專利名稱：大豆蛋白免疫活性肽的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大豆活性肽的制備方法，尤其涉及一種具有免疫功能的大豆蛋白活性肽的制備方法以及由該方法制備得到的產(chǎn)品，屬于大豆加工領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)且是大豆的故鄉(xiāng)，大豆的產(chǎn)量居世界第四位，而大豆的加工利用卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于國(guó)外先進(jìn)國(guó)家。作為農(nóng)作物的大豆要實(shí)現(xiàn)高附加值就必須提高加工技術(shù)、加工產(chǎn)品檔次。近年來(lái)，我國(guó)的大豆精深加工產(chǎn)品已有了一定的發(fā)展，從豆乳粉到大豆分離蛋白到大豆生理功能成份的開發(fā)都充分體現(xiàn)了加工技術(shù)的進(jìn)步。但由于管理和多方面的原因，我國(guó)的大豆分離蛋白企業(yè)都不景氣，國(guó)內(nèi)近百家的大豆蛋白企業(yè)，其中大部分停產(chǎn)或半停產(chǎn)。就產(chǎn)品而言，大豆分離蛋白本身就是一個(gè)附加值高的大豆精深加工產(chǎn)品，由于它的多樣功能特性而廣泛地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，而我國(guó)的分離蛋白生產(chǎn)之所以不景氣，是因?yàn)楫a(chǎn)品性能單一，品種單一，質(zhì)量不穩(wěn)定，致使其應(yīng)用受到很大限制，這是滯銷的一個(gè)主要原因。因而開發(fā)大豆的各個(gè)功能特性，提高產(chǎn)品質(zhì)量，增加產(chǎn)品品種，并協(xié)同應(yīng)用研究將是我國(guó)大豆蛋白開發(fā)的又一新起點(diǎn)。
眾所周知，生物修飾技術(shù)是二十一世紀(jì)首推的安全可靠的高新技術(shù)，其中的酶改性也是食品工業(yè)的首選，利用生物修飾技術(shù)對(duì)大豆蛋白進(jìn)行改性即通過(guò)蛋白酶水解大豆蛋白，改變其功能特性，是一種制造低粘度、高分散性，發(fā)揮產(chǎn)物特殊特性的一種有效方法，而且作用條件溫和、專一性強(qiáng)，并且這種處理對(duì)大豆蛋白功能性質(zhì)的改變包括增大溶解度、阻止熱凝結(jié)、增大泡沫體積。水解控制適度既可達(dá)到理想效果又不破壞專門用途對(duì)功能的要求。由于生物改性的安全性及適用性，因此具有很好的應(yīng)用前景，目前國(guó)內(nèi)對(duì)此項(xiàng)研究尚處于起步階段，市場(chǎng)上各種功能性大豆蛋白的產(chǎn)品也均為進(jìn)口產(chǎn)品。
在美國(guó)、日本生物改性大豆蛋白的研究與開發(fā)已進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化階段，主要關(guān)鍵技術(shù)為蛋白酶的選擇及產(chǎn)物苦味的控制，開展了從簡(jiǎn)單的復(fù)合水解物到單組分功能性水解產(chǎn)物分離的研究，并開發(fā)多系列產(chǎn)品。
國(guó)外大豆的加工業(yè)發(fā)展水平高于我國(guó)，以美國(guó)、日本為代表西方國(guó)家。不論在基礎(chǔ)研究還是生產(chǎn)應(yīng)用上都非常先進(jìn)，集團(tuán)化大豆產(chǎn)業(yè)早已形成，資金雄厚，產(chǎn)品多樣化，應(yīng)用廣泛，產(chǎn)量大。大豆食品生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)了規(guī)模化和現(xiàn)代化、對(duì)大豆保健成分進(jìn)行深入開發(fā)、綜合開發(fā)。2005年美國(guó)大豆蛋白質(zhì)、大豆纖維和大豆異黃酮等大豆原料銷售額增加至6.529億美元。目前，技術(shù)趨勢(shì)是采用現(xiàn)代食品分離技術(shù)、微膠囊造粒技術(shù)、酶促反應(yīng)等生物工程技術(shù)，其中酶促反應(yīng)技術(shù)在加工過(guò)程中能保持大豆?fàn)I養(yǎng)成分，不產(chǎn)生其他化學(xué)殘留物，可改善食品風(fēng)味提高食品的功能價(jià)值，大大拓寬了大豆精深加工利用的范圍，提高了綜合開發(fā)能力。
大豆肽是一種比大豆蛋白更為優(yōu)質(zhì)、新型的大豆蛋白酶改性產(chǎn)品。大豆肽具有易消化吸收，能迅速供給機(jī)體能量，無(wú)蛋白變性，無(wú)豆腥味，液體粘性小和受熱不凝固等特性，尤其是具有降低血清膽固醇、降血壓、增加免疫和促進(jìn)脂肪代謝等獨(dú)特的生理功能。大豆肽在食品、醫(yī)藥、日用化工等領(lǐng)域中都有開發(fā)前景和巨大的市場(chǎng)潛力。
到目前為止，免疫活性肽的研究仍處于實(shí)驗(yàn)水平，還沒(méi)有一套較為有效的制備方法?；钚噪陌传@取方法不同大致可分為四類(一)分離純化天然活性肽；(二)化學(xué)合成法；(三)重組DNA法；(四)蛋白質(zhì)酶解法。不同的方法適合不同的目的，取決于目的肽的長(zhǎng)短、數(shù)量、用途以及制備成本。每種方法也各有其優(yōu)缺點(diǎn)。天然活性肽來(lái)源少，提取成本高，不可能大規(guī)模開發(fā)應(yīng)用，另外提取的生物活性肽殘存的有機(jī)溶劑會(huì)帶來(lái)毒性問(wèn)題?；瘜W(xué)合成法廣泛用于生產(chǎn)合成高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、中等長(zhǎng)度的醫(yī)藥用肽，但是它的成本高，而且副產(chǎn)品等殘留化合物對(duì)人體有害，此方法僅在實(shí)驗(yàn)規(guī)模中使用。重組DNA技術(shù)適用于大分子肽和蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，現(xiàn)在也廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室及工業(yè)生產(chǎn)中，但與其它方法相比較發(fā)展尚未成熟。酶法生產(chǎn)功能肽有很多優(yōu)點(diǎn)，如生產(chǎn)條件溫和、產(chǎn)品安全性高且可定位生產(chǎn)特定的肽，成本低，已成為生物活性肽最主要的生產(chǎn)方法。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種大豆蛋白免疫活性肽的制備方法以及由該方法所得到的大豆蛋白免疫活性肽產(chǎn)品。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的 一種大豆蛋白免疫活性肽的制備方法，包括以下步驟將大豆分離蛋白用蛋白酶進(jìn)行水解反應(yīng)；將所得到的大豆分離蛋白水解液用超濾膜進(jìn)行超濾；收集超濾液，即得。
為了達(dá)到更好的制備效果，所述的蛋白酶可以是木瓜蛋白酶，復(fù)合蛋白酶，堿性蛋白酶或中性蛋白酶等蛋白酶；優(yōu)選為復(fù)合蛋白酶或堿性蛋白酶； 其中，采用復(fù)合蛋白酶進(jìn)行水解時(shí)，最佳的水解條件為反應(yīng)溫度為45℃，底物濃度5％(w/w)，酶用量10000IU/g，反應(yīng)時(shí)間6hr，反應(yīng)pH值為7；采用堿性蛋白酶進(jìn)行水解時(shí)，最佳的水解條件為反應(yīng)溫度50℃，底物濃度為5％(w/w)，酶用量為12000IU/g，反應(yīng)8小時(shí)，反應(yīng)pH值為9；采用木瓜蛋白酶進(jìn)行水解，最佳水解組合條件為底物濃度5％，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間6hr，酶用量7000IU/g，反應(yīng)pH6；采用中性蛋白酶進(jìn)行水解，最佳水解條件為反應(yīng)溫度45℃，底物濃度為5％，酶用量為7000IU/g，反應(yīng)6小時(shí)，在pH6.5下進(jìn)行。
所述的超濾膜優(yōu)選是分子量為3000Da的超濾膜； 所述的超濾優(yōu)選在15psi至40psi的壓力下進(jìn)行超濾，更優(yōu)選為在30psi的壓力下進(jìn)行超濾；為了達(dá)到更好的超濾效果，本發(fā)明人對(duì)影響超濾的其它因素進(jìn)行了優(yōu)化和篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大豆水解液的重量百分比濃度對(duì)于超濾效果有顯著影響，當(dāng)大豆水解液的重量百分比濃度為3％-6％時(shí)超濾的效果較好，當(dāng)其重量百分比濃度為5％時(shí)超濾的效果為最佳。另外，大豆蛋白水解液的pH值對(duì)于超濾效果也有一定的影響，當(dāng)大豆蛋白水解液的pH值為5-8時(shí)超濾效果較好，當(dāng)pH值為7時(shí)，超濾的效果為最佳。
本發(fā)明方法是酶法和膜法相結(jié)合的方法，即在酶解大豆分離蛋白后又針對(duì)所需要的功能肽段經(jīng)膜超濾有針對(duì)性的進(jìn)行分離富集，得到的活性肽產(chǎn)品功能更強(qiáng)，純度更高。本發(fā)明方法所制備得到的大豆蛋白免疫活性肽在3400Da的分子量所占的比例為70.95％；蛋白質(zhì)含量89.2％；氮含量為14.272％。
經(jīng)口投予小鼠不同劑量本發(fā)明所制備的大豆蛋白免疫活性肽30天，進(jìn)行了3類免疫功能的試驗(yàn)(即反映細(xì)胞免疫功能的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(足跖增厚法)、反映體液免疫功能的半數(shù)溶血值(HC50)的測(cè)定、反映單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)的檢測(cè))。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明方法所制備的大豆蛋白免疫活性肽可增強(qiáng)小鼠的半數(shù)溶血值和碳廓清功能，但是未見增加小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。提示本發(fā)明大豆蛋白免疫活性肽具有增強(qiáng)體液免疫功能和單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能。



圖1大豆蛋白酶解工藝流程圖。
圖2木瓜蛋白酶水解大豆分離蛋白K值對(duì)水解程度的影響結(jié)果。
圖3復(fù)合蛋白酶水解大豆分離蛋白K值對(duì)水解程度的影響結(jié)果。
圖4堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白K值對(duì)水解程度的影響結(jié)果。
圖5中性蛋白酶水解大豆分離蛋白K值對(duì)水解程度的影響結(jié)果 圖6不同壓力滲透通量變化。
圖7不同pH值滲透通量變化。
圖8不同物料濃度滲透通量變化。
圖9聚乙二醇在相應(yīng)色譜條件下工作曲線。
圖10本發(fā)明方法所制備的免疫肽的分子量分布。

具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
實(shí)驗(yàn)例1酶法水解大豆蛋白的最優(yōu)工藝條件研究實(shí)驗(yàn) 1.實(shí)驗(yàn)材料與方法 1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備 1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 大豆分離蛋白哈高科大豆食品有限公司 木瓜蛋白酶無(wú)錫杰能科生物有限公司 堿性蛋白酶NoVo公司 復(fù)合蛋白酶NoVo公司 甲醛分析純哈爾濱市新春化工廠 NaOH分析純齊齊哈爾化工總廠 中性蛋白酶無(wú)錫杰能科生物有限公司 1.1.2儀器設(shè)備 電熱恒溫水浴鍋WSZ-133-75廣東省汕頭市廣播儀器廠 酸度計(jì)PHS-3C上海雷磁儀器廠 磁力攪拌器79-1江蘇醫(yī)療儀器廠 電子天平AE200瑞典Tecator公司 1.2實(shí)驗(yàn)方法 1.2.1原料質(zhì)量分析 1)水分含量測(cè)定GB 5497-95 2)蛋白質(zhì)含量測(cè)定GB 5511-95 1.2.2酶活力測(cè)定 蛋白酶活力測(cè)定法ZB X 66030-87 1.2.3水解產(chǎn)物水解度的測(cè)定 甲醛滴定法取水解蛋白液5.00mL于小燒杯中加人60mL去CO2蒸餾水并磁力攪拌，用精密pH計(jì)指示其pH值并用0.1moL/LNaOH滴至pH＝8.2，然后加人已中和好的甲醛溶液20mL，記錄將其pH值滴至9.2時(shí)所耗0.1mol/LNaOH的mL數(shù)；作空白試驗(yàn)；則水解蛋白液中蛋白質(zhì)的一NH含量為 式中M為所用NaOH溶液的摩爾濃度，而Vl、V。為樣品滴定，空白試驗(yàn)時(shí)所耗NaOH的體積數(shù)(mL)。
1.2.5大豆蛋白酶種類篩選及最佳水解條件研究 1.2.5.1木瓜蛋白酶水解大豆蛋白最佳水解條件選擇 根據(jù)資料記載和模擬試驗(yàn)，考慮到加酶量、反應(yīng)溫度、時(shí)間、反應(yīng)pH值、底物濃度等因素的相互影響，擬采用正交實(shí)驗(yàn)來(lái)確定最佳水解條件，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)五因素四水平L16(45)正交試驗(yàn)來(lái)完成，方案見表1。
表1木瓜蛋白酶水解大豆蛋白試驗(yàn)
1.2.5.2復(fù)合蛋白酶水解大豆蛋白最佳條件選擇 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)模擬試驗(yàn)，從反應(yīng)溫度、底物濃度、酶用量、反應(yīng)時(shí)間、pH等因素考慮，設(shè)計(jì)L16正交試驗(yàn)來(lái)完成，見表2。
表2復(fù)合蛋白酶水解大豆蛋白最佳條件試驗(yàn)
1.2.5.3堿性蛋白酶水解大豆蛋白最佳條件選擇 本實(shí)驗(yàn)采用L16正交試驗(yàn)完成，方案見表3。
表3堿性蛋白酶水解大豆蛋白最佳條件試驗(yàn)
1.2.5.4中性蛋白酶水解大豆蛋白最佳條件選擇 本實(shí)驗(yàn)擬采用L16正交設(shè)計(jì)，見表4。
表4中性蛋白酶水解大豆蛋白最佳條件試驗(yàn)
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 2.1原料質(zhì)量分析 經(jīng)測(cè)定原料大豆分離蛋白的指標(biāo)為蛋白含量87.23％；水分含量4.27％。
原料蛋白質(zhì)的含量是實(shí)驗(yàn)中酶添加量及水解度計(jì)算的依據(jù)，從數(shù)據(jù)上看出采用的大豆蛋白蛋白質(zhì)含量是較高的，得到的水解產(chǎn)物含有脂肪、糖類的比例極小，所以在研究中也忽略了這些組分對(duì)水解效果的影響，即采用大豆分離蛋白進(jìn)行本項(xiàng)研究是可取的、直接的。
2.2酶解大豆蛋白最佳技術(shù)研究 2.2.1木瓜蛋白酶最佳水解條件選擇 經(jīng)測(cè)定木瓜蛋白酶的酶活力為13300IU/g。
表5木瓜蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果
從表5正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析看出，木瓜蛋白酶水解大豆蛋白各因素對(duì)水解程度的影響依次為酶用量＞反應(yīng)時(shí)間＞底物濃度＞pH＞反應(yīng)溫度。理論上反應(yīng)條件優(yōu)組合為A1B4C2D4E5。
從各因素水平K值對(duì)木瓜酶水解程度的影響結(jié)果看出底物濃度對(duì)水解程度的影響為濃度8％時(shí)為分界線，濃度小于8％，K值升高較快，由23.55升至27.28，而濃度大于8％，K值變化不大，基本處于20左右，即得出底物濃度越低，水解效果越好，但考慮到生產(chǎn)的適用性和可操作性，能源、成本計(jì)算的需要，不考慮5％以下，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)以5％的底物濃度為最低限，基本吻合生產(chǎn)企業(yè)可行狀態(tài)，故底物濃度選為5％適宜。
反應(yīng)溫度對(duì)水解程度的影響較小，40-50℃時(shí)影響不大，基本趨于平緩，但當(dāng)溫度升至50℃-70℃時(shí)，K值略有上升，但變化不大，單因素試驗(yàn)中，當(dāng)溫度高于70℃，將會(huì)在一定程度上使酶失活，基于此，本設(shè)計(jì)將上限定為70℃。從R值可以看出極差很小，因此此因素對(duì)水解程度影響不大，各水平相差不大，故反應(yīng)溫度選為60℃。
反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解程度的影響較大，反應(yīng)時(shí)間從4-6小時(shí)時(shí)適于反應(yīng)，隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，DH值變化大，而從6-8-12小時(shí)，隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，DH值雖增加，但較緩，由于大豆蛋白溶液是營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，在一定溫度下反應(yīng)也正適于微生物的生長(zhǎng)，易造成微生物的污染，故考慮實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用，反應(yīng)時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)，超過(guò)12hr不利于生產(chǎn)，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果，反應(yīng)時(shí)間選為6hr。
酶用量是影響水解程度的最主要因素，酶用量從3000IU/g至7000IU/g，隨酶用量增加，水解程度變化大，而酶用量大于7000IU/g，水解進(jìn)行不明顯，即對(duì)水解程度影響不是很大，又從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，故采用的最佳酶用量定為7000IU/g。
pH對(duì)水解程度的影響不大，即pH6-8之間對(duì)水解程度影響小，至pH9以上則抑制反應(yīng)，所以pH選為6。
從以上分析得出木瓜蛋白酶水解大豆蛋白的最佳水解組合條件為A1B4C2D4E5，即底物濃度5％，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間6hr，酶用量7000IU/g，反應(yīng)pH6。最佳水解條件下，大豆蛋白的水解度可達(dá)8.99％。
2.2.2復(fù)合蛋白酶最佳水解條件選擇 經(jīng)測(cè)定復(fù)合蛋白酶酶活力為12437.6IU/g。
表6復(fù)合蛋白酶水解大豆蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果
從表6正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析看出，復(fù)合蛋白酶水解大豆分離蛋白各因素對(duì)水解程度的影響依次為反應(yīng)pH＞底物濃度＞反應(yīng)溫度＞酶用量＞反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)條件最佳組合為A2B1C4D4C3。
從圖3看出反應(yīng)溫度對(duì)水解程度的影響35-45℃之間，隨溫度升高K值有上升趨勢(shì)，而溫度大于45℃，隨溫度升高，K值極劇下降，對(duì)反應(yīng)有較大影響，因此溫度選在45℃適宜。底物濃度對(duì)水解程度影響較大，隨濃度的升高，K值下降明顯，主要是由于隨大豆分離蛋白濃度的增高，底物與酶分子接觸的機(jī)會(huì)減少，且隨底物濃度的增加，溶液相對(duì)的粘度也在增加，阻礙了酶分子的運(yùn)動(dòng)，并被底物包裹起來(lái)，減少酶分子發(fā)揮作用的機(jī)會(huì)?？紤]到生產(chǎn)的實(shí)用性濃度最低選用5％，因此最適水解底物濃度確定為5％。酶用量對(duì)水解程度的影響，在酶用量的選擇范圍中，其用量對(duì)整個(gè)過(guò)程影響不大，這一范圍的選定是在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上并考慮到使用經(jīng)濟(jì)減少開發(fā)產(chǎn)品成本的大量增加而設(shè)定的，但從K值變化可看出，隨著酶用量的增加，反應(yīng)K值呈上升趨勢(shì)，即添加量越大，水解效果越好，綜合考慮本研究，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果酶用量10000IU/g適宜。反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解程度的影響從4-10小時(shí)變化不大，在6小時(shí)反應(yīng)達(dá)到高峰，故反應(yīng)時(shí)間選在6hr。反應(yīng)pH對(duì)整個(gè)水解反應(yīng)的影響最大，即pH5-8之間水解效果變化大，隨pH由5至7增大，水解程度成正相關(guān)，而當(dāng)pH由7繼續(xù)升高時(shí)，則反應(yīng)程度下降，這主要是由于蛋白酶具有反應(yīng)的適宜性，在一定的pH介質(zhì)中才充分發(fā)揮其活力，達(dá)到最佳水解效果。故最適pH確定為7。
由以上分析得出復(fù)合蛋白酶水解大豆分離蛋白的最佳條件優(yōu)化組合為A2B1C4D2E3，即反應(yīng)溫度為45℃，底物濃度5％，酶用量10000IU/g，反應(yīng)時(shí)間6hr，反應(yīng)pH為7，在最佳水解條件下，可得到大豆分離蛋白水解液的水解度為19.48％。
2.2.3堿性蛋白酶最佳水解條件選擇 經(jīng)測(cè)定堿性蛋白酶的酶活力為13535.9IU/ml。
表7堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果

由表7堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析看出，影響水解程度的主次因素為反應(yīng)溫度＞底物濃度＞反應(yīng)時(shí)間＞反應(yīng)pH＞酶用量。
從反應(yīng)中K值的變化可看出，反應(yīng)溫度對(duì)水解反應(yīng)的影響程度最大，在50℃時(shí)水解度最高，K值最大，即50℃成為激活堿性蛋白酶活力的最宜溫度即采用50℃適宜。
反應(yīng)濃度對(duì)水解程度的影響隨濃度由5％-10％的升高過(guò)程中，隨底物濃度的增大，水解程度逐漸減弱，主要由于濃度過(guò)大，蛋白質(zhì)分子膠囊包裹酶分子，使之運(yùn)動(dòng)減緩，只與周邊的蛋白質(zhì)分子發(fā)生作用，而減少了與其它蛋白分子結(jié)合的機(jī)會(huì)，故底物濃度確定為5％。酶用量在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)水解程度影響不大，理論酶用量是影響水解程度最大的因素，但經(jīng)過(guò)模擬試驗(yàn)，酶用量加到28000IU/g以下時(shí)，水解度在25.13％，較本實(shí)驗(yàn)的最佳水解度只高3.51％，但無(wú)形中造成了成本的巨大浪費(fèi)，所以本研究在綜合考慮實(shí)驗(yàn)效果和生產(chǎn)成本的同時(shí)選用在此水平范圍內(nèi)，從這四個(gè)水平來(lái)看，酶加量在8000IU/g時(shí)，K值變化較平緩，上升幅度不大，在16000IU/g時(shí)，K值稍高，因此適用12000IU/g適宜。反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解反應(yīng)的影響表現(xiàn)為反應(yīng)時(shí)間為8小時(shí)時(shí)是影響水解程度的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，低于8小時(shí)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，水解程度加強(qiáng)，而超過(guò)8小時(shí)，卻抑制了反應(yīng)，這主要是由于水解的肽又有局部可逆反應(yīng)的可能，又重新聚合，從而顯示水解度的降低，故選用反應(yīng)時(shí)間為8小時(shí)適宜。pH相對(duì)來(lái)講，對(duì)反應(yīng)影響不是很大，但可看出pH9時(shí)水解效果最好，即pH9是堿性蛋白酶活性中心發(fā)揮作用的最適pH，也符合其作用規(guī)律。因此pH選為9適宜。
由上述分析得出堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白的最佳水解條件為A2B1C3D3E4，即反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度50℃，底物濃度為5％，酶用量為12000IU/g，反應(yīng)8小時(shí)，在pH9下進(jìn)行，在此條件下，得到大豆分離蛋白水解度為21.62％。
2.2.4中性蛋白酶水解大豆分離蛋白最佳水解條件選擇 經(jīng)測(cè)定中性蛋白酶的酶活力為15443.8IU/g。
表8中性蛋白酶水解大豆分離蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果

由表8中性蛋白酶水解大豆分離蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析看出，各因素對(duì)水解程度的影響依次為底物濃度＞反應(yīng)溫度＞pH＞反應(yīng)時(shí)間＞酶用量。
從K值直觀圖(圖5)看出反應(yīng)溫度對(duì)水解程度的影響隨溫度由35℃升高至45℃時(shí)呈上升趨勢(shì)，而由45℃繼續(xù)升高卻呈下降趨勢(shì)，即溫度超過(guò)45℃，不同程度地將中性蛋白酶鈍化，活力降低而造成的，故選用45℃適宜。底物濃度在本研究中對(duì)水解程度影響最大，從K值變化看，隨底物濃度的升高，K值下降明顯，即濃度的增大，阻礙了酶分子運(yùn)動(dòng)，與蛋白質(zhì)分子充分接觸造成水解程度下降，故底物濃度選在5％。酶用量在本試驗(yàn)中對(duì)水解程度影響不大，即各水平差異不是非常顯著，其選擇主要是出于經(jīng)濟(jì)考慮，另通過(guò)模擬實(shí)驗(yàn)，當(dāng)酶加量用到30000IU/g以上時(shí)，反應(yīng)水解度達(dá)到9.47％，后趨于平衡，與試驗(yàn)的因素水平選擇水解度基本接近，從各水平看，酶用量7000IU/g適宜。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)論 3.1木瓜蛋白酶最佳水解條件為底物濃度5％，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間6hr，酶用量7000IU/g，反應(yīng)pH值6。最佳水解度可達(dá)8.03％。
3.2復(fù)合蛋白酶水解大豆分離蛋白最佳條件優(yōu)化組合為反應(yīng)溫度為45℃，底物濃度5％，酶用量10000IU/g，反應(yīng)時(shí)間6hr，反應(yīng)pH值為7，最佳水解度為19.48％。
3.3堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白的最佳水解條件為反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度50℃，底物濃度為5％，酶用量為12000IU/g，反應(yīng)8小時(shí)，在pH9下進(jìn)行，最佳水解度為21.62％。
3.4中性蛋白酶水解大豆分離蛋白的最佳水解條件為反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度45℃，底物濃度為5％，酶用量為7000IU/g，反應(yīng)6小時(shí)，在pH6.5下進(jìn)行，最佳水解度為9.47％。
實(shí)驗(yàn)例2大豆蛋白免疫肽分離富集方法及其功能特性實(shí)驗(yàn) 1.材料與方法 1.1主要實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備 (1)主要實(shí)驗(yàn)材料 大豆分離蛋白哈高科大豆食品有限責(zé)任公司 堿性蛋白酶 無(wú)錫杰能科生物有限公司 復(fù)合風(fēng)味蛋白酶 無(wú)錫杰能科生物有限公司 綿羊紅細(xì)胞(SRBC)哈爾濱市海峽貿(mào)易有限公司 補(bǔ)體(豚鼠血清) 哈爾濱市海峽貿(mào)易有限公司 都氏試劑黑龍江省疾病預(yù)防控制中心饋贈(zèng) 印度墨汁北京市西中化工廠 游標(biāo)卡尺(精密度0.01mm) 哈爾濱量具刃具廠 (2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供提供的昆明種小鼠。選擇健康雌性小鼠60只，體重18～24g，隨機(jī)分為5組，每組12只，作為免疫一組，進(jìn)行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)和半數(shù)溶血值(HC50)測(cè)定實(shí)驗(yàn)。選健康雌性小鼠60只，體重18～24g，隨機(jī)分為5組，每組12只，作為免疫二組，進(jìn)行碳廓清實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物臟體比值測(cè)定。
1.1.2主要儀器與試劑 酸度計(jì)pHS-25型上海偉業(yè)儀器廠 電子分析天平 梅勒特-托利多儀器(上海)有限公司 離心機(jī)北京醫(yī)用離心機(jī)廠 精密電動(dòng)攪拌機(jī)江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司 電熱恒溫水浴鍋余姚市東方電工儀器廠 蛋白自動(dòng)測(cè)定儀瑞典福斯公司 722-型分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司 Labscale TFF System超濾系統(tǒng) Millipore 聚醚砜膜(3000D) 美國(guó)頗爾公司 UV-1901紫外可見分光光度計(jì) 北京通用公司 潔凈工作臺(tái)哈爾濱東聯(lián) 計(jì)時(shí)器弘博生物科技有限公司 1.2主要實(shí)驗(yàn)方法 1.2.1免疫功能肽酶的選擇研究 比較大豆分離蛋白堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解液經(jīng)3000Da膜分離后肽斷的分布情況。
1.2.2免疫功能肽超濾優(yōu)化條件的研究 本實(shí)驗(yàn)選用3000Da膜進(jìn)行超濾優(yōu)化條件的研究。
(1)超濾壓力對(duì)超濾的影響 在室溫下，調(diào)pH為7，考察不同超濾壓力(15psi、20psi、30psi、40psi)下的滲透通量、透過(guò)蛋白質(zhì)含量。
(2)pH值對(duì)超濾的影響 根據(jù)試驗(yàn)(1)選擇最適超濾壓力，考察不同pH值(5、6、7、8)下的滲透通量、透過(guò)蛋白質(zhì)含量。
(3)物料濃度對(duì)超濾的影響 根據(jù)試驗(yàn)(1)選擇最適超濾壓力，根據(jù)試驗(yàn)(2)選擇最適pH值，考察不同物料濃度(3％、4％、5％、6％)下的滲透通量、透過(guò)蛋白質(zhì)含量。
(4)最適超濾條件的確定 超濾大豆蛋白酶解液，關(guān)鍵是提高蛋白的透過(guò)率。根據(jù)以上的單因素試驗(yàn)分析結(jié)果，本項(xiàng)目設(shè)計(jì)了三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，分別以膜的透過(guò)蛋白質(zhì)含量作為考察指標(biāo)，來(lái)確定超濾的最佳工藝方案。正交實(shí)驗(yàn)中具體因素水平見表9。
表9正交實(shí)驗(yàn)因素水平表
1.2.3免疫功能肽產(chǎn)品的生產(chǎn)制備 工藝路線 5％蛋白乳濁液→酶解→滅酶后冷卻(以DH值為指標(biāo)測(cè)定)→分離→蛋白酶解液→膜分離(3000D)→噴霧干燥→免疫功能肽粉 5％蛋白乳濁液→酶解→滅酶后冷卻(以DH值為指標(biāo)測(cè)定)→分離→蛋白酶解液→噴霧干燥→粗肽粉(未經(jīng)超濾) 1.2.4粗肽粉及免疫功能肽粉免疫活性的研究 經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，大豆蛋白水解肽(經(jīng)3000D超濾)設(shè)三個(gè)劑量組，分別為0.85g/kg體重(低高劑量)、1.7g/kg體重(中劑量)和5.1g/kg體重(高劑量)。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組(灌胃清潔水)和大豆水解蛋白粗肽粉(未經(jīng)超濾)組，(5.1g/kg體重)。各組動(dòng)物按體重的2％灌胃容積進(jìn)行灌胃，連續(xù)灌胃30天后測(cè)各項(xiàng)免疫指標(biāo)。免疫活性檢測(cè)試驗(yàn)由反應(yīng)細(xì)胞免疫的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(足跖增厚法)、反應(yīng)體液免疫的半數(shù)溶血值的測(cè)定和反應(yīng)非特異性免疫的小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)組成。
遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(足跖增厚法)將免疫一組動(dòng)物每只鼠經(jīng)腹腔注射2％(V/V，用生理鹽水配制)壓積SRBC(2000rpm，10分鐘)0.2ml，致敏后4天，測(cè)量左后足跖部厚度，同一部位測(cè)量三次，取平均值。然后在測(cè)量部位皮下注射20％(V/V，用生理鹽水配制)壓積SRBC 20μl，于注射后24小時(shí)測(cè)量左后足跖部厚度，以攻擊前后足跖厚度的差值(足跖腫脹度)來(lái)表示DTH的程度。
半數(shù)溶血值的測(cè)定在上述遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)結(jié)束的第2天，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1小時(shí)，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2000rpm離心10分鐘，收集血清。用SA緩沖液將血清稀釋250倍，取1ml置試管內(nèi)，依次加入10％(V/V，用SA緩沖液配制)壓積SRBC 0.5ml，補(bǔ)體1ml(用SA緩沖液按1∶10稀釋)。另設(shè)不加血清的對(duì)照管(以SA緩沖液代替)。置37℃恒溫水浴中保溫30分鐘后，冰浴終止反應(yīng)。2000rpm離心10分鐘，取上清液1ml、加都氏試劑3ml，同時(shí)取10％(V/V，用SA緩沖液配制)的壓積SRBC 0.25ml、加都氏試劑至4ml于另一試管中，充分混勻，放置10分鐘后，于540nm處以對(duì)照管作空白，分別測(cè)定各管光密度值。溶血素的量以半數(shù)溶血值(HC50)表示，按下式計(jì)算。
樣品HC50＝樣品光密度值/SRBC半數(shù)溶血時(shí)的光密度值×稀釋倍數(shù) 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)小鼠按0.1ml/10g體重尾靜脈注射1∶3.5倍稀釋的印度墨汁，待墨汁注入，立即計(jì)時(shí)。
注入墨汁后2、10分鐘，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μl，并將其加到2mL Na2CO3溶液中。將小鼠稱重后頸椎脫臼處死，取肝臟、脾臟和胸腺去盡筋膜，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。
用722分光光度計(jì)在600nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度值(OD)，以Na2CO3溶液作空白對(duì)照。按下式計(jì)算吞噬指數(shù)α K＝(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)
按公式計(jì)算脾臟/體重比值和胸腺/體重比值。
臟器/體重比值＝臟器重/體重×100。
數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定采用方差分析方法，按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。如方差齊，計(jì)算F值。F值＜F0.05，結(jié)論為各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，再用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊性要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
1.2.5免疫功能肽分子量分布及氮含量的測(cè)定 分子量分布檢測(cè)條件Agilent1100高效液相色譜儀，(國(guó)安捷倫公司)泵Agilent G1311A(四元泵)；示差檢測(cè)器Agilent G1315A/B(RID檢測(cè)器)；恒溫箱Agilent G1316A(恒溫箱)；色譜進(jìn)樣器Agilent G1313A(自動(dòng)進(jìn)樣器)；色譜柱Agilent79911GF-083，79911GF-084雙柱串聯(lián)；柱溫35℃；色譜工作站Angilent LC Chemstation；流動(dòng)相水；流速1.0ml/min；進(jìn)樣量20μl。
蛋白質(zhì)及氮含量測(cè)定GB 5511-95 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2.1免疫功能肽酶的選擇研究 表10復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶不同3000D膜分離比較 酶種類＞3000D肽含量 ＜3000D肽含量(％) (％) 復(fù)合蛋白酶64.1％35.9％ 堿性蛋白酶67.9％32.1％ 本實(shí)驗(yàn)選取3000D的分離膜進(jìn)行免疫肽的分離純化，比較復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶經(jīng)3000D膜分離后肽含量的分布情況可知兩種酶解液3000D以下的肽含量復(fù)合蛋白酶酶液高于堿性蛋白酶酶解液，并且復(fù)合蛋白酶的最解酶解時(shí)間為6小時(shí)低于堿性蛋白酶的8小時(shí)，因此我們選用復(fù)合酶為免疫功能肽的水解酶。
2.2免疫功能肽超濾優(yōu)化條件的研究 (1)超濾壓力對(duì)超濾的影響 超濾是壓力驅(qū)動(dòng)型的膜分離過(guò)程，壓差是超濾過(guò)程的推動(dòng)力，對(duì)超濾物質(zhì)滲透通量產(chǎn)生決定性影響。
壓力作為超濾過(guò)程中的唯一推動(dòng)力，對(duì)超濾物質(zhì)濾過(guò)率有決定性的影響。料液中的大分子物質(zhì)會(huì)在膜表面積聚，當(dāng)這種積聚使膜表面溶質(zhì)達(dá)到一定濃度時(shí)即可形成凝膠層，臨界壓力即為剛形成凝膠層時(shí)的壓力。實(shí)際操作時(shí)，壓力應(yīng)選擇在臨界壓力附近，這樣既保證了一定的濾液通量，避免了無(wú)謂增加壓力而引起的能耗增大，又防止了過(guò)高壓力下，大分子擠入孔膜，而使孔膜堵塞嚴(yán)重，避免了對(duì)膜的損害。
由圖6可以看出，升高壓力對(duì)初始的參透通量有顯著影響，壓力越高初始滲透通量越大，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，15psi、20psi、30psi、40psi下蛋白質(zhì)通量呈現(xiàn)顯著下降，特別是40psi，這主要是因?yàn)閴毫Φ纳唠S著時(shí)間的延長(zhǎng)使得濃差極化和膜污染加劇，造成滲透通量迅速下降。因此，不能一味地升高壓力而應(yīng)該選擇一個(gè)有利于蛋白質(zhì)平緩滲透的壓力。由此看出20psi至30psi的壓力有利于蛋白質(zhì)的滲透。
表11不同壓力透過(guò)液蛋白含量
由表11可以看出，隨著壓力的升高蛋白質(zhì)透過(guò)率而升高，但40psi下蛋白質(zhì)的透過(guò)率并沒(méi)有明顯高于30psi時(shí)的蛋白質(zhì)透過(guò)率，主要原因是超濾初期由于壓力過(guò)大，蛋白質(zhì)透過(guò)了膜，但超濾后期，過(guò)大的壓力加劇了濃差極化和膜污染的過(guò)程，使得蛋白質(zhì)被截留在了“膜”上，準(zhǔn)確的說(shuō)是被截留在了膜面上的蛋白質(zhì)吸附層上，使得蛋白質(zhì)和膜無(wú)法分開。因此綜合滲透通量、蛋白質(zhì)透過(guò)率，選擇30psi下進(jìn)行超濾較為合適。
(2)pH值對(duì)超濾的影響 表12不同PH值蛋白截留及蛋白含量
如圖7、表12所示，蛋白質(zhì)在中性pH7時(shí)，蛋白質(zhì)的滲透通量最好，且蛋白質(zhì)透過(guò)率也最高，因?yàn)檫@時(shí)當(dāng)pH值偏高等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)所帶電荷與膜表面電荷同性，由于同性相斥，蛋白質(zhì)粒子不易聚集，因此不易形成蛋白質(zhì)吸附層，截留率也較大。但當(dāng)pH值過(guò)大時(shí)，滲透通量、蛋白質(zhì)透過(guò)率反而減小。pH值對(duì)超濾的影響也受膜材料和物料性質(zhì)的限制。因此，在蛋白質(zhì)超濾過(guò)程中選擇適當(dāng)?shù)膒H值是至關(guān)重要的。
綜合滲透通量、蛋白質(zhì)透過(guò)率二個(gè)因素分析，pH7為最適宜的超濾pH條件。
(4)物料濃度對(duì)超濾的影響 表13不同物料濃度透過(guò)蛋白含量含量
由圖8可以看出，物料濃度低的料液膜滲透通量高于物料濃度高的料液，這是因?yàn)槌瑸V過(guò)程中，主體溶液濃度的增加導(dǎo)致蛋白質(zhì)濃度的升高，根據(jù)濃差極化理論，通量的下降正比于蛋白質(zhì)的對(duì)數(shù)濃度，當(dāng)物料濃度超過(guò)某一范圍之后，這種線性關(guān)系便不再保持，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)濃度的增加會(huì)導(dǎo)致料液粘度的增加，減少蛋白質(zhì)分子在溶液中擴(kuò)散系數(shù)，隨之而來(lái)的是濃差極化現(xiàn)象的加重，同時(shí)蛋白質(zhì)分子之間的相互作用加強(qiáng)，因而阻力增加，截留率增加而蛋白透過(guò)率降低。從表13可以看出隨著物料濃度的升高，料液總的蛋白質(zhì)透過(guò)率升高，物料濃度6％時(shí)最高，但它只略高于5％，綜合考慮滲透能量和蛋白質(zhì)透過(guò)率兩個(gè)因素的變化情況，本研究選擇的物料濃度選取5％為適合的物料濃度。
(5)最適超濾條件的確定 表14正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果極差表

表15蛋白含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析 F0.05(2，6)＝5.14 F0.01(2，6)＝10.92 從蛋白含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，影響因素主次為壓力＞物料濃度＞pH值，其中壓力最顯著，物料濃度為一般顯著，pH值不顯著。超濾的最佳條件為壓力30psi，pH值7，物料濃度為5％。
2.3免疫功能肽分子量分布情況及氮含量測(cè)定 1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 配制系列窄分布聚乙二醇標(biāo)樣，按照分子量大小配制相應(yīng)濃度的溶液。分子量分別為106、194、620、400、1010、4020、1900、6450、11840、22450。.在相應(yīng)的色譜條件下得到聚乙烯醇標(biāo)樣HPGPC校正工作曲線。
從標(biāo)準(zhǔn)曲線分析(圖9)可知，隨著時(shí)間的推移即隨著流動(dòng)相體積的增加，分子量由大到小的順序出峰。
2免疫肽的分子量分布 見圖10。由樣品的譜圖分析可知Mn、Mw、Mz分別為774.32、945.48、136.72，多分散系數(shù)D＝Mw/Mn＝1.22，樣品的分子量分布范圍窄。且在13min左右的分子量分布比例較大，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照進(jìn)一步分析可知，樣品的主要分布在5000Da以下，3400Da的分子量所占的比例為70.95％。
3氮含量結(jié)果 經(jīng)測(cè)定免疫蛋白肽的蛋白質(zhì)含量為89.2％，氮含量為14.272％ 2.4大豆肽免疫功能的研究 2.4.1大豆水解蛋白肽對(duì)小鼠體重的影響 小鼠給予大豆水解蛋白肽30天后對(duì)小鼠體重的影響分別見表16和17。
表16大豆水解蛋白肽對(duì)免疫一組小鼠體重的影響
表17大豆水解蛋白肽對(duì)免疫二組小鼠體重的影響
有表16和表17可見，與陰性對(duì)照組相比較，各免疫實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物和原粉組動(dòng)物的初始體重和終末體重均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)條件下大豆水解蛋白肽(經(jīng)3000D超濾)和大豆水解蛋白肽粗肽粉(未經(jīng)超濾)對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)無(wú)影響。
2.4.2大豆水解蛋白肽對(duì)小鼠臟器/體重比值的影響 小鼠給予大豆水解蛋白肽30天后，對(duì)臟器/體重比值的影響見表18。
表18大豆水解蛋白肽對(duì)小鼠臟器/體重比值的影響
由表18可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的大豆蛋白水解肽(經(jīng)3000D超濾)和原粉(未經(jīng)超濾)30天，與對(duì)照組間比較，各劑量組和原粉組動(dòng)物的脾臟/體重比值和胸腺/體重比值均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，即對(duì)小鼠的臟器/體重比值無(wú)影響。
2.4.3大豆水解蛋白肽對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響 小鼠給予大豆水解蛋白肽30天后對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響見表19。
表19大豆水解蛋白肽對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響
由表4可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的大豆水解蛋白肽(經(jīng)3000D超濾)和粗肽粉(未經(jīng)超濾)30天，與陰性對(duì)照組相比較，初始足跖厚度無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，足趾厚度差各劑量組和原粉組動(dòng)物無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，即大豆水解蛋白肽(經(jīng)3000D超濾)不能夠增強(qiáng)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。
2.4.4大豆水解蛋白肽對(duì)小鼠半數(shù)溶血值(HC50)的影響 小鼠給予大豆水解蛋白肽30天后對(duì)小鼠半數(shù)溶血值(HC50)的影響見表20。
表20大豆水解蛋白肽對(duì)小鼠半數(shù)溶血值(HC50)的影響
注*與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異P＜0.05；**與陰性對(duì)照組比較有極顯著性差異P＜0.01 由表20可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的大豆水解蛋白肽30天，與陰性對(duì)照組比較，中劑量組半數(shù)溶血值有顯著差異(P＜0.05)，高劑量組與粗肽粉組半數(shù)溶血值顯著差異(P＜0.01)，表明大豆水解蛋白肽能提高小鼠半數(shù)溶血值。
2.4.5大豆水解蛋白肽對(duì)小鼠碳廓清功能的影響 給予大豆水解蛋白肽30天后對(duì)小鼠碳廓清能力的影響見表21。
表21大豆水解蛋白肽對(duì)小鼠碳廓清功能的影響
注*與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異P＜0.05 由表21可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的大豆水解蛋白肽和粗肽粉30天，與陰性對(duì)照組比較，中劑量組和高劑量組吞噬指數(shù)有顯著性差異(P＞0.05)，即大豆水解蛋白肽可以增加小鼠碳廓清功能，原粉組未見增加小鼠碳廓清功能。
3實(shí)驗(yàn)結(jié)論 3.1選用復(fù)合酶為免疫肽的生產(chǎn)用酶；最佳超濾條件為pH＝7，壓力為0.3psi，物料濃度為5％；在最佳超濾條件下獲得的大豆免疫功能肽在3400Da的分子量所占的比例為70.95％；蛋白質(zhì)含量89.2％；氮含量為14.272％。
3.2經(jīng)口投予小鼠不同劑量的大豆水解蛋白肽30天，進(jìn)行了3類免疫功能的試驗(yàn)，即反映細(xì)胞免疫功能的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(足跖增厚法)、反映體液免疫功能的半數(shù)溶血值(HC50)的測(cè)定、反映單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)。結(jié)果表明本發(fā)明制備方法所制備的大豆水解蛋白肽可增強(qiáng)小鼠的半數(shù)溶血值和碳廓清功能，但是未見增加小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。說(shuō)明本發(fā)明大豆水解蛋白肽具有增強(qiáng)體液免疫功能和單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能。原液未見增加小鼠碳廓清功能，增強(qiáng)小鼠的半數(shù)溶血值效果不如同劑量的大豆水解蛋白肽。
權(quán)利要求
1、一種大豆蛋白免疫活性肽的制備方法，包括以下步驟將大豆分離蛋白用蛋白酶進(jìn)行水解反應(yīng)；將所得到的大豆分離蛋白水解液用超濾膜進(jìn)行超濾；收集超濾液，即得。
2、按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的蛋白酶選自木瓜蛋白酶，復(fù)合蛋白酶，堿性蛋白酶或中性蛋白酶。
3、按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的蛋白酶是復(fù)合蛋白酶；其中，采用復(fù)合蛋白酶進(jìn)行水解的反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度為45℃，底物濃度為5％，酶用量10000IU/g，反應(yīng)時(shí)間6小時(shí)，反應(yīng)pH值為7。
4、按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的蛋白酶是堿性蛋白酶；其中，采用堿性蛋白酶進(jìn)行水解時(shí)的水解條件為反應(yīng)溫度50℃，底物濃度為5％，酶用量為12000IU/g，反應(yīng)時(shí)間8小時(shí)，反應(yīng)pH值為9。
5、按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的蛋白酶是木瓜蛋白酶，其中采用木瓜蛋白酶進(jìn)行水解的組合條件為底物濃度5％，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間6hr，酶用量7000IU/g，反應(yīng)pH值為6；或是所述的蛋白酶是中性蛋白酶，其中采用中性蛋白酶進(jìn)行水解的組合條件為反應(yīng)溫度45℃，底物濃度為5％，酶用量為7000IU/g，反應(yīng)6小時(shí)，反應(yīng)pH值為6.5。
6、按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的超濾膜是分子量為3000Da的超濾膜。
7、按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在在于所述的超濾是在15psi至40psi的壓力下進(jìn)行超濾；優(yōu)選的，所述的超濾是在30psi的壓力下進(jìn)行超濾。
8、按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將重量百分比濃度為3％-6％的大豆分離蛋白水解液進(jìn)行超濾；優(yōu)選的，將重量百分比濃度為5％的大豆分離蛋白水解液進(jìn)行超濾。
9、按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述大豆分離蛋白水解液的pH值為5-8；優(yōu)選的，所述大豆分離蛋白水解液的pH值為7。
10、由權(quán)利要求1-9任何一項(xiàng)方法所制備得到的大豆蛋白免疫活性肽，其特征在于活性肽分子量在3400Da所占的比例為70.95％。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大豆蛋白免疫活性肽的制備方法及其產(chǎn)品。其制備方法包括以下步驟將大豆分離蛋白用蛋白酶進(jìn)行水解反應(yīng)；將大豆分離蛋白的水解液用超濾膜進(jìn)行超濾；收集超濾液，即得。本發(fā)明方法所制備得到的大豆蛋白免疫活性肽在3400Da的分子量所占的比例為70.95％；蛋白質(zhì)含量為89.2％；氮含量為14.272％。經(jīng)口投予小鼠不同劑量本發(fā)明所制備的大豆水解蛋白肽30天，進(jìn)行了3類免疫功能的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明方法所制備的大豆蛋白免疫活性肽可增強(qiáng)小鼠的半數(shù)溶血值和碳廓清功能，未見增加小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，說(shuō)明本發(fā)明大豆蛋白免疫活性肽具有增強(qiáng)體液免疫功能和單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能。
文檔編號(hào)C07K14/415GK101608206SQ20091015077
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月1日
發(fā)明者富校軼, 慧 許, 磊 姚, 朱秀清, 孫樹坤, 江連洲 申請(qǐng)人:黑龍江省大豆技術(shù)開發(fā)研究中心