專(zhuān)利名稱(chēng)：用于改進(jìn)植物的水分利用效率、肥料利用效率、生物/非生物脅迫耐受性、產(chǎn)量和生物量的 ...的制作方法
用于改進(jìn)植物的水分利用效率、肥料利用效率、生物/非生 物脅迫耐受性、產(chǎn)量和生物量的分離多肽、多核苷酸發(fā)明領(lǐng)域與背景在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及新的水通道蛋白多核苷酸和多肽，更準(zhǔn) 確但并非唯一地講是涉及使用所述多核苷酸和多肽提高植物的非生物脅迫耐受性、水分利 用效率(WUE)、肥料利用效率(FUE)、生物量、生長(zhǎng)勢(shì)和/或產(chǎn)量的方法。非生物脅迫條件例如鹽分、干旱、洪澇、亞適溫和有毒化學(xué)污染，給農(nóng)業(yè)植物造成 極大損失。大多數(shù)植物進(jìn)化出保護(hù)自身免受這些條件侵害的策略。然而，如果脅迫條件的嚴(yán) 重性太大，持續(xù)時(shí)間太久，則對(duì)大多數(shù)農(nóng)作物的植物發(fā)育、生長(zhǎng)和產(chǎn)量的影響都十分深遠(yuǎn)。 此外，大多數(shù)農(nóng)作物都非常易受到非生物脅迫(ABS)的影響，因此對(duì)于經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)量而言 需要最佳的生長(zhǎng)條件。連續(xù)暴露于脅迫會(huì)引起植物代謝發(fā)生較大改變，最終將導(dǎo)致細(xì)胞死 亡，結(jié)果使產(chǎn)量蒙受損失。全球性供水短缺是影響植物生長(zhǎng)和作物產(chǎn)量最嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)問(wèn)題之一，已進(jìn)行努力 以減輕全球耕地沙漠化和鹽堿化的有害作用。為此，Agbiotech公司試圖生產(chǎn)耐受不同非 生物脅迫的新的作物品種，主要集中在開(kāi)發(fā)新的可以耐受較長(zhǎng)時(shí)期缺水的新品種。研究表明，植物對(duì)不利環(huán)境條件適應(yīng)是具有多基因性質(zhì)的復(fù)雜遺傳特性。當(dāng)供水 受限時(shí)，植物WUE對(duì)于作物的存活和產(chǎn)量至關(guān)重要。因?yàn)槭澜绶秶鷥?nèi)缺水日漸嚴(yán)重，水質(zhì)下 降，因此增加水分生產(chǎn)率和植物WUE十分重要。許多環(huán)境非生物脅迫例如干旱、低溫或高 鹽，降低根系導(dǎo)水性，影響植物生長(zhǎng)，降低作物生產(chǎn)率?？梢酝ㄟ^(guò)傳統(tǒng)育種或者通過(guò)遺傳工程產(chǎn)生遺傳上改進(jìn)的植物FUE。在轉(zhuǎn)基因植物 中改進(jìn)FUE的努力可參見(jiàn)Choo等人的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)20020046419 ；Edgerton等人的美國(guó) 專(zhuān)利申請(qǐng) 20030233670 ；Chomet 等人的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng) 20060179511 ；Yanagisawa 等[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 2004，101 (20) :7833_8] ；Good AG 等[Trends Plant Sci. 2004， 9(12) 597-605]；以及Good等人的美國(guó)專(zhuān)利第6，084，153號(hào)。水通道蛋白(AQP，Aquaporin/water channel protein)參與水分跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，在環(huán) 境和發(fā)育條件發(fā)生變化的情況下維持細(xì)胞水平衡和穩(wěn)態(tài)[Maurel C. Plant aquaporins Novel functions and regulation properties (植物水通道蛋白新的功能與調(diào)節(jié)性 質(zhì)).FEBS Lett. 2007,581 (12) :2227_36]。這些蛋白質(zhì)被認(rèn)為是能夠使水和小的中性溶質(zhì) 例如尿素和 C02 跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的主要通道[Maurel C. Plant aquaporins :Novelfunctions and regulation properties (植物水通道蛋白新的功能與調(diào)節(jié)性質(zhì)).FEBS Lett. 2007年6月 12日；581 (12) :2227-36]。植物中，AQP以?xún)?nèi)在蛋白的4個(gè)亞家族存在質(zhì)膜蛋白(PIP)、液 泡膜蛋白(TIP)、堿性小蛋白(SIP)和N0D26樣蛋白(NIP)。與動(dòng)物相比，植物中AQP成員的 總數(shù)似乎出人意料的高[Maurel C.，2007 (同上)]。例如，在擬南芥基因組中已鑒定出35種 AQP 基因[Quigley F 等，"From genome tofunction :the Arabidopsis aquaporins (從基 因組到功能擬南芥水通道蛋白)” Genome Biol. 2002,3(1) :RESEARCH0001. 1-1. 17]；玉 米中 36 禾中[Chaumont F等，2001,"Aquaporins constitute a large and highlydivergent protein family in maize (水通道蛋白在玉米中構(gòu)建大量高度趨異的蛋白質(zhì)家族).Plant
5Physiol”，125(3) :1206_15]；水稻中 33 禾中[Sakurai, J.等，2005，Identification of 33 rice aquaporin genes and analysisof their expression and function (33 禾中水禾苗水 通道蛋白基因的鑒定及其表達(dá)與功能的分析).Plant Cell Physiol. 46，1568-1577]。植 物中大量的AQP表明在環(huán)境條件發(fā)生變化的情況下的不同作用和差異性調(diào)節(jié)[Maurel C.， 2007 (同上)]。本發(fā)明的發(fā)明人的W02004/104162教導(dǎo)了多核苷酸序列和使用同樣的多核苷酸 序列提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性和/或提高植物生物量的方法。本發(fā)明的發(fā)明人的W02007/020638教導(dǎo)了多核苷酸序列和使用同樣的多核苷酸 序列提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性和/或提高植物的生物量、生長(zhǎng)勢(shì)和/或產(chǎn)量的方法。Lian HL 等，2006 (Cell Res. 16 :651_60)在水稻中過(guò)量表達(dá) AQP 的 PIPl 亞組成 員。Aharon R. 2003 (Plant Cell, 15 439-47)在轉(zhuǎn)基因煙草植物中過(guò)量表達(dá)擬南芥質(zhì) 膜水通道蛋白PIPlb。發(fā)明概述本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供提高植物的非生物脅迫耐受性的方法，所 述方法包括在植物中表達(dá)編碼包含與選自以下的氨基酸序列有至少80 %同源性的氨基 酸序列的多肽的外源多核苷酸:SEQID NO :33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、 1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、 1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065 和 3067-3259，從而提高植物的非生物脅迫耐受性。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供提高植物的水分利用效率(WUE)、肥料利用 效率(FUE)、生物量、生長(zhǎng)勢(shì)和/或產(chǎn)量的方法，所述方法包括在植物中表達(dá)編碼多肽的 外源多核苷酸，所述外源多核苷酸包含與選自以下的氨基酸序列有至少80%同源性的氨 基酸序列:SEQ ID NO :33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、 1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、 2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065 和 3067-3259，從而提高植 物的水分利用效率(WUE)、肥料利用效率(FUE)、生物量、生長(zhǎng)勢(shì)和/或產(chǎn)量。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供分離多核苷酸，所述多核苷酸包含與選自 以下的核酸序列有至少80%同一性的核酸序列=SEQ IDNO :7、8、4、1-3、5、6、9_26、53_55、 57-87,89-147,149-195,197-206,208-212,214-480,482-519,521-1103,1106-1111, 1113-1116、1118-1134、1136、1138-1400、2748-2764、2843-2857 和 2859-3051。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明的 分離多核苷酸和指導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供分離多肽，所述多肽包含與選自以下的 氨基酸序列有至少80%同源性的氨基酸序列SEQ ID NO :33、34、30、27-29、31、32、 35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、 1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、 3052-3065 和 3067-3259。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供包含外源多肽的植物細(xì)胞，所述多肽具有與 選自以下的氨基酸序列有至少80%同源性的氨基酸序列SEQ ID N0:33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、 1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、 2765-2769,3052-3065 和 3067-3259。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供包含外源多核苷酸的植物細(xì)胞，所述外源多 核苷酸包含與選自以下的核酸序列有至少80%同源性的核酸序列SEQ ID N0:7、8、4、l-3、 5、6、9-26、53-55、57-87、89-147、149-195、197-206、208-212、214-480、482-519、521-1103、 1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、1138-1400、2748-2764、2843-2857 和 2859-3051。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供提高植物的非生物脅迫耐受性的方法， 所述方法包括在植物中表達(dá)編碼多肽的外源多核苷酸，所述多肽包含由SEQ ID N0:33、 34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、 1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、 2485-2746、2765-2769、3052-3065、3067-3258或3259所示的氨基酸序列，從而提高植物的 非生物脅迫耐受性。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供提高植物的水分利用效率(WUE)、肥料利用 效率(FUE)、生物量、生長(zhǎng)勢(shì)和/或產(chǎn)量的方法，所述方法包括在植物中表達(dá)編碼多肽的 外源多核苷酸，所述多肽包含由 SEQ ID NO :33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、 1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、 1868-2450,2453-2458,2460-2463,2465-2481,2483,2485-2746,2765-2769,3052-3065, 3067-3258或3259所示的氨基酸序列，從而提高植物的水分利用效率(WUE)、肥料利用效率 (FUE)、生物量、生長(zhǎng)勢(shì)和/或產(chǎn)量。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供分離多核苷酸，所述多核苷酸包含由SEQ ID NO :7、8、4、1-3、5、6、9-26、53-55、57-87、89-147、149-195、197-206、208-212、214-480、 482-519、521-1103、1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、1138-1400、2748-2764、 2843-2857,2859-3050或3051所示的核酸序列。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明的 分離多核苷酸和指導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供分離多肽，所述多肽包含由SEQ ID NO :33、 34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、 1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、 2485-2746、2765-2769、3052-3065、3067-3258 或 3259 所示的氨基酸序列。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供包含外源多肽的植物細(xì)胞，所述多肽具有由 SEQ ID NO :33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、 1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、 2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065、3067-3258 或 3259 所示的氨基酸序 列。本發(fā)明一些實(shí)施方案的一個(gè)方面提供包含外源多核苷酸的植物細(xì)胞，所述外 源多核苷酸包含由 SEQ ID NO :7、8、4、1-3、5、6、9-26、53-55、57-87、89-147、149-195、 197-206、208-212、214-480、482-519、521-1103、1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、 1138-1400、2748-2764、2843-2857、2859-3050 或 3051 所示的核酸序列。
按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述多核苷酸選自SEQ ID NO :7、8、4、1_3、5、6、 9-26、53-55、57-87、89-147、149-195、197-206、208-212、214-480、482-519、521-1103、 1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、1138-1400、2748-2764、2843-2857 和 2859-3051。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述氨基酸序列選自SEQ ID NO :33、34、30、27_29、 31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、 1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、 2765-2769,3052-3065 和 3067-3259。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述多肽選自SEQ ID NO :33、34、30、27_29、31、32、 35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、 1829-1866,1868-2450,2453-2458,2460-2463,2465-2481,2483,2485-2746,2765-2769, 3052-3065 和 3067-3259。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，非生物脅迫選自鹽分、脫水、低溫、高溫、重金屬毒 性、無(wú)氧生活、養(yǎng)分缺乏、養(yǎng)分過(guò)量、大氣污染和紫外幅射。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述方法還包括使表達(dá)外源多核苷酸的植物在非生 物脅迫下生長(zhǎng)。 按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，植物細(xì)胞形成植物的一部分。除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普 通技術(shù)人員通常所理解的含義。盡管類(lèi)似或等同于本文所述方法與材料的方法與材料可用 于本發(fā)明實(shí)施方案的實(shí)踐或試驗(yàn)中，但是下面描述了示例性的方法和/或材料。萬(wàn)一發(fā)生 抵觸，則以本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)(包括定義)為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實(shí)施例只是說(shuō)明性的，并不 一定是限制性的。附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明僅通過(guò)實(shí)施例并參照附圖進(jìn)行描述。要強(qiáng)調(diào)的是，有關(guān)具體附圖詳情，所表 示的具體細(xì)節(jié)是通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)行的，而且僅僅是為了舉例論述本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方 案的目的。在這一點(diǎn)上，附圖中的說(shuō)明使本領(lǐng)域技術(shù)人員明白本發(fā)明的實(shí)施方案是如何體 現(xiàn)在實(shí)踐中的。在附圖中

圖1是用于表達(dá)本發(fā)明的分離多核苷酸序列的pGI 二元質(zhì)粒示意圖。RB-T-DNA 右邊界；LB-T-DNA左邊界；H-HindI11限制性?xún)?nèi)切酶；X-XbaI限制性?xún)?nèi)切酶；B-BamHI限 制性?xún)?nèi)切酶；S-SalI限制性?xún)?nèi)切酶；Sm-SmaI限制性?xún)?nèi)切酶；R-I-EcoRI限制性?xún)?nèi)切酶； Sc-SacI/SstI/Ecll36II ；(數(shù)字)_堿基對(duì)長(zhǎng)度；NOS pro =胭脂堿合酶啟動(dòng)子；NPT-II =新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；NOS ter =胭脂堿合酶終止子；聚A信號(hào)(聚腺苷酸化信號(hào))； ⑶Sintron-GUS報(bào)道基因(編碼序列和內(nèi)含子)。將本發(fā)明一些實(shí)施方案的分離多核苷酸 序列克隆至載體中，同時(shí)置換⑶S內(nèi)含子報(bào)道基因。圖2A-B是在透明瓊脂平板中生長(zhǎng)的植物根發(fā)育的照片。使不同的轉(zhuǎn)基因在透明 瓊脂平板中生長(zhǎng)10-15天，自第1天開(kāi)始，每2-5天對(duì)平板進(jìn)行拍照。圖2A-在瓊脂平板上 12天后拍攝的示例性植物照片。圖2B-對(duì)根進(jìn)行分析的示例性照片，其中所測(cè)量的根長(zhǎng)用 紅色箭頭表示。
圖3A-F直方圖表示在200mM氯化鈉(NaCl)澆灌方案(分別為圖3A-C)下 或在兩種不同的水脅迫方案(分別WLI-I和WLI-2 ；圖3D-F)下，在市售溫室中生長(zhǎng)的 T0M-ABST36(黑色條形柱)與對(duì)照(白色條形柱)植物的經(jīng)濟(jì)果實(shí)總產(chǎn)量、植物生物量和 收獲指數(shù)。與在標(biāo)準(zhǔn)澆灌條件(OmM NaCl和WLI-0)下生長(zhǎng)的植物的產(chǎn)量表現(xiàn)進(jìn)行了比較。 結(jié)果是4件獨(dú)立事件的平均值。*在P <0.05下顯著不同。圖3G-J是生長(zhǎng)在不同條件下的轉(zhuǎn)基因番茄植物或?qū)φ罩参锏恼掌?。圖3G-生長(zhǎng)在 定時(shí)澆灌條件下的T0M-ABST36植物；圖3H-生長(zhǎng)在定時(shí)澆灌條件下的對(duì)照植物；圖31-在 整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)期間在200mM NaCl澆灌方案下生長(zhǎng)后的T0M-ABST36植物；圖3J-在整個(gè)生 長(zhǎng)季節(jié)期間在200mM NaCl澆灌方案下生長(zhǎng)后的對(duì)照植物。本發(fā)明具體實(shí)施方案詳述在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，涉及新的水通道蛋白多核苷酸和多肽，更準(zhǔn)確但并 非唯一地講是涉及使用同樣的多核苷酸和多肽以提高植物的非生物脅迫耐受性、水分利用 效率、肥料利用效率、生物量、生長(zhǎng)勢(shì)和/或產(chǎn)量的方法。在詳細(xì)解釋至少一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案前，要了解的是，本發(fā)明不一定局限于在 下面說(shuō)明書(shū)中給出或在實(shí)施例中列舉的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠有其它實(shí)施方案或者能夠以各種 方式實(shí)施或進(jìn)行。在將本發(fā)明付諸實(shí)施時(shí)，本發(fā)明的發(fā)明人鑒定出新的水通道蛋白(AQP)多核苷酸 和由其編碼的多肽。因此，如隨后的實(shí)施例部分所示，本發(fā)明的發(fā)明人利用將數(shù)字表達(dá)分析法 (digital expression analysis)與跨種比較基因組學(xué)相結(jié)合的生物信息學(xué)方法，并從單 子葉和雙子葉植物品種兩者的1，195個(gè)相關(guān)EST文庫(kù)中篩選出7. 2xl06個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽 (EST)。采用該方法，鑒定出1，114種不同的AQP基因，并且將其進(jìn)一步分成11個(gè)亞組(表 1)。進(jìn)一步的分析顯示，TIP2亞組的EST顯著過(guò)多呈現(xiàn)在植物根部和暴露在非生物脅迫 (ABS)的植物中，而且由TIP2亞組的多核苷酸(例如SEQID NO :1、2、19_22，表2)編碼的多 肽(例如 SEQ ID NO :27-28、45-48，表 2)有著共同的共有序列 TLXFXFAGVGS(SEQ ID NO: 2826)。以在根部的過(guò)量呈現(xiàn)、ABS條件和水分水平低的組織(例如種子和花粉)為基礎(chǔ)， 鑒定出水通道蛋白基因家族另外的多核苷酸(SEQ ID N0:3-18、23-26，表2)以及其同源物 或直系同源物(orthologue)(多核苷酸的 SEQID NO :53-1400、2844_3051，多肽的 SEQ ID NO 1401-2746,3052-3259 ；表3)。而且，定量RT-PCR分析表明在鹽脅迫下，代表性AQP基因 (例如SEQ ID N0:5、6和7)的表達(dá)增加，與對(duì)鹽脅迫敏感的植物(表5，隨后實(shí)施例部分的 實(shí)施例2)相比，這在具有耐鹽性的植物中較高。正如在隨后實(shí)施例部分的實(shí)施例3-4中進(jìn) 一步描述的一樣，對(duì)代表性AQP多核苷酸進(jìn)行克隆(表7、8和9)，產(chǎn)生過(guò)量表達(dá)所述克隆的 轉(zhuǎn)基因植物(實(shí)施例4)。研究表明這些植物對(duì)各種非生物脅迫例如滲透脅迫(表10-14 ； 實(shí)施例5)和鹽分脅迫(表30-45 ；實(shí)施例6)的耐受性提高，肥料利用效率(在氮限制條件 下，表59-68，實(shí)施例7)提高，以及在正常條件下[表15-29 (實(shí)施例5)、46-58 (實(shí)施例6)] 或非生物脅迫(實(shí)施例5-8)下的生長(zhǎng)、生物量和產(chǎn)量提高?？傊?，這些結(jié)果表明本發(fā)明的 AQP多核苷酸和多肽可用于提高植物的非生物脅迫耐受性、水分利用效率、肥料利用效率、 生物量、生長(zhǎng)勢(shì)和/或產(chǎn)量。應(yīng)當(dāng)注意的是，在脅迫下影響(例如提高)植物代謝、生長(zhǎng)、繁殖和/或生活力的多肽或多核苷酸，還可在最優(yōu)條件下影響植物生長(zhǎng)、生物量、產(chǎn)量和/或生長(zhǎng)勢(shì)。因此，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供提高植物的非生物脅迫耐受性、水分利用效 率、肥料利用效率、生長(zhǎng)、生物量、產(chǎn)量和/或生長(zhǎng)勢(shì)的方法。所述方法通過(guò)在植物中表達(dá)編 碼包含由SEQ ID NO 2826所示氨基酸共有序列TLXFXFAGVGS的多肽的外源多核苷酸來(lái)實(shí) 現(xiàn)，其中所述多肽的表達(dá)在正?；蛎{迫條件下提高植物的生物量/生長(zhǎng)勢(shì)和/或產(chǎn)量。研究表明，多肽的活性在結(jié)構(gòu)上與上述共有序列(SEQ ID NO 2826)的完整性 有關(guān)。在本發(fā)明這一方面的一些實(shí)施方案中，所述活性是通常存在于液泡膜(vacimolar membrane (tonoplast))和/或植物細(xì)胞質(zhì)膜中的水分通道活性，并且能夠跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水分和 /或小的中性溶質(zhì)，例如尿素、硝酸鹽和二氧化碳(CO2)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“非生物脅迫”是指對(duì)植物代謝、生長(zhǎng)、繁殖和/或生活力的任何 不利作用。因此，非生物脅迫可由亞適度環(huán)境生長(zhǎng)條件引起，例如鹽分、脫水、淹水、冷凍、低 溫或高溫、重金屬毒性、無(wú)氧生活、養(yǎng)分缺乏、大氣污染或紫外幅射。在背景部分論述了非生 物脅迫的含義。本文使用的術(shù)語(yǔ)“非生物脅迫耐受性”是指植物忍受非生物脅迫而不會(huì)在代謝、生 長(zhǎng)、生產(chǎn)率和/或生活力方面遭受實(shí)質(zhì)改變的能力。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“水分利用效率(WUE) ”是指植物消耗的每單位水分所產(chǎn)生的有 機(jī)物的水平，即植物干重與植物水分利用之比，例如每單位蒸騰所產(chǎn)生的生物量。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“肥料利用效率”是指從土壤中吸收的一種或多種無(wú)機(jī)物和有 機(jī)部分的攝取、傳送、吸收、蓄積、再定位(植物內(nèi))和利用，例如氮、磷酸鹽和/或鉀。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“植物生物量”是指生長(zhǎng)季節(jié)內(nèi)由植物產(chǎn)生的組織量(測(cè)量單 位為風(fēng)干組織的克數(shù))，這還可決定或影響植物產(chǎn)量或每生長(zhǎng)面積的產(chǎn)量。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“植物產(chǎn)量”是指每株植物或每個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)所產(chǎn)生的組織的量 (用重量/尺寸測(cè)定)或數(shù)量(數(shù)目)。因此產(chǎn)量的提高可以影響人們能夠從某一生長(zhǎng)面 積和/或生長(zhǎng)期的植物中所獲取的經(jīng)濟(jì)利益。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“植物生長(zhǎng)勢(shì)”是指在指定時(shí)間由植物產(chǎn)生的組織的量(用重 量測(cè)量)。因此生長(zhǎng)勢(shì)的提高可以決定或影響植物產(chǎn)量或每生長(zhǎng)期或每生長(zhǎng)面積的產(chǎn)量。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“提高/增長(zhǎng)”是指與天然植物[即沒(méi)有用本發(fā)明的生物分子 (多核苷酸或多肽)修飾的植物，例如生長(zhǎng)在相同生長(zhǎng)條件下同一品種的非轉(zhuǎn)化植物)]相 比，植物非生物脅迫耐受性、水分利用效率、肥料利用效率、生長(zhǎng)、生物量、產(chǎn)量和/或生長(zhǎng) 勢(shì)提高至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約 20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“外源多核苷酸”是指可以不是植物內(nèi)天然表達(dá)的異源核酸序 列，或者其在植物中的過(guò)量表達(dá)是需要的異源核酸序列。可以穩(wěn)定或瞬時(shí)方式將外源多核 苷酸序列導(dǎo)入植物中，以便產(chǎn)生核糖核酸(RNA)分子和/或多肽分子。應(yīng)當(dāng)注意的是，外源 多核苷酸可包含與植物內(nèi)源核酸序列相同或部分同源的核酸序列。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，本發(fā)明的外源多核苷酸編碼具有與選自SEQ ID NO 27-28、45-48、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561、 2449-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2484 和 2765 的氨基酸序列有至少約 60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約81%、至少約82 %、至少
10約83 %、至少約84 %、至少約85 %、至少約86 %、至少約87 %、至少約88 %、至少約89 %、至 少約90 %、至少約91%、至少約92 %、至少約93 %、至少約94 %、至少約95 %、至少約96 %、 至少約97%、至少約98%、至少約99%或更多比如100%同源性的氨基酸序列的多肽。同源性(例如百分比同源性)可以采用任何同源性比較軟件確定，包括例如當(dāng)自 多肽序列開(kāi)始時(shí)，通過(guò)使用默認(rèn)參數(shù)的例如國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)的BlastP或TBLASTN軟件；或者例如通過(guò)使用默認(rèn)參 數(shù)的tBLASTX算法(可通過(guò)NCBI獲取)，這可對(duì)核苷酸查詢(xún)序列(兩條鏈)的6讀框概念 翻譯產(chǎn)物(six—frame conceptual translation product)與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn) 亍比較。同源序列包括直系同源序列和旁系同源序列兩者。術(shù)語(yǔ)“旁系同源(paralogous)，， 是指某一品種基因組內(nèi)產(chǎn)生旁系同源基因的基因復(fù)制。術(shù)語(yǔ)“直系同源(orthologous) ”是 指不同生物由于祖先關(guān)系所引起的同源基因。在單子葉植物品種中鑒定直系同源物的一種備選方法是進(jìn)行交互比對(duì)檢索 (blast)搜索。這可通過(guò)第一次比對(duì)檢索進(jìn)行，包括使目標(biāo)序列針對(duì)任何序列數(shù)據(jù)庫(kù) 進(jìn)行比對(duì)檢索，例如公眾可獲取的NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，可參見(jiàn)超文本傳輸協(xié)議(Hypertext TransferProtocol) //www. ncbi. nlm. nih. gov。如果查到水稻的直系同源物，可將目標(biāo) 序列針對(duì)例如可獲自NCBI的日本晴水稻(Oryza sativaNipponbare)的28，469個(gè)全長(zhǎng) cDNA克隆進(jìn)行比對(duì)檢索?？蓪?duì)比對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)行過(guò)濾。然后，使過(guò)濾結(jié)果或未過(guò)濾結(jié)果 兩者的全長(zhǎng)序列反過(guò)來(lái)與目標(biāo)序列得自其中的生物的序列進(jìn)行比對(duì)檢索(第二次比對(duì)檢 索)。然后比較第一次和第二次比對(duì)檢索的結(jié)果。當(dāng)在第一次比對(duì)檢索中產(chǎn)生最高得分 (最佳命中)的序列在第二次比對(duì)檢索中鑒定查詢(xún)序列(原始目標(biāo)序列)為最佳命中時(shí)， 便鑒定出直系同源物。利用相同原理找出旁系同源物(paralogue)(同一生物中基因的 同源物)。在大序列家族的情況下，可以運(yùn)用ClustalW程序[超文本傳輸協(xié)議..Ih·. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/index. html]，接著運(yùn)用有助于目測(cè)觀察聚簇(clustering) 的鄰接系統(tǒng)樹(shù)(neighbor-joining tree)(超文本傳輸協(xié)議//en. wikipedia. org/wiki/ Neighbor-joining)。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，外源多核苷酸編碼由如SEQ ID NO :27_28、45_48、 1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561、2449-2450、 2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2484或2765中所示的氨基酸序列組成的多肽。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，外源多核苷酸包含與選自SEQ IDNO :1、2、19、20_22、 53-55、57-87、89-141、143-147、149-195、197-206、208-212、214、1102-1103、1106-1111、 1113-1116、1118-1134、1136、2751-2752 和 2748-2750 的核酸序列有至少約 60%、至少約 65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約81%、至少約82 %、至少約83 %、至少 約84 %、至少約85 %、至少約86 %、至少約87 %、至少約88 %、至少約89 %、至少約90 %、至 少約91 %、至少約92 %、至少約93 %、至少約93 %、至少約94 %、至少約95 %、至少約96 %、 至少約97%、至少約98%、至少約99%、例如100%同一性的核酸序列。同一性(例如百分比同源性)可運(yùn)用任何同源性比較軟件確定，包括例如通過(guò)使 用默認(rèn)參數(shù)的例如國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的比對(duì)BlastN軟件。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，外源多核苷酸如SEQ ID NO :1、2、19、20_22、 53-55、57-87、89-141、143-147、149-195、197-206、208-212、214、1102-1103、1106-1111、
111113-1116、1118-1134、1136、2751-2752、2748-2749 或 2750 所示。盡管如此，另外的AQP多核苷酸和由其編碼的多肽也包括在本發(fā)明的教導(dǎo)中。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，外源多核苷酸編碼具有與SEQ IDN0:33、34、 30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、 1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、 2485-2746、2765-2769、3052-3065、3067-3258 或 3259 有至少約 60%、至少約 65%、至少約 70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約86%、至少約87 %、至少約88 %、至少 約89 %、至少約90 %、至少約91%、至少約92 %、至少約93 %、至少約94 %、至少約95 %、至 少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%例如100%同源性的氨基酸序列的多肽。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，外源多核苷酸編碼由如SEQ ID NO :33、34、 30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、 1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、 2485-2746、2765-2769、3052-3065、3067-3258 或 3259 所示的氨基酸序列組成的多肽。在示例性實(shí)施方案中，外源多核苷酸不編碼具有選自SEQ ID NO 1828、1867、 1404、1436、1495、1543、1554、1560、2451、2452、2459、2464、2482、2484 和 3066 的氨基酸序 列的多肽。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，外源多核苷酸與SEQ ID NO :7、8、4、1_3、5、6、 9-26、53-55、57-87、89-147、149-195、197-206、208-212、214-480、482-519、521-1103、 1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、1138-1400、2748-2764、2843-2857、2859-3050 或 3051有至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至 少約86 %、至少約87 %、至少約88 %、至少約89 %、至少約90 %、至少約91%、至少約92 %、 至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約 99%例如100%同一性。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，多核苷酸如SEQ ID N0:7、8、4、l-3、5、6、9-26、 53-55、57-87、89-147、149-195、197-206、208-212、214-480、482-519、521-1103、 1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、1138-1400、2748-2764、2843-2857、2859-3050 或 3051所示。在一個(gè)示例性實(shí)施方案，外源多核苷酸不是如SEQ ID NO :481、520、56、88、148、 196、207、213、1104、1105、1112、1117、1135、1137 或 2858 所示的多核苷酸。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”是指分離的單鏈或雙鏈核酸序列，并且以RNA序 列、互補(bǔ)多核苷酸序列(cDNA)、基因組多核苷酸序列和/或復(fù)合多核苷酸序列(composite polynucleotide sequence)(例如上述的組合)的形式提供。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)多核苷酸序列”是指利用反轉(zhuǎn)錄酶或任何其它RNA依賴(lài) 性DNA聚合酶使信使RNA反轉(zhuǎn)錄的序列。這類(lèi)序列隨后可以利用DNA依賴(lài)性DNA聚合酶在 體內(nèi)或體外擴(kuò)增。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“基因組多核苷酸序列”是指從染色體得到(分離)的序列，因 此它代表著染色體的連續(xù)部分。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“復(fù)合多核苷酸序列”是指至少部分是互補(bǔ)且至少部分是基因 組的序列。復(fù)合序列可包括一些需要編碼本發(fā)明多肽的外顯子序列以及一些介于外顯子序列之間的內(nèi)含子序列。內(nèi)含子序列可以是任何來(lái)源，包括其它基因的內(nèi)含子序列，通?？砂?括保守剪接信號(hào)序列。這類(lèi)內(nèi)含子序列另可包括順式作用表達(dá)調(diào)節(jié)元件。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，本發(fā)明的多核苷酸包含長(zhǎng)度不超過(guò)5000個(gè)的核酸。 按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，本發(fā)明的多核苷酸包含長(zhǎng)度不超過(guò)4000個(gè)的核酸，例如不超 過(guò)3000個(gè)核酸，例如不超過(guò)2500個(gè)核酸。可使編碼本發(fā)明多肽的核酸序列最優(yōu)化以進(jìn)行表達(dá)。SEQ ID NO :2751中提供了 最優(yōu)化的核酸序列的非限制性實(shí)例，該序列編碼包含SEQ ID NO :27所示氨基酸序列的最優(yōu) 化多肽。這類(lèi)序列修飾的實(shí)例包括但不限于改變G/C含量以更緊密地接近通常存在于目標(biāo) 植物品種的含量，并且剔除非典型存在于植物品種的密碼子，通常亦稱(chēng)密碼子優(yōu)化。術(shù)語(yǔ)“密碼子優(yōu)化”是指選擇合適的DNA核苷酸用于接近目標(biāo)植物內(nèi)密碼子用法 的結(jié)構(gòu)基因或其片段內(nèi)。因此，最適基因或核酸序列是指這樣的基因，其中天然基因或天然 存在的基因的核苷酸序列已經(jīng)修飾以便利用植物內(nèi)在統(tǒng)計(jì)上優(yōu)選或統(tǒng)計(jì)上有利的密碼子。 通常在DNA水平上研究核苷酸序列，可以采用任何合適的方法確定優(yōu)化用于在植物品種中 表達(dá)的編碼區(qū),例如參見(jiàn)Sardana等(1996，Plant CellReports 15:677-681)。在該方法 中，密碼子用法的標(biāo)準(zhǔn)差、密碼子用法偏倚的量度，可以通過(guò)首先得出天然基因的各個(gè)密碼 子使用率的平方比例偏差(squared proportional deviation)與高表達(dá)的植物基因相比 較，接著計(jì)算均方差來(lái)計(jì)算。所用方程式為=ISDOT = η = IN[(Xn-Yn)/Υη]2/Ν，其中Xn是 指在高表達(dá)的植物基因中密碼子η的使用頻率，其中Yn是指目標(biāo)基因中密碼子η的使用頻 率，N是指目標(biāo)基因中密碼子的總數(shù)。利用Murray等(1989, Nuc Acids Res. 17 :477_498) 的數(shù)據(jù)編制雙子葉植物的高表達(dá)基因的密碼子用法表。按照特定植物細(xì)胞類(lèi)型的優(yōu)選的密碼子用法使核酸序列最優(yōu)化的一種方法是基 于直接利用密碼子優(yōu)化表，而無(wú)需進(jìn)行任何額外的統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，密碼子優(yōu)化表例如通過(guò)日 本NIAS(國(guó)立農(nóng)業(yè)生物科學(xué)研究院(National Institute of Agrobiological Sciences)) DNA庫(kù)(超文本傳輸協(xié)議·.//■. kazusa. or. jp/codon/)的密碼子用法數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)提供的 密碼子優(yōu)化表。密碼子用法數(shù)據(jù)庫(kù)含有多種不同品種的密碼子用法表，其中每個(gè)密碼子用 法表根據(jù)Genbank中提供的數(shù)據(jù)以統(tǒng)計(jì)方法確定。通過(guò)使用上述密碼子用法表確定特定品種(例如水稻)中每個(gè)氨基酸最優(yōu)選或最 有利的密碼子，可對(duì)編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的天然存在的核苷酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化以用于該特 定植物品種。對(duì)于氨基酸，通過(guò)用在統(tǒng)計(jì)學(xué)上較有利的相應(yīng)密碼子置換特定品種基因組中 可能具有低統(tǒng)計(jì)發(fā)生率的密碼子來(lái)實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。然而，可以選出一個(gè)或多個(gè)較不利的密碼 子以剔除存在的限制位點(diǎn)，并在可能有用的連接點(diǎn)(5'端和3'端添加信號(hào)肽或終止盒， 可用來(lái)同時(shí)切割和剪接區(qū)段產(chǎn)生正確的全長(zhǎng)序列的內(nèi)部位點(diǎn))上產(chǎn)生新的限制位點(diǎn)，或者 去掉可能負(fù)面影響mRNA穩(wěn)定性或表達(dá)的核苷酸序列。事先進(jìn)行任何修飾的天然存在的編碼核苷酸序列可能已含有相當(dāng)于特定植物品 種中在統(tǒng)計(jì)上有利的密碼子的多個(gè)密碼子。因此，天然核苷酸序列的密碼子優(yōu)化可包括確 定天然核苷酸序列內(nèi)的哪一個(gè)密碼子對(duì)于特定植物不是統(tǒng)計(jì)上有利的，并且按照特定植物 的密碼子用法表對(duì)這些密碼子進(jìn)行修飾，產(chǎn)生密碼子最優(yōu)化的衍生物。假若由修飾核苷酸 序列編碼的蛋白質(zhì)以高于由相應(yīng)的天然存在的基因或天然基因編碼的蛋白質(zhì)的水平產(chǎn)生， 則用于植物密碼子用法的修飾核苷酸序列可以是完全優(yōu)化或部分優(yōu)化的。通過(guò)改變密碼子用法進(jìn)行合成基因的構(gòu)建可參見(jiàn)例如PCT專(zhuān)利申請(qǐng)93/07278。因此，本發(fā)明包括在上文中描述的核酸序列、其片段、與之雜交的序列、與之同源 的序列、編碼具有不同密碼子用法的相似多肽的序列、特征在于突變的經(jīng)改變的序列，所述 突變例如一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸或者人造核苷酸隨機(jī)或定向方式產(chǎn)生的缺失、插入 或取代。如上所述，本發(fā)明的發(fā)明人揭示了之前未表征的多肽，該多肽都共有如SEQ ID NO 2826所示的氨基酸共有序列。因此，本發(fā)明提供具有與選自 SEQ ID NO :27-28、45_48、1401-1403、1405-1435、 1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561、2449-2450、2453-2458、2460_2463、 2465-2481、2483、2484和2765的氨基酸序列有至少約60%、至少約65%、至少約70%、至 少約75 %、至少約80 %、至少約81%、至少約82 %、至少約83 %、至少約84 %、至少約85 %、 至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約 92 %、至少約93 %、至少約93 %、至少約94%、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少 約98%、至少約99%或更多比如100%同源性的氨基酸序列的分離多肽。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，本發(fā)明提供具有與選自SEQ ID NO :33、34、 30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、 1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、 2485-2746、2765-2769、3052-3065 和 3067-3259 的氨基酸序列有至少約 60 %、至少約 65 %、 至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約 84%、至少約85 %、至少約86 %、至少約87 %、至少約88 %、至少約89 %、至少約90 %、至少 約91 %、至少約92 %、至少約93 %、至少約93 %、至少約94 %、至少約95 %、至少約96 %、至 少約97%、至少約98%、至少約99%或更多比如100%同源性的氨基酸序列的分離多肽。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述多肽如SEQ ID NO :33、34、30、27_29、31、32、 35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、 1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、 3052-3065,3067-3258 或 3259 中所示。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，所述多肽不是由SEQ ID NO 1828、1867、1404、1436、 1495、1543、1554、1560、2451、2452、2459、2464、2482、2484 或 3066 所示的多月太。本發(fā)明還包括上述多肽的片段和具有突變的多肽，所述突變例如一個(gè)或多個(gè)天然 存在的氨基酸或人造氨基酸隨機(jī)或以定向方式產(chǎn)生的缺失、插入或取代。本文使用的術(shù)語(yǔ)“植物”包括整株植物；植物的祖先和子代及植物組成部分，包括 種子、苗、莖、根(包括塊莖)；以及植物細(xì)胞、組織和器官。植物可以是任何形式，包括懸 浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、配子體、孢子體、花粉和小孢子。特別用于本發(fā)明 方法的植物包括屬于綠色植物(Viridiplantae)總科的全部植物，特別是選自以下的單子 葉植物和雙子葉植物，包括豆科飼料或豆科牧草、觀賞植物、糧食作物、喬木或灌木金合歡 (Acacia spp.)、槭木(Acer spp.)、稱(chēng)猴桃(Actinidia spp.)、七葉樹(shù)(Aesculus spp.)、 澳大禾Ij 亞貝殼杉(Agathisaustralis)、Albizia amara、Alsophila tricolor、須芒草 (Andropogon spp.)、花生(Arachis spp)、模榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、鷹嘴 紫云英(Astragalus cicer)、多小葉紅蘇木(Baikiaea pluri juga)、樺木(Betula spp·)、^^r (Brassica spp. )、7^_ (Bruguiera gymnorrhiza)(Burkeaafricana)
Li^l" (Butea frondosa) ΛCadaba f&rinos&、^·^^ (Calliandraspp) Λ^ ^^ (Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒(Capsicumspp.)、決明(Cassia spp.) ΛCentroema pubescens、Chacoomeles spp·、肉桂(Cinnamomum cassia)、小?？Х?Coffea arabica)、 Colophospermummopane、Coronillia varia、Cotoneaster serotina、 ill ^ (Crataegus spp.)、黃瓜(Cucumis spp.)、桕木(Cupressus spp.)、銀蔽(Cyathea dealbata)、媼 梓(Cydonia oblonga)、臼本柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅(Cymbopogon spp.)、 Cynthea (Ie^lbBtB)Mi李(Cydonia oblonga) ΛDalbergiamonetarDavalIia div&hc&t&、 ill 蟲(chóng)馬蟥(Desmodium spp.)、粗糖蟲(chóng)豐殼蔽(Dicksonia squarosa)、Dibeteropogon amplectens、Dioclea spp、德扁顯(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、Echinochloa pyramidalis、Ehraffiaspp.、禾參〒(Eleusine coracana)、！H| 眉胃(Eragrestis spp.)、 束Ij 桐(Erythrinaspp.)、㈱豐對(duì)(Eucalypfus spp.)、Euclea schimperi、Eulalia vi/ losa、養(yǎng)麥(Pagopyrum spp·)、南美穩(wěn)(Feijoa sellowlana)、草毒(Fragaria spp·)、 千斤拔(Flemingia spp)、Freycinetia banksli、Geranium thunbergii、銀杏(GinAgo biloba)、爪口圭大豆(Glycine javanica)、毒鼠豆(Gliricidia spp)、陸地棉(Gossypium hirsutum)、銀禪(Grevillea spp.)、Guibourtiacoleosperma、巖黃耆(Hedysarum spp·)、 Hemaffhia altissima、Heteropogon contoffus、大麥(Hordeum vulgare)、Hyparrhenia rufa、小連翅(Hypericum erectum)、Hypeffhelia dissolute、Indigo incamata、鸞 尾(Iris spp.) λ Leptarrhena pyrolifolia、古月枝子(Lespediza spp.)(Lettuca
spp.)、IS ^nfc (Leucaena leucocephala) Λ Loudetia simplex、Lotonus bainesli、H 脈根(Lotus spp.)、Macrotyloma axillare、海棠(Malusspp.)、花葉木薯(Manihot esculenta)、紫花苜猜(Medicago saliva)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、 色蕉(Musa sap i en turn)、煙草(Nicotianum spp.)、驢豆(Onobrychis spp.)、雞足豆 (Ornithopus spp.)、水禾§ (Oryza spp.)、Peltophorum africanum、各良尾草(Pennisetum spp.)、魚(yú)萼梨(Persea gratissima)、矮牽牛(Petunia spp.)、菜豆(Phaseolus spp.)、 力口 拿禾Ij 海麥(Phoenix canariensis)、Phormium cookianum、石捕(Photiniaspp.)、 Picea glauca、松樹(shù)(Pinus spp·)、豌豆(Pisum sativam)、新西蘭羅漢松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonaffhria squarrosa、 ^ M (Populus spp.)、 Prosopis cineraria、花方萁松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、矮生西 洋梨(Pyrus communis)、櫟樹(shù)(Quercusspp·)、厚葉石斑木(Rhaphiolepsis umbel lata) Λ Rhopalostylis sapida、Rhusnatalensis、歐洲醋栗(Ribes grossularia)、醋栗(Ribes spp.)、剌槐(Robiniapseudoacacia)、薔薇(Rosa spp.)、懸鉤子(Rubus spp.)、柳樹(shù) (Salix spp.)λ Schyzachyrium sanguineum、 Sciadopitys vefficillata、北美紅杉 (Sequoiasempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、高梁(Sorghumbicolor)、 菠菜(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、StiburusalopecuroidesΛ 矮柱花草 (Stylosanthos humilis)、葫戸荼(Tadehagi spp)、落習(xí)習(xí)杉(Taxodium distichum)、黃背草 (Themeda triandra)、三葉草(Trifolium spp·)、小麥(Triticum spp·)、異葉鐵杉(Tsuga heterophylla)、越桔(Vaccinium spp·)、香豆(Vicia spp·)、葡萄(Vitis vinifera)、 W&tsoni&pyr&mid&t&、^/￡$_ (Zantedeschia 已ethiopic已)、H (Zea mays)、 、# |、蘆筍、青花椰菜、孢子甘藍(lán)、甘藍(lán)、油菜、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘藍(lán)、亞麻、散葉甘藍(lán)、兵 豆、油菜、秋葵、洋蔥、馬鈴薯、水稻、大豆、稻草、糖甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、squash tea、玉 米、小麥、大麥(barely)、黑麥、燕麥、花生、豌豆、兵豆和苜蓿、棉花、油菜籽、油菜、辣椒、向 日葵、煙草、茄子、桉樹(shù)、喬木、觀賞植物、多年生牧草和飼料作物?；蛘咚搴推渌侵参镆?可用于本發(fā)明的方法。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，本發(fā)明的方法所使用的植物是農(nóng)作物，例如水稻、玉 米、小麥、大麥、花生、馬鈴薯、芝麻、橄欖樹(shù)、棕櫚油、香蕉、大豆、向日葵、油菜(canola)、甘 蔗、苜蓿、小米、豆科植物(菜豆、豌豆)、亞麻、羽扇豆、油菜籽、煙草、楊樹(shù)和棉花。植物中表達(dá)本發(fā)明的外源多核苷酸可如下進(jìn)行用外源多核苷酸轉(zhuǎn)化植物的一個(gè) 或多個(gè)細(xì)胞，接著從轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生成熟植物，并在適于成熟植物表達(dá)外源多核苷酸的條件 下培養(yǎng)成熟植物。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，轉(zhuǎn)化通過(guò)將包括本發(fā)明一些實(shí)施方案的外源多核苷 酸和至少一個(gè)能夠指導(dǎo)外源多核苷酸在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物 細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。合適的轉(zhuǎn)化方法的更多詳情見(jiàn)下文。本文使用的術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”是指位于基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的DNA區(qū)，RNA聚合 酶與之結(jié)合啟動(dòng)RNA轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子控制基因在何處(例如植物的哪一個(gè)部分)和/或何時(shí) (例如在生物生命中的哪一個(gè)階段或情況下)進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可以使用任何合適的啟動(dòng)子序列。優(yōu)選啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng) 子、組織特異性啟動(dòng)子或非生物脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。合適的組成型啟動(dòng)子包括例如CaMV 35S啟動(dòng)子(SEQ ID NO :2825 ;0dell等， Nature 313:810-812,1985)；擬南芥 At6669 啟動(dòng)子(SEQID NO :2823 ；參見(jiàn) PCT 公布號(hào) W004081173A2)；玉米 Ubi 1 (Christensen 等，Plant Sol. Biol. 18 :675_689，1992)；水 稻肌動(dòng)蛋白(McElroy 等，Plant Cell 2 :163_171，1990) ；pEMU(Last 等，Theor. Appl. Genet.81 :581-588，1991) ；CaMV 19S (Nilsson 等，Physiol. PlantlOO :456_462，1997)； G0S2 (de Pater 等，Plant J Nov ； 2 (6) :837_44，1992)；泛蛋白(Christensen 等，Plant Mol. Biol. 18 675-689,1992)；水稻親環(huán)蛋白(Bucholz 等，Plant Mol Biol. 25(5) 837-43,1994)；玉米 H3 組蛋白(L印etit 等，Mol. Gen. Genet. 231 :276_285，1992)；肌動(dòng)蛋 白 2(An 等，Plant J. 10(1) ；107-121，1996)和合成的 Super MAS(Ni 等，The PlantJournal 7 :661-76，1995)。其它組成型啟動(dòng)子包括美國(guó)專(zhuān)利第5，659，026,5, 608，149,5. 608，144、 5，604，121,5. 569，597,5. 466，785,5, 399，680,5, 268，463 和 5，608，142 號(hào)中的啟動(dòng)子。合適的組織特異性啟動(dòng)子包括但不限于葉特異性啟動(dòng)子[例如參見(jiàn)例如 Yamamoto 等，Plant J. 12 :255_265，1997 ；Kwon 等，Plant Physiol. 105 :357_67，1994 ； Yamamoto 等，Plant Cell Physiol. 35 :773_778，1994 ;Gotor 等，Plant J. 3 :509_18，1993 ； Orozco 等，Plant Mol. Biol. 23 :1129_1138，1993 ；以及 Matsuoka 等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA90 =9586-9590,1993]；種子優(yōu)選的啟動(dòng)子[例如得自種子特異性基因(Simon等， Plant Mol. Biol. 5. 191，1985 ；Scofield 等，J. Biol. Chem. 262 -.12202,1987 ；Baszczynski 等，Plant Mol. Biol. 14 :633，1990)；巴西堅(jiān)果白蛋白(Pearson，等，Plant Mol. Biol. 18 235-245,1992)；豆球蛋白(Ellis 等，Plant Mol. Biol. 10 :203_214，1988)；谷蛋白(水 稻)(Takaiwa 等，Mol. Gen. Genet. 208 15-22，1986 ；Takaiwa 等，F(xiàn)EBS Letts. 221 :43_47，
161987)；玉米醇溶蛋白(Matzke 等，Plant Mol Biol, 143). 323-321990) ；napA (Stalberg 等，Planta 199:515-519,1996)；小麥 SPA(Albanietal，Plant Cell,9 171-184,1997)； 向日葵油質(zhì)蛋白(Cummins等，Plant Mol. Biol. 19 =873-876,1992)]；胚乳特異性啟動(dòng)子 [例如小麥 LMW 和 HMW、麥谷蛋白-1 (Mol Gen Genet 216 81-90,1989 ；NAR 17:461-2); 小麥a、b和g麥醇溶蛋白(EMB03 =1409-15,1984)；大麥Itrl啟動(dòng)子、大麥Bi、C、D大 麥醇溶蛋白(Theor Appl Gen 98 1253-62,1999 ；Plant J 4 343-55,1993 ；Mol Gen Genet 250 :750_60，1996)；大麥 DOF(Mena 等，The PlantJournal, 116(1) :53_62，1998)； Biz2(EP99106056. 7)；合成啟動(dòng)子(Vicente-Carbajosa 等，Plant J. 13 :629_640，1998)； 水稻谷醇溶蛋白 NRP33、水稻球蛋白 Glb-I (Wu 等，Plant Cell Physiology 39(8)885-889， 1998)；水稻 α -球蛋白 REB/OHP-1 (Nakase 等，Plant Mol. Biol. 33 :513_S22，1997)；水 稻 ADP-葡萄糖 PP (Trans Res 6 157-68,1997)；玉米 ESR 基因家族(Plant J12 :235_46，
1997)；高粱(sorgum)Y-高粱醇溶蛋白(PMB 32 1029-35，1996)]；胚特異性啟動(dòng)子[例 如水稻 OSHl (Sato 等，Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93 :8117-8122) ；KNOX (Postma-Haarsma 等，Plant Mol. Biol. 39 :257_71，1999)，水稻油質(zhì)蛋白(Wu 等，J. Biochem.，123 :386，
1998)]；以及花特異性啟動(dòng)子[例如AtPRP4、查耳酮(chalene)合酶(chsA)(Van der Meer 等，Plant Mol. Biol. 15,95-109,1990) ；LAT52(Twell 等，Mol. Gen Genet. 217 240-245 ； 1989)、apetala-3]。合適的非生物脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括但不限于鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子，例如 RD29A(Yamaguchi-Shinozalei 等，Mol. Gen. Genet. 236 :331_340，1993)；干旱誘導(dǎo)性啟動(dòng) 子例如玉米 rabl7 基因啟動(dòng)子(Pla 等，Plant Mol. Biol. 21 :259_266，1993)、玉米 rab28 基因啟動(dòng)子(Busk 等，Plant J. 11 1285-1295，1997)和玉米 Ivr2 基因啟動(dòng)子(Pelleschi 等，Plant Mol. Biol. 39 =373-380,1999)；熱誘導(dǎo)性啟動(dòng)子例如得自番茄的番茄熱hsp80啟 動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利第5，187，267號(hào))。本發(fā)明一些實(shí)施方案的核酸構(gòu)建體可另包括合適的選擇標(biāo)記和/或復(fù)制起點(diǎn)。 按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所使用的核酸構(gòu)建體是穿梭載體，該載體既可在大腸桿菌 (E. coli)(其中構(gòu)建體包含合適的選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn))增殖，而且又可與在細(xì)胞中的增 殖相容。本發(fā)明的構(gòu)建體可為例如質(zhì)粒、桿粒(bacmid)、噬菌粒、黏粒、噬菌體、病毒或人工 染色體?？衫帽景l(fā)明一些實(shí)施方案的核酸構(gòu)建體來(lái)穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。在穩(wěn)定轉(zhuǎn) 化中，將外源多核苷酸整合到植物基因組中，因此它代表穩(wěn)定的遺傳性狀。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)化中， 外源多核苷酸由轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，但是不整合到基因組中，因此它代表瞬時(shí)性狀。有各種方法將外源基因?qū)雴巫尤~植物和雙子葉植物(Potrykus，I.，Annu. Rev. Plant. Physiol. ， Plant. Mol. Biol. (1991)42 205-225 ；Shimamoto 等，Nature (1989) 338 274-276)。使外源DNA穩(wěn)定整合入植物基因組DNA的主要方法包括兩種主要方法(i) 土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移Klee 等(1987) Annu. Rev. PlantPhysiol. 38 467-486 ;Klee 禾口 Rogers,載于 Cell Culture and Somatic CellGenetics of Plants, 第 6 卷，Molecular Biology of Plant Nuclear Genes,主編 Schell, J.禾口 Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989),第 2-25 頁(yè)；Gatenby,載于 PlantBiotechnology,主編 Kung, S.禾口 Arntzen, C. J. , Butterworth Publishers, Boston, Mass.
(1989)，第93-112 頁(yè)。(ii)直接 DNA 攝取=Paszkowski 等，載于 Cell Culture and SomaticCell Genetics of Plants,第 6 卷；Molecular Biology of Plant NuclearGenes,主編 Schell, J.和 Vasil, L. K.，Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989)，第 52-68 頁(yè)；包括 將 DNA 直接攝入原生質(zhì)體的方法，Toriyama, K.等(1988) Bio/Technology 6:1072-1074。 通過(guò)對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行短暫電擊誘導(dǎo)DNA攝取Zhang等，Plant Cell Rep. (1988)7 379-384。Fromm等，Nature (1986) 319 :791-793。通過(guò)粒子轟擊將DNA注入植物細(xì)胞或 組織，Klein 等，Bio/Technology (1988)6 :559_563 ；McCabe 等，Bio/Technology (1988)6 923-926 ；Sanford, Physiol. Plant, (1990)79 :206_209 ；通過(guò)使用微量移液系統(tǒng):Neuhaus 等，Theor. Appl. Genet. (1987) 75 :30_36 ；Neuhaus 禾口 Spangenberg, Physiol. Plant.
(1990)79213-217 ；細(xì)胞培養(yǎng)物、胚或愈傷組織的玻璃纖維或碳化硅晶須轉(zhuǎn)化，美國(guó)專(zhuān)利 第5，464，765號(hào)；或者通過(guò)使DNA與萌發(fā)的花粉直接孵育，Deffet等，載于Experimental Manipulation of Ovule Tissue, 主 編 Chapman, G. P., Mantel1, S. H.禾口 Daniels, W. Longman, London, (1985)第 197-209 頁(yè)；以及 Ohta，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83 715-719。土壤桿菌系統(tǒng)包括使用含有整合到植物基因組DNA的規(guī)定DNA區(qū)段的質(zhì)粒載體。 植物組織的接種方法隨植物品種和土壤桿菌遞送系統(tǒng)而變化。一種廣泛使用的方法是葉 盤(pán)法，該法可用提供用于引發(fā)整株植物分化的良好來(lái)源的任何組織外植體進(jìn)行。參見(jiàn)例如 Horsch 等，載于 Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988)，第1-9頁(yè)。一種補(bǔ)充方法應(yīng)用土壤桿菌遞送系統(tǒng)與真空過(guò)濾結(jié)合。土壤 桿菌系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因雙子葉植物創(chuàng)建中尤為可行。存在將直接DNA轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞的各種方法。在電穿孔中，將原生質(zhì)體短暫暴露 于強(qiáng)電場(chǎng)。在顯微注射中，用非常小的微量移液管以機(jī)械的方式將DNA直接注入細(xì)胞。在 微粒轟擊中，使DNA吸附在硫酸鎂晶體或鎢粒子等微轟擊粒子上，并且使微轟擊粒子進(jìn)行 物理加速進(jìn)入細(xì)胞或植物組織中。接著進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物繁殖。植物繁殖最常見(jiàn)的方法是通過(guò)種子。然而，通過(guò) 種子繁殖的再生在作物中因缺乏一致性所引起的雜合性而存在缺陷，因?yàn)榉N子是根據(jù)由 孟德?tīng)柖煽刂频倪z傳變異由植物產(chǎn)生的。每粒種子基本上在遺傳上都不相同，各自將 以其自身的特定性狀生長(zhǎng)。因此，優(yōu)選產(chǎn)生這樣的轉(zhuǎn)化植物，使得再生植物具有與親本 轉(zhuǎn)基因植物相同的性狀和特征。因此，優(yōu)選通過(guò)提供轉(zhuǎn)化植物快速且一致繁殖的微繁殖 (micropropagation)微繁殖是從選定的親本植物或栽培品種中切取一塊組織生長(zhǎng)出新一代植物的過(guò) 程。該過(guò)程允許具有表達(dá)融合蛋白的優(yōu)選組織的植物進(jìn)行大量繁殖。所產(chǎn)生的新一代植物 在遺傳上與原始植物相同，并且具有原始植物的全部特征。微繁殖可供在短時(shí)間內(nèi)大量生 產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的植物材料，并在保存原始轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)化植物的特征方面提供快速倍增的精選 栽培品種?？寺≈参锏膬?yōu)勢(shì)是植物倍增的速度和所產(chǎn)生植物的品質(zhì)和一致性。微繁殖是在各階段之間需要更換培養(yǎng)基或生長(zhǎng)條件的多階段過(guò)程。因此，微繁殖 過(guò)程包括4個(gè)基本階段第一階段，起始組織培養(yǎng)；第二階段，組織培養(yǎng)物倍增；第三階段，分化和植物形成；第四階段，溫室栽培和鍛煉。在第一階段，即起始組織培養(yǎng)，確立組織培養(yǎng) 物并確定不含污染物。在第二階段，使起始組織培養(yǎng)物倍增直到產(chǎn)生足夠數(shù)量的組織樣品 以達(dá)到生產(chǎn)目標(biāo)。在第三階段，使在第二階段生長(zhǎng)的組織樣品分化，并生長(zhǎng)成為獨(dú)立幼苗。 在第四階段，將轉(zhuǎn)化幼苗轉(zhuǎn)移到溫室中進(jìn)行鍛煉，在溫室中逐步提高植物耐光性，使之可在 自然環(huán)境下生長(zhǎng)。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，轉(zhuǎn)基因植物通過(guò)葉細(xì)胞、分生組織細(xì)胞或整株植物 的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生?？梢酝ㄟ^(guò)上述直接DNA轉(zhuǎn)移的任何方法或使用修飾的植物病毒通過(guò)病毒感染進(jìn) 行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。研究表明可用于植物宿主轉(zhuǎn)化的病毒包括CaMV、煙草花葉病毒(TMV)、雀 麥花葉病毒(BMV)和菜豆普通花葉病毒(BV或BCMV)。使用植物病毒的植物轉(zhuǎn)化參 見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第4，855，237號(hào)(菜豆金色花葉病毒；BGV)、EP-A 67，553 (TMV)、日本 公布申請(qǐng)?zhí)?63-14693 (TMV)、EPA 194，809 (BV)、EPA 278,667 (BV)；以 R Gluzman, Y.等，Communications in Molecular Biology :Viral Vectors, Cold SpringHarbor Laboratory, New York，第172-189頁(yè)(1988)。在許多宿主(包括植物)中用于表達(dá)外源 DNA的假病毒顆粒參見(jiàn)WO 87/06261。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的病毒是無(wú)毒力的，因此不能引起嚴(yán) 重癥狀，例如生長(zhǎng)率降低、花葉病、環(huán)斑病、卷葉病、變黃、起條紋、痘形成、瘤形成和銹斑。合 適的無(wú)毒病毒可以是天然存在的無(wú)毒病毒或人工減毒病毒。病毒減毒可通過(guò)用本領(lǐng)域眾所 周知的方法進(jìn)行，包括但不限于亞致死加熱、化學(xué)處理或通過(guò)定向誘變技術(shù)，例如參見(jiàn)諸如 Kurihara 禾口 Watanabe(Molecular Plant Pathology4 :259_269，2003)、Gal—on 等(1992)、 Atreya 等(1992)和 Huet 等(1994)。合適的病毒毒株可從有效來(lái)源獲得，例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type culture Collection, ATCC)或通過(guò)從受感染植物中分離出來(lái)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域眾所 周知的技術(shù)從受感染植物組織中分離病毒，例如參見(jiàn)諸如Foster和Tatlor主編，“Plant Virology Protocols :FromVirus Isolation to Transgenic Resistance(植物病毒 學(xué)方案從病毒分離到轉(zhuǎn)基因抗性)(Methods in Molecular Biology (Humana Pr))”， HumanaPress,19980簡(jiǎn)單地說(shuō)，將據(jù)信含有高濃度的適當(dāng)病毒的受感染植物的組織(優(yōu)選 嫩葉和花瓣)在緩沖溶液(例如磷酸緩沖溶液)中研磨以產(chǎn)生可用于隨后接種的病毒感染 液。用于在植物中導(dǎo)入和表達(dá)非病毒外源多核苷酸序列的植物RNA病毒的構(gòu)建可 參見(jiàn)上述參考文獻(xiàn)以及 Dawson，W. 0.等，Virology (1989) 172 :285_292 ；Takamatsu 等， EMBO J. (1987)6 :307_311 ；French 等，Science (1986) 231 1294-1297 ；Takamatsu 等，F(xiàn)EBS Letters (1990) 269 :73_76 ；以及美國(guó)專(zhuān)利第 5，316，931 號(hào)。當(dāng)病毒是DNA病毒時(shí)，可對(duì)病毒本身進(jìn)行適當(dāng)修飾?；蛘?，可先將病毒克隆至細(xì)菌 質(zhì)粒中以易于構(gòu)建所需要的具有外源DNA的病毒載體。然后可從質(zhì)粒中切取病毒。如果該 病毒是DNA病毒，則可將細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)與此病毒DNA連接，然后通過(guò)細(xì)菌復(fù)制。該DNA的轉(zhuǎn) 錄和翻譯將產(chǎn)生將用來(lái)包裹病毒DNA的外殼蛋白。如果該病毒是RNA病毒，則一般將病毒 作為cDNA克隆，并插入質(zhì)粒。然后使用質(zhì)粒進(jìn)行全部的構(gòu)建。然后通過(guò)質(zhì)粒病毒序列的轉(zhuǎn)
19錄和病毒基因的翻譯以產(chǎn)生包裹病毒RNA的外殼蛋白，來(lái)產(chǎn)生RNA病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供植物病毒多核苷酸，其中從病毒多核苷酸中剔除天然外 殼蛋白編碼序列，通過(guò)重組植物病毒多核苷酸，插入能夠在植物宿主中表達(dá)的非天然植物 病毒外殼蛋白編碼序列和非天然啟動(dòng)子，優(yōu)選非天然外殼蛋白編碼序列的亞基因組啟動(dòng) 子，包裝重組植物病毒多核苷酸，并確保宿主系統(tǒng)性感染。或者，可通過(guò)在外殼蛋白基因中 插入非天然多核苷酸序列使外殼蛋白基因失活，使得產(chǎn)生蛋白質(zhì)。重組植物病毒多核苷酸 可含有一個(gè)或多個(gè)另外的非天然亞基因組啟動(dòng)子。每個(gè)非天然的亞基因組啟動(dòng)子能夠在植 物宿主中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)鄰接基因或多核苷酸序列，并且不能彼此重組以及與天然亞基因組啟 動(dòng)子重組。如果包括不止一個(gè)多核苷酸序列，則可將非天然(外源)多核苷酸序列插入天 然植物病毒亞基因組啟動(dòng)子或天然和非天然植物病毒亞基因組啟動(dòng)子附近。在產(chǎn)生所需產(chǎn) 物的亞基因組啟動(dòng)子的控制下，非天然多核苷酸序列在宿主植物中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。在第二個(gè)實(shí)施方案中，提供與第一個(gè)實(shí)施方案一樣的重組植物病毒多核苷酸，只 是將天然外殼蛋白編碼序列置于非天然外殼蛋白亞基因組啟動(dòng)子之一的鄰接位置而不是 非天然外殼蛋白編碼序列的鄰接位置。在第三個(gè)實(shí)施方案中，提供重組植物病毒多核苷酸，其中天然外殼蛋白基因鄰接 其亞基因組啟動(dòng)子，一個(gè)或多個(gè)非天然亞基因組啟動(dòng)子被插入病毒多核苷酸。插入的非天 然亞基因組啟動(dòng)子能夠在植物宿主中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)鄰接基因，并且不能彼此重組以及與天然 亞基因組啟動(dòng)子重組?？蓪⒎翘烊欢嗪塑账嵝蛄朽徑硬迦敕翘烊粊喕蚪M植物病毒啟動(dòng) 子，使得該序列在產(chǎn)生所需產(chǎn)物的亞基因組啟動(dòng)子控制下在宿主植物中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。在第四個(gè)實(shí)施方案中，提供與第三個(gè)實(shí)施方案一樣的重組植物病毒多核苷酸，只 是天然外殼蛋白編碼序列被非天然外殼蛋白編碼序列置換。病毒載體用由重組植物病毒多核苷酸編碼的外殼蛋白包裹，以產(chǎn)生重組植物病 毒。使用重組植物病毒多核苷酸或重組植物病毒感染合適的宿主植物。重組植物病毒多核 苷酸能夠在宿主中復(fù)制，在宿主中系統(tǒng)性擴(kuò)散，并且在宿主中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)外源基因(外源 多核苷酸)以產(chǎn)生所需要的蛋白質(zhì)。用于將病毒接種到植物中的技術(shù)可參見(jiàn)Foster和Taylor主編，“Plant Virology Protocols :From Virus Isolation to Transgenic Resistance (植物病毒學(xué)方案從 病毒分離到轉(zhuǎn)基因抗性)(Methods in MolecularBiology (Humana Pr)，第 81 卷)，，， Humana Press,1998 ；Maramorosh 禾口 Koprowski 主編，“Methods in Virology",第 7 卷， Academic Press, NewYork 1967-1984 ；Hill, S. A. "Methods in Plant Virology", Blackwell, Oxford,1984；Walkey, D.G. A. "Applied Plant Virology", Wiley, NewYork, 1985 ；以及 Kado 禾口 Agrawa,主編，"Principles and Techniques inPlant Virology", Van Nostrand-ReinhoId, New York。除上述方法外，還可將本發(fā)明的多核苷酸導(dǎo)入葉綠體基因組從而能夠進(jìn)行葉綠體 表達(dá)。用于將外源多核苷酸序列導(dǎo)入葉綠體基因組的技術(shù)是已知的。該技術(shù)包括下列步 驟。首先，用化學(xué)方式處理植物細(xì)胞，以便使每個(gè)細(xì)胞的葉綠體數(shù)目減少至大約一個(gè)。其次， 通過(guò)粒子轟擊將外源多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞，其目的在于將至少一個(gè)外源多核苷酸分子導(dǎo)入葉 綠體中。選擇外源多核苷酸，使之容易通過(guò)葉綠體固有的酶實(shí)現(xiàn)同源重組而整合到葉綠體基因組中。為此，除目標(biāo)基因以外，外源多核苷酸還包括至少一個(gè)從葉綠體基因組得到的多 核苷酸序列段。另外，外源多核苷酸還包括選擇標(biāo)記，這用于順序選擇方法以確保在這類(lèi)選 擇后葉綠體基因組的全部拷貝或基本上全部拷貝都將包括該外源多核苷酸。有關(guān)該技術(shù)的 更多詳情可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第4，945，050和5，693，507號(hào)，所述專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。 因此，多肽可通過(guò)葉綠體的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生，并可整合到葉綠體內(nèi)膜上。由于在植物中非生物脅迫耐受性、水分利用效率、肥料利用效率、生長(zhǎng)、生物量、產(chǎn) 量和/或生長(zhǎng)勢(shì)可涉及多個(gè)起累加作用或起增效作用的基因(參見(jiàn)例如Quesda等，Plant Physiol. 130 :951_063，2002)，因此本發(fā)明還設(shè)想在單一宿主植物中表達(dá)大量外源多核苷 酸從而在非生物脅迫耐受性、水分利用效率、肥料利用效率、生長(zhǎng)、生物量、產(chǎn)量和/或生長(zhǎng) 勢(shì)方面獲得較好作用。在單一宿主植物中表達(dá)大量外源多核苷酸可通過(guò)將多個(gè)核酸構(gòu)建體共導(dǎo)入單個(gè) 植物細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)，每個(gè)構(gòu)建體包括不同的外源多核苷酸。然后可采用在上文中描述的方法， 使轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成為成熟植物?；蛘撸赏ㄟ^(guò)將包括大量不同外源多核苷酸的單個(gè)核酸構(gòu)建體共導(dǎo)入單個(gè)植物細(xì) 胞來(lái)實(shí)現(xiàn)在單一宿主植物中表達(dá)大量的外源多核苷酸。這類(lèi)構(gòu)建體可設(shè)計(jì)成具有單一啟動(dòng) 子序列，所述啟動(dòng)子序列可轉(zhuǎn)錄包括所有不同外源多核苷酸序列在內(nèi)的多順?lè)醋有攀筊NA。 為了使由多順?lè)醋有攀筊NA編碼的不同多肽能夠共翻譯，可將多核苷酸序列通過(guò)促進(jìn)位于 IRES序列下游的多核苷酸序列翻譯的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)序列相互連接。在這種 情況下，經(jīng)轉(zhuǎn)錄的編碼上述不同多肽的多順?lè)醋覴NA分子將從兩個(gè)封端的5'末端和多順 反子RNA分子的兩個(gè)內(nèi)部IRES序列起開(kāi)始翻譯，因此在細(xì)胞中產(chǎn)生所有不同的多肽?；蛘?， 構(gòu)建體可包括各與不同外源多核苷酸序列連接的若干啟動(dòng)子序列?？刹捎迷谏衔闹忻枋龅姆椒?，使包括大量不同外源多核苷酸的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物 細(xì)胞再生成為成熟植物。或者，可以通過(guò)將不同核酸構(gòu)建體(包括不同的外源多核苷酸)導(dǎo)入大量植物來(lái) 實(shí)現(xiàn)在單一宿主植物中表達(dá)大量的外源多核苷酸。然后，可以采用常規(guī)植物育種技術(shù)，使再 生的轉(zhuǎn)化植物進(jìn)行雜交，從所得到的子代中選出較好的非生物脅迫耐受性、水分利用效率、 肥料利用效率、生長(zhǎng)、生物量、產(chǎn)量和/或生長(zhǎng)勢(shì)性狀。因此，本發(fā)明包括外源性表達(dá)(如上所述)本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽的植物。 多肽在植物細(xì)胞或整株植物中一經(jīng)表達(dá)，便可通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的方法測(cè)定由外源多核 苷酸編碼的多肽水平，例如活性測(cè)定法，使用能夠特異性結(jié)合多肽的抗體進(jìn)行的蛋白質(zhì)印 跡法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、放射免疫測(cè)定法(RIA)、免疫組織化學(xué)法、免疫細(xì)胞化 學(xué)法、免疫熒光法等。植物中自外源多核苷酸轉(zhuǎn)錄的RNA水平的測(cè)定方法是本領(lǐng)域眾所周知的，包括例 如RNA印跡分析、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析(包括定量、半定量或?qū)崟r(shí)RT-PCR) 和RNA原位雜交。如上所述，本發(fā)明一些實(shí)施方案的多肽起水分通道的作用。因此，本發(fā)明的一些實(shí) 施方案包括該多肽的功能等同物(例如能夠具有水分通道的生物活性的多肽)，這可通過(guò) 使用例如細(xì)胞膨脹實(shí)驗(yàn)(cell-swelling assay)的功能測(cè)定法(例如能夠在植物中運(yùn)送水 分)來(lái)測(cè)定(Meng, Q. X.等，2008. Cell Physiol Biochem，21.第 123-128 頁(yè))。
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在上文中描述的多核苷酸和多肽可以安全和成本效益的方式用于多種經(jīng)濟(jì)植物 中。轉(zhuǎn)基因(編碼所述多肽的外源多核苷酸)對(duì)非生物脅迫耐受性、水分利用效率、肥 料利用效率、生長(zhǎng)、生物量、產(chǎn)量和/或生長(zhǎng)勢(shì)的作用可使用已知方法測(cè)定。非生物脅迫耐受性一使轉(zhuǎn)化(即表達(dá)轉(zhuǎn)基因)和非轉(zhuǎn)化(野生型)的植物暴露 于非生物脅迫條件下，例如脫水、亞適溫(低溫、高溫)、養(yǎng)分缺乏、養(yǎng)分過(guò)量、鹽脅迫條件、 滲透脅迫、重金屬毒性、無(wú)氧生活、大氣污染和紫外幅射。耐鹽性測(cè)定一預(yù)期具有高鹽濃度耐受性的轉(zhuǎn)基因植物在高鹽情況下顯示更好的 萌發(fā)、幼苗活力或生長(zhǎng)?？梢远喾N方式實(shí)現(xiàn)鹽脅迫，例如通過(guò)用高滲溶液澆灌植物，通過(guò)在 高滲生長(zhǎng)溶液(例如Hoagland溶液)中對(duì)植物進(jìn)行溶液培養(yǎng)，或通過(guò)在高滲生長(zhǎng)培養(yǎng)基 [例如50%Murashige-SkOOg培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基)]中培育植物。因?yàn)椴煌闹参镌谄淠望} 性方面極為不同，可根據(jù)具體植物栽培品種或變種的具體特征，調(diào)節(jié)澆灌水、生長(zhǎng)溶液或生 長(zhǎng)培養(yǎng)基中的鹽濃度，以便使植物的生理和/或形態(tài)受到輕微或中等的作用(有關(guān)合適濃 度的指引參見(jiàn) Bernstein 和 Kafkafi，Root Growth Under Salinity Stress(鹽分脅迫下 的根部生長(zhǎng))，載于Plant Roots, The Hidden Half 第 3 版，Waisel Y，EshelA 和 Kafkafi U.(主編)Marcel Dekker Inc.，New York, 2002 及其中的參考文獻(xiàn))。例如，通過(guò)在不同的發(fā)育階段，用濃度遞增的氯化鈉(例如50mM、100mM、200mM、 400mM NaCl)澆灌植物，從底部及從上部澆灌以確保鹽的均勻分布，來(lái)進(jìn)行耐鹽性試驗(yàn)。在 暴露在脅迫條件下之后，不時(shí)監(jiān)測(cè)植物直到在野生型植物中出現(xiàn)可觀的生理作用和/或形 態(tài)作用。因此，在對(duì)照植物和轉(zhuǎn)基因植物之間，對(duì)外部表型外觀、萎蔫程度及成功達(dá)到成熟 期的總數(shù)和子代產(chǎn)量進(jìn)行比較。所測(cè)量的耐受性的定量參數(shù)包括但不限于平均濕重和干 重、所產(chǎn)生種子的重量、平均種子大小和每株植物所產(chǎn)生的種子數(shù)量。未顯示實(shí)質(zhì)生理作用 和/或形態(tài)作用，或者顯示生物量比野生型植物的高的轉(zhuǎn)化植物被鑒定為非生物脅迫耐受 性植物。滲透壓耐受性試驗(yàn)一進(jìn)行滲透脅迫實(shí)驗(yàn)(包括氯化鈉和甘露醇實(shí)驗(yàn))以確定滲 透脅迫表型是否是氯化鈉特異性的或者是否是一般滲透脅迫相關(guān)性表型。耐受滲透脅迫的 植物可能對(duì)干旱和/或冷凍具有更大的耐受性。對(duì)于鹽和滲透脅迫萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基用例 如50mM、100mM、200mM NaCl或100mM、200mM NaCl、400mM甘露醇補(bǔ)充。另參見(jiàn)隨后實(shí)施例 部分的實(shí)施例5。干旱耐受性實(shí)驗(yàn)/滲壓劑實(shí)驗(yàn)一進(jìn)行耐旱性實(shí)驗(yàn)以鑒定在嚴(yán)重脫水后使植物較 好地存活的基因。為了分析轉(zhuǎn)基因植物是否較耐受干旱，在培養(yǎng)基中進(jìn)行了通過(guò)非離子滲 壓劑山梨醇產(chǎn)生的滲透脅迫。使對(duì)照植物和轉(zhuǎn)基因植物萌發(fā)，并在植物瓊脂平板上生長(zhǎng)4 天，之后將其轉(zhuǎn)移到含有500mM山梨醇的平板中。該處理引起生長(zhǎng)遲緩，然后，通過(guò)測(cè)量植 物重量(濕重和干重)、產(chǎn)量，并通過(guò)按開(kāi)花時(shí)間測(cè)量的生長(zhǎng)率，對(duì)對(duì)照植物和轉(zhuǎn)基因植物 兩者進(jìn)行了比較。相反地，基于土壤的干旱篩選用過(guò)量表達(dá)上文中詳述的多核苷酸的植物進(jìn)行。使 對(duì)照擬南芥植物的種子或過(guò)量表達(dá)本發(fā)明多肽的其它轉(zhuǎn)基因植物萌發(fā)，并移栽到盆中。在 澆灌停止并同時(shí)將盆放在吸水紙上以提高土壤干燥率來(lái)達(dá)到干旱脅迫。當(dāng)大部分對(duì)照植物 出現(xiàn)嚴(yán)重萎蔫時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)基因植物和對(duì)照植物彼此間進(jìn)行了比較。在獲得相當(dāng)一部分顯示嚴(yán)
22重萎蔫的對(duì)照植物后，給植物再次澆水。按下列兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中每一個(gè)，將植物與對(duì)照進(jìn)行比較 分級(jí)干旱條件的耐受性和再澆水后的復(fù)原狀況(存活)。冷脅迫耐受性一為了分析冷脅迫，將成熟(25天齡)植物轉(zhuǎn)移到4°C、必要光照 (constitutive light)的室內(nèi)達(dá)1周或2周。之后，將植物移回到溫室。2周后，通過(guò)測(cè)量 植物重量(濕重和干重)，并通過(guò)比較以開(kāi)花時(shí)間、植物大小、產(chǎn)量等測(cè)量的生長(zhǎng)率，在對(duì)照 植物和轉(zhuǎn)基因植物之間對(duì)導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩和其它表型的低溫期冷害進(jìn)行比較。熱脅迫耐受性一通過(guò)將植物暴露于34°C以上溫度達(dá)一定時(shí)期，達(dá)到熱脅迫耐受 性。在將植物轉(zhuǎn)移回到22°C以復(fù)原后，對(duì)植物耐受性進(jìn)行分析，5天后，相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照(非 轉(zhuǎn)基因植物)或既未暴露于冷脅迫也未暴露于熱脅迫的植物進(jìn)行評(píng)價(jià)。萌發(fā)試驗(yàn)一萌發(fā)試驗(yàn)對(duì)可完成萌發(fā)過(guò)程的轉(zhuǎn)基因植物種子的百分比與以相同方 式處理的對(duì)照植物種子的百分比進(jìn)行比較。例如在每日22小時(shí)光照2小時(shí)避光周期下于 22°C培育被視為正常條件。在種植后4天和14天之間，對(duì)萌發(fā)和幼苗活力進(jìn)行評(píng)價(jià)。基礎(chǔ) 培養(yǎng)基為 50% MS 培養(yǎng)基(Murashige 和 Skoog，1962，Plant Physiology 15，473-497)。同樣在不利條件下，例如冷(在10°C以下的溫度而不是22°C下培育)或含有高濃 度滲壓劑例如山梨醇(以50mM、100mM、200mM、300mM、500mM和高達(dá)IOOOmM的濃度)的種子 抑制溶液或施加濃度遞增的鹽(50mM、100mM、200mM、300mM、500mM NaCl)，檢查萌發(fā)。水分利用效率一可以每單位蒸騰所產(chǎn)生的生物量來(lái)確定。為了分析WUE，可在對(duì) 照植物和轉(zhuǎn)基因植物中測(cè)量葉片相對(duì)含水量。及時(shí)記錄鮮重(FW)；然后，在室溫避光下，將 葉片在浸泡在蒸餾水中8小時(shí)，記錄吸脹重量(TW)。在60°C下將葉片干燥至恒重后，記錄 總干重(DW)。按照下列方程式I計(jì)算相對(duì)含水量(RWC)方程式I(Fff-DW/TW-DW) χ 100肥料利用效率一為了分析轉(zhuǎn)基因植物是否對(duì)肥料的反應(yīng)更靈敏，使植物在具有 有限量的肥料的瓊脂平板或盆中生長(zhǎng)，參見(jiàn)例如下文中的實(shí)施例6和Yanagisawa等(Proc Natl Acad Sci U S Α. 2004 ； 101 :7833_8)。對(duì)植物的整體大小、開(kāi)花時(shí)間、產(chǎn)量、芽和/或 谷物的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行分析。檢查的參數(shù)為成熟植物的整體大小、其濕重和干重、所產(chǎn)生的 種子的重量、平均種子大小及每株植物所產(chǎn)生的種子的數(shù)目?？梢詼y(cè)定的其它參數(shù)為葉片 的葉綠素含量(因?yàn)橹参锏貭顩r與葉片青綠程度高度相關(guān))、種子或其它植物組成部分 (例如葉或苗)的氨基酸含量和總蛋白含量、油含量等。同樣，可以遞增的濃度加入磷酸鹽 或鉀而不是提供有限量的氮。此外，測(cè)量了與上列參數(shù)一樣的參數(shù)。同樣，對(duì)氮素利用效率 (NUE)、磷酸鹽利用效率(PUE)和鉀利用效率(KUE)進(jìn)行評(píng)價(jià)，檢查轉(zhuǎn)基因植物在氮素抑制 條件下健壯生長(zhǎng)的能力。氮素測(cè)定一測(cè)定植物的結(jié)構(gòu)部分中的N(氮)濃度的方法包括將器官N轉(zhuǎn)化成 NO3-的過(guò)硫酸鉀消化方法(Purcell和King 1996 Argon. J. 88 :111_113)；改進(jìn)的CcT介導(dǎo) NOf 還原成 NOf (Vodovotz 1996Biotechniques 20:390-394)以及通過(guò) Griess 試驗(yàn)測(cè)定亞 硝酸鹽(Vodovotz 1996，同上)。針對(duì)NaNO2的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，在550nm下測(cè)定吸光度值。該方 法的詳情參見(jiàn) Samonte 等，2006 Agron. J. 98 168-176。谷物蛋白質(zhì)濃度一谷物蛋白質(zhì)含量(谷物蛋白質(zhì)g/m2)用谷物的N質(zhì)量(谷物N g/m2)乘以N/蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換率k-5. 13的乘積來(lái)估算(MoSSel990，同上)。谷物蛋白質(zhì)濃度用每單位谷物質(zhì)量的谷物蛋白質(zhì)含量(谷物蛋白質(zhì)g/kg谷物)來(lái)估算。含油量一可通過(guò)從種子或植物的營(yíng)養(yǎng)部分中提取油來(lái)測(cè)定植物的含油 量。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在特定的溶劑(例如己烷或石油醚)存在下，可通過(guò)研磨植物組織，并 且在連續(xù)提取器中抽提油，從而從植物(例如種子)中提取脂質(zhì)(油)。間接含油量 分析可采用各種已知方法進(jìn)行，例如測(cè)量液體狀態(tài)的樣品中由氫原子吸收的共振能的 核磁共振(NMR)光譜法[參見(jiàn)例如 Conway TF.和 Earle FR.，1963，Journal of the AmericanOil Chemists ' Society ；Springer Berlin/Heidelberg, ISSN :0003_021X(印 刷)1558-9331 (在線(xiàn))]；利用樣品吸收近紅外能(1100-2500nm)的近紅外(Ni)光譜法；以 及W0/2001/023884中所描述的方法，該方法以在溶劑中提取油為基礎(chǔ)，在氣體流中蒸發(fā)溶 劑形成油顆粒，并把光照向氣體流和油粒子，這就形成了可檢測(cè)的反射光。植物生長(zhǎng)勢(shì)可通過(guò)每段時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)參數(shù)的增加來(lái)計(jì)算，生長(zhǎng)參數(shù)例如葉面積、纖 維長(zhǎng)度、蓮座(rosette)直徑、植物鮮重等?？梢詰?yīng)用生長(zhǎng)植物的數(shù)字分析來(lái)測(cè)定生長(zhǎng)率。例如，可以每3天拍攝溫室中在 試驗(yàn)區(qū)(plot)基礎(chǔ)上生長(zhǎng)的植物的照片，通過(guò)數(shù)字分析計(jì)算蓮座面積。蓮座面積生長(zhǎng) (growth)用取樣天數(shù)之間蓮座面積的差異除以樣品間天數(shù)的差異來(lái)計(jì)算?？赏ㄟ^(guò)同時(shí)從8-16株植物上采集總的種子，使用分析天平稱(chēng)量，將總重量除以植 物總數(shù)，來(lái)進(jìn)行種子產(chǎn)量的測(cè)量。每生長(zhǎng)面積的種子可以同樣方式同時(shí)考慮給定某一單種 植物的生長(zhǎng)面積來(lái)計(jì)算。增加每生長(zhǎng)面積的種子產(chǎn)量可通過(guò)增加每株植物的種子產(chǎn)量，和 /或通過(guò)增加在指定面積上生長(zhǎng)的植物數(shù)量來(lái)實(shí)現(xiàn)?？蓪⑼ㄟ^(guò)測(cè)量從8-16株植物產(chǎn)生和收獲的干種子的量(重量或大小)或數(shù)量(即 數(shù)目)除以植物數(shù)，來(lái)估算每株植物的種子產(chǎn)量。可通過(guò)測(cè)量每段時(shí)間所產(chǎn)生的植物生物量、蓮座面積、葉大小或根長(zhǎng)來(lái)估算生長(zhǎng) 率(可按葉面積cm2/天進(jìn)行測(cè)量)。纖維長(zhǎng)度可以使用纖維照影機(jī)測(cè)量。使用纖維照影機(jī)系統(tǒng)計(jì)算長(zhǎng)度，用“上半 部平均長(zhǎng)度”表示。上半部平均長(zhǎng)度(UHM)是纖維分布中較長(zhǎng)一半的平均長(zhǎng)度。纖維照 影機(jī)測(cè)量規(guī)定百分點(diǎn)的跨度距離內(nèi)的長(zhǎng)度(超文本傳輸協(xié)議/VVww. cottoninc. com/ ClassificationofCotton/ ？ Pg = 4#Length)。因此，本發(fā)明具有較高農(nóng)業(yè)價(jià)值，用于促進(jìn)所需經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量(例如營(yíng)養(yǎng)器官 (例如楊樹(shù)木材)的生物量，或繁殖器官的生物量(例如種子數(shù)或種子生物量))。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“約”是指士 10%。術(shù)語(yǔ)“包含”、“含有”、“包括”、“包括”、“具有”及其變化形式是指“包括但不限于”。術(shù)語(yǔ)“由......組成”是指“包括并限于”。術(shù)語(yǔ)“基本由......組成”是指組合物、方法或結(jié)構(gòu)可包括額外的成分、步驟和/
或組成部分，但只有當(dāng)額外成分、步驟和/或組成部分不實(shí)質(zhì)性地改變要求保護(hù)的組合物、 方法或結(jié)構(gòu)的基本和新的特征才可以。本文所使用的未給定數(shù)量詞的單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)形式，除非文中另有明確說(shuō)明。 例如，術(shù)語(yǔ)“化合物”或“至少一種化合物”可包括大量化合物，包括其混合物。在整個(gè)申請(qǐng)書(shū)中，本發(fā)明的各種實(shí)施方案以范圍格式提供。應(yīng)當(dāng)了解的是，范圍 格式中的描述僅僅是出于方便和簡(jiǎn)明，不應(yīng)解釋為是對(duì)本發(fā)明范圍的不可變更的限制。因此，范圍的描述應(yīng)視為特別公開(kāi)的所有可能的子范圍以及在該范圍內(nèi)的各個(gè)數(shù)值。例如諸 如1-6范圍的描述應(yīng)視為特別公開(kāi)的例如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等的子范圍，以及該 范圍內(nèi)的每個(gè)數(shù)，例如1、2、3、4、5和6。這不論范圍寬度如何都適用。每當(dāng)本文表明數(shù)字范圍時(shí)，是指包括所引用的指定范圍內(nèi)的任何數(shù)字(分?jǐn)?shù)或整 數(shù))。術(shù)語(yǔ)“介于”第一規(guī)定數(shù)字和第二規(guī)定數(shù)字“之間”，以及“自，，第一規(guī)定數(shù)字“至”第 二規(guī)定數(shù)字的“范圍”在本文可互換使用，是指包括第一規(guī)定數(shù)字和第二規(guī)定數(shù)字以及它們 之間的所有分?jǐn)?shù)和整數(shù)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“方法”是指用于完成指定任務(wù)的方式、手段、技術(shù)和方法步驟， 包括但不限于化學(xué)、藥理學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)從業(yè)人員已知的或者易由所述從業(yè)人 員從已知方式、手段、技術(shù)和方法步驟開(kāi)發(fā)的方式、手段、技術(shù)和方法步驟。要了解的是，為了清楚起見(jiàn)在單獨(dú)的實(shí)施方案內(nèi)容中描述的本發(fā)明的某些特征， 也可結(jié)合起來(lái)在一個(gè)實(shí)施方案中提供。相反地，為了簡(jiǎn)明起見(jiàn)在一個(gè)實(shí)施方案中內(nèi)容中描 述的本發(fā)明的各種特征，也可以單獨(dú)提供或以任何合適的再組合或以適于任何其它描述的 本發(fā)明實(shí)施方案提供。各種實(shí)施方案內(nèi)容中描述的某些特征不得視為是所述實(shí)施方案不可 缺少的特征，除非無(wú)這些要素實(shí)施方案無(wú)法實(shí)施。上文中描述的本發(fā)明的各種實(shí)施方案和方面，以及所附權(quán)利要求書(shū)部分所要求保 護(hù)的內(nèi)容的實(shí)驗(yàn)支持參見(jiàn)在下面的實(shí)施例。
實(shí)施例下面列出下列實(shí)施例的參考文獻(xiàn)，所述參考文獻(xiàn)與上文中的說(shuō)明書(shū)一起以非限制 性方式對(duì)本發(fā)明的一些實(shí)施方案予以說(shuō)明。一般而言，本文所使用的術(shù)語(yǔ)和用于本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)室方法包括分子、生物化學(xué)、 微生物和重組DNA技術(shù)。文獻(xiàn)中對(duì)這類(lèi)技術(shù)進(jìn)行了全面的講解。參見(jiàn)例如“Molecular Cloning :A laboratory Manual"Sambrook^, (1989) ；"Current Protocols in Molecular Biology”，第 I-III 卷，Ausubel, R. Μ·，主編(1994) ；Ausubel 等，“Current Protocols inMolecular Biology，，，John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989) ；Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning，，，John Wiley & Sons, New York(1988) ；Watson 等,“Recombinant DNA，，，Scientific AmericanBooks, New York ;Birren 等(主編)“Genome Analysis :A LaboratoryManual Series，，，第 1-4 卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork(1998)；美國(guó)專(zhuān)利第 4，666，828、4，683，202、4，801，531、5， 192，659 和 5，272，057 號(hào)中所述方法；“Cell Biology :A Laboratory Handbook”，第 I-III 卷，Cellis， J. E.主編(1994) ；"Current Protocols in Immunology” 第 I-III 卷，Coligan J. E.主 編(1994) ；Stites 等(主編)，“Basic and Clinicallmmunology”(第 8 版)，Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) ；Mishell 和 Shiigi (主編)，“Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co. , New York(1980)；專(zhuān)利和科技文獻(xiàn)中大量記載的可 應(yīng)用的免疫測(cè)定法，參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利第3，791，932,3, 839，153,3, 850，752,3, 850，578、 3，853，987,3，867，517,3，879，262,3，901，654,3，935，074,3，984，533,3，996，345, 4，034，074、4，098，876、4，879，219、5，011，771 和 5，281，521 號(hào)；“Oligonucleotide Synthesis"Gait, Μ. J.主編(1984) ；"Nucleic Acid Hybridization”Hames，B. D.和Higgins S. J.主 編(1985) ；"Transcription and Translation，，Hames, B. D.禾口 Higgins S. J.主編(1984) ;‘‘Animal Cell Culture"Freshney, R. I.主編(1986); ‘‘ ImmobilizedCells and Enzymes，，IRL Press, (1986) ； "A Practical Guide to MolecularCloning"Perbal, B. , (1984)和"Methods in Enzymology"第 1-317 卷， Academic Press ；"PCR Protocols :A Guide To Methods AndApplications，，，Academic Press, San Diego, CA(1990) ；Marshak "Strategies for Protein Purification and Characterization-Α LaboratoryCourse Manual，，CSHL Press (1996)，所有文獻(xiàn)都通過(guò)引用 予以結(jié)合就如全部列舉在本文中一樣。其它一般參考文獻(xiàn)貫穿在本文中提供。其中的方法 步驟被視為是本領(lǐng)域眾所周知的，為了方便讀者而提供。其中所包含的全部信息通過(guò)引用 結(jié)合到本文中。實(shí)施例1應(yīng)用數(shù)字表達(dá)分析和跨種比較基因組鑒定AQP基因植物中存在大量的AQP，而且當(dāng)AQP在植物中過(guò)量表達(dá)時(shí)所得到的相抵觸的結(jié)果 表明，需要選擇性地鑒定可以改進(jìn)植物的水分利用效率(WUE)、在非生物脅迫下以及在不利 條件下導(dǎo)致產(chǎn)量和生物量提高的AQP基因。在不利的脅迫條件下，植物的一些生物活性終止或降低，而其它不是初期活性的 生長(zhǎng)活性則啟動(dòng)。盡管如此，仍然維持對(duì)植物存活必不可少的一些活性。一種假設(shè)是，對(duì)于 植物在不利條件下維持生命活性的所需要的關(guān)鍵基因應(yīng)當(dāng)在大范圍的生物脅迫和非生物 脅迫下具有活性。為了檢驗(yàn)這個(gè)假設(shè)并且鑒定出具有在不同的生物脅迫和/或非生物脅迫條件(例 如鹽或干旱脅迫)下改進(jìn)植物性能潛力的關(guān)鍵AQP基因，綜合進(jìn)行了數(shù)字表達(dá)分析(亦稱(chēng) 電子RNA印跡法)和跨種比較基因組學(xué)分析。所利用的數(shù)據(jù)庫(kù)可獲自NCBI (超文本傳輸協(xié) 議://www. ncbi.nlm.nih. gov/dbEST/)，并包括了源自15種不同品種的1，195個(gè)相關(guān)EST 文庫(kù)的7. 2x IO6個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，同時(shí)包括單子葉植物和雙子葉植物品種，即擬南 芥、大麥、蕪菁(Brassica rapa)、棉花、葡萄、玉米、苜蓿、楊樹(shù)、馬鈴薯、水稻、苜蓿、大豆、甘 蔗、番茄和小麥。根據(jù)可用于數(shù)據(jù)挖掘的得自若干番茄品種的高品質(zhì)番茄數(shù)據(jù)庫(kù)以及本發(fā)明的發(fā) 明人在使用番茄基因組作為模式植物中的經(jīng)驗(yàn)，選擇番茄植物作為模式植物。另外，各種番 茄品種具有相對(duì)高的耐鹽性，使得番茄基因組成為用于鑒定新的脅迫耐受性機(jī)制的優(yōu)良的 候選植物。而且，番茄不僅僅用作遺傳學(xué)研究的模式植物，而且它還用作具有界限清晰的產(chǎn) 量參數(shù)的重要作物，所述參數(shù)可用來(lái)區(qū)分影響非生物脅迫耐受性的基因和防止在非生物脅 迫條件下產(chǎn)量受損失的基因。基因分析和數(shù)據(jù)挖掘一對(duì)于基因分析和數(shù)據(jù)挖掘，所使用的生物信息過(guò)濾方法 具有三個(gè)階段1.聚簇和裝配從 GenBank 157、160、161、162、164、165、166 版中提取 15 個(gè)品種 每一種的EST和mRNA序列，采用CompugenLEADS聚簇和裝配平臺(tái)(Compugen ’ s LEADS clustering and assemblyplatform, Compugen Ltd. , Tel Aviv, Israel ；Yelin 等 2003, NatureBiotechnology 21，379-85)進(jìn)行聚簇和裝配。自動(dòng)摘錄的EST文庫(kù)注釋用手工 校正并根據(jù)解剖學(xué)、發(fā)育階段、非生物/生物脅迫處理和栽培品種進(jìn)行分類(lèi)。將結(jié)果錄入Oracle數(shù)據(jù)庫(kù)。然后預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)使用InterPro (2)(超文本傳輸協(xié)議/VVww. ebi. ac. uk/ interpro/)注釋。2.聚簇的選擇一選擇包含主要內(nèi)在蛋白結(jié)構(gòu)域(IPR000425)的全部聚簇用于進(jìn) 一步分析(η = 1，114)。3.獲取聚簇表達(dá)譜一通過(guò)數(shù)字表達(dá)方法，根據(jù)植物解剖學(xué)(即基因在哪些組織/ 器官中表達(dá))、發(fā)育階段(即在哪個(gè)發(fā)育階段可存在某一基因)和處理特征(提供在哪種生 理?xiàng)l件下(例如干旱、冷、病菌感染等)基因進(jìn)行表達(dá))，獲得全部聚簇的表達(dá)譜。數(shù)字表達(dá)計(jì)算法如下計(jì)算以m/(n*M/N)計(jì)算過(guò)量表達(dá)倍數(shù)，其中“N”是具體生物 的EST總數(shù)；“M”是給定文庫(kù)/組織/種類(lèi)的EST數(shù)；“η”是給定重疊群的EST總數(shù)；“m” 是重疊群中文庫(kù)/組織/種類(lèi)的EST數(shù)；P值應(yīng)用Fisher精確檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量計(jì)算。在根部和 非生物脅迫條件下過(guò)量表達(dá)的綜合P值用l-(l-pl)X(l-p2)計(jì)算。在種間轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定 出1，114個(gè)不同的AQP基因。對(duì)于數(shù)據(jù)挖掘方法，本發(fā)明的發(fā)明人結(jié)合使用兩種方法根 部與苗相比，或者在各種非生物脅迫(包括干旱、冷、鹽分、熱、化學(xué)處理等)下與非脅迫對(duì) 照相比，精選AQP聚簇顯示顯著過(guò)量表達(dá)(EST分布是正常的兩倍以上；過(guò)量表達(dá)的統(tǒng)計(jì)顯 著一性P值< 0. 05)。研究發(fā)現(xiàn)，約9%的AQP基因的EST顯著過(guò)量存在于根中，在不同非 生物脅迫下誘導(dǎo)其中的3. 5%。選出高過(guò)量存在于根部的AQP基因，因?yàn)轭A(yù)期具有有效根系 的植物能從干燥土壤中奪取更多水分。另外，鑒于AQP基因可提供對(duì)各種脅迫的高耐受性， 因此選擇過(guò)量存在于各種非生物脅迫(例如養(yǎng)分缺乏、熱、鹽分和重金屬脅迫)及生物脅迫 (例如施用激位素(elicitor)和病原體)中的AQP基因。按照文獻(xiàn)中已知的可接受的組別，對(duì)同一組的1，114個(gè)AQP進(jìn)行了分類(lèi)第一次分 成4個(gè)主要亞組PIP、TIP、NIP和SIP，第二次分類(lèi)按照其在氨基酸序列中的同源性，將這4 個(gè)亞組分成11個(gè)亞組。然后，利用Fisher精確檢驗(yàn)鑒定在根部和當(dāng)暴露在不同非生物脅 迫下過(guò)量存在的大量EST的亞組。如下文中的表1所示，11個(gè)亞組中，僅TIP2亞組顯示在 根部和當(dāng)暴露于非生物脅迫時(shí)過(guò)量存在大量的EST (P值分別1. 7X10_5和1. 6X10_3)。表 1在根部以及在非生物脅迫時(shí)AQP類(lèi)型分布和過(guò)量表達(dá)
2權(quán)利要求
一種提高植物的非生物脅迫耐受性的方法，所述方法包括在植物中表達(dá)編碼包含與選自以下的氨基酸序列有至少80％同源性的氨基酸序列的多肽的外源多核苷酸SEQ ID NO33、34、30、27 29、31、32、35 52、1401 1403、1405 1435、1437 1494、1496 1542、1544 1553、1555 1559、1561 1827、1829 1866、1868 2450、2453 2458、2460 2463、2465 2481、2483、2485 2746、2765 2769、3052 3065和3067 3259，從而提高植物的非生物脅迫耐受性。
2.一種提高植物的水分利用效率(WUE)、肥料利用效率(FUE)、生物量、生長(zhǎng)勢(shì)和/ 或產(chǎn)量的方法，所述方法包括在植物中表達(dá)編碼包含與選自以下的氨基酸序列有至少 80%同源性的氨基酸序列的多肽的外源多核苷酸:SEQ ID N0:33、34、30、27-29、31、32、 35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、 1829-1866,1868-2450,2453-2458,2460-2463,2465-2481,2483,2485-2746,2765-2769, 3052-3065和3067-3259，從而提高植物的水分利用效率(WUE)、肥料利用效率(FUE)、生物 量、生長(zhǎng)勢(shì)和/或產(chǎn)量。
3.一種分離多核苷酸，所述多核苷酸包含與選自以下的核酸序列有至少80%同 一性的核酸序列:SEQ ID NO :7、8、4、1-3、5、6、9-26、53-55、57-87、89-147、149-195、 197-206、208-212、214-480、482-519、521-1103、1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、 1138-1400、2748-2764、2843-2857 和 2859-3051。
4.一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含權(quán)利要求3的分離多核苷酸和用于指導(dǎo)所述 核酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
5.一種分離多肽，所述多肽包含與選自以下的氨基酸序列有至少80%同源性的氨基 酸序列SEQ ID NO :33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、 1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、 2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065 和 3067-3259。
6.一種植物細(xì)胞，所述細(xì)胞包含具有與選自以下的氨基酸序列有至少80%同源 性的氨基酸序列的外源多肽:SEQ ID NO :33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、 1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、 1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065 和 3067-3259。
7.一種植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞包含含有與選自以下的核酸序列有至少80%同 源性的核酸序列的外源多核苷酸SEQ ID NO :7、8、4、1-3、5、6、9-26、53-55、57-87、 89-147、149-195、197-206、208-212、214-480、482-519、521-1103、1106-1111、1113-1116、 1118-1134,1136,1138-1400,2748-2764,2843-2857 和 2859-3051。
8.權(quán)利要求1或2的方法、權(quán)利要求3的分離多核苷酸、權(quán)利要求4的核酸構(gòu)建體或 權(quán)利要求7的植物細(xì)胞，其中所述多核苷酸選自SEQ ID NO :7、8、4、1-3、5、6、9-26、53-55、 57-87、89-147、149-195、197-206、208-212、214-480、482-519、52卜1103、1106-1111、 1113-1116、1118-1134、1136、1138-1400、2748-2764、2843-2857 和 2859-3051。
9.權(quán)利要求1或2的方法、權(quán)利要求5的分離多肽或權(quán)利要求6的植物細(xì)胞，其中 所述氨基酸序列選自 SEQ ID NO :33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、 1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065 和 3067-3259。
10.權(quán)利要求1或2的方法、權(quán)利要求5的分離多肽或權(quán)利要求6的植物細(xì)胞，其中所 述多月太選自 SEQ ID NO :33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、 1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、 2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065 和 3067-3259。
11.一種提高植物的非生物脅迫耐受性的方法，所述方法包括在植物中表達(dá)編碼 包含由 SEQ ID NO :33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、 1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、 2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065、3067-3258 或 3259 所示的 氨基酸序列的多肽的外源多核苷酸，從而提高植物的非生物脅迫耐受性。
12.一種提高植物的水分利用效率(WUE)、肥料利用效率(FUE)、生物量、生長(zhǎng)勢(shì)和/或 產(chǎn)量的方法，所述方法包括在植物中表達(dá)編碼包含由SEQ ID NO :33、34、30、27-29、31、32、 35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、 1829-1866,1868-2450,2453-2458,2460-2463,2465-2481,2483,2485-2746,2765-2769, 3052-3065、3067-3258或3259所示的氨基酸序列的多肽的外源多核苷酸，從而提高植物的 水分利用效率(WUE)、肥料利用效率(FUE)、生物量、生長(zhǎng)勢(shì)和/或產(chǎn)量。
13.一種分離多核苷酸，所述多核苷酸包含由SEQ ID NO :7、8、4、1-3、5、6、9-26、53-55、 57-87、89-147、149-195、197-206、208-212、214-480、482-519、521-1103、1106-1111、 1113-1116,1118-1134,1136,1138-1400,2748-2764,2843-2857,2859-3050 或 3051 所示的 核酸序列。
14.一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含權(quán)利要求13的分離多核苷酸和用于指導(dǎo)所 述核酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
15.一種分離多肽，所述多肽包含由 SEQ ID NO :33、34、30、27-29、31、32、35-52、 1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、 1829-1866,1868-2450,2453-2458,2460-2463,2465-2481,2483,2485-2746,2765-2769, 3052-3065,3067-3258或3259所示的氨基酸序列。
16.一種植物細(xì)胞，所述細(xì)胞包含具有由SEQ ID NO :33、34、30、27-29、31、32、 35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、 1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、 3052-3065,3067-3258或3259所示的氨基酸序列的外源多肽。
17.一種植物細(xì)胞，所述細(xì)胞包含含有由SEQ ID NO :7、8、4、1-3、5、6、9-26、53-55、 57-87,89-147,149-195,197-206,208-212,214-480,482-519,521-1103,1106-1111, 1113-1116,1118-1134,1136,1138-1400,2748-2764,2843-2857,2859-3050 或 3051 所示核 酸序列的外源多核苷酸。
18.權(quán)利要求1或11的方法，其中所述非生物脅迫選自鹽分、脫水、低溫、高溫、重金屬 毒性、無(wú)氧生活、養(yǎng)分缺乏、養(yǎng)分過(guò)量、大氣污染和紫外幅射。
19.權(quán)利要求1或11的方法，所述方法還包括使表達(dá)所述外源多核苷酸的植物在非生 物脅迫下生長(zhǎng)。
20.權(quán)利要求4或14的核酸構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。
21.權(quán)利要求6、7、16或17的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞形成植物的組成部分。
全文摘要
本發(fā)明提供多核苷酸、多肽、表達(dá)相同多肽的植物細(xì)胞和使用相同核苷酸、多肽和植物細(xì)胞以提高植物的非生物脅迫耐受性、水分利用效率(WUE)、肥料利用效率(FUE)、生物量、生長(zhǎng)勢(shì)和/或產(chǎn)量的方法。所述方法通過(guò)在植物中表達(dá)編碼包含與選自以下的氨基酸序列有至少80％同源性的氨基酸序列的多肽的外源多核苷酸來(lái)實(shí)現(xiàn)SEQ IDNO33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065和3067-3259，從而提高植物的水分利用效率(WUE)、肥料利用效率(FUE)、生物量、生長(zhǎng)勢(shì)和/或產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C07K14/415GK101977928SQ200880127757
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2008年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月27日
發(fā)明者A·迪伯, B·J·維諾庫(kù)爾, G·羅南, H·卡基, S·阿亞爾, Y·赫施科維茨 申請(qǐng)人:伊沃基因有限公司