾迪生物 公司生產(chǎn))和0. 5%的甘氨酸(由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))作為凍干保護(hù)劑 并充分?jǐn)嚢杈鶆颍凑铡吨袊F藥典》無菌檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長。5)分裝與凍干將配好的抗原液用安瓿進(jìn)行分裝，每瓶1ml，分裝后迅速放入凍 干機(jī)內(nèi)進(jìn)行冷凍真空干燥。凍干后扎鋁蓋、標(biāo)號(hào)后放置-20°C保存。(5)成品檢驗(yàn)1)物理性狀呈微黃色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁分離，加稀釋液后迅速溶解，溶 解后的外觀應(yīng)與液體血清相同。2)無菌檢驗(yàn)按《中國獸藥典》無菌檢驗(yàn)法進(jìn)行，應(yīng)無菌生長。3)效價(jià)測定按附錄進(jìn)行，HI抗體效價(jià)應(yīng)彡81og2。4)特異性檢驗(yàn)同半成品，應(yīng)符合規(guī)定。
5) PH測定將血清按規(guī)格稀釋后，用PH儀測定其pH值，應(yīng)為7. 9 8. 26)剩余水分測定按《中國獸藥典》剩余水分測定法進(jìn)行，應(yīng)低于3%。7)真空度測定按《中國獸藥典》真空度測定法進(jìn)行，符合規(guī)定。8)血清HI抗體效價(jià)的定值①定值方法紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)96孔微量板法進(jìn)行測定。
②定值單位由6 8家具有資質(zhì)且事先經(jīng)過比對確認(rèn)其定值能力相同的試驗(yàn) 室，采用同一方法進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定。③定值要求(a)應(yīng)對每個(gè)被測標(biāo)準(zhǔn)樣品分別做6 8次獨(dú)立的測定，測定分兩個(gè)單元，每個(gè)單 元做三次獨(dú)立測定；兩個(gè)單元之間相隔不少于3天。所獲得的6個(gè)數(shù)據(jù)應(yīng)按統(tǒng)計(jì)學(xué)方法檢 驗(yàn)異常值，如發(fā)現(xiàn)有異常值，應(yīng)予標(biāo)明，并補(bǔ)做一次測定。然后報(bào)出全部結(jié)果。(b)所有用于定值測量的計(jì)量器具/測量儀器需經(jīng)檢定或校準(zhǔn)合格，并在有效期 內(nèi)。④數(shù)據(jù)處理(a)匯總?cè)吭紨?shù)據(jù)，考察全部測量數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性。(b)在數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布或近似正態(tài)分布的情況下，將每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的所測數(shù)據(jù)的 平均值視為單次測量值，構(gòu)成一組新的測量數(shù)據(jù)。用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法從統(tǒng)計(jì)上剔除可疑值。計(jì) 算出總平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。(c)當(dāng)全部數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布或近似正態(tài)分布情況下，也可視其為一組新的測量 數(shù)據(jù)。用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法從統(tǒng)計(jì)上剔除可疑值，再計(jì)算全部原始數(shù)據(jù)的總平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。9)均一性檢驗(yàn)①抽樣數(shù)量凍干數(shù)量在500支以上時(shí)取樣25支；凍干數(shù)量在500只以下時(shí)取樣 15支。②測量分別稱量每支內(nèi)容物的凈重量，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析其均一性。10)穩(wěn)定性檢驗(yàn)血清分別在-20°C、4°C、37°C條件下保存，并定期進(jìn)行HA價(jià)測 定，每一時(shí)間均要進(jìn)行數(shù)次重復(fù)測量，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法剔除可疑值，再計(jì)算每次的平均值，該 值與定值的偏差應(yīng)不大于標(biāo)準(zhǔn)偏差。3.弱陽性血清制備(1)免疫選用3 4月齡SPF雞飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器內(nèi)，用制備的禽流感滅活疫苗 以胸部肌肉注射方式接種疫苗，接種劑量為0. 5ml/只。(2)試血于免疫接種后14 21日，用翅下靜脈采血方式采集血清，采血同時(shí)對 雞和血清對應(yīng)編號(hào)，分別測定HI抗體效價(jià)(按《附錄》進(jìn)行)，選取HI抗體效價(jià)< 81og2而 ^ 41og2的免疫雞只備用。(3)血清的分離選選取HI抗體效價(jià)< 81og2而彡41og2的免疫雞只用20ml無 菌注射器在負(fù)壓隔離器內(nèi)進(jìn)行心臟采血，血液采集完畢后先置于37°C 4h，然后再置于4°C 冰箱內(nèi)過夜，在無菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)提取血清，若血清中混有紅血球，應(yīng)對其進(jìn)行無菌離心 后混合于同一滅菌后的容器內(nèi)。(4)血清半成品的檢驗(yàn)1)無菌檢驗(yàn)對混合后的血清取樣，按《中國獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌或霉菌 生長。若有雜菌污染，應(yīng)用0.22 μ的濾膜對其進(jìn)行過濾除菌。2)HI抗體價(jià)的測定按附錄進(jìn)行測定，結(jié)果應(yīng)為大于41og2，小于81og2。3)特異性鑒定將待檢血清在同一條件下分別與H5、H7和H9亞型禽流感、雞新城 疫、減蛋綜合征病毒抗原進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)(按《附錄》進(jìn)行)，僅與禽流感病毒H9 亞型抗原呈陽性反應(yīng)(HI抗體效價(jià)< 81og2而> 41og2)，與H7和H5亞型禽流感、雞新城疫、減蛋綜合征病毒抗原均應(yīng)為陰性反應(yīng)。(5)血清的配制經(jīng)檢驗(yàn)合格的血清按總量的3%加入海藻糖(由北京拜爾迪生 物公司生產(chǎn))和0. 5%的甘氨酸(由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))作為凍干保護(hù) 劑并充分?jǐn)嚢杈鶆?，并按照《中國獸藥典》無菌檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長。(6)分裝與凍干將配好的抗原液用安瓿進(jìn)行分裝，每瓶1ml，分裝后迅速放入凍 干機(jī)內(nèi)進(jìn)行冷凍真空干燥。凍干后扎鋁蓋、標(biāo)號(hào)后放置-20°C保存。(7)成品檢驗(yàn)1)物理性狀同陽性血清。2)無菌檢驗(yàn)同陽性血清。3)效價(jià)測定按附錄進(jìn)行，HI抗體效價(jià)< 81og2而彡41og2。4)pH測定將血清按規(guī)格稀釋后，用PH儀測定其pH值，應(yīng)為7. 6 8. 2。5)特異性檢驗(yàn)同陽性血清。6)剩余水分測定同陽性血清。7)真空度測定同陽性血清。8)血清HI抗體效價(jià)的定值同陽性血清。9)均一性檢驗(yàn)同陽性血清。10)穩(wěn)定性檢驗(yàn)同陽性血清。4.陰性血清(1)血清分離青年SPF雞飼養(yǎng)于生物安全動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的負(fù)壓隔離器內(nèi)，以無 菌注射器在生物安全動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的負(fù)壓隔離器內(nèi)進(jìn)行心臟采血，血液采集完畢后先置于 370C 4h，然后再置于4°C冰箱內(nèi)過夜，在無菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)提取血清，然后混合于同一滅 菌后的容器內(nèi)。(2)血清半成品的檢驗(yàn)1)無菌檢驗(yàn)對混合后的血清取樣，按《中國獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌或霉菌 生長。2)效價(jià)測定按附錄進(jìn)行，HI抗體效價(jià)應(yīng)為陰性。3)特異性將血清在同一條件下(按《附錄》進(jìn)行)，分別與禽流感、雞新城疫、減 蛋綜合征病毒抗原進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)，血清對禽流感H5、H7、H9亞型、雞新城疫、減 蛋綜合征病毒抗原均為陰性反應(yīng)。(3)血清的配制按總量的3%加入海藻糖(由北京拜爾迪生物公司生產(chǎn))和 0. 5%的甘氨酸(由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))作為凍干保護(hù)劑并充分?jǐn)嚢杈?勻，并按《中國獸藥典》無菌檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長。4)分裝與凍干按anl/瓶進(jìn)行定量分裝，分裝后迅速冷凍真空干燥凍干(按《中 華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國獸用生物制 品規(guī)程二〇〇〇年版.化學(xué)工業(yè)出版社，2001，本發(fā)明簡稱《規(guī)程》)進(jìn)行。(5)成品檢驗(yàn)1)物理性狀呈微黃色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁分離，加稀釋液后迅速溶解，溶 解后的外觀應(yīng)與液體血清相同。2)無菌檢驗(yàn)按《中國獸藥典》無菌檢驗(yàn)法進(jìn)行，應(yīng)無菌生長。
3)效價(jià)測定同陽性血清。4)特異性同陽性血清。5)剩余水分測定按《中國獸藥典》剩余水分測定法進(jìn)行，應(yīng)低于3%。6)真空度測定按《中國獸藥典》真空度測定法進(jìn)行，符合規(guī)定。二、H9亞型陽性血清、弱陽性血清和陰性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用陽性血清和弱陽性血清系用青年SPF雞，經(jīng)肌肉注射禽流感病毒H5W亞型(R5 株)油乳劑滅活疫苗后，采集SPF雞血清并進(jìn)行半成品檢驗(yàn)，加入適宜穩(wěn)定劑后凍干；陰性 血清系采自SPF雞血，分離血清并進(jìn)行半成品檢驗(yàn)，凍干而成。主要用于禽流感病毒H5W亞型Re-5株HI試驗(yàn)對照。1.標(biāo)準(zhǔn)抗原的稀釋取禽流感H5W亞型Re-5株抗原凍干安瓿1支，啟封后加Iml 生理鹽水恢復(fù)原量；先做10倍、20倍稀釋。然后依次進(jìn)行80、160、240、320、400、480、560倍稀釋。2.紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(1)取96孔V型微量血凝板，每一稀釋度分別取25 μ L加入到孔中，加入生理鹽水 25 μ L，再加入1 %雞紅細(xì)胞懸液25 μ Lo(2)對照50 μ L生理鹽水+25 μ L 1 %雞紅細(xì)胞懸液。(3)在微量振蕩器振蕩Imin ^iin。(4)室溫(Μ )放置30min，判定結(jié)果。將血凝板傾斜70。且靜置10秒左 右開始記錄，凡反應(yīng)孔底部有紅細(xì)胞沉積且沿傾斜面向下呈淚珠狀流淌，呈現(xiàn)與紅細(xì)胞對 照孔一樣者為完全不凝集孔(_)；反應(yīng)孔底部有紅細(xì)胞沉積且沿傾斜面緩慢向下呈淚珠狀 流淌者為不完全凝集孔(+)；反應(yīng)孔底部有紅細(xì)胞沉積但不沿傾斜面流淌者為50%凝集 孔(++)；除底部有少許紅細(xì)胞外，反應(yīng)孔其他部位幾乎為完全凝集孔者(+++)；反應(yīng)孔底部 無紅細(xì)胞，整個(gè)反應(yīng)孔完全凝集者為完全凝集孔(#)。(5)結(jié)論完全凝集孔對應(yīng)的最高稀釋度應(yīng)為300士60倍。3.微量血凝抑制試驗(yàn)(1)4ΗΑ·抗原的配制與驗(yàn)證1)抗原稀釋方法將抗原先進(jìn)行10倍稀釋，再稀釋為含4ΗΑ·血凝素。將配制的4ΗΑ·血凝素用生 理鹽水進(jìn)行1 2、1 3、1 4、1 5、1 6和1 7稀釋。2)取96孔V型微量血凝板，每一稀釋度分別取25 μ L加入到孔中，加入生理鹽水 25 μ L，再加入1 %雞紅細(xì)胞懸液25 μ Lo3)對照50 μ L生理鹽水+25 μ L 1 %雞紅細(xì)胞懸液。4)以上試驗(yàn)做2個(gè)平行重復(fù)。5)在微量振蕩器振蕩Imin ^iiin。6)室溫04 )放置30min，判定結(jié)果。7)判定標(biāo)準(zhǔn)如果配制的抗原液為4HA·，則1 4稀釋度將給出100%凝集點(diǎn)，即 反應(yīng)孔底部無紅細(xì)胞，整個(gè)反應(yīng)孔完全凝集；如果4HA·高于4個(gè)單位，可能1 5或1 6 為100%凝集點(diǎn)；如果較低，則可能1 2或1 3為100%凝集點(diǎn)。應(yīng)根據(jù)測定結(jié)果適當(dāng) 調(diào)整，其準(zhǔn)確稀釋倍數(shù)=使100%紅細(xì)胞凝集終點(diǎn)的稀釋倍數(shù)XM0/4，使抗原工作液確為碰100。( 血清的稀釋1)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的的稀釋血清恢復(fù)原量后，依次進(jìn)行10倍、20倍稀釋；然后 進(jìn)行然后進(jìn)行160、240、320、400、480、560倍稀釋。將稀釋好的陽性血清每一稀釋倍數(shù)取 0. 025ml，分別加入到V型微量反應(yīng)板對應(yīng)孔中。2)陰性血清的稀釋在V型微量反應(yīng)板中，每孔加0. 025ml生理鹽水；第1孔加 入恢復(fù)原量后的陰性血清0. 025ml,反復(fù)抽打3 5次混勻；從第1孔吸取0. 025ml血清 加入第2孔，混勻后吸取0. 025ml加入第3孔，如此進(jìn)行對倍稀釋至第6孔，從第6孔吸取 0. 025ml 棄去。3)被檢血清的稀釋血清恢復(fù)原量后，依次進(jìn)行10倍、20倍稀釋；然后進(jìn)行160、 240、320、400、480、560倍…依次遞增80倍稀釋。將稀釋好的陽性血清每一稀釋倍數(shù)取 0. 025ml，分別加入到V型微量反應(yīng)板對應(yīng)孔中。(3) V型微量反應(yīng)板上所有血清孔加入4HA·的抗原液25 μ L。最后1排設(shè)50 μ L 生理鹽水和25 μ L生理鹽水+25 μ L 4ΗΑ100抗原(各4個(gè)孔)做對照。(4)充分振蕩后，室溫( )下靜置30min。每孔再加入雞紅細(xì)胞懸液 25 μ L，充分振蕩。(5)室溫(Μ )放置30min后判定結(jié)果。將血凝板傾斜70°且靜置10秒 左右開始記錄，凡反應(yīng)孔底部有紅細(xì)胞沉積且沿傾斜面向下呈淚珠狀流淌，呈現(xiàn)與紅細(xì)胞 對照孔一樣者為完全不凝集孔(_)；反應(yīng)孔底部有紅細(xì)胞沉積且沿傾斜面緩慢向下呈淚珠 狀流淌者為不完全凝集孔(+)；反應(yīng)孔底部有紅細(xì)胞沉積但不沿傾斜面流淌者為50%凝集 孔(++)；除底部有少許紅細(xì)胞外，反應(yīng)孔其他部位幾乎為完全凝集孔者(+++)；反應(yīng)孔底部 無紅細(xì)胞，整個(gè)反應(yīng)孔完全凝集者為完全凝集孔(#)。(6)結(jié)論陽性血清為200士40倍，陰性血清稀釋孔為(+)、(++)、(+++)或(#) ；50 μ L生理鹽 水對照孔為㈠，25 μ L生理鹽水+25 μ L 4ΗΑ100抗原孔為(#)，此時(shí)試驗(yàn)方可判為成立。被 校定血清的完全不凝集孔對應(yīng)的最高稀釋度即為該血清的紅細(xì)胞凝集抑制價(jià)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明涉及禽流感病毒H5W亞型Re-5株陽性血清和陰性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及制備 方法。本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)陽性血清和弱陽性血清系用青年或成年SPF雞，經(jīng)肌肉注射禽流感病毒 H5m亞型(Re-5株)油乳劑滅活疫苗后，采集SPF雞血清并進(jìn)行半成品檢驗(yàn)，加入適宜穩(wěn)定 劑后凍干；陰性血清系采自SPF雞血，分離血清并進(jìn)行半成品檢驗(yàn)，凍干；經(jīng)成品檢驗(yàn)、均一 性檢驗(yàn)及穩(wěn)定性檢驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)定、定值等一系列的工藝過程而制成。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是 禽流感H5亞型準(zhǔn)確診斷、H5N1亞型(Re-5株)的免疫監(jiān)測及對其疫苗免疫效果進(jìn)行正確 評(píng)價(jià)的根本保障，提高禽流感的防控水平。對禽流感H5亞型進(jìn)行診斷和相關(guān)產(chǎn)品檢驗(yàn)工作 進(jìn)行評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制的基本保障。實(shí)施例1陽性血清制造及半成品檢驗(yàn)1.陽性血清制造(1)免疫選用3 4月齡SPF雞飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器內(nèi)，用制備的禽流感滅活疫苗以胸部肌肉注射方式2次接種疫苗，第一次接種劑量為1.0ml/只，間隔21日后進(jìn)行第二次 接種，劑量為1. 5ml/只，且分點(diǎn)注射。(2)試血于第2次免疫接種后觀日，用翅下靜脈采血方式采集血清，采血同時(shí)對 雞和血清對應(yīng)編號(hào)，分別測定HI抗體效價(jià)(按《附錄》進(jìn)行)，挑選HI抗體效價(jià)> 91og2 的SPF雞備用。(3)血清的分離選HI抗體效價(jià)彡91og2的SPF雞用20ml無菌注射器在負(fù)壓隔 離器內(nèi)進(jìn)行心臟采血，血液采集完畢后先置于37°C 4h，然后再置于4°C冰箱內(nèi)過夜，在無菌 室超凈工作臺(tái)內(nèi)提取血清，若血清中混有紅血球，應(yīng)對其進(jìn)行無菌離心后混合于同一滅菌 后的容器內(nèi)。2.陽性血清半成品的檢驗(yàn)(1)無菌檢驗(yàn)對混合后的血清取樣，按《中國獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌或霉菌 生長。(2)HI抗體價(jià)的測定按附錄進(jìn)行HI抗體價(jià)的測定，結(jié)果應(yīng)> 91og2。(3)特異性鑒定將待檢血清在同一條件下分別與H5、H7和H9亞型禽流感、雞新 城疫、減蛋綜合征病毒抗原進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)(按《附錄》進(jìn)行)，僅與禽流感病毒H9 亞型抗原呈陽性反應(yīng)(HI ^ 71og2)，與H7和H9亞型禽流感、雞新城疫、減蛋綜合征病毒抗 原均應(yīng)為陰性反應(yīng)(HI ( 41og2)。(4)血清的配制經(jīng)檢驗(yàn)合格的血清按總量的3%加入海藻糖(由北京拜爾迪生 物公司生產(chǎn))和0. 5%的甘氨酸(由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))作為凍干保護(hù) 劑并充分?jǐn)嚢杈鶆?，并按《中國獸藥典》無菌檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長。(5)分裝與凍干將配好的抗原液用安瓿進(jìn)行分裝，每瓶lml，分裝后迅速放入凍 干機(jī)內(nèi)進(jìn)行冷凍真空干燥。凍干后扎鋁蓋、標(biāo)號(hào)后放置-20°C保存。實(shí)施例2弱陽性血清制造及半成品檢驗(yàn)1.弱陽性血清制造(1)免疫選用3 4月齡SPF雞飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器內(nèi)，用制備的禽流感滅活疫苗 以胸部肌肉注射方式接種疫苗，接種劑量為0. 5ml/只。(2)試血于免疫接種后14 21日，用翅下靜脈采血方式采集血清，采血同時(shí)對 雞和血清對應(yīng)編號(hào)，分別測定HI抗體效價(jià)(按附錄進(jìn)行)，挑選HI抗體效價(jià)為51og2的SPF 雞備用。(3)血清的分離選HI抗體效價(jià)51og2的SPF雞用20ml無菌注射器在負(fù)壓隔離 器內(nèi)進(jìn)行心臟采血，血液采集完畢后先置于37°C 4h，然后再置于4°C冰箱內(nèi)過夜，在無菌室 超凈工作臺(tái)內(nèi)提取血清，若血清中混有紅血球，應(yīng)對其進(jìn)行無菌離心后混合于同一滅菌后 的容器內(nèi)。2.弱陽性血清半成品的檢驗(yàn)(1)無菌檢驗(yàn)對混合后的血清取樣，按《中國獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌或霉菌 生長。若有雜菌污染，應(yīng)用0.22 μ的濾膜對其進(jìn)行過濾除菌。(2) HI抗體價(jià)的測定按附錄進(jìn)行HI抗體價(jià)的測定，結(jié)果應(yīng)為HI價(jià)< 81og2，而 > 41og2。
(3)特異性鑒定將待檢血清在同一條件下分別與H5、H7和H9亞型禽流感、雞新 城疫、減蛋綜合征病毒抗原進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)(按《附錄》進(jìn)行)，僅與禽流感病毒H9 亞型抗原呈陽性反應(yīng)(HI價(jià)< 81og2，而> 41og2)，與H7和H9亞型禽流感、雞新城疫、減蛋 綜合征病毒抗原均應(yīng)為陰性反應(yīng)。(4)血清的配制經(jīng)檢驗(yàn)合格的血清按總量的3%加入海藻糖(由北京拜爾迪生 物公司生產(chǎn))和0. 5%的甘氨酸(由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))作為凍干保護(hù) 劑并充分?jǐn)嚢杈鶆颍础吨袊F藥典》無菌檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長。(5)分裝與凍干將配好的抗原液用安瓿進(jìn)行分裝，每瓶1ml，分裝后迅速放入凍 干機(jī)內(nèi)進(jìn)行冷凍真空干燥。凍干后扎鋁蓋、標(biāo)號(hào)后放置-20°C保存。實(shí)施例3陰性血清制造及半成品檢驗(yàn)1.陰性血清制造青年SPF雞飼養(yǎng)于生物安全動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的負(fù)壓隔離器內(nèi)，以無菌注射器在生物 安全動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的負(fù)壓隔離器內(nèi)進(jìn)行心臟采血，血液采集完畢后先置于37°C 4h，然后再 置于4°C冰箱內(nèi)過夜，在無菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)提取血清，然后混合于同一滅菌后的容器內(nèi)。2.陰性血清半成品的檢驗(yàn)(1)菌檢驗(yàn)對混合后的血清取樣，按《中國獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌或霉菌生長。(2)效價(jià)測定按附錄測定HI抗體效價(jià)，應(yīng)為陰性。(3)特異性將血清在同一條件下(按《附錄》進(jìn)行)，分別與禽流感、雞新城疫、 減蛋綜合征病毒抗原進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)，血清對禽流感H5、H7、H9亞型、雞新城疫、 減蛋綜合征病毒抗原均為陰性反應(yīng)。(4)血清的配制按總量的3%加入海藻糖(由北京拜爾迪生物公司生產(chǎn))和 0.5%的甘氨酸(由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))作為凍干保護(hù)劑并充分?jǐn)嚢杈?勻，并按《中國獸藥典》無菌檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長。(5)分裝與凍干按aiil/瓶進(jìn)行定量分裝，分裝后迅速冷凍真空干燥凍干(按照 《規(guī)程》方法進(jìn)行)。實(shí)施例4血清成品檢驗(yàn)1.物理性狀檢驗(yàn)結(jié)果均為微黃色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。2.無菌檢驗(yàn)結(jié)果檢驗(yàn)結(jié)果見表1，所有凍干制品全部呈陰性。表1無菌檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)表
權(quán)利要求
1.一種禽流感病毒H5m亞型Re-5株陽性血清和陰性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其特征在于(1)陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有強(qiáng)陽性血清和弱陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，此兩種陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物 質(zhì)只與禽流感病毒H5m亞型Re-5株抗原呈陽性反應(yīng)，強(qiáng)陽性血清的HI價(jià)> 81og2,弱陽性 血清的HI價(jià)< 81og2而> 41og2 ；此兩種陽性血清與H7和H9亞型禽流感、雞新城疫、減蛋 綜合征病毒抗原均應(yīng)為陰性反應(yīng)；(2)陰性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在同一條件下，分別與禽流感、雞新城疫、減蛋綜合征病毒抗原 進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)，血清對禽流感H5、H7和H9亞型、雞新城疫、減蛋綜合征病毒抗原 均為陰性反應(yīng)。
2.一種禽流感病毒H5W亞型Re-5株陽性血清和陰性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特 征在于(1)按常規(guī)方法用禽流感病毒H5W亞型Re-5株病毒制備的油乳劑滅活疫苗；(2)陽性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物系用青年或成年SPF雞，經(jīng)肌肉注射禽流感病毒H5W亞 型Re-5株油乳劑滅活疫苗1)制備強(qiáng)陽性血清候選物，經(jīng)2次免疫后，選取HI抗體效價(jià)>81og2的免疫雞只，分別 采集雞血清并進(jìn)行半成品檢驗(yàn)后混合，加入適宜穩(wěn)定劑后凍干；2)制備弱陽性血清候選物僅1次免疫，選取HI抗體效價(jià)<81og2而> 41og2的免疫雞 只，分別采集雞血清并進(jìn)行半成品檢驗(yàn)后混合，加入適宜穩(wěn)定劑后凍干；(3)陰性血清系采自SPF雞血，分離血清并進(jìn)行半成品檢驗(yàn)，凍干；(4)以上制備的強(qiáng)陽性血清、弱陽性血清和陰性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物經(jīng)檢驗(yàn)、均一性檢 驗(yàn)及穩(wěn)定性檢驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)定、定值等一系列的工藝過程而成為強(qiáng)陽性血清、弱陽性 血清和陰性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1-2所述的一種禽流感病毒H5W亞型Re-5株陽性血清和陰性血清標(biāo)準(zhǔn) 物質(zhì)及制備方法，其特征在于使用的凍干保護(hù)劑為按血清總量的3%加入海藻糖和0. 5% 的甘氨酸作為凍干保護(hù)劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及禽流感病毒H5N1亞型Re-5株陽性血清和陰性血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及制備方法。本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)陽性血清(強(qiáng)陽性血清和弱陽性血清)系用青年或成年SPF雞，經(jīng)肌肉注射禽流感病毒H5N1亞型Re-5株油乳劑滅活疫苗后，采集SPF雞血清并進(jìn)行半成品檢驗(yàn)，加入適宜穩(wěn)定劑后凍干；陰性血清系采自SPF雞血，分離血清并進(jìn)行半成品檢驗(yàn)，凍干；經(jīng)成品檢驗(yàn)、均一性檢驗(yàn)及穩(wěn)定性檢驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)定、定值等一系列的工藝過程而制成。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是禽流感H5N1亞型準(zhǔn)確診斷和H5N1亞型Re-5株的免疫監(jiān)測及對其疫苗免疫效果進(jìn)行正確評(píng)價(jià)的根本保障，提高禽流感的防控水平。對禽流感H5N1亞型進(jìn)行診斷和相關(guān)產(chǎn)品檢驗(yàn)工作進(jìn)行評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制的基本保障。
文檔編號(hào)C07K16/18GK102050876SQ201010532298
公開日2011年5月11日 申請日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者劉景利, 孫建宏, 張從祿, 徐姍姍, 楊帆, 田國彬, 胡井雷, 韓正博 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所