專利名稱：一種肺泡表面活性蛋白質(zhì)(sp-b和sp-c)的分離純化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種肺表面活性蛋白質(zhì)(SP-B和SP-C)的分離純化方法，特別是以新 鮮豬肺為原料進行分離純化的方法。
背景技術：
哺乳動物肺泡表面活性物質(zhì)(Pulmonary Surfactant,簡稱PS)是由肺泡II型上 皮細胞分泌的具有多相的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的混合物，PS的主要功能是降低肺泡表面張力，防 止肺泡在呼氣末期萎縮。SP-B和SP-C是PS中的兩種疏水性蛋白，它們在呼吸過程中均扮
演著重要角色。在應用生物學領域，大規(guī)模的且經(jīng)濟的蛋白質(zhì)提純方法，越來越重要。一般來說， 蛋白質(zhì)主要來自細胞培養(yǎng)，即在哺乳動物細胞或者細菌細胞內(nèi)植入能夠促進目標蛋白質(zhì)合 成的質(zhì)粒。有關蛋白質(zhì)純化的方法，中國專利CN1214614A提出了一種油料籽仁蛋白質(zhì)的提 取方法，該方法使用食品級鹽溶液，通過浸提具有相當脂肪含量的油料籽仁粗粉，來促使油 料籽仁粗粉中的蛋白質(zhì)及脂肪發(fā)生溶解，形成蛋白質(zhì)水溶液，再通過冷卻蛋白質(zhì)水溶液的 方法除去蛋白質(zhì)水溶液中脂肪的方法。中國專利CN1216685A提出了一種富含葡糖苷配基 異黃酮的植物蛋白提取物和分離物及其生產(chǎn)和回收方法。該方法用具有高于大約蛋白質(zhì)物 質(zhì)等電點的PH的含水提取劑提取包含葡糖苷異黃酮的植物蛋白物質(zhì)。目前尚無有關SP-B 和SP-C從哺乳動物細胞中的分離和純化的相關報道，為了填補這一空白，本發(fā)明提出了如 下方案，獲得純化的SP-B和SP-C。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是將哺乳動物肺部細胞內(nèi)的表面活性蛋白質(zhì)(SP-B和SP-C)分離出 來并進行純化。本發(fā)明的方法包括如下步驟(1) 一只正常的新鮮豬肺，用自來水沖去表面血跡后，順著主氣管向其中灌入溫度 為25 40°C的生理鹽水，并擠壓豬肺，收集溢出的泡沫，重復上述過程10 20次，直至豬 肺的主氣管內(nèi)基本無泡沫溢出，得到泡沫與生理鹽水的混合物；(2)將步驟(1)所得混合物倒入2000ml的分液漏斗中，靜置5min，放出下層液體， 并將剩余物轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)進行離心分離，離心機轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/分，離心時間為45min ；(3)離心完畢，將泡沫層刮出，放入250ml分液漏斗中，加入氯仿/甲醇(體積比為 1 1)混合液50 60ml，充分混合后靜置30min，收集下層清液；(4)將步驟(3)所得下層清液倒入250ml單口燒瓶中，減壓蒸餾，除去部分溶劑，得 濃縮液20 30ml ；(5)將步驟(4)所得濃縮液加入層析柱中進行分離，柱子的固定相為葡聚糖凝膠 LH-60，柱長為50cm，柱子內(nèi)經(jīng)為lcm，流動相為氯仿/甲醇(體積比1 1)的混合溶液，收 集排出體積為90 130ml的產(chǎn)品共40ml，即為SP-B溶液，再收集排出體積為170 210ml的產(chǎn)品共40ml,即為SP-C溶液；(6)分別將步驟(5)得到的SP-B溶液和SP-C溶液進行減壓蒸餾，除去溶劑即得純 化的肺表面活性蛋白質(zhì)。所述的每次向豬肺主氣管中灌入的生理鹽水的體積為60 80ml，最后獲得的泡 沫與生理鹽水的混合物的體積約為600 1600ml。所述的由步驟(1)得到的泡沫與生理鹽水的混合物靜置后，放出的下層液體體積 約為 450 1450ml ο所述的兩次減壓蒸餾的溫度均為40 50°C。所述的柱層析分離法中，柱子溫度為30 40°C，層析分離時控制流動相流速為 15 20ml/h。本發(fā)明的創(chuàng)新點在于提取豬肺中的表面活性物質(zhì)，并采用葡聚糖凝膠色譜柱分離 出表面活性蛋白，所得的蛋白質(zhì)具有較高的純度。
具體實施例方式實施例1一只正常的新鮮豬肺，用自來水沖去表面血跡后，順著主氣管向其中灌入溫度為 25°C的生理鹽水60ml，并擠壓豬肺，收集溢出物，重復上述過程10次，直至豬肺的主氣管內(nèi) 基本無泡沫溢出，共獲得泡沫與生理鹽水的混合物約為600ml。將混合物倒入2000ml分液 漏斗中，靜置5min，放出下層液體約450ml，并將剩余物轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)進行離心分離。離 心機轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/分，離心時間為45min。離心完畢，用小勺將分離得到的上層泡沫刮 出，放入250ml分液漏斗中，加入氯仿/甲醇(體積比為1 1)混合液50ml，充分混合后靜 置30min，收集下層清液。將下層清液倒入250ml單口燒瓶中，在40°C減壓蒸餾，除去部分 溶劑，得到濃縮溶液20ml ；將該濃縮液加入層析柱中進行分離，柱子的固定相為葡聚糖凝 膠LH-60，流動相為氯仿/甲醇(體積比1 1)的混合溶液，柱長為50cm，柱子內(nèi)經(jīng)為lcm， 柱子溫度為30°C，控制流動相流速為15ml/h，收集排出體積為90 130ml的產(chǎn)品共40ml， 即為SP-B溶液，采用液相色譜分析，純度為98. 8% (不計溶劑)，再收集排出體積為170 210ml的產(chǎn)品共40ml，即為SP-C溶液，采用液相色譜分析，純度為98.5% (不計溶劑)；分 別將上述兩種溶液在40°C下減壓蒸餾，分別得SP-B (98. 8% )4. lmg、SP-C(98. 5% ) 2. Omgo實施例2一只正常的新鮮豬肺，用自來水沖去表面血跡后，順著主氣管向其中灌入溫度為 40°C的生理鹽水80ml，并擠壓豬肺，收集溢出物，重復上述過程10次，直至豬肺的主氣管內(nèi) 基本無泡沫溢出，共獲得泡沫與生理鹽水的混合物約為800ml。將混合物倒入2000ml分液 漏斗中，靜置5min，放出下層液體約650ml，并將剩余物轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)進行離心分離。離 心機轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/分，離心時間為45min。離心完畢，用小勺將分離得到的上層泡沫刮 出，放入250ml分液漏斗中，加入氯仿/甲醇(體積比為1 1)混合液60ml，充分混合后 靜置30min，收集下層清液。將下層清液倒入250ml單口燒瓶中，在50°C減壓蒸餾，除去部 分溶劑，即得到濃縮溶液30ml ；將該濃縮液加入層析柱中進行分離，柱子的固定相為葡聚 糖凝膠LH-60，流動相為氯仿/甲醇(體積比1 1)的混合溶液；柱長為50cm，柱子內(nèi)經(jīng)為 lcm，柱子溫度為40°C，控制流動相流速為20ml/h。收集經(jīng)過柱層析分離得到的產(chǎn)品，收集排出體積為90 130ml的產(chǎn)品共40ml，即為SP-B溶液，采用液相色譜分析，純度為98. 5% (不計溶劑)，再收集排出體積為170 210ml的產(chǎn)品共40ml，即為SP-C溶液，采用液相 色譜分析，純度為98.7% (不計溶劑)；分別將上述兩種溶液在40°C下減壓蒸餾，分別得 SP-B(98. 5% )5. 6mg, SP-C(98. 7% )2. 6mgo實施例3一只正常的新鮮豬肺，用自來水沖去表面血跡后，順著主氣管向其中灌入溫度為 30°C的生理鹽水70ml，并擠壓豬肺，收集溢出物，重復上述過程16次，直至豬肺的主氣管內(nèi) 基本無泡沫溢出，共獲得泡沫與生理鹽水的混合物約為1150ml ；將混合物倒入2000ml分液 漏斗中，靜置5min，放出下層液體約980ml，并將剩余物轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)進行離心分離，離 心機轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/分，離心時間為45min，離心完畢，用小勺將分離得到的上層泡沫刮出， 放入250ml分液漏斗中，加入氯仿/甲醇(體積比為1 1)混合液55ml，充分混合后靜置 30min,收集下層清液。將下層清液倒入250ml單口燒瓶中，在45°C減壓蒸餾，除去部分溶 劑，得到濃縮溶液26ml ；將該濃縮液加入層析柱中進行分離，柱子的固定相為葡聚糖凝膠 LH-60，流動相為氯仿/甲醇(體積比1 1)的混合溶液；柱長為50cm，柱子內(nèi)經(jīng)為lcm， 柱子溫度為35°C，控制流動相流速為20ml/h，收集排出體積為90 130ml的產(chǎn)品共40ml， 即為SP-B溶液，采用液相色譜分析，純度為99.0% (不計溶劑)，再收集排出體積為170 210ml的產(chǎn)品共40ml，即為SP-C溶液，采用液相色譜分析，純度為98.7% (不計溶劑)；分 別將上述兩種溶液在45°C下減壓蒸餾，分別得SP-B (99. 0% )4. 9mg, SP-C(98. 7% ) 2. 2mg。實施例4一只正常的新鮮豬肺，用自來水沖去表面血跡后，順著主氣管向其中灌入溫度為 35°C的生理鹽水80ml，并擠壓豬肺，收集溢出物，重復上述過程20次，直至豬肺的主氣管內(nèi) 基本無泡沫溢出，共獲得泡沫與生理鹽水的混合物約為1600ml。將混合物倒入2000ml分 液漏斗中，靜置5min，放出下層液體約1450ml，并將剩余物轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)進行離心分離。 離心機轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/分，離心時間為45min，離心完畢，用小勺將分離得到的上層泡沫刮 出，放入250ml分液漏斗中，加入氯仿/甲醇(體積比為1 1)混合液60ml，充分混合后 靜置30min，收集下層清液，將下層清液倒入250ml單口燒瓶中，在45°C減壓蒸餾，除去部 分溶劑，得濃縮液30ml ；將該濃縮液加入層析柱中進行分離，柱子的固定相為葡聚糖凝膠 LH-60，流動相為氯仿/甲醇(體積比1 1)的混合溶液，柱長為50cm，柱子內(nèi)經(jīng)為1cm，柱 子溫度為30°C，控制流動相流速為18ml/h，收集排出體積為90 130ml的產(chǎn)品共40ml，即 為SP-B溶液，采用液相色譜分析，純度為98. 9% (不計溶劑)，再收集排出體積為170 210ml的產(chǎn)品共40ml，即為SP-C溶液，采用液相色譜分析，純度為98.7% (不計溶劑)；分 別將上述兩種溶液在50°C下減壓蒸餾，分別得SP-B(99. 0% )6. 2mg, SP-C(98. 7% )3. Omgo
權利要求
一種肺泡表面活性蛋白質(zhì)(SP B和SP C)的分離純化方法，其特征在于包括以下步驟(1)一只正常的新鮮豬肺，用自來水沖去表面血跡后，順著主氣管向其中灌入溫度為25～40℃的生理鹽水，并擠壓豬肺，收集流出的泡沫和水，重復上述過程10～20次，直至豬肺的主氣管內(nèi)基本無泡沫溢出，得到泡沫與生理鹽水的混合物；(2)將步驟(1)所得混合物倒入2000ml的分液漏斗中，靜置5min，放出下層液體，并將剩余物轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)進行離心分離，離心機轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/分，離心時間為45min；(3)離心完畢，將泡沫層刮出，放入250ml分液漏斗中，加入氯仿/甲醇(體積比為1∶1)混合液50～60ml，充分混合后靜置30min，收集下層清液；(4)將步驟(3)所得下層清液倒入250ml單口燒瓶中，減壓蒸餾，除去部分溶劑，即得到濃縮后的肺泡表面活性物的混合溶液20～30ml；(5)將步驟(4)所得混合液加入層析柱中進行分離，柱子的固定相為葡聚糖凝膠LH 60，柱長為50cm，柱子內(nèi)經(jīng)為1cm，流動相為氯仿/甲醇(體積比1∶1)的混合溶液，收集排出體積為90～130ml的產(chǎn)品共40ml，即為SP B溶液，再收集排出體積為170～210ml的產(chǎn)品共40ml，即為SP C溶液；(6)將步驟(5)得到的SP B溶液和SP C溶液分別進行減壓蒸餾，除去溶劑即得純化的SP B和SP C。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，每次向豬肺主氣管中灌入的生理鹽水的 體積為60 80ml，最后獲得的泡沫與生理鹽水的混合物的體積約為600 1600ml。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，由步驟(1)得到的泡沫與生理鹽水的混合 物靜置后，放出的下層液體體積約為450 1450ml。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，兩次減壓蒸餾的溫度均為40 50°C。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的柱層析分離法中，柱子溫度為30 40°C，層析分離時控制流動相流速為15 20ml/h。
6.采用權利要求1 5任一項所述方法分離純化肺泡表面活性蛋白質(zhì)(SP-B和SP-C)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種肺泡表面活性蛋白(SP-B和SP-C)的分離純化方法，主要包括如下步驟(1)灌洗豬肺主氣管，收集溢出的泡沫；(2)向收集到泡沫中加入氯仿/甲醇(體積比為1∶1)的混合液并進行充分混合后，收集下層清液；(3)將(2)中收集到的下層清液進行減壓蒸餾，獲得的溶液放入冰箱儲存?zhèn)溆茫?4)將(3)中得到的溶液加入凝膠色譜柱中進行分離純化，收集對應排除體積的產(chǎn)品，并對其進行減壓蒸餾，獲得肺泡表面活性蛋白(SP-B和SP-C)。本發(fā)明涉及一種肺泡表面活性蛋白SP-B和SP-C的分離純化方法，特別是以新鮮豬肺為原料進行分離純化的方法。
文檔編號C07K14/475GK101948526SQ20101027279
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月2日 優(yōu)先權日2010年9月2日
發(fā)明者張娟, 曾作祥, 王丹, 薛為嵐 申請人:華東理工大學