專利名稱：：結(jié)晶人血清白蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于提供一種結(jié)晶人白蛋白的高度可靠的方法和商業(yè)上可行的方法的方法。更具體地說，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)晶體人白蛋白的方法，所述人白蛋白純化自各種白蛋白來源，具體包括自轉(zhuǎn)基因動物或其它重組來源。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的結(jié)晶人血清白蛋白("hSA，，)的方法(在本申請中，hSA將被與術(shù)語人血清白蛋白互換地使用)。優(yōu)選進(jìn)行這種方法以加強(qiáng)重組hSA的純化程序，該重組hSA然后可被用于治療應(yīng)用或作為藥物制劑中的賦形劑。就藥物制劑來說，如本發(fā)明所純化的人白蛋白可被用作治療劑或用作賦形劑。在每一種情況下，適合的制劑可以在REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES(16th和18th版，MackPublishing,Easton，Pa.(1980和1990)),以及在INTRODUCTIONTOPHARMACEUTICALDOSAGEFORMS(4th版，Lea&Febiger，Philadelphia(1985))中找到，在此全部引入以供參考。關(guān)于hSA的治療應(yīng)用，白蛋白施用的目的主要是通過維持血漿膠體滲透壓(colloidoncoticpressure)來維持循環(huán)血漿容量，以及通過使腔內(nèi)和間質(zhì)的流體進(jìn)入血管來治療其他抗性嚴(yán)重的水腫。通過在急性低蛋白血癥引起的病理狀況中，以及在對其他治療方法耐受的慢性低蛋白血癥引起的病理狀況中補(bǔ)充白蛋白，白蛋白產(chǎn)品被用來獲得暫時的狀況改善。白蛋白是第一個臨床上用作血容量擴(kuò)充劑的自然膠體成分，并且與其他膠體產(chǎn)品相比它是標(biāo)準(zhǔn)的膠體物質(zhì)。一些特定的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥(在該適應(yīng)癥中白蛋白可被用來增加患者中血管內(nèi)膠體滲透壓(oncoticpressure)并由此擴(kuò)充血管內(nèi)容量)包括低血容量性休克；嚴(yán)重?zé)齻?；成人呼吸窘迫綜合征(ARDS);腹水；肝衰竭；胰腺炎和正在經(jīng)歷心肺分流術(shù)的患者。(Cochrane等，1998)。白蛋白也可凈皮用來治療新生兒高膽紅素血癥、低蛋白血癥和腎病綜合征。(Vermeulen等，1995)。人血液中的白蛋白部分起三種主要的生理作用(1)維持血漿膠體滲透壓，(2)運輸和螯合膽紅素，以及(3)運輸脂肪酸和其他中間代謝產(chǎn)物例如激素和酶。(Peters，T等)。因為白蛋白引起大約80%的血漿膨脹壓，所以血清白蛋白濃度50%的減少會隨之產(chǎn)生膠體滲透壓66%的下降。(RaineyT.G.，等，1994)。在重癥病患者中，死亡的危險與血清白蛋白濃度呈反相關(guān)。(Cochrane等，1998)。Goldwaster和Feldman估計對于血清白蛋白濃度的每2.5g/dL減少，有24%-56°/。死亡危險的增加。(Goldwaster等，1997)。這種估計是在關(guān)于其他共變量(例如，腎功能，血清氨基轉(zhuǎn)移酶，乳酸酸中毒)調(diào)整后做出的，它強(qiáng)有力地表明白蛋白輸注可能具有直接的細(xì)胞保護(hù)作用。(Cochrane等，1998)。如上所述，清楚的是，根據(jù)可以得到的描述它的科學(xué)文獻(xiàn)的數(shù)量和通過它享有的工業(yè)應(yīng)用的數(shù)目來判斷，hSA也許是所有血漿蛋白質(zhì)中最為人們所知的。然而，這種大量的知識主要集中于它的生理學(xué)和白蛋白的臨床應(yīng)用，而不是血漿分級分離以外的從任何來源純化它或獲得所述分子所用的方法學(xué)。最熟知的并且仍然被廣泛使用的純化方法是60年前由Cohn和他的同事們開發(fā)(CohnE.J.等，1947)。Cohn血漿分級分離方法主要被用來生產(chǎn)純化的血漿產(chǎn)品，用于多種臨床應(yīng)用。Cohn還開發(fā)了一種被廣泛使用的用于人血清白蛋白的結(jié)晶方法，該方法利用與從血漿分級分離方法熟知的那些類似的原理。然而，該方法具有明顯的效率低并且經(jīng)常不能提供足夠的高度純化的hSA的供應(yīng)。pH的影響pH的影響是蛋白質(zhì)結(jié)晶中的主要因素之一。通常蛋白質(zhì)晶體在特定的pH有一個界定很好的溶解度最小的點。在蛋白質(zhì)結(jié)晶的通常文獻(xiàn)中，最常見的情況是這個最小溶解度是在靶蛋白質(zhì)的等電點。然而，hSA在其等電點是高度可溶的，跨越大范圍的離子強(qiáng)度。因此，白蛋白的結(jié)晶特性比許多其他蛋白質(zhì)的特性更復(fù)雜的多，使可靠的結(jié)晶和/或純化成問題。白蛋白具有變化的等電點，取決于它接受的化學(xué)處理。帶有全部足量的6個結(jié)合脂肪酸，hSA的pl通常是4.6，然而，當(dāng)被全部脫脂時，它的pl可高達(dá)5.6。因此，hSA的結(jié)晶特性在它的"天然的"狀態(tài)和脫脂狀態(tài)之間變化，并且文獻(xiàn)中報道的hSA本身結(jié)晶的最適pH實質(zhì)上在低值4.6至高值8.0之間變化，并且高度依賴于以每批為基礎(chǔ)的hSA的分子狀態(tài)。因此，存在于文獻(xiàn)中的被認(rèn)為是hSA結(jié)晶的最適pH范圍是混亂的并且明顯依賴于不同的沉淀試劑，使用的每種沉淀劑具有可變化的濃度，也許只最適合于hSA分子可能狀態(tài)中的一種。例如，用低離子強(qiáng)度的hSA時，像在Cohn醇方法中期望的那樣，結(jié)晶最適在pH4.9-5.3進(jìn)行，該pH接近于天然白蛋白的等電點。在具有更高離子強(qiáng)度的狀況中和當(dāng)被強(qiáng)緩沖時，通過PEG溶液結(jié)晶的最適pH是7.4?？傊瑘蟮赖年P(guān)于hSA最適結(jié)晶的pH影響以這樣一種表面上看來不合常規(guī)的方式依賴于試劑組成，所述方式通過參考現(xiàn)有技術(shù)和現(xiàn)有技術(shù)方法學(xué)不能得出可靠的結(jié)論。事實上，鑒于現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)的狀態(tài)，每一種新試劑和技術(shù)必須根據(jù)特定pH或其他單變量進(jìn)行大量的優(yōu)化，以在得出結(jié)晶條件時被保持一致。沉淀試劑的影響應(yīng)該注意到，hSA在變化的鹽濃度中具有很高的溶解度。它在低離子強(qiáng)度下加入乙醇(Cohn方法；CohnE.J.等，1947)或其他溶劑，它可被沉淀或結(jié)晶?；蛘撸煤芨啕}濃度的鹽析出是可能的，并且描述了早期文獻(xiàn)大多數(shù)使用的硫酸銨或乙醇。在更近的文獻(xiàn)中，不同分子量的PEG溶液已被廣泛地應(yīng)用。然而，因為殘余的污染物，列于文獻(xiàn)中的試劑對于所得到的hSA臨床應(yīng)用來說是不可接受的。在現(xiàn)有技術(shù)的沉淀試劑中，只有乙醇和硫酸銨在hSA的生產(chǎn)中是有用的。然而，它們都有明顯的實際問題。用乙醇結(jié)晶需要加入有毒的有機(jī)變性劑例如苯或重金屬。硫酸銨對于最終白蛋白制劑來說不是合適的鹽，因此需要被去除。特定試劑的影響除了它的其他特征以外，白蛋白具有與許多較小的分子和離子結(jié)合和附著的超常能力。不同的長鏈醇和脂肪酸與hSA的結(jié)合強(qiáng)烈影響分子hSA的結(jié)晶特征，并且再次起使臨床級人血清白蛋白的生產(chǎn)高度可變和不可預(yù)測的作用。能夠顯著影響hSA結(jié)晶特征的試劑的例子包括癸醇，棕櫚酸和辛酸。溫度的影響還應(yīng)該注意到，現(xiàn)有技術(shù)試圖在乙醇溶液中結(jié)晶hSA，該溶液典型地是在0-10X:范圍內(nèi)的低溫度下制備的。高鹽和PEG操作經(jīng)常在4-20。C的寬溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。在這些現(xiàn)有技術(shù)努力中，不清楚溫度對白蛋白沉淀的真正影響。在乙醇中晶體溶解度在低溫下看起來較低。存在于現(xiàn)有技術(shù)中的PEG和鹽方法中沒有清楚描述溫度的影響。對于生產(chǎn)效率和商業(yè)可行的方法來說，溫度是主要的因素之一?？傊?，溫度的意義沒有被現(xiàn)有技術(shù)解釋或公開。動力學(xué)和放入晶種(seeding)根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，在將要完成的給定反應(yīng)中結(jié)晶白蛋白所需的時間占幾天時間。然而，現(xiàn)有技術(shù)方法中那些應(yīng)用乙醇的方法也許是最快的，只需要12到24小時開始結(jié)晶。還根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)方法，沒有添加劑，包括用從先前反應(yīng)中形成的晶體接種反應(yīng)混合物，白蛋白的實際結(jié)晶也許是根本不可能的。另外，依賴PEG的結(jié)晶方法，可能利用或可能不利用這種類型的添加劑。應(yīng)注意到，加入晶種確實顯著加快晶體生長，盡管鑒于本
技術(shù)領(lǐng)域：
中的混亂，通常沒有可被利用的參考文7獻(xiàn)，給出了一致地可靠結(jié)果或產(chǎn)生高收率的晶體。表1.在文獻(xiàn)中找到的結(jié)晶試劑和條件的實例一覽表。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>血清白蛋白的方法，所述無機(jī)鹽包括50%飽和的(NH4)2S04;15-20%Na2S04;2.2MK-磷酸鹽pH6.8和3MNa-磷酸鹽pH5.0。在這些現(xiàn)有技術(shù)結(jié)晶方法中發(fā)現(xiàn)癸醇是必需的結(jié)晶輔助劑。發(fā)現(xiàn)在它們的分子主鏈上多于5個碳原子的其它脂肪醇也是適用的。然而，非常有限地描述了結(jié)晶條件和步驟。沒有呈現(xiàn)物料平衡。在可從本引文中獲得的數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，以充分可控或可靠的方式進(jìn)行白蛋白的結(jié)晶是不可能的?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的綜述顯示，盡管有多種建議的結(jié)晶方法，但相關(guān)的引文沒有教導(dǎo)在工業(yè)或商業(yè)規(guī)模上有效的方法，教導(dǎo)了不適用于生產(chǎn)治療產(chǎn)品或賦形劑的方法，或教導(dǎo)了僅適用于生產(chǎn)僅在X-射線衍射研究中有用的單晶的方法。因此現(xiàn)有技術(shù)的局限阻止了結(jié)晶條件的廣博知識的發(fā)展，所述結(jié)晶條件是在設(shè)計治療劑、藥物賦形劑或醫(yī)療輔助劑作用中hSA的大規(guī)模結(jié)晶方法中必需的。此外，現(xiàn)有技術(shù)沒有提供這樣的教導(dǎo)，該教導(dǎo)提供了來自人血漿以外來源的用途。因此，存在了解可靠并且在商業(yè)規(guī)模上由各種各樣的來源生產(chǎn)白蛋白晶體的物理和化學(xué)條件的需要。發(fā)明概述本發(fā)明提供了改進(jìn)的生產(chǎn)晶體人白蛋白的方法。該方法適合于各種白蛋白來源包括人血漿，以及來自重組白蛋白來源例如培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳或其它體液、轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因鳥類、重組細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物、重組酵母細(xì)胞培養(yǎng)物或重組昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物。也就是，它適用于生產(chǎn)結(jié)晶的和藥物級hSA，不論它來自的原料流(feedstream)。所述方法具有高純化力，以致于能將晶體白蛋白與存在于特定原料或原料流中的其它蛋白質(zhì)、細(xì)菌、脂肪酸或其它分子種類有效地分離。在本發(fā)明的另外實施方案中，通過在結(jié)晶介質(zhì)中的加熱和冷卻循環(huán)，可以將白蛋白溶解并再結(jié)晶。按照本發(fā)明使用者的需要，可以重復(fù)這種，重結(jié)晶步驟無限數(shù)次。在重結(jié)晶步驟中常規(guī)地改進(jìn)白蛋白的純度。本發(fā)明的方法還提供試劑和條件的精確組合，允許晶體人白蛋白生產(chǎn)的最佳化。在這些方法中重要的方法參數(shù)例如pH和溫度被精確操作。本發(fā)明的另外實施方案提供了磷酸鈉或磷酸鉀和/或辛酸或辛酸鹽的沉淀試劑的最佳濃度。本發(fā)明的方法是基于某些影響人白蛋白結(jié)晶的關(guān)鍵因素。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法以特定的方式優(yōu)化了如下變量以便優(yōu)化結(jié)晶方案參數(shù)如下1.以計劃步驟改變磷酸鹽濃度；2.以計劃步驟變化反應(yīng)混合物的溫度，其中連續(xù)地應(yīng)用加熱和冷卻過程；3.以計劃的步驟方式控制反應(yīng)混合物的pH或變化其pH;4.其中這些特定步驟的應(yīng)用允許人白蛋白從特定原料流中純化和結(jié)晶。參照附圖，在下面本發(fā)明優(yōu)選實施方案的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將變得顯而易見。附圖簡要說明圖1顯示了結(jié)晶重組人血清白蛋白的方法流程圖。圖2顯示了在pH6.2，不同的溫度下的白蛋白溶解度，和指數(shù)趨勢線。圖3顯示了在pH6.2,不同的溫度下的白蛋白溶解度，和線性趨勢線。圖4顯示了在15。C下白蛋白晶體的pH溶解度。圖5提供了洗滌的白蛋白晶體在不同的磷酸鹽溶液pH6.2中的溶解度研究。圖6提供了洗滌的白蛋白晶體在具有變化的辛酸鹽濃度的2.63M磷酸鹽溶液中的溶解度研究。圖7顯示了hSA晶體漿液在2.7M磷酸鹽pH6.2中的熱沉淀研究。圖8顯示了白蛋白的制備性結(jié)晶的方法流程圖。圖9顯示了重組人血清白蛋白結(jié)晶的方法流程圖。圖IO顯示了重結(jié)晶重組人血清白蛋白的方法流程圖。圖11顯示了在溶液混合物中的結(jié)晶的人白蛋白，該溶液混合物是2.3摩爾Na-K-確酸鹽pH6.2;辛酸鹽1.4mg/ml;hSA80mg/ml，在4'C結(jié)晶過夜，有兩小時在室溫(RT)下在空氣密封室中。圖12顯示了結(jié)晶的人白蛋白。顯示了在溶液混合物中的結(jié)晶的人白蛋白，該溶液混合物是2.5摩爾Na-K-磷酸鹽pH6.2;用辛酸鹽飽和；hSA46.5mg/ml，在4T結(jié)晶過夜。圖13顯示了在溶液混合物中的結(jié)晶的人白蛋白，該溶液混合物是2.3摩爾Na-K-磷酸鹽pH6.2;辛酸鹽1.4mg/ml;hSA80mg/ml，在4。C結(jié)晶過夜，有0小時在室溫(RT)下在空氣密封室中。圖14顯示了，本發(fā)明的白蛋白晶體以及更多的非晶形沉淀。典型的晶體大小大約是0.1x0.4mm。沉淀隨時間消失成為結(jié)晶。在4。C下，在2.7摩爾含有0.08%癸醇的硫酸銨；0.05MNa-K-磷酸鹽pH7.4中制備晶體。在4。C下結(jié)晶，hSA58.7mg/ml。優(yōu)選實施方案的描述在本說明書中下列縮寫具有指定的含義?？s寫:pH按照熟知的科學(xué)參數(shù)描述化學(xué)物或化合物氫離子活性的所用術(shù)語。PEG聚乙二醇的縮寫術(shù)語的解釋膠體-指不能輕易穿過毛細(xì)管壁的大分子。這些化合物發(fā)揮滲透(oncotic)(即它們吸引流體)負(fù)載的作用并且通常4皮施用以恢復(fù)血管內(nèi)容量和改善組織灌流。滲濾-一種結(jié)合超濾膜從大分子溶液中有效去除鹽或其它小分子的操作。目的是從白蛋白溶液中去除小分子并且調(diào)節(jié)緩沖劑，用于下一個步驟。組織灌流-流至組織的血液的量原料流-提供過程或方法并且含有目的蛋白質(zhì)的原料或原溶液。本發(fā)明結(jié)晶hSA的方法提供了高度理想的從含有各種各樣的其它蛋白質(zhì)組分的原料流中分離和純化白蛋白的方法。晶體是蛋白質(zhì)的最純的形式，一旦被沉淀，晶體比非晶形沉淀具有顯著更好的機(jī)械操作特性并且可通過各種各樣的本領(lǐng)域中已知的方法-陂分離。例如，在工業(yè)濾器上可有效地分離和洗滌晶體。結(jié)晶是被最多使用的精細(xì)化學(xué)物質(zhì)和藥物的最終純化方法。按照本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，用磷酸鈉和磷酸鉀的混合物結(jié)晶白蛋白。通過使用本發(fā)明的方法條件和方法以系統(tǒng)方式優(yōu)化結(jié)晶。如果條件沒有被最佳地調(diào)節(jié)，白蛋白可以非晶形相、液滴或凝膠的形式沉淀。非晶形沉淀是非常難以操作的，在濾器上不能有效地分離和洗滌它。非晶形相不輕易地轉(zhuǎn)化為晶體。當(dāng)按照本發(fā)明調(diào)節(jié)方法條件時，晶體產(chǎn)生是最佳的。下面提供了本發(fā)明的不同實施方案。1.磷酸鹽盡管單獨用磷酸鈉或單獨用磷酸鉀可進(jìn)行結(jié)晶，但優(yōu)選使用磷酸鈉和磷酸鉀的混合物。優(yōu)選磷酸鹽NaH2P04和K2HP04，因為它們可凈皮溶解呈直到4摩爾水溶液的濃度?？梢运械谋壤旌线@些4M的磷酸鹽以制備具有各種希望的pH值的4M結(jié)晶緩沖劑。優(yōu)選地，以相對高的磷酸鹽濃度結(jié)晶白蛋白，典型地約2.7M或更高。在圖1和圖2中最清楚地揭示了磷酸鹽濃度的重要性，它們描述了白蛋白晶體在具有不同摩爾濃度的磷酸鹽中的溶解度。圖2的半對數(shù)圖顯示，通過增加磷酸鹽摩爾濃度系統(tǒng)地降低晶體的溶解度。通過使用不斷增加的磷酸鹽的摩爾濃度，在方法中可以將白蛋白收率調(diào)節(jié)至理想的水平。借助磷酸鹽的溶解度，設(shè)置可使用磷酸鹽濃度的上限。通過降低溫度和增加白蛋白濃度，降低磷酸鹽溶解度。在本發(fā)明方法的一個實施方案中，通過將試劑的溫度降低至iox:以下，顯著地降低磷酸鹽的溶解度。通過降低試劑的溫度和增加白蛋白濃度，可獲得的水濃度也被降低。按照本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，在磷酸鹽濃度2.0-2.7M的范圍內(nèi)，原料中的大多數(shù)雜質(zhì)有效地沉淀，白蛋白在室溫(2s-30x:)下不輕易地結(jié)晶。通過被過濾(在調(diào)節(jié)磷酸鹽濃度2.0-2.7M后)去除雜質(zhì)。此后將濾液致冷至l(TC，在該溫度下白蛋白結(jié)晶。此外為了增加晶體白蛋白收率，可以增加磷酸鹽濃度(利用圖1和圖2的信息)，還參見表2和圖4。2.pH的重要性按照本發(fā)明，用磷酸鹽混合物充分控制結(jié)晶批料(batch)的pH。將具有不同pH值的混合物的實例和得到的對白蛋白晶體的影響呈現(xiàn)在表1中。將pH對白蛋白晶體溶解度的影響圖解地呈現(xiàn)在圖2中，還參見表2。通過降低pH從pH5.6至大約6.6降低了白蛋白晶體溶解度。直到至少pH7.4晶體溶解度仍然在很低的水平。在低于pH5.5晶體完全溶解。pH對結(jié)晶動力學(xué)具有特異的作用，因此不能以簡單的方式使用更高的pH范圍6.3-7.4。在更高的pH范圍內(nèi)，如果恰好在方法的開始調(diào)節(jié)這樣的pH，白蛋白以非晶形相(液滴)的形式沉淀。因此結(jié)晶方法優(yōu)選最初用磷酸鹽pH6.2進(jìn)行(見表1磷酸鹽的混合配方以及圖2和圖3)。過后當(dāng)白蛋白大多數(shù)被結(jié)晶時，增加磷酸鹽濃度并且調(diào)節(jié)pH至更高的值，以增加晶體收率。當(dāng)洗滌晶體時，還有利地使用更高的pH，因為減少了蛋白質(zhì)的丟失。3.溫度的影響將白蛋白晶體在不同溫度和磷酸鹽濃度下的溶解度圖解地呈現(xiàn)在圖3中。在更高的溫度下，白蛋白晶體溶解度增加。最低的溶解度存在于約0"C。然而，優(yōu)選的結(jié)晶溫度是約IO"C，因為在更低的溫度下磷酸鹽可結(jié)晶并且使方法失去控制。實例操作約(TC是可能被進(jìn)行的，因為磷酸鹽結(jié)晶相對地慢。白蛋白的結(jié)晶動力學(xué)在室溫下非常慢。因此可以在室溫下將磷酸鹽濃度調(diào)節(jié)至2.6-2.7，不沉淀或結(jié)晶白蛋白。然而，雜質(zhì)在室溫下輕易地沉淀。過濾后，將白蛋白溶液致冷優(yōu)選至iox:。攪拌溶液，白蛋白結(jié)晶。通過利用加熱循環(huán)可以將白蛋白再結(jié)晶。通過加熱至45'C溶解晶體。致冷至1(TC后，白蛋白再次結(jié)晶。可以使用再結(jié)晶以提高晶體純度。在每次結(jié)晶后，通過進(jìn)行過濾可以去除母液?？稍跒V器上用冷的3M磷酸鹽洗滌晶體?？梢灾貜?fù)無數(shù)次再結(jié)晶循環(huán)。可以使用再結(jié)晶以提高白蛋白純度。為方便，請參見表7和表8以及圖7。白蛋白相對熱穩(wěn)定。它能被加熱直到65-70X:持續(xù)長時間。在這樣的高溫度下，大多數(shù)其它的蛋白質(zhì)變性和沉淀。因此可以使用65-70。C的加熱處理以在結(jié)晶前純化白蛋白溶液。最高的可耐受溫度與白蛋白的組成和pH有關(guān)。在高磷酸鹽濃度pH6，2下，最高的溫度是65匸。在低鹽媒介和pH5.4下，在70。C加熱2-3小時是可能的。將熱處理影響的實例呈現(xiàn)在表2和表3以及圖6中。4.辛酸鹽白蛋白需要用辛酸鹽飽和以便能夠結(jié)晶。辛酸鹽對白蛋白，具體對熱穩(wěn)定性還具有穩(wěn)定作用。其它的長連脂肪酸和長鏈醇也是有用的。在現(xiàn)有技術(shù)中癸醇是非常有效和熟知的。辛酸鹽具有雙重作用，這取決于如何使用它。當(dāng)僅將它用來飽和白蛋白的結(jié)合位點時，它是有益的。然而，過量的辛酸鹽將溶解晶體并減少白蛋白收率。辛酸鹽的作用很好地揭示在圖4中。向洗滌的晶體中添加辛酸鹽明顯增加晶體溶解度。當(dāng)辛酸鹽增加至10mM時，晶體溶解度快速增加。當(dāng)辛酸鹽增加從IO福至20mM時，溶解度增值較小但仍然明顯。14在磷酸鹽濃度2.63M和溫度lOt:下，白蛋白溶解度增加從10mM辛酸鹽中的9mg/ml至10mM辛酸鹽中的21mg/ml。在更高的磷酸鹽濃度2.82M和溫度10"C下，白蛋白溶解度增加從0mM辛酸鹽中的2mg/ml至10mM辛酸鹽中的12mg/ml。辛酸鹽的溶解影響是這樣的重要，以致于游離辛酸鹽的濃度應(yīng)被很好地控制并在結(jié)晶步驟中維持盡可能低。當(dāng)其它方面的條件使白蛋白晶體溶解度非常低時，低水平的游離辛酸鹽，l-2raM，也許是可接受的。請參見圖2至圖7。5.白蛋白濃度、純度在實驗溶液中，將起始溶液中的白蛋白濃度設(shè)定至比所用條件下晶體的溶解度更高的水平。按照本發(fā)明，當(dāng)用來源于轉(zhuǎn)基因動物或細(xì)胞培養(yǎng)物的原料流工作時，通常使用最初的澄清步驟以提供一種溶液，在該溶液中白蛋白濃度和其它化學(xué)參數(shù)被調(diào)節(jié)或被操作以致于它也比hSA晶體的溶解度高。在這兩種情況下，通過使用相圖(圖1-4)中的溶解度信息可以估計白蛋白的回收。按照本發(fā)明，在原料流溶液中的白蛋白的濃度水平通常在一升結(jié)晶批中15-300克白蛋白的范圍內(nèi)。在來自生物來源并且適用于商業(yè)或產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)hSA的原料流中，遇到了這些相同的范圍。此外，按照本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，在結(jié)晶過程中白蛋白不需要是純的?？衫帽景l(fā)明開發(fā)并提供的方法以結(jié)晶出在原料中的白蛋白，其中純度水平大約是10%,也就是，白蛋白僅構(gòu)成給定溶液總蛋白質(zhì)的10%。例如，用來源自轉(zhuǎn)基因來源或細(xì)胞培養(yǎng)物的hSA，在澄清步驟后留下的大多數(shù)雜質(zhì)在第一次添加磷酸鹽直到2.6M濃度水平后可被去除。還應(yīng)注意到，轉(zhuǎn)基因來源，典型地是乳汁，但也包括其它體液例如血液或尿，可含有hSA，該hSA是被設(shè)計以引起hSA(或其它目的蛋白質(zhì))在那些體液或組織中穩(wěn)定表達(dá)的DNA構(gòu)建體的插入的結(jié)果。在沉淀和被過濾后，通過超濾進(jìn)一步濃縮濾液以增加白蛋白濃度水平。此后按照本發(fā)明將濃縮的白蛋白溶液冷卻并結(jié)晶。15實施例1優(yōu)選的結(jié)晶方法本方法描述了純化的白蛋白溶液的結(jié)晶并為所述目的描述了僅磷酸鹽溶液的用途。然而，按照本發(fā)明，添加本文提供的另外的步驟，可以在不純或只是部分純化的原料上使用本方法，如可從轉(zhuǎn)基因或細(xì)胞培養(yǎng)原料流中見到的原料。下面呈現(xiàn)了例如利用具有明顯不純物質(zhì)的起始溶液的本發(fā)明方法的變異。步驟1.沉淀在結(jié)晶中使用了磷酸鹽儲備溶液，該溶液含有溶解在水中并被補(bǔ)充至1.0升的2.8摩爾的NaH2P04和1.2摩爾的K2HP0"當(dāng)被稀釋成0.5M后測量時，該4M磷酸鹽溶液具有pH6.2。此后，通過添加371mlpH6.2的4.OM磷酸鹽儲備溶液，沉淀200ml純化的白蛋白溶液。在所添加體積的基礎(chǔ)上，磷酸鹽濃度是2.6M。^f吏溶液在室溫下沉淀4-18小時，就本發(fā)明的這種變異來說，目的時間相對于現(xiàn)有技術(shù)方法是短的，在所有情況下少于24小時。所產(chǎn)生的沉淀的量與白蛋白溶液中雜質(zhì)的量直接有關(guān)。步驟2.過濾此后，通過具有大約1jam孔徑的玻璃纖維或纖維素纖維紙過濾沉淀的hSA。然后將過濾的溶液用于按照本發(fā)明優(yōu)選的結(jié)晶方法。步驟3.結(jié)晶在IOTC的恒溫的溫箱中進(jìn)行結(jié)晶。用頂部驅(qū)動的螺旋槳緩慢攪拌(大約70rpm)所述批料(batch)。通過添加229mlpH6.2的4M磷酸鹽從2.6M至3M逐漸增加磷酸鹽濃度。使結(jié)晶批料持續(xù)4天，然后收獲和洗滌。步驟4.晶體的收獲和洗滌<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>磷酸鹽緩沖劑稀釋的緩沖劑的pH值是在0.1-0.4M的范圍內(nèi)。緩沖劑No:11.pH6.3不太受稀釋的影響。當(dāng)M更高時，緩沖劑No:l-10具有更低的pH。當(dāng)摩爾濃度更高時，緩沖劑No:12-30具有更高的pH。還應(yīng)注意到，在本公開的圖6中提供了作為辛酸鹽濃度和溫度的函數(shù)的白蛋白在2.63M磷酸鹽中溶解度的曲線開放的圏(o)為在10。C下溫育的樣品的標(biāo)記并且黑色正方形(■)為在5。C下溫育的樣品的標(biāo)記。實施例2用樣支擴(kuò)散(microdiffusion)方法結(jié)晶白蛋白按照本領(lǐng)域中已知的懸滴微擴(kuò)散(hangingdropmicrodiffusion)法由48份樣品制備了結(jié)晶樣本。樣品溶液含有純化的198mg/ml的白蛋白和3.2mg/ml辛酸鈉。通過將3ja1的白蛋白溶液與3ja1的1.8-2.3M磷酸鹽混合制備了白蛋白的水溶液。允許滴在封閉的微擴(kuò)散孔中平衡并在5。C下冷卻。按照本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，在少于24小時內(nèi)產(chǎn)生晶體。按照本發(fā)明，來自其它來源物質(zhì)，特別是轉(zhuǎn)基因來源和細(xì)胞培養(yǎng)來源的原料流也可以與懸滴法結(jié)合被使用。用顯微鏡觀察晶體并用數(shù)字照相機(jī)拍照。在表19和20上提供了關(guān)于晶體發(fā)展的信息。這些樣本顯示，辛酸鹽飽和的白蛋白在1.8M至2.3M磷酸鹽，在精確限定的pH范圍，即從5.0-6.4內(nèi)結(jié)晶。結(jié)晶形成的最優(yōu)選的pH是在pH6.2，如在下表3中所見。有效提供的實驗條件的范圍覆蓋了在其它原料流來源中所見的濃度和溶液參數(shù)的范圍，見表4。18表3.<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實施例3在不純原料中結(jié)晶白蛋白從重組hSA原料起始進(jìn)行下面的方法描述，該原料含有許多干擾結(jié)晶的雜質(zhì)。需要最先的方法步驟用于去除雜質(zhì)。如果使用更純的白蛋白，相應(yīng)地減少步驟的數(shù)目。步驟1.濃縮應(yīng)通過盡可能多的超濾過濾濃縮原料。高蛋白質(zhì)濃度將減少磷酸鹽的使用并增加可結(jié)晶rhSA的收率。在濃縮步驟的末尾還應(yīng)用水過濾材料，以減少來源于前面方法步驟的鹽。蛋白質(zhì)濃縮的標(biāo)準(zhǔn)A280nra=150-200。步驟2.用磷酸鹽的最初沉淀向1.5體積的rhSA濃縮物中添加2.5體積的4M磷酸鹽(pH6.2)。在本步驟中的最終磷酸鹽濃度是2.5M，該濃度沉淀雜質(zhì)但不沉淀白蛋白。優(yōu)選在室溫下進(jìn)行該步驟。步驟3.過濾去除用布氏漏斗或壓力室濾器濾出的沉淀。使用硅藻土作為助濾劑，因為沉淀是非常細(xì)粒狀的物質(zhì)。因為沉淀將浮在液體的上面，所以離心不是一種方便的選擇。步驟4.結(jié)晶通過在濾液中添加更多的4M磷酸鹽(pH6.2)直到濃度為2.8M，開始hSA的結(jié)晶。在冷卻的溫度，優(yōu)選約5.(TC下進(jìn)行結(jié)晶。hSA的結(jié)晶，按照本發(fā)明的實施方案在24小時內(nèi)自發(fā)開始。在另一個實施方案中，晶種的添加將使該過程更迅速。步驟5.晶體的洗滌按照本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，通過離心或優(yōu)選通過過濾洗滌晶體。在離心中，晶體浮在磷酸鹽緩沖劑的上面。在約+5。C下用新鮮2.8M磷酸鹽溶液進(jìn)行洗滌。應(yīng)該用小于O.1bar的低壓差進(jìn)行晶體洗滌。重復(fù)洗滌3-4次直到濾液中的可溶性蛋白質(zhì)保持在接近恒定的低水21平，A28(L=1.0或更小。步驟6,晶體貯存物的配制將洗滌過的晶體分散在小體積的2.8M磷酸鹽緩沖劑中?？梢栽谶@種溶液中J^藏晶體直到被配置用于下一步驟。實施例4加熱處理后結(jié)晶不純的白蛋白原料本實施例使用的原料流物質(zhì)具有顯著量的作為雜質(zhì)的蛋白質(zhì)。白蛋白為存在的蛋白質(zhì)的大約30%。如已所述，這在由澄清的或部分純化的轉(zhuǎn)基因或細(xì)胞培養(yǎng)物來源提供的原料流物質(zhì)的典型范圍內(nèi)。將使用的包括107ml4M磷酸鹽pH6.2的溶液添加到200ml原料溶液中(此步驟前它是在2M磷酸鹽中)以得到2.70M溶液。按照本發(fā)明，將這種沉淀的溶液用作結(jié)晶的原料溶液。熱處理在55C將沉淀的起始溶液(在2.70M磷酸鹽中)溫育90分鐘。作為這種熱處理的結(jié)果，形成了大量的棒條樣晶體以及非晶形沉淀?？偟鞍踪|(zhì)的大約75%至80%結(jié)晶或沉淀。當(dāng)它還是熱的時候，通過玻璃纖維濾器過濾漿液去除晶體和沉淀。使用一些硅藻土作為助濾劑。只取含白蛋白的上清液濾液用于下一步驟。濃縮和過濾過濾后，溶液具有太低的白蛋白濃度用于結(jié)晶。因此，要將它濃縮并用FreseniusPolysulfoneUF6.2HemoflowF5HPS透析筒在55。C滲濾。方法步驟的詳細(xì)數(shù)據(jù)顯示在表6中。hSA結(jié)晶增加濃縮溶液的磷酸鹽濃度并將其緩慢調(diào)節(jié)至2.8。同時在冷卻器中輕輕地攪拌該批料使hSA結(jié)晶。收獲hSA晶體并通過過濾的真空洗滌。洗滌溶液是2.88M磷酸鹽pH6.4。如在下表5和圖7中所顯示的，雜質(zhì)的熱結(jié)晶在技術(shù)上是容易的并且是去除原料的主要雜質(zhì)的快速方法。表5.原料和洗滌的晶體的純度分析。ELISA試驗的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>原料Genzyme轉(zhuǎn)基因hSA:白蛋白濃度lot#X1131FF，蛋白質(zhì)濃度試驗TP84g/1和79g/1,ALB28.58g/1和28.75g/l。表6.不純的白蛋白從原料到晶體<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>用200ml等份樣品溶液計算全部序列步驟的物料平衡。實施例5通過使用加熱和冷卻循環(huán)重結(jié)晶白蛋白將先前在2.7M磷酸鹽pH6.2中制備的hSA晶體漿液，蛋白質(zhì)濃度為37.5g/l，用作按照本發(fā)明的優(yōu)選實施方案進(jìn)行的本研究的原料。將五份所述晶體漿液的樣品，每份0.50ml,在40、4、55、65或70。C培育60分鐘。在全部測試溫度下溶解晶體。在加熱結(jié)束時，通過0.45艸濾器過濾樣品。通過測量在280nm處的吸收測定濾液的可溶性蛋白質(zhì)。如在表7和表8以及圖13中所見，當(dāng)在40-55。C溫育所述晶體漿液時，總蛋白質(zhì)的約10%沉淀。在這種溫度范圍內(nèi)該值非常恒定并且它表示在加熱過濾步驟中被去除的雜質(zhì)。當(dāng)將溫度從65增加至70°C，樣品中的可溶性蛋白質(zhì)從83%降低至37%。因此，在70。C白蛋白也開始不可逆地沉淀。過濾后，樣品1至5加熱達(dá)到65°C，在設(shè)定在5。C的冷卻器中18小時后樣品全部重結(jié)晶良好。當(dāng)在7(TC溫育樣品5時，在濾液中沒有晶體產(chǎn)生，這表明白蛋白在所述溫度下在2.7M磷酸鹽中不穩(wěn)定，參見表8。這些例子顯示白蛋白可以，按照本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，通過使用加熱達(dá)到65'C，此后過濾并通過合適的重結(jié)晶循環(huán)而被很好地純化。表7.hSA晶體漿液的加熱沉淀研究的結(jié)果樣品加熱溫度在被過濾前，熱濾液0.45fim總蛋白質(zhì)中的編號處理后的觀察的A280可溶性蛋白質(zhì)(W輕度渾濁的溶液。大多數(shù)的140。C晶體被溶解17.0886245'C輕度渾濁的溶液，沒有晶體。17.9090355°C輕度渾濁的溶液，沒有晶體。17.7089增加地渾濁的溶液，沒有晶465x:體。16.6083570°C強(qiáng)沉淀的漿液，沒有晶體7.423724表8.被加熱并過濾的樣品的觀察，在低溫下重結(jié)晶。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實施例6在更高的PH下結(jié)晶白蛋白按照本發(fā)明進(jìn)行的本研究顯示，白蛋白晶體的溶解度和結(jié)晶可能依賴pH。另一個問題是在磷酸鹽緩沖劑存在下的辛酸鹽的分離。在更高的pH下辛酸鹽的溶解度增加。因此，甚至輕微更高的pH對最佳結(jié)晶形成將是理想的。按照本發(fā)明，用三個不同的磷酸鹽摩爾濃度水平在pH6.2-6.6的范圍內(nèi)制備了試驗結(jié)晶。如下表9中呈現(xiàn)了實驗細(xì)節(jié)。結(jié)果的評價如在下表9中所見，當(dāng)將pH增加至值6.4和6.5時，白蛋白非常有效地結(jié)晶。在pH6，4以上時，白蛋白溶解度非常低。不幸的是，在更高的pH水平時，白蛋白結(jié)晶為非常小的針形(參見圖10-13)?？赡芡ㄟ^在較低的pH6.2或6.3開始結(jié)晶，可發(fā)展成較大的晶體尺寸。在實現(xiàn)接近平衡時，通過逐漸地添加4MK2HP(h將pH調(diào)節(jié)至更高的水平。表9.白蛋白濃縮物102-5的試管結(jié)晶。樣品No#.每個實驗3mlRhSA31rag/ml可溶性蛋白質(zhì)20h(nd-未測定)磷酸鹽顯微鏡觀察N=沒有相分離A=非晶形沉淀C=晶體L='液相分離G=凝膠顆粒分離A280nmMpH102+1nd2.466.2N102+2nd2.466.3N102-9-317.62.466.4最初L，最后C102-9-46.22,466.5L，C，非常細(xì)的針狀體102-9-51.52.466.6C，非常細(xì)的針狀體，A102-9-6nd2.576.2最初L,最后C102-9-716.22.576.3最初L,G,最后C102-9-89.02.576.4L,G，C針狀體102+90.32.576.5C,短的針狀體或棒條102+10nd2.576.6C，短的針狀體或棒條102+11nd2.676.2最初G，最后C102-9-1214.92.676.3最初L，G,最后C102+130.32.676.4c，許多非常小的針狀體102-9-14nd2.676.5C，許多非常小的針狀體102-9-15nd2,676.6c,許多非常小的針狀體實施例7白蛋白晶體的重結(jié)晶和洗滌重結(jié)晶和洗滌在45X:加熱洗滌的晶體(102-12)5分鐘。晶體快速溶解。在還溫的時候，用0.45nm注射器濾器過濾溶液。在2X:攪拌經(jīng)過濾的溶液直到結(jié)晶(3天)。該批結(jié)晶很好(圖2)。通過過濾收獲晶體并在0.45nm(50mm直徑)Sartorius膜上用2.82MpH6.2磷酸鹽洗滌。將洗滌過的晶體分散在2.82M磷酸鹽緩沖劑中。26表IO.白蛋白晶體的重結(jié)晶和洗滌步驟MIA280nm白蛋白g以102-12開始26.936.91.877步驟1.在45"C加熱5分鐘26.9步驟2.過濾0.45nm26步驟3.在2。C攪拌3天(見圖2)26步驟4.收獲并洗滌、過濾37.83.60.256在2.82M中的晶體懸浮液22.134.81.451樣品102-13至Sigma71834.81.182適應(yīng)癥和用途低血容量癥低血容量癥是通過本發(fā)明的方法純化并可制備得到的白蛋白，25%的溶液，Buminate25%的可能適應(yīng)證。它在逆轉(zhuǎn)低血容量癥的有效性在很大程度上取決于它將腸液吸入循環(huán)中的能力。它對水合很好的患者最有效。當(dāng)?shù)脱萘堪Y是長時間持續(xù)并且血白蛋白減少存在，伴隨大量的水合或浮胂，25°/。白蛋白比5%蛋白質(zhì)溶液優(yōu)選。然而，在缺乏大量或過度水合的情況下，應(yīng)該使用5%蛋白質(zhì)溶液或應(yīng)用擬晶體稀釋25%白蛋白。雖然在休克的緊急處理中可以使用擬晶體溶液和含膠體的血漿替代物，但白蛋白具有延長的靜脈內(nèi)半衰期。當(dāng)血容量缺失是出血造成的時候，應(yīng)盡可能快速地給予適合的紅血細(xì)胞或全血。血清蛋白減少血清蛋白減少是使用通過本發(fā)明方法純化和可制得的白蛋白(25%的溶液，Buminate25%)的另一種可能的適應(yīng)癥。血清白蛋白減少可由下面所述的一種或多種引起產(chǎn)生不足(營養(yǎng)不良、燒傷、大手術(shù)、感染等)；過量的分解代謝(燒傷、大手術(shù)、胰腺炎等)；從身體的丟失(出血、過量的腎排泄、燒傷滲出物等)；以及身體內(nèi)的重分布27(大手術(shù)、各種炎性狀況等)。當(dāng)白蛋白缺失是過量蛋白質(zhì)丟失的結(jié)果時，施用白蛋白的效果將是暫時的，除非逆轉(zhuǎn)了潛在的病癥。在大多數(shù)情況下，伴隨潛在病癥的治療的增加的氨基酸和/或蛋白質(zhì)的營養(yǎng)性替代將比白蛋白溶液更有效地恢復(fù)正常血漿白蛋白水平。偶然地伴隨嚴(yán)重?fù)p傷、感染或胰腺炎的血清蛋白減少不能快速地逆轉(zhuǎn)并且營養(yǎng)補(bǔ)充劑可能不能恢復(fù)血清白蛋白水平。在這些情況下，白蛋白(人)，25%的溶液，Buminate25°/?？赡苁且环N有用的輔助劑。燒傷還沒有建立在燒傷的早期治療中使用白蛋白、電解質(zhì)和流體的最佳方案，但是，結(jié)合適當(dāng)?shù)念惥w療法，白蛋白(人)，25%的溶液，Buminate25%可能被表明在廣泛燒傷后起始24小時期間后用于膠體滲透壓缺陷的治療和替代伴隨任何嚴(yán)重?zé)齻牡鞍踪|(zhì)丟失。成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)ARDS的特征是血蛋白過少狀態(tài)，該狀態(tài)在原因上可能與間質(zhì)性肺水腫有關(guān)。雖然關(guān)于在這些患者中白蛋白輸注的精確適應(yīng)癥存在不確定性，但如果有伴隨有血白蛋白減少的肺過載，當(dāng)與利尿劑一起使用時，25%白蛋白溶液可能具有治療效果。腎變病在治療有嚴(yán)重腎變病的患者中的浮腫中，白蛋白(人)，25°/的溶液可能是一種有用的輔助，所述患者正接受類固醇類和/或利尿劑。心肺分流外科手術(shù)在心肺分流手術(shù)之前或在心肺分流手術(shù)過程中推薦白蛋白(人)，25%的溶液，Buminate25%,盡管沒有顯示它相對于類晶體溶液的優(yōu)點的明確數(shù)據(jù)。新生兒的溶血病(HDN)在患有嚴(yán)重的HDN的嬰兒中可給予白蛋白(人)，25%的溶液，Buminate25%以試圖結(jié)合未綴合膽紅素并4吏其解毒。將通過本發(fā)明方法純化的白蛋白用作藥物給藥的賦形劑也是可能的。晶體篩選實驗在具有被分成4排(A、B、C、D)和6列的24孔盒中進(jìn)行懸滴篩選。在初步報告中，僅以如下試劑列表的形式呈現(xiàn)所述篩選。提供了對結(jié)果的簡要評論。在最終報告中，在表中用類似于下面實施例表的完全細(xì)節(jié)提供結(jié)果。顯微術(shù)和表在實驗的開始用2-3天的頻率以及后來一周一次進(jìn)行了用顯微術(shù)的樣品評價。表中的顯微術(shù)觀察結(jié)果為使用下面字母的縮寫形式:N-沒有沉淀或其它相分離C-一些沉淀存在CC-顯著量的晶體存在A-非晶形沉淀，看起來像云或棕色煙的非透明顆粒云，顆粒的大小接近光學(xué)顯微鏡分離能力的最低限。AA-顯著量的非晶形沉淀L-液相分離，球形透明滴，看起來像水中的油。LL-明顯的液相分離G-凝膠塊，直徑幾微米的不規(guī)則玻璃狀透明顆粒GG-顯著量的凝膠X-污染或干燥的滴，中斷的實驗表11.對非晶形沉淀的可逆溫度影響。在顯微術(shù)下，在較高的溫度下沉淀增加。晶體是非常溫度敏感的，它們在較高的溫度下溶解。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>MCS23AAT，樣品GTChSA:標(biāo)記7F-5AC;用0.05MK-Na-磷酸鹽pH7.4緩沖的PEG3350或(NH4)2S04,癸醇添加物的影響。A排在0.05MK-Na-磷酸鹽pH7.4中的17、18、19、22、25或30%的500piPEG3350;向每500jilA試劑中添加10jn14%癸醇以得到最終0.08%癸醇。B排和A排一樣，但向每500ji1A試劑中添加50ja14%癸醇以得到最終0.36。/。癸醇。C排500ja1的(匪4)2304，在0.05MK-Na-磷酸鹽pH7.4中的1.5、1.65、1.8、2.1、2.4或2,7M;向每500ia1A試劑中添加10ja14%癸醇以得到最終0.08%癸醇。D排和C排一樣，但向每500m1a試劑中添加50|ii14%癸醇以得到最終0.36°/0癸醇。結(jié)果用2.4M和2.7M硫酸銨-癸醇組合產(chǎn)生了高質(zhì)量的晶體(圖14)用19%PEG,0.08%癸醇生產(chǎn)了不同習(xí)性的晶體。用兩種試劑還生產(chǎn)了非晶形或凝膠沉淀。結(jié)晶與試劑濃度和溫度非常顯著地相關(guān)。表12.<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>上表12，MCS22AAS，樣品SigmahSA，A-9511;用0.05MK-Na-磷酸鹽pH7.4緩沖的PEG3350或(NH4)2S04癸醇添加物的影響與表11相似的篩選。結(jié)果SigmahSA以及GTChSA7F-5AC不結(jié)晶。只有一個在1.5M(NH4)2S04，0.36%癸醇中的樣品產(chǎn)生了高質(zhì)量的晶體。表13.對非晶形的可逆溫度影響。在顯微術(shù)下，在較高的溫度下沉淀增加。體是非常溫度敏感的，它們在較高的溫度下溶解。盒代碼MCS22AT開始日期(日，月，年)17.8.2001顯微術(shù)觀察C=晶體A=非晶形沉淀L=液相分離，球形滴G=凝膠，玻璃狀固體不規(guī)則顆粒N=沒有相分離，澄清的溶液X=實驗失敗，中斷，干燥，微生物污染等。樣品GTChSA:標(biāo)記7F-5AC滴8in1樣品+2(j1試劑溫度+25°(:或+7匸最初蛋白質(zhì)濃度11.7mg/ml最終蛋白質(zhì)濃度58mg/ml緩沖劑0.05MK-Na-磷酸鹽pH7.4孑匕試劑Id+25'C4d+25°C30d，+7°Cd，。CAl17%PEG3350NNNA218%PEG3350NNNA319%PEG3350NNNA422%PEG3350NNAA525%PEG3350NNNA630%PEG3350IXIXA，GBl17%PEG33500.4%辛酸NNAB218%PEG33500.4%辛酸NNAB319%PEG33500.4%辛酸NNAB422%PEG33500.4%辛酸NNNB525%PEG33500.4%辛酸NNA，LB630%PEG33500.4%辛酸IXIXA，LCl1.5M(NH4)2S04NNNC21.65M(NH4)2S04NNNC31.8M(NH4)2S04NNNC42.1M(NH4)2S04NNAC52.4M(NH4)2S04ANA，GC62.7M(NH4)2S04GGC,GA，GDl1.5M(NH4)2S040.4%辛酸NNND21.65M(NH4)2S040.4%辛酸NNND31.8M(NH4)2S040.4%辛酸NNND42.1M(NH4)2S040.4%辛酸NNAD52.4M(NH4)2S040.4°/。辛酸NLL，GGAD62.7M(NH4)2S040.4%辛酸L，GLL，GGA關(guān)于表13，MCS22AT，樣品GTChSA;標(biāo)記7F-5AC;用0.05MK-Na-磷酸鹽pH7.4緩沖的PEG3350或(NH4)2S04辛酸添加物的影響。結(jié)果只在沒有辛酸的2.7M(NH4)2S04中產(chǎn)生了不穩(wěn)定的晶體。33<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表15.<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>MCS16樣品GTChSA:標(biāo)記7F-5AC;用磷酸鹽緩沖的硫酸銨4排Al，OM，B1,5M，C2，0M，D3，0M6欄0，1M磷酸鹽pH5，0pH5.6pH5.9pH6.2pH6,6pH結(jié)果在2M以上非晶形沉淀。一些不穩(wěn)定的質(zhì)量不好的晶體在40天貯藏中消失了。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>MCS17，樣品GTChSA:標(biāo)記7F-5AC;用磷酸鹽緩沖的硫酸鈉4排A1,0M，B1,5M，C1,75M，D2.0MNa2S046欄0，1M磷酸鹽pH5.0pH5.6pH5.9pH6.2pH6.6pH7.0結(jié)果在1.75M和2.0MNa2S04中的不穩(wěn)定晶體在1.5-2,0MNa2S04中的沉淀、非晶形和凝膠表17.注當(dāng)將晶體移至室溫進(jìn)行顯微鏡觀察時，晶體不穩(wěn)定。開始日期(日，月，年)28.8.2001顯微術(shù)觀察C=晶體A=非晶形沉淀L=液相分離，球形滴G=凝膠，玻璃狀固體不規(guī)則顆粒N=沒有相分離，澄清的溶液X=實驗失敗，中斷，干燥，微生物污染等。樣品GTChSA:標(biāo)記7F-5AC滴5p1樣品+2n1i式劑溫度最初蛋白質(zhì)濃度10.3mg/ml最終蛋白質(zhì)濃度36mg/ml緩沖劑0.1MNa—K-^酸鹽pH6.6-7.8孑L試劑在所有樣品中0.36%癸醇天數(shù)(d)，溫度('C)12d，+7。C22d,+7°C28d,+7°CAl1.6MNa-K-磷酸鹽pH6.6NNA21.6MNa-K-磷酸鹽pH7.0NNA31.6MNa-K-磷酸鹽pH7.2NNA41.6MNa-K-磷酸鹽pH7.4LNNA51.6MNa-K-磷酸鹽pH7.6NNA61.6MNa-K-磷酸鹽pH7.8GNNBl1.8MNa-K-磷酸鹽pH6.6NNB21.8MNa-K-磷酸鹽pH7.0NNB31.8MNa-K-磷酸鹽pH7.2NNNB41.8MNa-K-磷酸鹽pH7.4NNNB51.8MNa-K-磷酸鹽pH7.6NNNB61.8MNa-K-磷酸鹽pH7.8L，GNNCl2.0MNa-K-磷酸鹽pH6.6NNC22.0MNa-K-磷酸鹽pH7.0NNC32.0MNa-K-磷酸鹽pH7.2NNC42.0MNa-K-磷酸鹽pH7.4NNC52.0MNa-K-磷酸鹽pH7.6NNC62.0MNa-K-磷酸鹽pH7.8L，GNNDl2.2MNa-K-磷酸鹽pH6.6ND22.2MNa-K-磷酸鹽pH7.0CCND32.2MNa-K-磷酸鹽pH7.2CCND42.2MNa-K-磷酸鹽pH7.4CCND52.2MNa-K-磷酸鹽pH7.6CCNCC,LD62.2MNa-K-磷酸鹽pH7.8CCNCC，L37MCSA30，樣品GTChSA:標(biāo)記7F-5AC在所有滴中1.6-2.2MK-Na-磷酸鹽pH6.6-7.8,0.36%癸醇結(jié)果在2.2M磷酸鹽pH7.0-7.8中好質(zhì)量的晶體。晶體是非常溫度敏感的，在室溫下顯微術(shù)后它們?nèi)芙獠⑶以谥吕淦髦杏纸Y(jié)晶。表18.注可逆溫度影響；顯微術(shù)下在更高溫度下非晶形沉淀增加。晶體不穩(wěn)定，顯微術(shù)下在較高溫度下它們?nèi)芙狻?lt;table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>表19.注可逆溫度影響；顯微術(shù)下在較高溫度下非晶形沉淀增加。晶體不穩(wěn)定，顯微術(shù)下在較高溫度下它們?nèi)芙狻ｉ_始日期(日，月，年)10.8.2001顯微術(shù)觀察C=晶體A=非晶形沉淀L=液相分離，球形滴G=凝膠，玻璃狀固體不^L則顆粒N=沒有相分離，澄清的溶液X=實驗失敗，中斷，干燥，微生物污染等。樣品GTChSA:標(biāo)記7F-5AC滴5ja1樣品+1n1試劑溫度+7'C最初蛋白質(zhì)濃度12.2mg/ml最終蛋白質(zhì)濃度73mg/ml緩沖劑Na-K磷酸鹽pH6.6-8.2孑匕試劑天數(shù)(d),溫度(°C)3d,+7。C8d,+7°C10d，+7。C40d，+7。CAl1.2MNa-K-磷酸鹽pH6.6NNNNA21.2MNa-K-磷酸鹽pH7.0NNNNA31.2MNa-K-磷酸鹽pH7.4NNNNA41.2MNa-K-磷酸鹽pH7.7NNNNA51.2MNa-K-礴酸鹽pH8.2NNNNA6Bl1.6MNa-K-磷酸鹽pH6.6NNAAB21.6MNa-K-磷酸鹽pH7.0NNAAB31.6MNa-K-磷酸鹽pH7.4AAA,GGAAB41.6MNa-K-磷酸鹽pH7.7NNNNB51.6MNa-K-磷酸鹽pH8.2NNNNB6Cl1.8MNa-K-磷酸鹽pH6.6NNAAC21.8MNa-K-磷酸鹽pH7.0NNAAC31.8MNa-K-磷酸鹽pH7.4AAAA，GGCC,GGAAC41.8MNa-K-磷酸鹽pH7.7NAAGGAC51.8MNa-K-磷酸鹽pH8.2NAAGGAC6Dl2.2MNa-K-磷酸鹽pH6.6ACC，AGGG,AD22.2MNa-K-磷酸鹽pH7.0ACC，GGGG，AD32.2MNa-K-磷酸鹽pH7.4AA，LGG，LLGGG，AD42.2MNa-K-磷酸鹽pH7.7AAAAGGAAD52.2MNa-K-磷酸鹽pH8.2AAAAGGAAD6表18和19MCS15/1和MCS15/2,樣品GTChSA:標(biāo)記7F-5AC沒有任何添加物的磷酸鹽39pH4.3-8.2Na-K-P(h濃度1，2M-2，2M4排A1，2M，B1，6M，C1，8M，D2，2M11欄:pH4,3(NaH2P0,)含有pH5.0pH5.3pH5.6pH5,9pH6.2pH6.6pH7.0pH7.4pH7.7pH8.2結(jié)果在pH7.4為沉淀的精確最佳值。在pH6,6以上和在pH5.3不穩(wěn)定的晶體。存在進(jìn)一步研究的很大潛力。表20.開始日期(日，月，年)14.8.2001顯微鏡觀察C=晶體A=非晶形沉淀L=液相分離，5求形滴G=凝膠，玻璃狀固體不規(guī)則顆粒N=沒有相分離，澄清的溶液X=實驗失敗，中斷，干燥，微生物污染等。樣品GTChSA:標(biāo)記7F-5AC滴5n1樣品+1u1試劑溫度+25匸或+7^最初蛋白質(zhì)濃度12.2mg/ml最終蛋白質(zhì)濃度73rag/ml緩沖劑0.03Na-HEPESpH7.5-7.8孑匕試劑天數(shù)(d)，溫度('C)6d，+25°C30d，+7。CAl25%2—丙醇，20mMMgCl2NNA230%2—丙醇，20mMMgCl2GG,AA335%2_丙醇，20mMMgChGL,AA41.5%千醇，20mMMgCl2NAA51.5%卡醇，50mMMgCl2NNA61.5%千醇，100mMMgCl2NNBl25%2—丙醇，100mMMgCl2NNB230%2-丙醇，100mMMgCl2GG,AB335%2—丙醇，100mMMgCl2L，AB41.5%卡醇，200mMMgCl2NNB51.5°/節(jié)醇，300mMMgCl2NNB61.5%千醇，400mMMgChNNCl25%2-丙醇，200mMMgCl2NNC230%2-丙醇，200mMMgCl2GG,AC335%2-丙醇，200mMMgCl2GG，AC41.25%千醇，20raMMgCl2NNC51.25%千醇，100mMMgCl2NNC61.25%千醇，300mMMgCl2NNDl25%2-丙醇,300mMMgCl2NND230%2-丙醇，300mMMgCl2NND335%2—丙醇，300mMMgCl2NND41.0%卡醇，20mMMgCl2NND51.0%節(jié)醇，100mMMgCl2NND61.0°/。節(jié)醇，300mMMgCl2NN40MCS21，樣品GTChSA:標(biāo)記7F-5AC與氯化鎂的試劑組合并含有2-丙醇或芐醇結(jié)果只在用含有2-丙醇的樣品時沉淀。用芐醇沒有影響。表21.<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>用磷酸鹽緩沖的氯化鈉4排A1，5B2.0M，C3,0M，D4，0M6欄0，1M磷酸鹽pH5.0pH5.6pH5.9pH6.2pH6.6pH7.0結(jié)果沒有沉淀或相分離表22.開始日期(日，月，年)10.8.2001顯微術(shù)觀察C=晶體A=非晶形沉淀L=液相分離，球形滴G=凝膠，玻璃狀固體不規(guī)則顆粒N=沒有相分離，澄清的溶液x=實驗失敗，中斷，干燥，微生物污染等。沖羊品GTChSA:標(biāo)記7F-5AC滴5m1樣品+1m1試劑溫度+7°C最初蛋白質(zhì)濃度12.2rag/ral最終蛋白質(zhì)濃度73mg/ml緩沖劑0.1MNa-K-磷酸鹽pH5.0—7.0孑匕試劑天數(shù)(d)，溫度(。C)3d，+7。C4d，十7'C10d，+7'C40d，+7'CAl1.5MKC1pH5.0NNNNA21.5MKC1pH5.6NNNNA31.5MKC1pH5.9NNNNA41.5MKC1pH6.2NNNNA51.5MKC1pH6.6NNNNA61.5MKC1pH7.0NNNNBl2.0MKC1pH5.0NNNNB22.0MKC1pH5.6NNNNB32.0MKC1pH5,9NNNNB42.0MKC1pH6.2NNNNB52.0MKC1pH6.6NNNNB62.0MKC1pH7.0NNNNCl3.0MKC1pH5.0NNNNC23.0MKC1pH5.6NNNNC33.0MKC1pH5.9NNNNC43.0MKC1pH6.2NNNNC53.0MKC1pH6.6NNNNC63.0MKC1pH7.0NNNNDl4.0MKC1pH5.0NNNND24.0MKC1pH5.6NNNND34.0MKC1pH5.9NNNND44.0MKC1pH6.2NNNG,AD54.0MKC1pH6.6NNNG，AD64.0MKC1pH7.0NNNN42樣品GTChSA:標(biāo)記7F-5AC用磷酸鹽緩沖的氯化鉀4排A1，5M，B2.0M，C3.0M，D4，0M6欄0，1M磷酸鹽pH5.0pH5.6pH5'9pH6.2pH6.6pH7.0結(jié)果大多數(shù)沒有沉淀或相分離。在3.9MKC1pH6.2-6.6中40天后，凝膠沉淀。表23.開始日期(日，月，年)15.8.2001顯微鏡觀察C=晶體A=非晶形沉淀L=液相分離，球形滴G=凝膠，玻璃狀固體不規(guī)則顆粒N=沒有相分離，澄清的溶液X=實驗失敗，中斷，干燥，微生物污染等。樣品GTChSA:標(biāo)記7F-5AC滴5m1樣品+1p1試劑溫度+25匸或+4匸最初蛋白質(zhì)濃度12.2mg/ml最終蛋白質(zhì)濃度73rag/ml緩沖劑0.035MTrisHClpH8.0或8.4孔試劑日期或天數(shù)(溫度)5d，+25°C30d,+4'CAl10%PEG600050mM乙酸銨pH8.0NNA210%PEG6000lOOmM乙酸銨pH8.0NNA310%PEG6000300mM乙酸銨pH8.0NNA410%PEG600050mM乙酸按pH8.4A,GNA510%PEG6000lOOmM乙酸銨pH8.4A,GAA610%PEG6000300mM乙酸銨pH8.4NNBl15%PEG600050mM乙酸銨pH8.0NNB215%PEG6000lOOmM乙酸銨pH8.0ANB315%PEG6000300mM乙酸銨pH8.0IXL,AB415%PEG600050mM乙酸銨pH8.4A,GNB515%PEG6000lOOmM乙酸銨pH8.4A,GAB615%PEG6000300mM乙酸銨pH8.4NNCl20%PEG600050mM乙酸銨pH8.0A,LXC220%PEG6000lOOmM乙酸銨pH8.0NAC320%PEG6000300mM乙酸銨pH8.0LL，AC420%PEG600050mM乙酸銨pH8.4A，GC520%PEG6000lOOmM乙酸銨pH8.4GA,GC620%PEG6000300mM乙酸銨pH8.4Dl25%PEG600050邁M乙酸銨pH8.0L，GD225%PEG6000lOOmM乙酸銨pH8.0IXL，GD325%PEG6000300mM乙酸銨pH8.0IXL,GD425%PEG600050mM乙酸銨pH8.4IXA，GD525%PEG6000lOOmM乙酸銨pH8.4IXL,G,AD625%PEG6000300mM乙酸銨pH8.4L，G43樣品GTChSA:標(biāo)記7F-5AC10—25%PEG6000，0.05—0.3M乙酸銨，0.035MTris-HClpH8.0-8.4，結(jié)果沒有晶體。在大多數(shù)樣品中有不同的沉淀。表24,<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>樣品GTChSA:標(biāo)記7F-5AC樣品中的不同分子量400-20000的PEG，磷酸鹽緩沖劑pH7.4。結(jié)果沒有晶體并且大多數(shù)沒有沉淀，在最高濃度的PEG6000下非晶形形成。表25.<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>樣品GTChSA:標(biāo)記7F-5AC用0.1MK-Na-磷酸鹽pH4.8-8.2緩沖的25%PEG6000和10-30%2-丙醇排A:25%PEG6000和10%2-丙醇，緩沖劑pH4.8、5.3、6.2、7,0、7.4和8.2排B:25%PEG6000和15%2-丙醇，緩沖劑pH4.8、5.3、6.2、7.0、7,4和8.2排C:25%PEG6000和20%2-丙醇，緩沖劑pH4.8、5.3、6.2、7.0、7.4和8.2排D:25%PEG6000和30%2-丙醇，緩沖劑pH4.8、5.3、6.2、7.0、7.4和8.2結(jié)果在所有樣品中的強(qiáng)液相分離，在30%2-丙醇中的凝膠相。重組生產(chǎn)越來越多的重組蛋白質(zhì)正被開發(fā)用于治療和診斷應(yīng)用。然而，使用常規(guī)方法，這些蛋白質(zhì)的許多可能難以以功能形式和/或以所需要的量生產(chǎn)或生產(chǎn)費用昂貴。常規(guī)方法涉及將負(fù)責(zé)特定蛋白質(zhì)產(chǎn)生的基因插入宿主細(xì)胞例如細(xì)菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞，例如，COS或CHO細(xì)胞中，然后使細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長。然后培養(yǎng)的細(xì)胞合成所需要的蛋白質(zhì)。傳統(tǒng)的細(xì)菌或酵母系統(tǒng)不能產(chǎn)生呈功能形式的許多復(fù)合體蛋白質(zhì)。盡管哺乳動物細(xì)胞可以產(chǎn)生復(fù)合體蛋白質(zhì)，但他們一般難以生長和生長費用昂貴，并且通常只產(chǎn)生mg/L量的蛋白質(zhì)。另外，非分泌的蛋白質(zhì)相對地難以從原核細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞中純化，因為它們不4皮分泌到培養(yǎng)基中。一般地，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的特征在于，制造和分泌正常情況下不被分泌的蛋白質(zhì)(非分泌的蛋白質(zhì))的方法。該方法包括從核酸構(gòu)建體中表達(dá)蛋白質(zhì)，所述核酸構(gòu)建體包括(a)啟動子，例如，乳上皮特異性啟動子，例如，乳汁蛋白啟動子；(b)能指引蛋白質(zhì)分泌的信號序列，例如，來自乳汁特異性蛋白質(zhì)的信號序列；(c)可選擇地，編碼分泌的蛋白質(zhì)的氨基末端編碼區(qū)的足夠部分的46序列，例如，被分泌到乳中的蛋白質(zhì)，以允許，例如，在轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳汁中，非分泌的蛋白質(zhì)的分泌；以及(d)編碼非分泌的蛋白質(zhì)的序列，其中元件(a)、(b)，可選擇地(c),以及(d)優(yōu)選以所述次序可操作地連接。在優(yōu)選的實施方案中元件a、b、c(如果存在)，以及d來自相同的基因；元件a、b、c(如果存在)，以及d來自兩種或更多種基因。在優(yōu)選的實施方案中，所述分泌是至轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳汁中。在優(yōu)選的實施方案中所述信號序列是P-酪蛋白信號序列；所述啟動子是P-酪蛋白啟動子序列。在優(yōu)選的實施方案中，非分泌的蛋白質(zhì)編碼序列是人來源的；編碼截短的核或胞質(zhì)多肽；編碼人血清白蛋白或其它期望的目的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實施將使用，除非另有說明，常規(guī)的細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的技術(shù)，這些技術(shù)在本領(lǐng)域的技術(shù)人員技能之內(nèi)。在文獻(xiàn)中描述了這樣的技術(shù)。參見,例如，#o/ecw/a_rC/on//7g"<26or"c>/"7#a/7ya/，2ndEd.，由Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis編(ColdSpringHarborLaboratoryPress:1989);細(xì)67,'/^，巻I和II(D.N.Glover編，1985);胎》謹(jǐn)c/eo〃Ve加/力e57s(M，J.Gait編，1984);Mullis等，美國專禾'〗No:4，683，195;腸/e/c爿"V外6"/za〃w2(B.D.Hames&S.J.Higgins編，1984);TranscriptionAndTranslation(B.D.Hames&S.J.Higgins編，1984);Cw"wreO尸J/2/鵬/6W7s(R.LFreshney，AlanR.Liss，Inc.,1987);/鵬06/"zed6W/"/7"/，es(IRLPress,1986);B.Perbal，爿化油Toyl/b/ecy/arC/o/7//7g(1984);論文,vl/ef力0^y//7A/7zjB7o/o^7，(AcademicPress,Inc.,N.Y.);teze7ya/zs/"er尸or47#a^z^//a/Ce/Ay(J.H.Miller和M.P.Calos編，1987,ColdSpringHarborLaboratory);//75/7z/邁0/0^7，Vols.154和155(Wu等人編)，/鵬w/70c力e/z7/ca/Ce/yj/7t/yf/o/ecwia/"(Mayer和Walker編，AcademicPress,London,1987);^2/^/600iO尸~er/iZ7e/^a//咖"/7o7og7，巻I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell編，1986);7^a/7//7f//sf//7gf力eyJ/ozAsef/z/6r/o，(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y-，1986)。乳汁特異性啟動子在實施本發(fā)明中有活的那些啟動子，包括控制編碼乳汁蛋白例如酪蛋白、P乳球蛋白(Clark等，(1989))》/0/rec力/20/0^r工487-492)、乳清酸蛋白(Gorton等(1987)"/o/rec力/o/o^F1:1183—1187)、以及乳清蛋白(Soulier等，(1992)/^^^1^1:的基因的啟動子。酪蛋白啟動子可來源于任何哺乳動物物的a、P、y或k酪蛋白基因；優(yōu)選的啟動子來源于山羊P酪蛋白基因(DiTullio，(1992)"/o/Tec力/7c77m/1^:74-77)。在乳房組織中^皮特異性激活的乳汁特異性蛋白質(zhì)啟動子可來源于cDNA或基因組序列。優(yōu)選地，它們是來源基因組。關(guān)于在至少一個，通常是多個生物中的上面列出的所有乳腺特異性基因的DNA序列信息是可獲得的。參見，例如，Richards等，/.脅7.C力e瓜256，526-532(1981)(a-乳清蛋白大鼠)；Campbell等，腸/e/cJc油M.12，8685-8697(1984)(大鼠WAP);Jones等，/.^/o厶C力e瓜260，7042-7050(1985)(大鼠P—酪蛋白)；Yu-Lee&Rosen，/"/oAC力e瓜258，10794—10804(1983)(大鼠y—酪蛋白)；Hall，/242，735-742(1987)(oc-乳清蛋白人);Stewart,12，389(1984)(牛otsl和k酪蛋白cDNAs);Gorodetsky等，Ce/7e66，87—96(1988)(牛P酪蛋白)；Alexander等，^""r./."/oc力e瓜178，395-401(1988)(牛k酪蛋白)；Brignon等，Z^^yZe〃.188，48-55(1977)(牛as2酪蛋白)；Jamieson等，Ce/e61,85-90(1987)，Ivanov等，萬/o入C力e邊，^o/^e-^e/Yer369，425-429(1988)，Alexander等，細(xì)7e/cJc油她17，6739(1989)(牛P乳球蛋白)；Vilotte等，Biochimie69，609-620(1987)(牛a一乳清蛋白)。Mercier&Vilotte，J.DairySci.76，3079-3098(1993)綜述了不同乳蛋白基因的結(jié)構(gòu)和功能(為所有目全部并入以供參考)。達(dá)到可能需要另外的序列的程度，使用現(xiàn)有的序列作為探針，可輕易地克隆已經(jīng)獲得的序列側(cè)翼區(qū)。使用已知的相關(guān)核苷酸序列，或相關(guān)蛋白質(zhì)的抗體作為探針，通過篩選來自這類生物的庫，同樣獲得來自不同生物的乳腺特異性調(diào)節(jié)序列。信號序列在信號序列中，適用于本發(fā)明的是乳汁特異性信號序列或?qū)е抡婧嘶蛟说鞍踪|(zhì)分泌的其它信號序列。優(yōu)選地，所述信號序列選自乳汁特異性信號序列，即，它來自編碼被分泌入乳汁中的產(chǎn)品的基因。最優(yōu)選地，所述乳汁特異性信號序列與在本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)中使用的乳汁特異性啟動子有關(guān)。對本發(fā)明來說，信號序列的大小并不關(guān)鍵。全部所需要的是，所述序列具有足夠的大小以實現(xiàn)例如，乳房組織中所期望的重組蛋白質(zhì)的分泌。例如，來自編碼酪蛋白，例如，oc、P、Y或k酪蛋白、P乳球蛋白、乳清酸蛋白和乳清蛋白的基因的信號序列適用于本發(fā)明。優(yōu)選的信號序列是山羊P-酪蛋白信號序列。也可以使用來自其它分泌的蛋白質(zhì)，例如，由肝細(xì)胞、腎細(xì)胞或胰細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)的信號序列。轉(zhuǎn)基因哺乳動物在本發(fā)明人血清白蛋白的情況下，將目的蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入哺乳動物的生殖系。例如，通過標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可將所述構(gòu)建體的一個或多個拷貝摻入哺乳動物胚胎的基因組中。在本發(fā)明中可以有用地使用非人類哺乳動物。本申請將哺乳動物定義為不包括人的具有乳腺并產(chǎn)生乳汁的所有動物。優(yōu)選地，優(yōu)選產(chǎn)生大量的乳汁并具有長泌乳期的哺乳動物。優(yōu)選的哺乳動物是奶牛、綿羊、山羊、小鼠、牛、駱駝和豬。當(dāng)然，關(guān)于本發(fā)明的任何給定的表達(dá)序列，這些哺乳動物中的每一個可能與其它的不一樣有效。例如，特定的乳汁特異性啟動子或信號序列可能在一種哺乳動物中比在其它的哺乳動物中更有效。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過本發(fā)明的教導(dǎo)可容易地作出這樣的選擇。雖然為理解的目的用舉例說明和實例在一些細(xì)節(jié)中描述了前述發(fā)明，但對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可以實施某些變化和修飾將是顯而易見的。因此，所述描述和實例不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍，該范圍由所附的權(quán)利要求限定。還應(yīng)注意的是，盡管白蛋白是用不同的化合物、乙醇和包括磷酸鹽的無機(jī)鹽進(jìn)行結(jié)晶的，但在文獻(xiàn)中沒有發(fā)現(xiàn)用磷酸鹽結(jié)晶的產(chǎn)業(yè)方法。通過本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)通過最大程度地利用本發(fā)明的發(fā)明關(guān)鍵方法參數(shù)和/或條件，用磷酸鹽可有利地結(jié)晶人白蛋白。上面列舉和描述了發(fā)明的參數(shù)及其一些變異。因此，還要理解，此處提供結(jié)晶的和純化的人白蛋白的本發(fā)明的實施方案僅僅是舉例說明本發(fā)明原理的應(yīng)用。從前面的描述中明顯的是，不脫離本發(fā)明的精神，或所附權(quán)利要求的范圍，可以采用在形式、使用方法和所公開的元件的應(yīng)用中的變化。50通過參考并入的現(xiàn)有技術(shù)引文1.Andersson,1966,，'77ze^We7'ogewe/(yC)/5oW"e5fen/m爿/Zw"n力，"BIOCHIM.Biophys.Acta.117:115-133.2.CarterDC，etal.，C73Ay^3/sQ/^*Sferw"z乂/Z)w〃"'"尸wf7seG^zeric五7zg7'"ee'z'〃g^("t/淑/o朋/Z)，i^勿z，USPatent#5，585，466.3，CarterDC，etal.,//wma/ziS^7'w"z」/Zw"""Oys^z/sa72d^A^fe,Aorf<尸廠epa/'a,Zo",EuropeanPatentApplication#0357S57Al.4.CarterDC,etal.，Pre/z'/m'wwjO^^/^Z/ograj^/^ciSVw^'es0/Fow廠CV3Cafo尸o/7"s。/6fen/"z爿/Zw""",EurJBiOCHEM(1994);226:1049-1052.5.CarterDC，etal.，T7『ee-Z)/"ze肌'o/za/iSV/加加'e。//^w歸ziSfe/'畫^4/^"""〃，Science(1989)244:1195-1198.6.Cochraneetal.,爿/Zw7"/wJ^^M/M^/ra/Zc"Cn.//c^z//yi7/尸arie/znj^ys^e附artciev/e、vq/1i"7(io肌z'zedCo7";-o//gd7h'"/s.BrMedJ.(1998);317:235-240.7.CohnEJ3etal"/Vepa廠ario/z〃nrf尸7'oper^&sSe7一wmanrfJ7os7zaP廠c^ezw.chem.Soc.(1947)69:1753-1761.8.CohnEJ，etal"1946，"尸r^7wa/z》"y4"diVc^e廠々'^y5erww/Voyw"68:459-'475.9.CopelinC.etal.,尸廠flc"ca/Poz力x57%et/seQf/f/6ww""_For^^ovo/e附/a.JPeranesthNurs.(1998)13:118-120.10.DaleLB，etal"G^ro/e/w-Ccw//e<f及e^p/o/'^A7/z^zy^MW她JZ)eye/m'/^2々》"CHEM(2000);275:38213-38220.11.EmersonTE,t/m'gweFea似resc/^4/6wwn'7z.'」丑7'/e/iev/ew，CritCareMed.(1989)17:690-693.12.GoldwaserP，etal.，i4咖cfa"'c^<&rww爿"di械J.CLINEpidemiol.(1997)50:693-703.13.GoreDC,etal.，T/y^s7'o;wG7omerw/a7'丑ef7zgy/feredih及eyw化ftato/5w/7zJ.Trauma.(1996)3:356-360.14.HauptHandICHeide3q/*/Jwmawj/6wwu'CZs7'7zgikft72e7'fl/iS"a/&,KlinWOCHENSCHR(1967);45:726-729.15.HughesandDintzis，1964，"C7y加版a"0"merawdz膨rs0//zw附aw朋dW/"e,，牆廳'","J.BlOL.Chem.239:845-849.16.HughesWL,爿"X/6,z."尸ra幼.o"Zyo/。W尸/'cw//w/"朋尸/as,<zyaC,:ysmffi,ieMercwricJ.Am.chem.Soc.(1947);69:1836-1837.17.KleinGL,etal.,益"m."w"7G7"e/"q/"Pa7柳fera/5b/""o'wCi"re".rNUTO.REV.(1991)49:74-79.18.KovalikSG,etal.,77wQW。c^fec/<^47te/'ecQz/由w//"e爪asto/j蕩麵'"ie馬cz.她oh,J.Trauma.(1981)21:275-279.19.LedgerwoodAM,etal.,戶as^-i&swscz-torio72//;vj!erte7wz'o",五ho/o幻'，Mo7'&d"乂j;zd7)'ea加e"iT.ARCH.surg.(1974);10S:531-53S.20.LewinJ,尸/'e/A7加'o"。'zJ尸廠o/ert/ayy&廠《'"尸/w2aiV她/肌/VoteZ/zs,J.Am.Chem.Soc(1951);73:3906-3911.21.LowBW，/Vep"7'W。"尸'邵eWas^/"iS^7'w"za7zdJ"to,/Vote/zw.CHEM.Soc.(1^52);74:4830-4834.22.LowBWandEJWeiche,/Ve/w加》/7朋d/Vo/7erZ/&yq/"/S"e7'z"7z"7zc尸/a汐歸尸roto'肌爿"Qo"'ca/朋cMo/y/zo/ogz'ca/&"辦So/weC7y加〃/oe//w"za"iSe,whyi仿w7"/77iVe/a廠fl&o7Wand<^/"J7zez)'De77'v。Z/v&,J.am.Chem.SOC.(1951);73:3911-3916.23.PetersT.&聰廟畫力，Adv.ProteinChem37:161-245.(1985),24.RaineyTG,etal.,PharmacologyOfColloidsAndCrystalloids.T7!eJVw則co/og7.cy^woacAto〃zeCW&'ca//_yi7/尸aft.e"^(ChernowB.ed);(WilliamsandWilkins,BaltimoreMD.Publ.)(1994)pages272-290.25.RaoSN,etal.,/Ve"77zz、a7y^A^iizvayrigadoMyC>rtAor/z.07M6/cC'ysto/o/hww"h/VflwwaZ/6wm力，JBlOLC朋m(1976)251:3191-3193.26.RobertsJS，etal.,Cb//ozVfF"0/w77wExjw打cfe7'5v/Vo&Ze7w,■P/^/fe,A7'zrfPoMz:&'/z'rias.DRUGS.1998;55:621-630.27.Sollenneetal.,"Z)z'w一z.owCy"7^er'y/^op/mH<Sz'teJ7ze//臓"hSen/"zy4/6w打z力D/"zeV'Arch.Biochem.Biophys.207:264-269(1981)..28.SugioS,etal.,Crysto/>SVn/"M7'e0/iSferwm^Z6mwzz力■_2.5乂iaso/w&'oj7.proteinEng(1999)12:439-446.29.TullisJL,etal.,爿/6w/m.7z.'5acAgrotmda，WJAMA.(1977)237:355-360.30.VermeulenLCetal.，GWie/z'M.esW!eCZye<^4/6柳"!，iVb打w。ze/'zCb〃oz血<37wfC'7加"0zV/1Sb/z"/0'w,ArchInternMed.(1995)155:373-379.本發(fā)明還包括以下內(nèi)容項1.一種晶體人白蛋白產(chǎn)品，該產(chǎn)品包含至少一部份由如下方法得到的物質(zhì)a)濃縮含白蛋白的流體，直到所述流體具有每升溶液至少15克白蛋白；b)向所述含白蛋白的流體中添加第一磷酸鹽混合物，直到所述磷酸鹽混合物的濃度在2.4-2.6摩爾的范圍內(nèi)；c)提供所述含白蛋白的溶液的第一次過濾以致形成所得的結(jié)晶批料溶液以去除雜質(zhì)；d)冷卻所述結(jié)晶批料溶液的濾液至至多15'C的溫度；e)讓所述結(jié)晶批料溶液中的人白蛋白結(jié)晶；f)向所述結(jié)晶批料溶液中添加更多的所述第一磷酸鹽混合物，足以達(dá)到至多3.O摩爾的濃度；g)從任何剩下流體中進(jìn)行白蛋白晶體的第一次分離；h)將來自所述第一次白蛋白晶體分離的白蛋白晶體懸浮在第二磷酸鹽混合物中，其中所述第二磷酸鹽混合物具有2.7-3.OM的濃度；i)加熱來自所述第一次白蛋白晶體分離的晶體懸浮液達(dá)到溫度在40-50。C的范圍內(nèi)以溶解晶體；j)對來自所述白蛋白晶體的第一次分離的溶解的晶體懸浮液提供第二次過濾；k)冷卻來自所述白蛋白晶體的第一次分離的所得到的溶解的晶體懸浮液至至多15。C的溫度；和1)讓白蛋白晶體從所得到的冷卻的晶體懸浮液中形成；其中這些特定步驟的應(yīng)用允許人白蛋白從給定的含有人白蛋白的原料流中純化和結(jié)晶。項2.項1的方法，其中所述第一磷酸鹽混合物由磷酸鈉鹽組成。項3.項1的方法，其中所述第一磷酸鹽混合物是磷酸鉀鹽。項4.項1的方法，其中所述第一磷酸鹽混合物由鈉鹽和鉀鹽組成。項5.項1的方法，其中所述含白蛋白的流體具有在一升溶液中15-50克范圍內(nèi)白蛋白的濃度。項6.項1的方法，其中在添加時所述第一磷酸鹽混合物的溫度在20-30X:的范圍內(nèi)。項7.項1的方法，其中在添加時所述第一磷酸鹽混合物具有6.0-6.7范圍內(nèi)的pH。項8.項1的方法，其中將過濾所述結(jié)晶批料后收集的所述濾液的溫度冷卻至至多io'c。項9.項1的方法，其中使所述結(jié)晶批料溶液結(jié)晶至多12小時。項1的方法，其中使所述結(jié)晶批料溶液結(jié)晶至多24小時。項1的方法，其中使所述結(jié)晶批料溶液結(jié)晶至少24小時。項1的方法，其中通過過濾完成所述白蛋白晶體的第一次項1的方法，其中通過離心完成所述白蛋白晶體的第一次項l的方法，其中通過重力完成所述白蛋白晶體的第一次項1的方法，其中通過干燥完成所述白蛋白晶體的第一次項1的方法，其中所述第二磷酸鹽混合物由磷酸鈉鹽組成。項1的方法，其中所述第二磷酸鹽混合物是磷酸鉀鹽。項1的方法，其中所述第二磷酸鹽混合物由鈉鹽和鉀鹽組項1的方法，其中將來自白蛋白晶體的第一次分離的所述溶解的晶體懸浮液冷卻至至多IO'C的溫度。項21.項20的方法，其中將從所述溶解的晶體懸浮液中沉淀出來的白蛋白晶體再溶解成溶液并且重結(jié)晶至少一次。項22.項1的方法，其中預(yù)先將所述含白蛋白的流體澄清以去除54項10.項11.項12.分離。項13.分離。項14.分離。項15.分離。項17.項18.項19.成。項20.雜質(zhì)不在溶液中。項23.項1的方法，其中所述原料流是來自轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳汁或其它體液。項24.項23的方法，其中將來自轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳汁澄清以去除雜質(zhì)和一些乳汁蛋白質(zhì)。項25.項23的方法，其中在給定原料流中純度的水平是至少10%，也就是，其中人白蛋白構(gòu)成給定溶液總蛋白質(zhì)的至少10%。項26.項1的方法，其中所述得到的結(jié)晶批料溶液的pH是5.6-7.8。項27.項1的方法，其中所述得到的結(jié)晶批料溶液的pH是6.0-6.5。項28.項1的方法，其中所述得到的結(jié)晶批料溶液的pH是7.0-7.8。項29項1的方法，其中所述第一磷酸鹽混合物的濃度具有2.2-3.0M范圍內(nèi)的濃度。項30.項1的方法，其中所述含白蛋白的流體具有每升溶液2-400克范圍內(nèi)的白蛋白濃度。項31.項l的方法，其中所述含白蛋白的流體具有每升溶液3-300克范圍內(nèi)的白蛋白濃度。項32.項l的方法，其中所述含白蛋白的流體具有每升溶液3-100克范圍內(nèi)的白蛋白濃度。項33.項1的方法，其中所述含白蛋白的流體具有每升溶液3-40克范圍內(nèi)的白蛋白濃度。項34.項1的方法，其中所述含白蛋白的流體具有每升溶液2-10克范圍內(nèi)的白蛋白濃度。項35.項1的方法，其中將所述結(jié)晶人白蛋白產(chǎn)品用作藥物制劑中的賦形劑。項36.項1的方法，其中將所述結(jié)晶人白蛋白產(chǎn)品用作藥物組合物中的治療劑。項37.項1的方法，其中所述原料流是來源自表達(dá)重組人白蛋白的宿主的培養(yǎng)上清液或體液。項38.項37的方法，其中所述宿主是哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物。項39.項37的方法，其中所述宿主是酵母細(xì)胞培養(yǎng)物。項40.項37的方法，其中所述宿主是昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物。項41.項37的方法，其中所述宿主是原核細(xì)胞培養(yǎng)物。項42.項1的方法，其中將所述結(jié)晶人白蛋白產(chǎn)品用于治療醫(yī)'疾病。項43.項42的方法，其中所述醫(yī)學(xué)疾病選自a)水腫；b)低血容量癥；c)血清蛋白減少；d)成人呼吸窘迫綜合征(ARDS);e)腎變病；f)新生兒溶血性疾病(HDN);g)嚴(yán)重?zé)齻籬)低蛋白血癥；和i)急性胰腺炎。項44.項1的方法，其中在心肺分流外科手術(shù)期間使用所述結(jié)人白蛋白產(chǎn)品。項45.—種生產(chǎn)結(jié)晶人白蛋白的方法，該方法包括a)濃縮含白蛋白的流體，直到所述流體具有每升溶液至少15克白蛋白；b)向所述含白蛋白的流體中添加第一磷酸鹽混合物，直到所述磷酸鹽混合物的濃度在2.4-2.6摩爾的范圍內(nèi)；c)提供所述含白蛋白的溶液的第一次過濾以致形成所得的結(jié)晶批料溶液以去除雜質(zhì)；d)冷卻所述結(jié)晶批料溶液的濾液至至多15X:的溫度；e)使所述結(jié)晶批料溶液中的人白蛋白結(jié)晶；f)向所述結(jié)晶批料溶液中添加更多的所述第一磷酸鹽混合物，足以達(dá)到至多3.0摩爾的濃度；g)從任何剩下流體中進(jìn)行白蛋白晶體的第一次分離；h)將來自所述第一次白蛋白晶體分離的白蛋白晶體懸浮在第二磷酸鹽混合物中，其中所述第二磷酸鹽混合物具有2.7-3.0M的濃度；i)加熱來自第一次白蛋白晶體分離的晶體懸浮液直到溫度在40-50。C的范圍內(nèi)以溶解晶體；j)對來自所述白蛋白晶體的第一次分離的溶解的晶體懸浮液提供第二次過濾；k)冷卻來自所述白蛋白晶體的第一次分離的所得到的溶解的晶體懸浮液；和1)使白蛋白晶體從所得到的冷卻的晶體懸浮液中形成；其中這些特定步驟的應(yīng)用允許人白蛋白從給定的含有人白蛋白的原料流中純化和結(jié)晶。項46.項45的方法，其中所述第一磷酸鹽混合物由磷酸鈉鹽組成。項47.項45的方法，其中所述第一磷酸鹽混合物是磷酸鉀鹽。項48.項45的方法，其中所述第一磷酸鹽混合物由鈉鹽和鉀鹽組成。項49.項45的方法，其中所述含白蛋白的流體具有在一升溶液中15-50克范圍內(nèi)白蛋白的濃度。項50.項45的方法，其中在添加時所述第一磷酸鹽混合物的溫度在20-30。C的范圍內(nèi)。項51.項45的方法，其中在添加時所述第一磷酸鹽混合物具有6.0-6.7范圍內(nèi)的pH。項52.項45的方法，其中將過濾所述結(jié)晶批料后收集的所述濾液的溫度冷卻至至多l(xiāng)(TC。項53.項45的方法，其中允許所述結(jié)晶批料溶液結(jié)晶至多12小時。項45的方法，項45的方法，項45的方法項45的方法項45的方法項45的方法:項45的方法:項45的方法，項45的方法:項45的方法:其中允許所述結(jié)晶批料溶液結(jié)晶至多24小其中允許所述結(jié)晶批料溶液結(jié)晶至少24小其中通過過濾完成所述白蛋白晶體的第一其中通過離心完成所述白蛋白晶體的第一其中通過重力完成所述白蛋白晶體的第一其中通過干燥完成所述白蛋白晶體的第一其中所述第二磷酸鹽混合物由磷酸鈉鹽組其中所述第二磷酸鹽混合物是磷酸鉀鹽。其中所述第二磷酸鹽混合物由鈉鹽和鉀鹽項54.時。項55.時。項56.次分離。項57.次分離。項58.次分離。項59.次分離。項60.成。項61.項62.組成。項63.項45的方法，其中將來自白蛋白晶體的所述第一次分離的所述溶解的晶體懸浮液冷卻至至多l(xiāng)(TC的溫度。項64.項63的方法，其中將從所述溶解的晶體懸浮液中沉淀出來的白蛋白晶體再溶解成溶液并且重結(jié)晶至少一次。項65.項45的方法，其中預(yù)先將所述含白蛋白的流體澄清以去除雜質(zhì)不在溶液中。項66.項45的方法，其中所述原料流是來自轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳汁或其它體液。項67.項66的方法，其中將來自轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳汁澄清以去除雜質(zhì)和一些乳汁蛋白質(zhì)。項68.項66的方法，其中在給定原料流中純度的水平是至少10%，也就是，其中人白蛋白構(gòu)成給定溶液總蛋白質(zhì)的至少10%。58項45的方法，其中所述得到的結(jié)晶批料溶液的PH是項45的方法，其中所述得到的結(jié)晶批料溶液的pH是項45的方法，其中所述得到的結(jié)晶批料溶液的PH是項45的方法，其中所述第一磷酸鹽混合物的濃度具有2.2-3.0M范圍內(nèi)的濃度。項73.項45的方法，其中所述含白蛋白的流體具有每升溶液2-400克范圍內(nèi)的白蛋白濃度。項74.項45的方法，其中所述含白蛋白的流體具有每升溶液3-300克范圍內(nèi)的白蛋白濃度。項75.項45的方法，其中所述含白蛋白的流體具有每升溶液3-100克范圍內(nèi)的白蛋白濃度。項76.項45的方法，其中所述含白蛋白的流體具有每升溶液3-40克范圍內(nèi)的白蛋白濃度。項77.項45的方法，其中所述含白蛋白的流體具有每升溶液2-10克范圍內(nèi)的白蛋白濃度。項78.項45的方法，其中將所述結(jié)晶人白蛋白產(chǎn)品用作藥物制劑中的賦形劑。項79.項45的方法，其中將所述結(jié)晶人白蛋白產(chǎn)品用作藥物組合物中的治療劑。項80.項45的方法，其中所述原料流是來源自表達(dá)重組人白蛋白的宿主的培養(yǎng)上清液或體液。項81.項80的方法，其中所述宿主是哺乳動物細(xì)胞。項82.項80的方法，其中所述宿主是酵母細(xì)胞。項83.項80的方法，其中所述宿主是昆蟲細(xì)胞。項84.項80的方法，其中所述宿主是原核細(xì)胞。項85.項45的方法，其中將所述結(jié)晶人白蛋白產(chǎn)品用于治療醫(yī)項69.5.6-7.8。項70.6.0-6.5。項71.7.0-7.8。項72.學(xué)疾病。項86.項85的方法，其中所述醫(yī)學(xué)疾病選自a)水腫；b)低血容量癥；c)血清蛋白減少；d)成人呼吸窘迫綜合征(ARDS);e)腎變??；f)新生兒溶血性疾病(HDN);g)嚴(yán)重?zé)齻?；h)^f氐蛋白血癥；和i)急性胰腺炎。項87.項85的方法，其中在心肺分流外科手術(shù)期間使用所述結(jié)晶人白蛋白產(chǎn)品。項88.—種人白蛋白產(chǎn)品，該產(chǎn)品包含至少一部份由如下方法形成的物質(zhì)a)濃縮含白蛋白的流體，直到所述流體具有每升溶液至少15克白蛋白；b)向所述含白蛋白的流體中添加第一磷酸鹽混合物，直到所述磷酸鹽混合物的濃度在2.6-3.0摩爾的范圍內(nèi)并且pH在6.1-6.3的范圍內(nèi)；c)冷卻所述結(jié)晶批料溶液的所得濾液至至多15'C的溫度；d)使所述結(jié)晶批料溶液中的人白蛋白結(jié)晶；和e)從任何剩下的流體中分離白蛋白晶體；其中這些特定步驟的應(yīng)用允許人白蛋白從給定的含有人白蛋白的原料流中純化和結(jié)晶。項89.項88的方法，其中所述第一磷酸鹽混合物由磷酸鈉鹽組成。項90.項88的方法，其中所述第一磷酸鹽混合物是磷酸鉀鹽。項91.項88的方法，其中所述第一磷酸鹽混合物由鈉鹽和鉀鹽組成。項92.項88的方法，其中所述含白蛋白的流體具有在一升溶液中15-50克范圍內(nèi)白蛋白的濃度。項93.項88的方法，其中在添加時所述第一磷酸鹽混合物的溫度在20-30X:的范圍內(nèi)。項94.項88的方法，時。項95.項88的方法，時。項96.項88的方法，時。項97.項88的方法次分離。項98.項88的方法次分離。項99.項88的方法次分離。項100.項88的方法次分離。項101.項88的方法，其中將從所述溶解的晶體懸浮液中沉淀出來的白蛋白晶體再溶解成溶液并且重結(jié)晶至少一次。項102.項88的方法，其中預(yù)先將來自所述原料流的所述含人白蛋白的流體澄清以去除雜質(zhì)不在溶液中。項103.項88的方法，其中所述原料流是來自轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳汁或其它體液。項104.項103的方法，其中將來自轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳汁澄清以去除雜質(zhì)和一些乳汁蛋白質(zhì)。項105.項103的方法，其中在給定原料流中純度的水平是至少10%，也就是，其中人白蛋白構(gòu)成給定溶液總蛋白質(zhì)的至少10%。其中允許所述結(jié)晶批料溶液結(jié)晶至多12小其中允許所述結(jié)晶批料溶液結(jié)晶至多24小其中允許所述結(jié)晶批料溶液結(jié)晶至少24小其中通過過濾完成所述白蛋白晶體的第一其中通過離心完成所述白蛋白晶體的第一其中通過重力完成所述白蛋白晶體的第一其中通過干燥完成所述白蛋白晶體的第一項106.項88的方法，其中所述含白蛋白的流體具有每升溶液2-400克范圍內(nèi)的白蛋白濃度。項107.項88的方法，其中所述含白蛋白的流體具有每升溶液3-300克范圍內(nèi)的白蛋白濃度。項108.項88的方法，其中所述含白蛋白的流體具有每升溶液3-100克范圍內(nèi)的白蛋白濃度。項109.項88的方法，其中所述含白蛋白的流體具有每升溶液3-40克范圍內(nèi)的白蛋白濃度。項110.項88的方法，其中所述含白蛋白的流體具有每升溶液2-10克范圍內(nèi)的白蛋白濃度。項111.項88的方法，其中將所述結(jié)晶人白蛋白產(chǎn)品用作藥物制劑中的賦形劑。項112.項88的方法，其中將所述結(jié)晶人白蛋白產(chǎn)品用作藥物組合物中的治療劑。項113.項88的方法，其中所述原料流是來源于表達(dá)重組人白蛋白的宿主的培養(yǎng)上清液或體液。項114.項113的方法，其中所述宿主是哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物。項115.項113的方法，其中所述宿主是轉(zhuǎn)基因哺乳動物。項116.項113的方法，其中所述宿主是轉(zhuǎn)基因烏。項117.項113的方法，其中所述宿主是轉(zhuǎn)基因植物。項118.項113的方法，其中所述宿主是酵母細(xì)胞培養(yǎng)物。項119.項113的方法，其中所述宿主是昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物。項120.項113的方法，其中所述宿主是原核細(xì)胞培養(yǎng)物。項121.項88的方法，其中將所述結(jié)晶人白蛋白產(chǎn)品用于治療醫(yī)學(xué)疾病。項122.項121的方法，其中所述醫(yī)學(xué)疾病選自a)水腫；b)低血容量；c)血清蛋白減少；d)成人呼吸窘迫綜合征(ARDS);e)腎變病；f)新生兒溶血性疾病(HDN);g)嚴(yán)重?zé)齻?；h)低蛋白血癥；和i)急性胰腺炎。項123.項88的方法，其中在心肺分流外科手術(shù)期間使用所述結(jié)晶人白蛋白產(chǎn)品o項124.項88的方法，其中通過一個或多個重結(jié)晶步驟進(jìn)一步純化所述白蛋白晶體，所述步驟包括a)將來自第一次白蛋白晶體分離的白蛋白晶體懸浮在第二磷酸鹽混合物中，其中所述第二磷酸鹽混合物具有2.7-3.0M的濃度并且6.1-6.3范圍內(nèi)的pH;b)加熱來自第一次白蛋白晶體分離的晶體懸浮液直到溫度在40-50。C的范圍內(nèi)以溶解晶體；c)對來自所述白蛋白晶體的第一次分離的溶解的晶體懸浮液提供第二次過濾；d)冷卻來自所述白蛋白晶體的第一次分離的所得到的溶解的晶體懸浮液至至多15。C的溫度；e)讓白蛋白晶體從所得到的冷卻的晶體懸浮液中形成；和f)從任何剩下流體中分離白蛋白晶體；其中這些特定步驟的應(yīng)用允許人白蛋白從給定的原料流中純化和結(jié)晶。項125.項124的方法，其中所述第二磷酸鹽混合物由磷酸鈉鹽組成。項126.項124的方法，其中所述第二磷酸鹽混合物是磷酸鉀鹽。項127.項124的方法，其中所述第二磷酸鹽混合物由鈉鹽和鉀鹽組成。項128.—種人白蛋白產(chǎn)品，該產(chǎn)品包含至少一部份由如下方法得到的物質(zhì)a)濃縮含白蛋白的流體，直到所述流體具有每升溶液至少15克白蛋白；b)向所述含白蛋白的流體中添加第一磷酸鹽混合物，直到所述磷酸鹽混合物的濃度為至多2.6摩爾并且pH在6.1-6.3的范圍內(nèi)；c)提供所述含白蛋白的溶液的第一次過濾以致形成所得的結(jié)晶批料溶液以去除雜質(zhì)；d)冷卻所述結(jié)晶批料溶液的所得濾液至至多15。C的溫度；e)向所述結(jié)晶批料溶液中添加更多的所述第一磷酸鹽混合物，足以達(dá)到至多3.0摩爾的濃度；f)讓所述結(jié)晶批料溶液中的人白蛋白結(jié)晶；和g)從任何剩下流體分離白蛋白晶體；其中這些特定步驟的應(yīng)用允許人白蛋白從給定的原料流中純化和結(jié)晶。項129.項128的方法，其中所述第一磷酸鹽混合物由磷酸鈉鹽組成。項130.項128的方法，其中所述第一磷酸鹽混合物是磷酸鉀鹽。項131.項128的方法，其中所述第一磷酸鹽混合物由鈉鹽和鉀鹽組成。項132.項128的方法，其中所述含白蛋白的流體具有在一升溶液中15-50克范圍內(nèi)白蛋白的濃度。項133.項128的方法，其中在添加時所述第一磷酸鹽混合物的溫度在20-30。C的范圍內(nèi)。項134.項128的方法，其中允許所述結(jié)晶批料溶液結(jié)晶至多12小時。項135.項128的方法，其中允許所述結(jié)晶批料溶液結(jié)晶至多24小時。項136.項128的方法，其中允許所述結(jié)晶批料溶液結(jié)晶至少24小時。64項137.項128的方法，其中通過過濾完成所述白蛋白晶體的第一次分離。項138.項128的方法，其中通過離心完成所述白蛋白晶體的第一次分離。項139.項128的方法，其中通過重力完成所述白蛋白晶體的第一次分離。項140.項128的方法，其中通過干燥完成所述白蛋白晶體的第一次分離。項141.項128的方法，其中將從所述溶解的晶體懸浮液中沉淀出來的白蛋白晶體再溶解成溶液并且重結(jié)晶至少一次。項142，項128的方法，其中預(yù)先將來自所述原料流中的所述含人白蛋白的流體澄清以去除雜質(zhì)不在溶液中。項143.項128的方法，其中所述原料流是來自轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳汁或其它體液。項144.項103的方法，其中將來自轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳汁澄清以去除雜質(zhì)和一些乳汁蛋白質(zhì)。項145.項103的方法，其中在給定原料流中純度的水平是至少10%，也就是，其中人白蛋白構(gòu)成給定溶液總蛋白質(zhì)的至少10%。項146.項128的方法，其中所述含白蛋白的流體具有每升溶液2-400克范圍內(nèi)的白蛋白濃度。項147.項128的方法，其中所述含白蛋白的流體具有每升溶液3-300克范圍內(nèi)的白蛋白濃度。項148.項128的方法，其中所述含白蛋白的流體具有每升溶液3-100克范圍內(nèi)的白蛋白濃度。項149.項128的方法，其中所述含白蛋白的流體具有每升溶液3-40克范圍內(nèi)的白蛋白濃度。項150.項128的方法，其中所述含白蛋白的流體具有每升溶液2-10克范圍內(nèi)的白蛋白濃度。項151.項128的方法，其中將所述結(jié)晶人白蛋白產(chǎn)品用作藥物制劑中的賦形劑。項152.項128的方法，其中將所述結(jié)晶人白蛋白產(chǎn)品用作藥物組合物中的治療劑。項153.項128的方法，其中所述原料流是來源自表達(dá)重組人白蛋白的宿主的培養(yǎng)上清液或體液。項154.項153的方法，其中所述宿主是哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物。項155.項153的方法，其中所述宿主是轉(zhuǎn)基因哺乳動物。項156.項153的方法，其中所述宿主是轉(zhuǎn)基因烏。項157.項153的方法，其中所述宿主是轉(zhuǎn)基因植物。項158.項153的方法，其中所述宿主是酵母細(xì)胞培養(yǎng)物。項159.項153的方法，其中所述宿主是昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物。項160.項153的方法，其中所述宿主是原核細(xì)胞培養(yǎng)物。項161.項128的方法，其中將所述結(jié)晶人白蛋白產(chǎn)品用于治療醫(yī)學(xué)疾病。項162.項161的方法，其中所述醫(yī)學(xué)疾病選自a)水腫；b)低血容量癥；c)血清蛋白減少；d)成人呼吸窘迫綜合征(ARDS);e)腎變??；f)新生兒溶血性疾病(HDN);g)嚴(yán)重?zé)齻?；h)j氐蛋白血癥；和i)急性胰腺炎。項163.項128的方法，其中在心肺分流外科手術(shù)期間使用所述結(jié)晶人白蛋白產(chǎn)品0項164.項128的方法，其中通過一個或多個重結(jié)晶步驟進(jìn)一步純化所述白蛋白晶體，所述步驟包括g)將來自第一次白蛋白晶體分離的白蛋白晶體懸浮在第二磷酸鹽混合物中，其中所述第二磷酸鹽混合物具有2.7-3.0M的濃度并且6.1-6.3范圍內(nèi)的pH;h)加熱來自第一次白蛋白晶體分離的晶體懸浮液直到溫度在40-50。C的范圍內(nèi)以溶解晶體；i)對來自所述白蛋白晶體的第一次分離的溶解的晶體懸浮液提供第二次過濾；j)冷卻來自所述白蛋白晶體的第一次分離的所得到的溶解的晶體懸浮液至至多15'C的溫度；k)讓白蛋白晶體從所得到的冷卻的晶體懸浮液中形成；和1)從任何剩下流體中分離白蛋白晶體；其中這些特定步驟的應(yīng)用允許人白蛋白從給定的原料流中純化和結(jié)晶。項165.項164的方法，其中所述第二磷酸鹽混合物由磷酸鈉鹽組成。項166.項164的方法，其中所述第二磷酸鹽混合物是磷酸鉀鹽。項167.項164的方法，其中所述第二磷酸鹽混合物由鈉鹽和鉀鹽組成。項168.項1的方法，其中所述含白蛋白的原料流含有與溶解的人血清白蛋白產(chǎn)品結(jié)合的化合物，所述化合物選自a)辛酸鹽；b)脂肪酸；和c)長鏈醇。項169.項1的方法，其中將所述人白蛋白產(chǎn)品純化至濃縮物，所述濃縮物為各種狀態(tài)中的一種，所述條件為選自a)結(jié)晶；b)凝膠；c)沉淀j和。d)小滴。項170.項88的方法，其中所述含人白蛋白的原料流含有與溶解的人血清白蛋白產(chǎn)品結(jié)合的化合物，所述化合物選自a)辛酸鹽；b)脂肪酸；和c)長鏈醇。項171.項88的方法，其中將所述人白蛋白產(chǎn)品純化至濃縮物，所述濃縮物為各種狀態(tài)中的一種，所述條件為選自和a)結(jié)曰-曰b)凝膠；c)沉淀d)小滴。項172.項128的方法，其中所述含人白蛋白的原料流含有與溶解的人血清白蛋白產(chǎn)品結(jié)合的化合物，所述化合物選自a)辛酸鹽；b)脂肪酸；和c)長鏈醇。項173.項128的方法，其中將所述人白蛋白產(chǎn)品純化至濃縮物，所述濃縮物為各種狀態(tài)中的一種，所述條件為選自a)結(jié)晶b)凝膠；c)沉淀)和。d)小滴。項174.—種生產(chǎn)結(jié)晶人白蛋白的方法，該方法包括a)濃縮含白蛋白流體，直到所述流體具有每升溶液至少15克白蛋白；b)向所述含白蛋白的流體中添加足夠量的第一化學(xué)修飾劑；c)提供所述含白蛋白的溶液的第一次過濾以致形成所得的結(jié)晶批料溶液以去除雜質(zhì)；d)冷卻所述結(jié)晶批料溶液的所得濾液至至多20'C的溫度；e)讓所述結(jié)晶批料溶液中的人白蛋白結(jié)晶；f)向所述結(jié)晶批料溶液中添加更多的所述第一化學(xué)修飾劑，足以達(dá)到至多3.0摩爾的濃度；g)從任何剩下流體中進(jìn)行白蛋白晶體的第一次分離；h)將來自第一次白蛋白晶體分離的白蛋白晶體懸浮在第二化學(xué)修飾劑中；i)加熱來自第一次白蛋白晶體分離的晶體懸浮液直到溫度在40-50。C的范圍內(nèi)以溶解晶體；j)對來自所述白蛋白晶體的第一次分離的溶解的晶體懸浮液提供第二次過濾；k)冷卻來自所述白蛋白晶體的第一次分離的所得到的溶解的晶體懸浮液至至多15'C的溫度；和1)讓白蛋白晶體從所得到的冷卻的晶體懸浮液中形成；原料流中純化和結(jié)晶。項175.項174的方法，其中所述第一化學(xué)修飾劑是聚乙二醇并且所述第二化學(xué)修飾劑是癸醇。項176.項174的方法，其中所述第一化學(xué)修飾劑是(NH4)2S04并且所述第二化學(xué)修飾劑是癸醇。項177.項174的方法，其中所述第一化學(xué)修飾劑是聚乙二醇并且所述第二化學(xué)修飾劑是辛酸。項178.項174的方法，其中所述第一化學(xué)修飾劑是(NH4)2S04并且所述第二化學(xué)修飾劑是辛酸。項179.項174的方法，其中所述第一化學(xué)修飾劑是2-丙醇并且所述第二化學(xué)修飾劑是MgCh。項180.項174的方法，其中所述第一化學(xué)修飾劑是節(jié)醇并且所述第二化學(xué)修飾劑是MgCl2。項181.項174的方法，其中所述第一化學(xué)修飾劑是氯化鉀并且所述第二化學(xué)修飾劑是氯化鉀。項182.項174的方法，其中所述第一化學(xué)修飾劑是聚乙二醇并且所述第二化學(xué)修飾劑是乙酸銨。項183.項174的方法，其中所述第一化學(xué)修飾劑是聚乙二醇并且所述第二化學(xué)修飾劑是聚乙二醇。項184.項174的方法，其中所述第一化學(xué)修飾劑是聚乙二醇并且所述第二化學(xué)修飾劑是2-丙醇。權(quán)利要求1.使人白蛋白結(jié)晶的方法，包括a)向含白蛋白的液體中加入用磷酸鹽緩沖的硫酸銨；b)過濾該含白蛋白的液體；c)冷卻所得到的濾液；d)使該人白蛋白結(jié)晶；和e)將白蛋白晶體與任何剩余的液體分離。2.權(quán)利要求1的方法，其中還向所述含白蛋白的液體中加入長鏈醇。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中加入所述硫酸銨到其濃度為1.5M為止。4.權(quán)利要求1或2的方法，其中加入所述硫酸銨到其濃度為2M為止。5.權(quán)利要求1或2的方法，其中加入所述用磷酸鹽緩沖的硫酸銨到其濃度為2M并且pH為5.9為止。6.權(quán)利要求1或2的方法，其中加入所述用磷酸鹽緩沖的硫酸銨到其濃度為2M并且pH為6.2為止。7.權(quán)利要求1或2的方法，其中加入所述硫酸銨到其濃度為2.4M為止。8.權(quán)利要求1或2的方法，其中加入所述硫酸銨到其濃度為2.7M為止。9.權(quán)利要求l-8任一項的方法，其中磷酸鹽緩沖液包含鈉和鉀鹽。10.權(quán)利要求9的方法，其中磷酸鹽緩沖液是0.5MK-Na-磷酸鹽，pH7.4。11.權(quán)利要求l-10任一項的方法，其中白蛋白晶體的所述第一次分離通過過濾來分離。12，權(quán)利要求l-10任一項的方法，其中該方法還包括向人白蛋白中加入更多用磷酸鹽緩沖的硫酸銨。13.權(quán)利要求l-10任一項的方法，其中將人白蛋白晶體再溶解成溶液并重結(jié)晶至少一次。14.權(quán)利要求1-IO任一項的方法，其中含人白蛋白的液體先前被澄清以除去不溶解的雜質(zhì)。15.權(quán)利要求1或14的方法，其中含人白蛋白的液體是來自轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳汁或其他體液。16.權(quán)利要求1-IO任一項的方法，其中含人白蛋白的液體具有的白蛋白濃度范圍為2—400、3—300、3-100、3—40、2—10或15-50克每升溶液。17.組合物，其包含通過權(quán)利要求1-16任一項的方法產(chǎn)生的人白蛋白。18.權(quán)利要求17的組合物在制備用于治療對象的藥物中的用途。19.權(quán)利要求18的用途，其中所述對象患有水腫、低血容量癥、血清蛋白減少、成人呼吸窘迫綜合征、腎變病、新生兒溶血性疾病、嚴(yán)重?zé)齻⒌偷鞍籽Y、或急性胰腺炎。20.權(quán)利要求18的用途，其中所述組合物在心肺分流外科手術(shù)期間施用給所述對象。全文摘要本發(fā)明涉及通過結(jié)晶和重復(fù)的結(jié)晶從各種來源純化和生產(chǎn)人白蛋白。本發(fā)明方法的基本特征包括提供特定的反應(yīng)條件和沉淀試劑以使白蛋白結(jié)晶最大化。利用溶解度圖作為本發(fā)明方法的過程控制的基礎(chǔ)。本發(fā)明特別地控制磷酸鹽濃度、pH和溫度以精確指導(dǎo)結(jié)晶動力學(xué)和晶體產(chǎn)率。文檔編號C07K14/765GK101560253SQ20091000462公開日2009年10月21日申請日期2003年10月28日優(yōu)先權(quán)日2002年11月19日發(fā)明者D·E·考托,K·維蘇里,S·P·弗爾頓,S·尤奧迪拉申請人:陶洛斯Hsa有限責(zé)任公司