專利名稱：鏈親和素/白細胞介素15融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，特別是涉及兩種利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的鏈親和素-白細胞介15雙功能融合蛋白。背景知識
白細胞介素-15 (Interleukin-15, IL-15)是一種T細胞生長因子和信號調(diào)節(jié)分子，與IL-2
有許多相似的生物學活性。它通過誘導淋巴細胞的增值、分化和發(fā)育，誘導自然殺傷細胞和淋巴因子激活殺傷細胞的細胞活性,誘導細胞毒性T淋巴細胞活性,而體現(xiàn)抗腫瘤效應。IL-15
基因常用來修飾腫瘤細胞，制備腫瘤細胞疫苗，以增強腫瘤抗原的免疫原性。
鏈親和素(SA)是由親和素鏈霉菌產(chǎn)生的非糖基化同源四聚體蛋白，故一個鏈親和素蛋白可結(jié)合四個生物素。它能與生物素緊密非共價結(jié)合(Kd-10"5M),其結(jié)合力是抗原一抗體間作用力的一千至一百萬倍。由于鏈親和素可與生物素快速且?guī)缀醪豢赡娴膹娏Y(jié)合，以及生物素較容易參入各種生物分子(如蛋白質(zhì)，核酸和脂多糖)中，即生物素化，故鏈親和素一生物素間的強力作用早已用于生物醫(yī)學的許多領(lǐng)域(Sano,T. and Cantor，C.R. Streptavidin-containingchimeric proteins: 4esign — production. Methods Enzymol.2000; 326: 305-311.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可以對腫瘤細胞進行快速表面修飾并能夠永久地錨定在腫瘤細胞表面的新型白細胞介素-15。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是
一種融合蛋白，該蛋白由接頭肽連接一鏈親和素和一白細胞介素-15構(gòu)成，其中所述的接
頭肽的氨基酸序列為Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。
本發(fā)明融合蛋白中的鏈親和素位于接頭肽的N端或C端；其中鏈親和素位于接頭肽的C
端的融合蛋白(如SEQN0.1)的活性比鏈親和素位于接頭肽的N端的融合蛋白(如SEQN0.2)高10倍以上。
本發(fā)明融合蛋白可通過將鏈親和素基因、白細胞介素-15基因以及連接所述的鏈親和素和白細胞介素-15的接頭多核苷酸通過基因重組、轉(zhuǎn)化構(gòu)建工程菌表達獲得，其中基因重組和轉(zhuǎn)化的方法均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟識的技術(shù)。
為了便于融合蛋白的分離純化，本發(fā)明所述的融合蛋白的鏈親和素部分的末端還可以連接有純化標簽，本發(fā)明融合蛋白SEQ N0.2的鏈親和素的N端連有組氨酸標簽，本發(fā)明融合蛋白SEQN0.4的鏈親和素的N端連有組氨酸標簽。本發(fā)明還提供一種編碼本發(fā)明融合蛋白的多核苷酸，該多核苷酸由成熟鏈親和素cDNA、成熟白細胞介素-15 cDNA通過TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGCGGG GGC GGATCC連接而成;該多核苷酸中成熟鏈親和素cDNA的末端還可以連接有CATCAT CAC CAT CAC CAT。
將所述的編碼本發(fā)明融合蛋白的多核苷酸通過基因重組插入到原核表達載體中，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌可獲得高效表達本發(fā)明融合蛋白的工程菌；所述的原核表達載體可以是pET24a或pET24d，大腸桿菌為DH5a 。
本發(fā)明融合蛋白在上述工程菌中主要以包涵體的形式存在，從包涵體中分離純化蛋白并復性處理后，即可獲得本發(fā)明融合蛋白。
本發(fā)明融合蛋白采用富含甘氨酸和絲氨酸的鏈接肽連接白細胞介素-15和鏈親和素，此15肽非常靈活，有助于融合蛋白中各單元蛋白質(zhì)分子的獨立折疊，從而保存各自的生物活性，使融合蛋白具有鏈親和素和白細胞介素-15的雙重活性，可通過鏈親和素與生物素的強力結(jié)合將白細胞介素-15錨定在生物素化的腫瘤細胞表面，且能在Y射線滅活腫瘤細胞表面穩(wěn)定存在，并仍保持白細胞介素-15的活性。
經(jīng)本發(fā)明融合蛋白表面修飾的腫瘤疫苗具有預防和治療腫癯的作用，可用于制備預防性和治療性腫瘤的疫苗。本發(fā)明所述的腫瘤疫苗是將本發(fā)明融合蛋白錨定在生物素化的腫癯細胞表面獲得的。
本發(fā)明所述的腫癯疫苗的制備充分利用了蛋白質(zhì)的氨基(即-NH2)易生物素化以及生物素與鏈親和素高效而強有力幾乎不可逆的結(jié)合這兩個特性，先用生物素化試劑將生物素化學交聯(lián)到欲修飾的腫瘤細胞表面，然后本發(fā)明融合蛋白借助鏈親和素與生物素的特異結(jié)合將白細胞介素-15迅速永久地錨定在腫瘤細胞表面，從而使白細胞介素-15在局部達到持續(xù)有效的治療濃度；再者，由于一個鏈親和素蛋白可結(jié)合四個生物素，因此本發(fā)明融合蛋白錨定到腫瘤細胞的量是可以精確控制的。


圖1是IL15 -L-SA-6His-pET24重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖。圖2是6His-SA-L-IL15-pET24重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖。
圖3是融合蛋白IL2-L-SA-6His的SDS-PAGE電泳圖，其中1是分子量標準，2是工程菌誘導前，3是工程菌誘導后；4是包涵體，5是Ni-NTA柱層析后；6是復性后還原；7是復性后非還原。
圖4是用抗IL-15單克隆抗體及熒光標記的二抗經(jīng)流式細胞儀對錨定在生物素化的816.F10表面上本發(fā)明融合蛋白進行檢測的結(jié)果，左峰為未修飾,胞(陰性對照)，而右峰為本發(fā)明融合蛋白錨定修飾的細胞。
圖5是用PHA刺激人外周血淋巴細胞MTT法對錨定在生物素化的B16.F10表面上本發(fā)明融合蛋白的IL-15進行生物活性測定的結(jié)果，以錨定在生物素化的B16.F10表面上
GFP-L-SA為陰性對照；其中，表示本發(fā)明融合蛋白，+表示融合蛋白GFP-L-SA。
圖6是接種本發(fā)明腫瘤疫苗后的預防腫瘤小鼠模型的腫瘤生長情況曲線圖，以GFP-L-SA修飾的B6.F10腫瘤細胞疫苗為實驗對照，其中實線表示本發(fā)明融合蛋白組，虛線表示GFP-L-SA對照組。
圖7是接種本發(fā)明腫瘤疫苗后的預防腫瘤小鼠模型的小鼠存活情況曲線圖，以GFP-L-SA修飾的B6.F10腫瘤細胞疫苗為實驗對照，其中實線表示本發(fā)明融合蛋白組，虛線表示GFP-L-SA對照組。
圖8是接種本發(fā)明腫瘤疫苗后的治療腫瘤小鼠模型的小鼠存活情況曲線圖，以GFP-L-SA修飾的B6.F10腫瘤細胞疫苗為實驗對照，其中實線表示本發(fā)明融合蛋白組，虛線表示GFP-L-SA對照組。
下面將通過實施例進一步說明本發(fā)明以及本發(fā)明具有的技術(shù)效果。
具體實施例方式
下述實施例和實驗所用的材料及設(shè)備如下
細胞株、菌株與質(zhì)粒B16.F10 (鼠黑色素瘤細胞株)；菌株5^pto/^ce《ovW附'!'(親和素鏈霉菌，ATCC), DH5a和Rosetta;原核表達質(zhì)粒pET24a (Kanaf ， Novagen)。
主要生化試劑及材料DNeasy組織試劑盒和質(zhì)粒DNA的制備試劑盒(Qiagen)，寡核苷酸的合成(Sigma)， Trizol, Superscript H逆轉(zhuǎn)錄酶，Platinum戶々DNA聚合酶和T4 DNA連接酶(Invitrogen); IL-15標準品(R & D Systems),瓊脂糖和SDS-PAGE (Biorad); 2-Iminobiotin(Sigma)和Ni-NTA (Qiagen)填料；Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce)和抗IL-15單克隆抗體(BD Biosciences Pharmingen)。
DNA片段的連接、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選，限制性內(nèi)切酶分析，SDS-聚丙烯酰胺凝膠點泳等常規(guī)方法均參照文獻(Sambrook J， et al. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York, 2nd edition, 1989)或廠家提供的產(chǎn)品說明書；DNA序列分析在大連寶生物工程公司的DNA測序服務(wù)中心完成。
例1融合蛋白IL15 -L-SA-6His的制備
1、用DNeasy組織試劑盒從親和素鏈霉菌抽提出細菌的基因組DNA，然后用其作為模板,通過Platinum;^cDNA聚合酶進行PCR制備成熟鏈親和素cDNA 。
弓I物5 ，GGAATTCTCAAGCGGGGGCAGCGGGGGCGGAGGCAGCGGCGGGGGCG
GATCCGCCGACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCC3， (78nt)和
5'GTGGTGCTCGAGCTGCTGAACGGCGTCGAGCGGGTTGCC 3， (39nt)。
反應條件變性94'C, 2min，循環(huán)(94'C, 15s—60。C， 15s—68'C， 30s) 25輪，最后
68。C， 5min。
2、 用Trizol抽提起PHA-活化的外周血淋巴細胞的總RNA,并以其作為模板，進行 RT-PCR制備成熟IL-15 cDNA。
弓|物5，-CGGGATCCATGAACTGGGTGAATGTAATAAG-3， ( 31nt ) 和 5，-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3， (19nt)。
反應條件變性94。C， 2min,循環(huán)(94", 20s—55°C， 30s—68'C, 60s) 30輪，最后 68。C， 5min。
3、 構(gòu)建IL15 -L-SA-6His-pET24重組質(zhì)粒
制備的IL-15 cDNA (不含終止碼，兩端分別含BamHI和EcoRI限制性內(nèi)切酶位點)和 SA cDNA (不含終止碼，兩端分別含EcoRI和Xhol限制性內(nèi)切酶位點)，將上述IL-15和SA 基因片段克隆于pET-24d載體中，獲得IL15-L-SA-6His-pET24重組表達質(zhì)粒(結(jié)構(gòu)圖如圖1 所示)。其中L為富含甘氨酸、絲氨酸的連接肽(15肽)。重組表達質(zhì)粒經(jīng)DNA序列分析鑒定， 驗證其正確無誤。
4、 構(gòu)建IL15 -L-SA-6His-pET24/Rosetta工程菌
IL15 -L-SA-6His-pET24重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后Rosetta感受態(tài)細胞后，用含卡那霉素的LB 平皿篩選。挑取轉(zhuǎn)化平皿上的單菌落接種于加有卡那霉素(2(Vg/ml)的LB培養(yǎng)基中。經(jīng)37 'C搖床培養(yǎng)擴增至吸光度A600為0. 4 0. 5時，加入終濃度為0. lmmol/L的IPTG， 37'C誘導 表達4h，離心(8000gX 10min)收獲菌體，將細胞破碎后用12%的SDS-PAGE檢測分析融合蛋白 的表達情況。
5、 融合蛋白IL15 -L-SA-6His-pET24的表達
融合蛋白IL15丄-8八-6^3卞￡丁24在菌體中主要以包涵體的形式存在，其表達量達20
30%。
6、 從包涵體中獲得融合蛋白IL15 -L-SA-6His
a.制備包涵體5克菌體懸于100ml lxPBS中，冰浴中超聲(電流270mA), 30秒X10 次(每次間隔30秒);接著于4'C離心10分鐘(8000g)，將沉淀懸浮于100ml lxPBS (內(nèi)含4mol/L 尿素，0.5%Triton X-100, 20mmol/L EDTA)中進行漂洗，隨后離心(l加0gX10分鐘)收集沉淀；漂洗兩次后，溶于50mmol/L磷酸鈉緩沖液，8mol/L尿素(pH8.0)中，15000gX15分鐘， 取上清液。
b. Ni-NTA柱層析將步驟a得到的上清液上樣于Ni-NTA柱(2.6X5cm),用平衡液 (50mmol/L磷酸鈉緩沖液，8mol/L尿氣0.5mmol/LNaCl， pH8.0)進行沖洗至樣品A2抑恢復至 基線；然后用洗脫液(50mmol/L磷酸鈉緩沖液，8mol/L尿氣0.5mmol/LNaCl ，pH8.0,其中咪 唑分別為30mmol/L， 50mmol/L, 100mmol/L, 200mmol/L)進行洗脫，洗脫液經(jīng)SDS-PAGE鑒 定，收集融合蛋白質(zhì)峰(融合蛋白6His-SA-L-IL15的分子量為30KD)。
c. 透析復性將Ni-NTA柱層析純化獲得的6His-SA-L-IL15融合蛋白調(diào)至OD28(^0.2, 在大于20倍體積的透析液(50mmol/L磷酸鈉緩沖液，4.0mol/L尿素，0.2mmol/LNaCl， 5%甘 油，pH8.0)中4'C透析食性8小時；然后在50mmol/L磷酸鈉緩沖液，2.0mol/L尿素，2.5°/。甘油， pH8.0)中4'C透析復性8小時；再在5Ommol/L磷酸鈉緩沖液，l.OmoiyL尿素，1.25%甘油，pH8.0) 中4'C透析復性8小時；最后在50mmol/L磷酸鈉緩沖液中繼續(xù)透析8小時；離心除去不溶物， 收集上清。將收集的融合蛋白質(zhì)液調(diào)至pH8.0,并過濾除菌分裝，儲存于-20'C。
所得融合蛋白IL15 -L-SA-6His用SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如圖3所示。 7、利用PHA刺激人外周血淋巴細胞對IL-15的活性進行測定，測得的IL-15活性為 lxl06U/mg。
例2 6His-SA-L-IL15融合蛋白的制備
1、 制備成熟鏈親和素cDNA:方法與例1同。
弓I物 5 '^GGAATTCC ATATGCATCATCACCATCACC ATGAGGCCGGCATCACCGGCACCT GG-3，(55nt)和5'-GGAATTCGGCGGATCCGCCCCC GCCGCTGCCTCCGCCCCCGCTGCCCCC GCTCGTCTGCTGAACGGCGTCGAGCGGGTTGCC-3' (82nt)。
2、 制備成熟ML-15cDNA:方法與例1同。
引物5,-CGGGATCCATGAACTGGGTGAATGTAATAAG-3，和5，-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3，。 3 、構(gòu)建6His-SA-L-IL 15-pET24重組質(zhì)粒
制備的SAcDNA (不含終止碼，兩端分別含Xbal和BamHI限制性內(nèi)切酶位點)和IL-15 cDNA (不含終止碼，兩端分別含BamHI和EcoRI限制性內(nèi)切酶位點)，將上述SA基因片段 和IL-15克隆于pET-24d載體中，獲得6His-SA-L-IL15-pET24重組表達質(zhì)粒(結(jié)構(gòu)圖如圖2 所示)。其中L為富含甘氨酸、絲氨酸的連接肽(15肽)。重組表達質(zhì)粒經(jīng)DNA序列分析鑒定， 驗證其正確無誤。
4、 構(gòu)建6His-SA-L-IL15-pET24/Rosetta工程菌方法與例1同。
5、 融合蛋白6His-SA-L-IL15的表達融合蛋白6His-SA-L-IL15在菌體中主要以包涵體的形式存在，6His-SA-L-IL15融合蛋白 的分子量為30KD,其表達量達20 30%。
6、 從包涵體中獲得融合蛋白6His-SA-L-IL15:方法與例1同。
7、 利用PHA刺激人外周血淋巴細胞對IL-15的活性進行測定，測得的IL-15活性為 lxl07U/mg，是IL15 -L-SA-6His融合蛋白相應比活的10倍。
例3 IL15-L-SA-6His或6His-SA-L-IL15融合蛋白修飾的腫瘤疫苗的制備 將107個B16.F10細胞懸浮在lml 1 XPBS中，加入0.5mg SulfoNHS-LC-Biotin并混勻 后，室溫下作用30分鐘；用1XPBS洗滌細胞3次后，每106個B16.F10細胞加入200ng 6His-SA-L-IL15融合蛋白，冰上作用30分鐘；1 XPBS洗滌細胞1次后，然后用y射線滅活 (20000rad)即可。
例4本發(fā)明融合蛋白對腫瘤細胞的修飾效果及其穩(wěn)定性檢測
用抗IL-15單克隆抗體及熒光標記的二抗經(jīng)流式細胞儀對錨定在生物素化的B16.F10表 面上的IL15-L-SA-6His或6His-SA-L-IL15融合蛋白進行檢測，結(jié)果見圖3，幾乎100%的腫 瘤細胞被修飾，且腫瘤細胞表面有大量的IL-15。對錨定在腫瘤細胞表面的IL15-L-SA-6His 融合蛋白的穩(wěn)定性經(jīng)流式細胞儀進行分析表明，在一周內(nèi)這些鋪定的融合蛋白在細胞表面的 數(shù)量無顯著下降。
例5對錨定在生物素化的B16.F10表面上的本發(fā)明融合蛋白進行IL-15生物活性的測定 首先將表面已錨定了 IL15-L-SA-6His或6His-SA-L-IL15融合蛋白的106個B16.F10經(jīng)超 聲破碎，離心收集其不溶的膜性成分；然后將其懸浮于100nl完全培養(yǎng)基中，用PHA刺激人 外周血淋巴細胞MTT法對其中的IL-15進行生物活性測定，結(jié)果如圖5所示，活化的淋巴細 胞的生長增殖依賴于已錨定修飾細胞的不溶膜性成分的劑量，表明IL15-L-SA-6His或 6His-SA-L-IL15融合蛋白錨定在細胞表面后仍然能保持IL-15的生物活性。 例6本發(fā)明融合蛋白修飾的B6.F10腫瘤細胞疫苗預防腫瘤的效果
(1) 材料
本發(fā)明腫瘤疫苗制備方法見實施例2; GFP-L-SA-6His (即綠色熒光蛋白和鏈親和素的 融合蛋白)修飾的、y射線滅活(20000rad)的B6.F10腫瘤細胞作為實驗的陰性對照。
(2) 方法
分別將106個GFP-L-SA-6His修飾的、y射線滅活(20000rad)的B6.F10腫癯細胞以及 本發(fā)明腫瘤疫苗接種于C57BL/6小鼠左肋腹部的皮內(nèi)，14天后加強一次；7天后，將105未 經(jīng)任何處理的B6.F10腫瘤細胞接種于小鼠右肋腹部的皮下，然后觀^腫瘤的生長情況和小鼠 在40天內(nèi)的成活情況(3)結(jié)果
有20%的免疫小鼠獲得100%的保護(即無腫瘤生長)，陰性對照組全部有腫癯生長(圖 6)。同時，本發(fā)明腫瘤疫苗的預防接種組的生存數(shù)及生存期顯著高于GFP修飾的陰性對照組 (圖7)。
例7本發(fā)明融合蛋白修飾的B6.F10腫瘤細胞疫苗治療腫瘤的效果。
(1) 材料見實施例6。
(2) 方法
將105個未經(jīng)任何處理的86. 10腫瘤細胞接種于小鼠右肋腹部的皮下;4， 11和18天后， 分別將106 GFP-L-SA-6His或IL15-SA-6His修飾的、y射線滅活(20000rad)的B6.F10腫瘤 細胞接種于C57BL/6小鼠左肋腹部的皮內(nèi)，然后觀察腫瘤的生長情況和小鼠在40天內(nèi)的成 活情況。
(3) 結(jié)果
如圖8所示,本發(fā)明腫瘤疫苗治療組的生存數(shù)及生存期顯著高于GFP修飾的附性對照組。SEQUENCE LISTING
<110>溫州醫(yī)學院
<120〉鏈親和素/白細胞介素15融合蛋白
<160〉 4
<170> Patent In version 3.3
<210> 1
<211> 289
<212〉 PRT
<213> 人工序列
<220>
〈221〉 CHAIN
<222〉 (1)..(115) <223>人成熟IL-15
<220>
<221〉 DOMAIN
<222> (116)..(130)
<223>甘氛酸和絲氨酸的鏈接肽(L),此15肽非常靈活，有助于融合蛋白中各單元 蛋白質(zhì)分子的獨立折疊，從而保存各自的生物活性，最終提高融合蛋白的雙
重活性o
<220〉
<221> CHAIN
<222〉 (131)..(289)
<223>鏈霉菌成熟的全長鏈親和素(SA)
<400> 1
Met Asn Trp Val Asn Val lie Ser Asp Leu Lys Lys lie Glu Asp Leu
15 10 15
lie Gin Ser Met His He Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
20 25 30
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu 35 40 45Gin Val He Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser He His Asp Thr Val
50 55 60
Glu Asn Leu lie lie Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn 65 70 75 80
85 90 95
He Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe Val His He Val Gin Met Phe He
100 105 110
Asn Thr Ser Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gin Val Ser Ala Ala
130 135 140
Glu Ala Gly He Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gin Leu Gly Ser Thr Phe
145 150 155
He Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser 160 165 170 175
Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp
180 185 190
Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val
195 200 205
Ala T卬Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser
210 215 220
Gly Gin Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg lie Asn Thr Gin Trp Leu
225 230 235
Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val 240 245 250 255
260 265 270
Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val 275 280 285
Gin Gin
<210> 2
<211> 277
<212> PRT <213〉人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)"(147)
<223〉鏈親和素；與成熟的全長相比，在N-端缺失了 13個貧基酸。并且第 133位的絲氨酸突變?yōu)榘腚装彼?lt;220>
<221> DOMAIN
<222> (148)..(162)
<223>連接肽，并且其3'端含有BamHI和EcoRI的酶切位點。
<220>
<221〉 CHAIN
<222> (163)..(277) <223>人成熟IL15
<400> 2
Met Glu Ala Gly He Thr Gly Thr T卬Tyr Asn Gin Leu Gly Ser Thr 15 10 15
Phe He Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu 20 25 30
35 40 45
Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr
50 55 60
Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80
Ser Gly Gin Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg He Asn Thr Gin Trp
85 90 95
Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu
100 105 110
Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Cys He
115 120 125
Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala
130 135 140
Val Gin Gin Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160
Gly Ser Met Asn Trp Val Asn Val He Ser Asp Leu Lys Lys He Glu
165 170 175
Asp Leu lie Gin Ser Met His lie Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser
180 185 190
Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
195 200 205
Glu Leu Gin lie Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser lie His Asp
210 215 220
Thr Val Glu Asn Leu lie lie Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn 225 230 235 240
Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu
245 250 255
Lys Asn He Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe Val His He Val Gin Met 260 265 270Phe lie Asn Thr Ser 275
<210〉 3
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221〉 CHAIN
<222> (1)..(115)
<223>人成熟IL-15的cDNA
<220〉
<221> DOMAIN 〈222〉 (116)..(130)
<223〉富含甘氨酸和絲氨酸的鏈接肽(L),此15肽非常靈活，有助于融合蛋白中各 單元蛋白質(zhì)分子的獨立折疊，從而保存各自的生物活性，最終提高融合蛋白 的雙重活性。
<220>
<221> CHAIN
<222> (131)..(289)
<223〉鏈霉菌成熟的全長鏈親和素。
<220>
<221> PEPT腿
<222> (290)..(297) <223>組氨酸標簽
<400> 3
Met Asn Trp Val Asn Val lie Ser Asp Leu Lys Lys lie Glu Asp Leu 15 10 15
lie Gin Ser Met His lie Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
20 25 30
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
35 40 45
Gin Val He Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser He His Asp Thr Val
50 55 60
Glu Asn Leu lie He Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn 65 70 75 80
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
85 90 95
He Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe Val His He Vai Gin Met Phe He
100 105 110
Asn Thr Ser Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly115 120 125
Gly Ser Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gin Val Ser Ala Ala
130 135 140
Glu Ala Gly He Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gin Leu Gly Ser Thr Phe
145 150 155
He Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser 160 165 170 175
Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp
180 185 190
Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val
195 200 205
Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser
210 215 220
Gly Gin Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg He Asn Thr Gin Trp Leu
225 230 235
Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val 240 245 250 255
Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Cys He Asp 260 265 270
275 280 Gin Gin Leu Glu His His His His His His 290 295
285
<210> 4
<211〉 283
<212> PRT <213>人工序列
<220〉
<221> PEPTIDE
<222> (2)..(7) <223>組氨酸標簽
<220〉
<221> CHAIN
<222〉 (8)..(153)
<223>鏈親和素；與成熟的全長相比，在N-端缺失了 13個氨基酸。并且第 133位的絲氨酸突變?yōu)榘腚追账?br> <220〉
<221> DOMAIN
<222> (154)..(168)<223>連接肽，并且其3'端含有BamHI和EcoRI的酶切位點。 <220>
〈221> CHAIN
<222> (169)..(283) <223>人成熟IL15
<400> 4
Met His His His His His His Glu Ala Gly He Thr Gly Thr Trp Tyr
15 10 15
Asn Gin Leu Gly Ser Thr Phe He Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala
20 25 30
Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr 35 40 45
50 55 60
Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala 65 70 75 80
His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gin Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala
85 90 95
Arg He Asn Thr Gin Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn 100' 105 110
115 120 125
Pro Ser Ala Ala Cys lie Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn
130 135 140
Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gin Gin Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Asn Trp Val Asn Val lie Ser
165 170 175
Asp Leu Lys Lys lie Glu Asp Leu lie Gin Ser Met His lie Asp Ala
180 185 190
Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala
195 200 205
Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gin Val He Ser Leu Glu Ser Gly
210 215 220
Asp Ala Ser lie His Asp Thr Val Glu Asn Leu He He Leu Ala Asn 225 230 235 240
Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu
245 250 255
Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn He Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe
260 265 270
Val His He Val Gin Met Phe He Asn Thr Ser 275 280
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，該蛋白由接頭肽連接一鏈親和素和一白細胞介素-15構(gòu)成，其中所述的接頭肽的氨基酸序列為Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種融合蛋白，其特征在于所述的鏈親和素位于接頭肽的N端。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ.N0 2。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種融合蛋白，其特征在于所述的鏈親和素位于接頭肽的C端。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的的鏈親和素部分的末端連接有純化 標簽。
6. —種基因，該基因編碼權(quán)利要求l、 2、 3或4融合蛋白。
7. —種表達載體，該表達載體含有權(quán)利要求5所述的基因。
8. —種工程菌，該工程菌轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求6所述的表達載體。
9. 權(quán)利要求l、 2、 3或4所述的融合蛋白在制備腫瘤疫苗中的應用。
10. —種腫瘤疫苗，該腫瘤疫苗是將權(quán)利要求1、 2、 3或4所述的融合蛋白錨定到經(jīng)過生物 素化的腫瘤細胞的表面獲得的。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種融合蛋白，該蛋白由接頭肽連接一鏈親和素和一白細胞介素-15構(gòu)成，其中所述的接頭肽的氨基酸序列為Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly GlyGly Ser。本發(fā)明融合蛋白同時具有鏈親和素和白細胞介素-15的雙重活性，可通過鏈親和素與生物素的強力結(jié)合將白細胞介素-15錨定在生物素化的腫瘤細胞表面，且能在γ-射線滅活腫瘤細胞表面穩(wěn)定存在，并仍保持白細胞介素-15的活性。因此，這些鏈親和素/白細胞介素15融合蛋白可用于已生物素化的腫瘤細胞、腫瘤組織的修飾以增強其免疫原性并調(diào)節(jié)機體的免疫反應，從而預防和治療腫瘤。
文檔編號C07K19/00GK101492508SQ200910004309
公開日2009年7月29日 申請日期2009年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月24日
發(fā)明者琳 張, 胡志明, 華 蘇, 高基民 申請人:溫州醫(yī)學院