專利名稱：：一種快速檢測三聚氰胺(Melamine)含量的ELISA試劑盒及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及食品安全檢測，特別是涉及小分子的抗原、抗體制備及其檢測方法的建立。本發(fā)明具體涉及通過阻斷ELISA檢測樣品中三聚氰胺含量的方法及基于該方法的ELISA試劑盒的制備。技術(shù)背景小分子化合物，在組織化學(xué)上被稱為半抗原，僅具有與相應(yīng)抗原或致敏淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)性，而無免疫原性。對于半抗原的檢測一般釆用氣相色譜、高壓液相色譜、質(zhì)譜等手段，但是免疫學(xué)檢測方法在半抗原的檢測上逐漸顯示出其不可替代的優(yōu)勢。免疫學(xué)檢測法不像傳統(tǒng)的色譜和質(zhì)譜等方法那樣需要復(fù)雜、昂貴的設(shè)備，此外還具有易操作，前處理過程簡單，成本低，檢測快速、準(zhǔn)確、靈敏，可實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化檢測等優(yōu)點(diǎn)，因此具有極為廣泛的應(yīng)用前景。由于小分子化合物不具有免疫原性，所以小分子化合物的免疫學(xué)檢測方法中至關(guān)重要的一步就是如何設(shè)計(jì)合成同時(shí)具有免疫原性和反應(yīng)原性的小分子載體偶聯(lián)物。通常將小分子化合物與分子量比較大的載體蛋白偶聯(lián)制備完全抗原(免疫原)，借助載體蛋白的T細(xì)胞表位獲得免疫原性，以刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。制備完全抗原時(shí)常用的載體有牛血清白蛋白(BSA)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、兔血清白蛋白(RSA)、雞卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)、多聚賴氨酸(PLL傳。本發(fā)明中的三聚氰胺(Melamine)(化學(xué)式Qt^Nj,俗稱密胺、蛋白精，IUPAC命名為[l,3,5-三嗪-2，4，6-三氨基]，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，被用作化工原料。它是白色單斜晶體，幾乎無味，微溶于水(3.1g/L常溫)，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶等，對身體有害，不可用于食品加工或食品添加物。食品工業(yè)中常常需要測定食品的蛋白質(zhì)含量，由于直接測量蛋白質(zhì)技術(shù)上比較復(fù)雜，所以常用一種叫做凱氏定氮法的方法，通過測定氮原子的含量來間接推算食品中蛋白質(zhì)的含量。由于三聚氰胺(含氮量66%)與蛋白質(zhì)(平均含氮量16%)相比含有更高比例的氮原子，所以被一些造假者利用，添加在食品中以造成食品蛋白質(zhì)含量較高的假象，從而造成諸如2007年美國寵物食品污染事件和2008年中國毒奶粉事件等嚴(yán)重的食物安全事故。中囯國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢測中心在2008年9月13日指出，三聚氰胺屬于化工原料，是不允許添加到食品中的，故暫未設(shè)定像農(nóng)藥般的殘留標(biāo)準(zhǔn)限制。10月8日，衛(wèi)生部、工業(yè)和信息化部、農(nóng)業(yè)部、國家工商行政管理總局和國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局聯(lián)合發(fā)布公告，制定三聚氰胺在乳與乳制品中的臨時(shí)管理值嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的限量值為lmg/kg,高于限量值的產(chǎn)品一律不得銷售。液態(tài)奶(包括原料乳)、奶粉、其它配方乳粉中三聚氰胺的限量值為2.5mg/kg,高于限量值的產(chǎn)品一律不得銷售。含乳15%以上的其它食品中三聚氰胺的限量值為2.5mg/kg，高于限量值的產(chǎn)品一律不得銷售。有鑒于此，三聚氰胺含量檢測成為目前國內(nèi)食品安全檢測的焦點(diǎn)。三聚氰胺屬于小分子化合物，與其他很多小分子化合物一樣，一般采用GC、MS、LC-UV法、高效液相色譜法等測定三聚氰胺含量，相關(guān)檢測機(jī)構(gòu)建立的方法也少有報(bào)道。農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T1372-2007中建立的飼料中三聚氰胺的測定方法是HPLC法和GC-MS法。最近國家質(zhì)檢總局與國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會聯(lián)合發(fā)布的《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》(GB/T22388-2008)中也是采用HPLC法、LC-MS/MS法、GC-MS和GC-MS/MS法。但以上方法存在過程冗長、需要衍生、試劑用量較大及靈敏度低等缺點(diǎn)。目前三聚氰胺免疫學(xué)檢測方法也有報(bào)道，但是市面上能夠有效檢測三聚氰胺的試劑盒不多。本專利根據(jù)三聚氰胺小分子化合物的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)抗原，制備特異性抗體，研制出的檢測三聚氰胺的阻斷酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒，能快速、特異性的檢測出樣品中的三聚氰胺，根據(jù)試劑盒內(nèi)說明書操作能計(jì)算出三聚氰胺的含量；是一種高效、快速、經(jīng)濟(jì)的高科技產(chǎn)品。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種小分子抗原及抗體制備方法，利用酶聯(lián)免疫吸附原理，建立一種能快速、特異性檢測出樣品中小分子物質(zhì)(三聚氰胺)含量的ELISA方法。所述小分子抗原制備方法指將無免疫原性或弱免疫原性小分子(三聚氰胺)偶聯(lián)到特殊載體上，使其同時(shí)具有免疫原性和反應(yīng)原性。具體為將三聚氰胺小分子分別偶聯(lián)到特殊載體BSA和OVA上，成為同時(shí)具有免疫原性和反應(yīng)原性的抗原小分子。得到的三聚氰胺-BSA偶聯(lián)物為包被原，三聚氰胺-OVA偶聯(lián)物為免疫原。所述小分子抗體的制備方法指將三聚氰胺-OVA偶聯(lián)物，經(jīng)過免疫學(xué)方法得到三聚氰胺-OVA偶聯(lián)物的抗體，經(jīng)過抗體親和層析，得到純化的三聚氰胺的特異性抗體。所述ELISA檢測試劑盒在本專利中為三聚氰胺阻斷包被在微孔反應(yīng)板上6的三聚氰胺-BSA偶聯(lián)物跟HRP酶標(biāo)記的三聚氰胺抗體結(jié)合，經(jīng)過酶和底物顯色，通過標(biāo)準(zhǔn)三聚氰胺樣品和相應(yīng)的OD值得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，來檢測樣品中的三聚氰胺含量。所述快速指應(yīng)用此試劑盒檢測時(shí)間不超過1小時(shí)。所述特異性指本試劑盒可檢測乳、乳制品、飼料中的三聚氰胺，且不與乳、乳制品、飼料的成分反應(yīng)。圖l:顯示三聚氰胺抑制試驗(yàn)結(jié)果。其中橫坐標(biāo)代表標(biāo)準(zhǔn)品中三聚氰胺的含量，縱坐標(biāo)代表光密度值(OD45。)，抑制試驗(yàn)具體結(jié)果數(shù)值如下表所示。三聚氰胺含量(ng/ml)50025012562.531.215.67.80光密度值(OD450)0.1820.4800.6260.6770.7110.7410.8710.885專利具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，使其更明確，但決不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l抗體的制備和純化1.抗原的制備根據(jù)三聚氰胺的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成三聚氰胺衍生物，偶聯(lián)載體，制備包被抗原三聚氰胺-BSA和免疫抗原三聚氰胺-OVA。2.免疫動(dòng)物制備抗體將三聚氰胺-OVA偶聯(lián)物作為免疫原注射實(shí)驗(yàn)用日本大耳白兔，每次注射0.5mg免疫原，并加等體積佐劑。第一次免疫使用弗氏完全佐劑，以后使用弗氏不完全佐劑。共免疫四次，頸動(dòng)脈取血或心臟取血得到抗血清。3.三聚氰胺親和層析柱制備用CNBr-activated+S印harose+4B作為柱膠加入三聚氰胺制作親和層析柱。4.抗體純化(1)平衡層析柱至中性。(2)加入抗血清4ml，循環(huán)至少6次，使血清中的三聚氰胺抗體與柱中三聚氰胺結(jié)合。(3)清洗層析柱除去雜質(zhì)。(4)將弱酸性溶液加入層析柱，洗脫抗體并收集。(5)調(diào)節(jié)抗體洗脫液pH值至中性。(6)平衡層析柱至中性，透析濃縮得到純化的抗體。實(shí)施例2三聚氰胺ELISA試劑盒的制備1.包被有三聚氰胺-BSA偶聯(lián)物的微孔反應(yīng)板，l塊(96T或48T)。2.三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品(500ng/ml300^1,2瓶或1瓶)。3.HRP酶標(biāo)的三聚氰胺抗體lx60^il/瓶或lx3(Hil/瓶(1:100)。4.濃縮洗滌液lx20ml/瓶或lxl0ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。5.底物lxlOml/瓶或lx5ml/瓶。6.反應(yīng)終止液lxlOml/瓶或lx5ml/瓶(2NH2S04)。7.樣品稀釋液l"Oml/瓶P瓶或l瓶)實(shí)施例3樣品中三聚氰胺的含量測定l.樣品處理液態(tài)樣品直接用樣品稀釋液稀釋1000倍，固態(tài)樣品處理方法取lg樣品，加入10ml甲醇充分混合。5000g以上離心IO分鐘。取上清lml于試管中，吹干。加入2.5ml含10。/。甲醇的PBS溶液充分溶解，取150pl用于分析。2.檢測(1)加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100^U，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品5(V1，注意不要有氣泡，將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，然后在標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔中加入50pl稀釋好的酶標(biāo)物工作液(空白孔不加)。盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。(2)酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37。C反應(yīng)30分鐘。(3)溫育后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡l-2分鐘，20(^1/每孔，甩干。(4)依序每孔加底物溶液90iil，37。C避光顯色20分鐘。(此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的后3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，前3-4孔顏色不明顯，即可終止)。(5)依序每孔加終止溶液50p1,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。(6)用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。3.結(jié)果處理以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)X,OD45o為縱坐標(biāo)Y，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，輸入標(biāo)準(zhǔn)品的不同濃度及對應(yīng)的OD450即可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品的OD450代入，得出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1、一種小分子的抗原、抗體制備及其檢測方法的建立。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子指三聚氰胺或者不改變其免疫原性的三聚氰胺衍生物。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的小分子抗原，其特征在于，小分子為三聚氰胺或者具備三聚氰胺相似免疫原性的三聚氰胺衍生物并通過化學(xué)偶聯(lián)形成具備免疫原性的完全抗原。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于該抗體是使用三聚氰胺或者具備三聚氰胺相似免疫原性的三聚氰胺衍生物偶聯(lián)后的復(fù)合物通過免疫動(dòng)物獲得的多克隆抗體或者單克隆抗體。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的檢測方法，其特征是，建立在抗原抗體特異性反應(yīng)原理基礎(chǔ)上，通過包括但不限于酶聯(lián)免疫(ELISA)法的免疫學(xué)方法檢測樣品中三聚氰胺含量。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的酶聯(lián)免疫(ELISA)法，其特征是包括但不限于阻斷ELISA。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的酶聯(lián)免疫(ELISA)法，其特征是，三聚氰胺-BSA偶聯(lián)物預(yù)先固相化。樣品中的三聚氰胺可以阻斷三聚氰胺抗體和固相化的三聚氰胺(或類似物)的結(jié)合。8、根據(jù)權(quán)利要求5所述的樣品包括但不限于液態(tài)奶或溶液萃取的奶粉或者飼料以及其他可能存在三聚氰胺的與人畜生活相關(guān)的食用品。9、根據(jù)權(quán)利要求5所述的酶聯(lián)免疫(ELISA)法，其特征在于利用三聚氰胺阻斷包被的三聚氰胺-BSA跟HRP酶標(biāo)記的三聚氰胺抗體的結(jié)合，經(jīng)過酶和底物顯色，待測樣品中三聚氰胺的濃度越高，酶標(biāo)記的經(jīng)純化的三聚氰胺抗體和包被的三聚氰胺結(jié)合就越受到阻斷，0D^顯色的深淺與樣本中待測的三聚氰胺含量呈負(fù)相關(guān)。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的固相化，其特征在于，將三聚氰胺偶聯(lián)物包被到固相支持物上，該支持物可以是，例如用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的聚苯乙烯或聚氯乙烯表面，或膠乳(聚苯乙烯)顆粒，或由壓縮的聚乙烯顆粒組成的過濾玻璃棒，或多孔消化纖維素基質(zhì)，或事實(shí)上是在免疫化學(xué)分析使用中任何合適的支持物。全文摘要本發(fā)明涉及一種食品安全相關(guān)的小分子添加劑三聚氰胺或其類似物的抗原、抗體制備及對各種可能存在三聚氰胺或其類似物樣品進(jìn)行半定量或定量的方法。本發(fā)明基于抗原抗體的特異性反應(yīng)原理，利用三聚氰胺特異性抗體使用阻斷ELISA法檢測樣品中三聚氰胺或其類似物的濃度。所述抗原為人工制備具有反應(yīng)原性和免疫原性的三聚氰胺免疫原及包被原，使用免疫原免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制備抗體，利用阻斷ELISA原理，建立三聚氰胺的檢測方法。本發(fā)明提供的三聚氰胺抗原具有很好的免疫原性，所得包被原有很好的活性。所建立的檢測方法可檢測乳、乳制品、飼料中的三聚氰胺含量，且不與乳、乳制品、飼料的其他成分發(fā)生非特異性反應(yīng)。文檔編號C07K14/77GK101565464SQ200910061638公開日2009年10月28日申請日期2009年4月17日優(yōu)先權(quán)日2009年4月17日發(fā)明者華權(quán)高申請人:武漢華美生物工程有限公司