專利名稱：提高植物水分利用效率的方法和手段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是在植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及到有新的表型的轉(zhuǎn)基因植物，生產(chǎn)此類植物的方法和以此方法生產(chǎn)有用的多核苷酸和多肽。更明確的是，本發(fā)明涉及抑制蛋白激酶以及具有抑制蛋白激酶活性的轉(zhuǎn)基因植物。
背景技術(shù)：
水是植物的生存，生長和繁殖必不可少的。經(jīng)過光合作用的二氧化碳的同化直接關(guān)系到水通過氣孔的流失。與生物質(zhì)生產(chǎn)密切相關(guān)的作物生產(chǎn)力，依賴于植物水分利用效率(WUE)，尤其是在水分限制的條件下(Passioura 1994 and Sinclair 1994，in Physiology and Determination of Crop Yield)。植物的生長周期中的水分利用效率， 可使用每單位水蒸騰量生成的生物質(zhì)量比例進(jìn)行計算(Sinclair 1994)。水分利用效率瞬時測量亦可通過使用氣體交換測量法測定二氧化碳的吸收與蒸騰的比率來確定(Farquhar and Sharkey 1994，in Physiology and Determination of Crop Yield)。由于作物產(chǎn)量和水分利用效率密切相關(guān)，人們已作出許多努力，來學(xué)習(xí)和理解這種關(guān)系以及密切相關(guān)的基因組成。為了實(shí)現(xiàn)作物產(chǎn)能和產(chǎn)量的最大化，人們努力設(shè)法提高植物的水分利用效率 (Condon et al. ,2002, Araus et al. ,2002, Davies et al.，2002)。較高的水分利用效率可以通過提高生物質(zhì)生產(chǎn)量和二氧化碳同化或通過減少蒸騰水分流失來實(shí)現(xiàn)。減少蒸騰作用，尤其是在非限水環(huán)境下，可能隨之降低生長速度，從而減少作物產(chǎn)量。這就帶來了一個兩難選擇，如何在水有限的條件下提高作物的產(chǎn)能和產(chǎn)量，同時在灌溉水或非限水條件下還能保持產(chǎn)量(Condon et al. ,2002) 對于水分利用效率的改善，到目前為止，都采用植物育種方法進(jìn)行，藉此，將水分利用率較高的品種與高產(chǎn)能但水分利用率較低的品種進(jìn)行雜交，在限水條件下以期改善作物的產(chǎn)量(Condon et al.，2002，Araus et al.，2002)。使用數(shù)量性狀定位(QTL)的方法來確定水分利用效率的組成是歷史上最普遍的方法(Mian et al.，1996，Martin et al.， 1989, Thumma et al. ,2001,Price et al.，2002)，最近，人們嘗試通過分子遺傳學(xué)手段來構(gòu)建優(yōu)良植物品種。第一個與水分利用效率相關(guān)的基因是ERECTA。ERECTA基因是在花序發(fā)育和器官形態(tài)中作為功能基因首次被發(fā)現(xiàn)的(Torii el al.，1996)。后來通過QTL定位發(fā)現(xiàn)，它是蒸騰效率的一個重要貢獻(xiàn)因子，蒸騰效率被定義為每吸收一個二氧化碳蒸騰的水，在擬南芥中，作為一個與水分利用效率相反的指標(biāo)(Masle el al.，2005)。ERECTA基因編碼一個假定的富含亮氨重復(fù)的類受體激酶(LRR-RLK)。盡管有人提出，至少在某種程度上，其對氣孔密度，表皮細(xì)胞擴(kuò)張，葉肉細(xì)胞增殖和細(xì)胞間的聯(lián)系有影響，但LRR-RLK的調(diào)控機(jī)制有待理解。在eracta突變體中，使用野生型ERECTA進(jìn)行互補(bǔ)，可以恢復(fù)正常的蒸騰效率。然而，不能確定的是，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過表達(dá)ERECTA是否會降低蒸騰效率或提高水分利用效率。 這是唯一的報告，顯示植物類受體激酶與蒸騰效率或水分利用效率相關(guān)。另一個與水分利用效率相關(guān)的擬南芥基因是HARDY基因，是通過對活化標(biāo)簽突變體庫的表型篩選而發(fā)現(xiàn)的(Karaba el al.，2007)。在水稻中過表達(dá)HARDY，通過提高光合吸收和減少蒸騰，最終導(dǎo)致了水分利用效率的改善。增強(qiáng)表達(dá)HARDY的轉(zhuǎn)基因水稻在最佳水環(huán)境下發(fā)芽生物量有所增強(qiáng)，在限水條件下出根生物量有所增強(qiáng)。過量表達(dá)HARDY，在擬南芥中產(chǎn)生了含有更多的葉肉細(xì)胞的厚葉片，在水稻中提高了葉片和束葉細(xì)胞的生物量。這些修飾有助于提高光合活性和效率(Karaba et al.，2007)。蛋白激酶是一個大家族酶系，通過添加磷酸基團(tuán)(磷酸化)修飾蛋白除。在所有真核基因中，蛋白激酶約占2%，其中許多介導(dǎo)了真核細(xì)胞對外界刺激的響應(yīng)。所有的單亞基蛋白激酶在羧基端附近含有一個共同的催化結(jié)構(gòu)域，而氨基端起著調(diào)節(jié)作用。植物類受體激酶為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其含有，氨基端的一段預(yù)知信號肽， 一段跨膜域和一段胞漿激酶域。在擬南芥中，有超過610種的潛在編碼類受體激酶GhiU and Bleecker 2001)。類受體激酶往往是信號級聯(lián)反應(yīng)的一部分。他們在信號級聯(lián)反應(yīng)中解釋胞外信號，通過配體結(jié)合，磷酸化目標(biāo)，從而影響到下游的細(xì)胞過程，如基因的表達(dá) (Hardie 1999) 可被操作用來提供有益特征的基因的鑒定是非?？扇〉摹Ｊ褂靡汛_定的基因來評價所需要的特征也是同樣的方法和手段。在TA^數(shù)據(jù)庫中被定義為At2g25220的類受體激酶是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是擬南芥中超過600名的成員的類受體激酶基因大家族中的一員(Shiu et al.，2001)。然而，除了作為一種激酶進(jìn)行了序列的注釋，并沒有對 At2g25220基因進(jìn)行功能和作用的披露。在本發(fā)明中，確定了高水分利用效率基因(HWE)， 當(dāng)其表達(dá)或活性受到抑制時，會導(dǎo)致有益的表型，例如，相對于用水量，提高了植物生物量的積累。在限水條件或非限水條件下均可發(fā)生這種情況，并且確保更好的增長，因此植物有更大的生產(chǎn)率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)，PK220基因的突變導(dǎo)致了植物表型的改變，例如，與未突變的植物相比，水分利用效率提高，耐旱性增強(qiáng)，對低溫的敏感性降低、低氮條件下幼苗生長抑制性降低等等。
更具體地說，本發(fā)明涉及一種突變植物的鑒定，包含冊220基因的突變，在這里也稱為HWE基因。該H(220基因是一種類受體蛋白激酶。在植物中抑制H(220基因的表達(dá)或活性提供了有益的表型，例如改進(jìn)了植物的水分利用效率。改善的植物水分利用效率表型導(dǎo)致植物耐旱性增強(qiáng)。
在一方面，發(fā)明提供了一種獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法，通過使用載體來轉(zhuǎn)化植物、植物組織培養(yǎng)物、或植物細(xì)胞，載體中含有一種核酸構(gòu)建物能夠抑制PK220基因的表達(dá)或活性，從而獲得PK220表達(dá)或活性水平降低的植物、組織培養(yǎng)物或植物細(xì)胞。從植物組織培養(yǎng)物或植物細(xì)胞中培育或再生植物，其中水分利用效率提高的植物被制備。
因此，本發(fā)明提供了一種具有改良屬性的植物的生產(chǎn)方法，其中所述方法包括，抑制內(nèi)源性H(220基因的表達(dá)或活性，其中所產(chǎn)生的植物具有有益的表型或改良的屬性。在一個具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)水分利用效率提高的植物的方法，其中所述方法包括，轉(zhuǎn)基因植物的形成以及使用所述方法進(jìn)行植物基因組的修飾。
水分利用效率是指，當(dāng)使用重力法測量時，生成的生物質(zhì)的總量與單位水蒸騰量之間的比率，以及當(dāng)使用氣體交換定量法測量時，光合作用速率與葉片或枝條的蒸騰速率之間的比率。本文中所使用的術(shù)語“提高的水分利用效率“指的是，當(dāng)與相應(yīng)的野生型植物的水分利用效率相比時，植物水分利用效率是野生型的2，4，5，6，8，10，20或更多倍。舉例來說，具有提高的水分利用效率的植物相比野生型植物，可能有5%，10^,15^,20%, 25%，30%，40%，50%，60%，70%，75%或更高的水分利用效率。
本發(fā)明的方法包括抑制或降低內(nèi)源性基因的表達(dá)或活性，例如冊220，其中產(chǎn)生的植物具有有益的表型或改良的屬性，例如提高的水分利用效率。一方面，本發(fā)明提供了一種植物的生產(chǎn)方法，該植物相對于野生型植物有提高的水分利用效率，通過在植物細(xì)胞中引入一個核酸構(gòu)建物來抑制或降低H(220的表達(dá)或活性。舉例來說，相對于野生型植物，具有提高的水分利用效率的植物由以下幾步產(chǎn)生a)提供一種抑制H(220的活性的核酸構(gòu)建物，該核酸構(gòu)建物含有一個聯(lián)結(jié)于其上的合適啟動子；b)將核酸構(gòu)建物摻入到載體中；C) 將該載體轉(zhuǎn)化至植物、組織培養(yǎng)物或者植物細(xì)胞中，來制備具有PK220活性降低的植物、組織培養(yǎng)物或者植物細(xì)胞；d)從組織培養(yǎng)物或植物細(xì)胞中培育或再生植物，在此過程中制備該植物，與野生型植物相比，該植物的水分利用效率有所提高。該構(gòu)建物包括一個啟動子， 例如組成型啟動子、組織特異性啟動子或者誘導(dǎo)性啟動子。優(yōu)選的是，組織特異性啟動子為根莖啟動子。優(yōu)選的誘導(dǎo)型啟動子為干旱誘導(dǎo)型啟動子。
術(shù)語“核酸構(gòu)建物“是指一個全長基因序列或部分序列，其中一部分是最好至少有 19，20，21，22，23，24，25，30，40，50，60，70，75，80，90，100 或 150 個核苷酸長，或其互補(bǔ)體。 或者，它可能是一個寡核苷酸，單鏈或雙鏈，由DNA或RNA或DNA-RNA雙鏈組成。在一個具體實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建物包含PK220全長基因序列，或其中一部分，其中的一部分PK220 序列至少是 19，20，21，22，23，24，25，30，40，50，60，70，75，80，90，100 或 150 個核苷酸長，或其互補(bǔ)體。
本發(fā)明也提供了一種轉(zhuǎn)基因植物，具有有益的表型或者改良的屬性，例如提高的水分利用效率，通過本文描述的方法制備。
在另一個方面，本發(fā)明提供了一種植物，該植物在H(220基因中具有一個非天然存在的突變，其中，所述植物具有降低的H(220表達(dá)或活性，并且與野生型對照相比，具有提高的水分利用效率。PK220的表達(dá)或活性降低，是指與野生型H(220相比，在DNA、RNA或者蛋白質(zhì)水平上，降低2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50，60，或75倍或更多，或者與野生型 PK220 活性相比，降低 2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50，60，或 75 倍。 PK220活性包括但不限于多肽底物的絲氨酸和/或蘇氨酸殘基處的激酶活性，那是它參與磷酸化反應(yīng)的位置。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了轉(zhuǎn)基因種子，由本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物制備，其中種子產(chǎn)生的植物，具有有益的表型或者改良的屬性，例如與野生型植物相比，具有提高的水分利用效率。
在另一實(shí)施例中，發(fā)明提供了核酸用于在植物細(xì)胞中表達(dá)該核酸，來制備轉(zhuǎn)基因植物，該植物具有有益的表型或者改良的屬性，例如提高的水分利用效率。
在本發(fā)明中某些方面發(fā)現(xiàn)使用的編碼野生型冊220基因或其中的一部分的模板序列由以下序列號描述:SEQ ID 1，7，9，11，12，13，24，25，27，四，31，33，35，37，39，41，43， 45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，84，86，88，90，92， 94，96，98，100，153，161和193。編碼突變的PK220基因由SEQ ID 3和5描述。用于下調(diào) PK220表達(dá)和活性的對構(gòu)建物有用的模板序列由以下序列號描述SEQ ID 12，13，147，149， 153，161，168和174。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一些組合，包含本發(fā)明的核酸，用于在植物中進(jìn)行表達(dá)，制備所述的轉(zhuǎn)基因植物。
除非另有界定，此處使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中技術(shù)人員所熟知的含義相同的含義。雖然與此處所述類似的或相同的方法和材料可用于實(shí)踐或檢驗(yàn)本發(fā)明，合適的方法和材料如下所述。所有出版物，專利申請，專利和本文提及的其他文獻(xiàn)全部引用作為參考。在沖突的情況下，以本發(fā)明說明書，包括定義，為準(zhǔn)。此外，材料， 方法及實(shí)例僅用于闡述目的而作為對本發(fā)明的限制。
本發(fā)明其他的特點(diǎn)和優(yōu)勢，將是顯而易見的，并由下面的詳細(xì)說明書和權(quán)利要求書涵蓋。
具體實(shí)施例方式除非另有界定，此處使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中技術(shù)人員所熟知的含義相同的含義。雖然與此處所述類似的或相同的方法和材料可用于實(shí)踐或檢驗(yàn)本發(fā)明，合適的方法和材料如下所述。所有出版物，專利申請，專利和本文提及的其他文獻(xiàn)全部引用作為參考。在沖突的情況下，以本發(fā)明說明書，包括定義，為準(zhǔn)。此外，材料， 方法及實(shí)例僅用于闡述目的而作為對本發(fā)明的限制。
為方便起見，在本發(fā)明的進(jìn)一步說明前，這里先進(jìn)行用于說明、示例及要求的特定術(shù)語的規(guī)定。這些定義應(yīng)當(dāng)由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易閱讀并理解。
“啟動子序列”或“啟動子”，是指在植物細(xì)胞中，能夠誘導(dǎo)可操作基因序列轉(zhuǎn)錄的核酸序列。啟動子包括，例如(但不限于)組成型啟動子、組織特異性啟動子，例如根莖啟動子、誘導(dǎo)型啟動子，例如干旱誘導(dǎo)型啟動子、或內(nèi)源性啟動子，例如與興趣基因即PK220基因相關(guān)的啟動子。
術(shù)語“表達(dá)盒”是指載體構(gòu)建物，其中一個基因或核酸序列被轉(zhuǎn)錄。此外，所表達(dá)的基因可能被翻譯成多肽。
術(shù)語“表達(dá)”或“過表達(dá)”可以互換使用，都指的是，基因的表達(dá)也就是轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。相對于野生型細(xì)胞，細(xì)胞中的表達(dá)總水平可升高。
所謂“非天然存在突變"指的是任何方法，在一種植物或植物種群引入基因突變。 例如，化學(xué)誘變，如磺酸甲乙酯或甲磺酸乙酯，快中子誘變，DNA插入誘變?nèi)鏣-DNA插入或定點(diǎn)突變的方法。
術(shù)語“干旱脅迫"是指這樣一種情況，相對水非受限情況，植物生長或產(chǎn)量受到抑制。術(shù)語“水分-脅迫”與干旱水分脅迫同義可互換。
術(shù)語“耐旱性”是指植物能夠超越野生型植物的能力，在干旱脅迫條件下，或限水條件下，或相對于野生型植物在成長和發(fā)展過程中使用更少的水。
術(shù)語“水分利用效率”是一個比率表達(dá)式，當(dāng)使用重力法測量時，指的是生成的生物質(zhì)的總量與單位水蒸騰量之間的比率，當(dāng)使用氣體交換定量法測量時，指的是光合作用速率與葉片或枝條的蒸騰速率之間的比率。
術(shù)語“干重”是指已被干燥去除大部分細(xì)胞水的植物組織，與術(shù)語“生物質(zhì)”這個詞同義可互換。
術(shù)語“空”定義為，同胞基因分離的轉(zhuǎn)基因線，已經(jīng)失去摻入的轉(zhuǎn)基因，因此作為對昭線。
說明書中使用了各種標(biāo)準(zhǔn)縮寫，例如g，克；WT，野生型；DW，干重；WUE，水分利用效率；d，天。
術(shù)語“hwell6”指的是含有PK220基因突變的植物。
HWE基因指的是H(220基因序列，由H(220基因編碼的蛋白質(zhì)指的是H(220多肽或蛋白質(zhì)。術(shù)語HWE和H(220是同義詞。
術(shù)語“PK220核酸〃是指至少有一部分H(220核酸。同樣的，術(shù)語“PK220蛋白質(zhì)” 或“PK220多肽”是指至少有一部分蛋白質(zhì)。一部分對于核酸來說是指至少21個核苷酸長， 對于蛋白質(zhì)或多肽來說是至少有7個氨基酸。術(shù)語“AtfK220”指的是擬南芥PK220基因， 術(shù)語“BnPK220”指的是一個甘藍(lán)型油菜PK220基因。
本發(fā)明部分地取決于有改良農(nóng)藝屬性植物的發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上的，例如，相對于野生型對照，水分利用效率提高，耐旱性增加，敏感性低溫降低以在低氮條件下幼苗生長抑制降低。有益表型所對應(yīng)的基因已被確定并證明是一種抑制PK220基因。
制備具有提高的水分利用效率的植物的方法在本說明書中詳細(xì)進(jìn)行了描述，包括突變植物、轉(zhuǎn)基因植物、或者遺傳修飾植物。具體來說，本發(fā)明確定了 H(220基因的功能，當(dāng)其表達(dá)或者活性受到抑制時，可制備具有有益表型的植物。
兩個或兩個以上序列同源性的確定 要確定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列之間的同源性百分比，為實(shí)現(xiàn)最佳比較目的，所有序列被對齊。(例如，可以在用于最優(yōu)對齊比較的兩個序列任一個中引入間隔)。將氨基酸殘基或相應(yīng)的氨基酸位點(diǎn)的核苷酸或核苷酸位點(diǎn)進(jìn)行比較。當(dāng)?shù)谝粋€序列中的某個位點(diǎn)被第二個序列中相應(yīng)位置的同樣的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)，那么這兩個分子在此處是同源的(即這里所用的氨基酸或核酸“同源性“相當(dāng)于氨基酸或核酸的“一致性“)。
核酸序列同源性，可以兩個序列之間一致性的程度來確定。同源性也可使用本領(lǐng)域熟知的計算機(jī)程序來確定，如GCG程序包提供的GAP軟件，見Needleman and Wunsch (1970)。使用GCG-GAP軟件進(jìn)行如下設(shè)定用于核酸序列比較GAP創(chuàng)建點(diǎn)為5. 0，GAP 延伸點(diǎn)為0. 3，類似的核酸序列的編碼區(qū)域參照上面提到的，與序列號SEQ IDl顯示的DNA 序列的編碼序列部分一致性程度最好至少是70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，95 %，98 %，或 99%。
術(shù)語“序列一致性”指的是當(dāng)進(jìn)行特定區(qū)域比較時，在“殘基-殘基“基礎(chǔ)上兩個多核苷酸或多肽序列的一致性程度。術(shù)語“序列一致性百分比”通過所對比的區(qū)域中，比較兩個最佳相似序列來計算，測定兩個序列中相同核酸堿基(例如A，T，C，G，U，或I，在核酸的情況下)同時存在的位點(diǎn)的數(shù)量來得出匹配位點(diǎn)的數(shù)量，除以比較區(qū)域(例如窗口尺寸)的總位點(diǎn)數(shù)，然后將結(jié)果乘以100得出序列一致性百分比。這里所用的術(shù)語“實(shí)質(zhì)同一性”是指一個多核苷酸序列特征，其中與對照區(qū)域的參考序列相比，該多核苷酸包括的序列中至少有80%的序列一致性，最好是至少85%，經(jīng)常是90-95%，更常見的是至少99%。術(shù)語“陽性殘基百分比”通過所對比的區(qū)域中，比較兩個最佳相似序列來計算，測定兩個序列中相同和保守氨基酸殘基，如上所述，同時存在的位點(diǎn)的數(shù)量來得出匹配位點(diǎn)的數(shù)量，除以比較區(qū)域(例如窗口尺寸)的總位點(diǎn)數(shù)，然后將結(jié)果乘以100得出陽性殘基百分比。
內(nèi)源性PK220表達(dá)及活性的抑制 本發(fā)明的一方面，是關(guān)于抑制或降低PK220基因的表達(dá)和活性的方法和手段，任意地，導(dǎo)致冊220蛋白表達(dá)和活性的抑制或降低。術(shù)語“PK220表達(dá)或活性”包括抑制或減少這兩個層次。PK220的表達(dá)或活性降低，是指與野生型冊220相比，在DNA、RNA或蛋白質(zhì)水平上降低2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50，60或75倍或更多，或者與野生型 PK220 活性相比，PK220 蛋白活性降低 2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50，60 或 75 倍。PK220活性包括但不限于多肽底物的絲氨酸和/或蘇氨酸殘基處的激酶活性，那是它參與磷酸化反應(yīng)的位置。測定絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的方法是本領(lǐng)域人員眾所周知的。
對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，目前已有很多方法來實(shí)現(xiàn)這種抑制作用，通過影響基因表達(dá)途徑中各種步驟，例如轉(zhuǎn)錄調(diào)控，后轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控。這些方法包括但不限于，反義核酸的方法，RNA干擾構(gòu)建物，包括所有的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和有用的RNAi構(gòu)建物，通過雙鏈RNA 指導(dǎo)的DNA甲基化抑制或者通過mRNA的降解抑制，或翻譯抑制，小RNA(miRNA)，包括人工 miRNA的(amiRNA) (Schwab et al.，2006)的技術(shù)，突變和TILLING方方法，在體內(nèi)特定位點(diǎn)突變技術(shù)以及顯性/隱性抑制方法。
基因抑制的一種優(yōu)選方法包括RNA抑制(RNAi)技術(shù)也被稱為發(fā)夾結(jié)構(gòu)。擬抑制的基因的一部分被使用，并以正義和反義方向克隆，在正義和反義部分具有一定的間隔。 該部分基因的大小應(yīng)至少為20個核苷酸長，間隔可能為13個核苷酸長(Kermerdell and Carthew, 2000)，可能是內(nèi)含子序列，編碼或非編碼序列。
反義是一種常見的方法，即目標(biāo)基因，或其中一部份，以一種反義方向表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)源基因表達(dá)和活性的抑制。反義部分不需要一個全長基因，也不需要100%相同。只要反義序列與內(nèi)源目的基因至少大約70%或更多相同，核苷酸長度至少為19，20，21，22，23， 24，25，30，40，50，60，70，75，80，90，100，或150。優(yōu)選的是，核苷酸長度為50或更長，將取得預(yù)期的抑制作用。
在制備構(gòu)建體時，編碼野生型PK220基因及其中的部分序列對于PK220抑制是有用的，包括以下序列，例如，SEQ ID 序列號:1，7，9，11，12，13，24，25,27, , 31，33，35，37， 39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，84，86，
88，90，92，94，96，98，100，153，161和193。為了下調(diào)PK220的表達(dá)或活性，對于構(gòu)建體有用的模版序列由以下序列號所述SEQ ID 12，13，147，149，153，161，168和174。
當(dāng)使用反義策略下調(diào)，抑制內(nèi)源基因的活性可有選擇性的針對特定基因或所選的基因群，通過合適的選擇用于反義表達(dá)的片段或部分基因。選擇目的基因序列中存在，而相關(guān)基因群(非目的基因)中不存在或與非目的序列保守性小于70%的序列將會導(dǎo)致特異性基因抑制作用。
另外，amiRNA抑制可以用來抑制基因的表達(dá)和活性，以一種比其他RNAi方法更特異的方式。與需要小分子RNA和目標(biāo)mRNA之間完美匹配的siRNA相反，amiRNA允許多達(dá) 5個不匹配，只要不超過2個連續(xù)不匹配。amiRNA的構(gòu)建需要滿足一定的標(biāo)準(zhǔn)，如Schawab
8et al. (2006)所述。這就提供了一種下調(diào)目的基因表達(dá)或活性的方法，使用的基因片段包含冊220中的至少21個核苷酸序列。
顯性/陰性抑制類似于生化反應(yīng)中的競爭性抑制。修飾的或突變的缺乏全功能的多肽的表達(dá)會與野生型或內(nèi)源性多肽競爭，從而降低總的基因/蛋白的活性。例如，一個表達(dá)的蛋白質(zhì)可能會結(jié)合到蛋白復(fù)合體或酶亞基上從而產(chǎn)生一個非功能復(fù)合物。或者，表達(dá)的蛋白可能與底物結(jié)合，但沒有活性去執(zhí)行天然的功能。非活性蛋白的表達(dá)水平足以降低或抑制整體功能。
表達(dá)PK220基因產(chǎn)生缺失活性的H(220蛋白可用于基因活性的顯性/陰性下調(diào)。 這類似于競爭性抑制。例如，產(chǎn)生的PK220蛋白可能與目的分子聯(lián)合或綁定，但缺乏內(nèi)源性活性。這樣的無活性H(220的一個例子是，分離自hwell6突變體的AtPK220序列，如序列號SEQ ID N0:3所示。目的分子可以是核酸序列的相互作用蛋白。在這種方式下，內(nèi)源性蛋白PK220被有效稀釋，下游響應(yīng)將被衰減。
體內(nèi)位點(diǎn)的特異性突變是可得到的，據(jù)此，可以在細(xì)胞的基因組中引入一個突變來產(chǎn)生特異性突變。該方法可見Dong et al. O006)詳細(xì)描述，或者在美國專利申請公布號 20060162024中，其中提到了寡核苷酸定向基因修復(fù)的方法。另外一種方法，可以利用嵌合 RNA/DNA寡核苷酸，如Beetham(1999)所描述。因此，可能在細(xì)胞的內(nèi)源性基因中產(chǎn)生未成熟終止密碼，從而產(chǎn)生一種特異性無效突變。另外，突變可能會干擾初始轉(zhuǎn)錄的拼接，從而產(chǎn)生無翻譯能力的mRNA，或者是一種產(chǎn)生可變多肽的mRNA，該多肽不具備內(nèi)源性活性。優(yōu)選的突變，能夠造成PK220表達(dá)或活性減少或降低，包括，在核酸位點(diǎn)874處的C到T的轉(zhuǎn)變，與序列號SEQ ID NOs :1或3—致，或者核酸突變導(dǎo)致了氨基酸位點(diǎn)292處的氨基酸轉(zhuǎn)變，從亮氨酸(L)編碼(CTT)變成了苯丙氨酸(F)編碼(TTT)，與序列號SEQ ID NOs :2或4 一致。
TILLING是一種在已知基因中分離突變的方法，來自于EMS-誘變庫群。使用 (Greene et al. ,2003)所詳細(xì)描述的方法篩選誘變庫群。
基因抑制的其他策略，對于本領(lǐng)域熟練的工作者，包括那些在這里沒有討論的以及未來發(fā)展的，都將是顯而易見的。
AtPK220同源性的鑒定 擬南芥H(220(AtPK220)的同源性通過使用數(shù)據(jù)庫序列搜索工具被確定，例如基本局部比對搜索工具(BLAST) (Altschul et al.，1990 and Altschul et al.，1997)。 該tblastn或blastn序列分析程序使用BL0SUM-62得分矩陣進(jìn)行工作(Henikoff and Henikoff, 1992)。BLAST報告的輸出提供一個分?jǐn)?shù)，考慮到類似或相同的殘基，以及為了保持序列對齊所需的任何間隙。得分矩陣指定一個分?jǐn)?shù)用于對齊任何可能的序列對。P值反映的是希望看到一個分?jǐn)?shù)偶然出現(xiàn)的次數(shù)。優(yōu)選分?jǐn)?shù)較高者，以及低閾值P值。這些都是序列相似性的標(biāo)準(zhǔn)。tblastn序列分析程序是用于查詢數(shù)據(jù)庫中的多肽序列，與核苷酸數(shù)據(jù)庫中的六道翻譯序列比對。選中P值小于-25，優(yōu)選少于-70，更優(yōu)選不到-100的，確定為同源序列(模板序列選擇標(biāo)準(zhǔn))。Blastn序列分析程序是用于查詢核苷酸序列數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列。在這種情況下，也優(yōu)選得分較高者，首選P閥值小于-13，優(yōu)選小于-50，更優(yōu)選小于-100。
通過標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)可以分離PK220基因。使用PK220基因的保守區(qū)域引物和PCR擴(kuò)增產(chǎn)生所需基因的片段或全長拷貝。模板可以是DNA，基因組或cDNA文庫，或是 RNA或mRNA，使用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RtPCR)技術(shù)。保守區(qū)域，可使用如BLAST或如CLUSTALW序列對比工具來確定。合適的引物被應(yīng)用，并在本申請的其他地方進(jìn)行了描述。
或者，一個來自于H(220基因的序列片段被隨機(jī)引物進(jìn)行32P放射性標(biāo)記 (Sambrook et al.，1989)，用于篩選植物基因組文庫(模板檢測核苷酸)。作為示例，根據(jù) Stockinger等人的方法，分離了來自于擬南芥，煙草，番茄，苦茴芹，甜櫻桃，桃櫻，黃瓜，或水稻的總植物DNA (Stockinger et al.，1996)。每種DNA樣品大約取2到10微克進(jìn)行限制性消化，轉(zhuǎn)印至尼龍膜上(Micron Separations, ffestboro, Mass)進(jìn)行雜交。雜交條件為 420C，50%甲酰胺，5X SSC，20mM磷酸緩沖液1 XDenhardt，s，10%硫酸葡聚糖和100微克/ 毫升鯡魚精DNA。室溫下用2XSSC，0. 05%肌酸鈉和0. 02%焦磷酸鈉緩沖液低嚴(yán)格清洗四次，然后在下使用0. 2 X SSC, 0. 05%肌酸鈉和0. 01%焦磷酸鈉緩沖液高嚴(yán)格清洗，直到按照Walling等人的方法，在沖洗液中檢測不到(Walling et al.，1988)。陽性分離物進(jìn)行鑒定，純化和測序。其他方法也可用于雜交，例如Clonetech公司提供的ExpressHyb 雜交溶液。
PK220重組表達(dá)載體以及宿主細(xì)胞 本發(fā)明的另一個方面涉及到載體，優(yōu)選的表達(dá)載體，含有一種編碼H(220蛋白質(zhì)的核酸，PK220基因或基因組序列或其中的部分類似序列或其同源序列。本文中所使用的術(shù)語表達(dá)載體包括被設(shè)計用于提供核酸序列轉(zhuǎn)錄的載體。轉(zhuǎn)錄序列可以被設(shè)計用于抑制與轉(zhuǎn)錄序列相關(guān)的內(nèi)源性表達(dá)或內(nèi)源性基因的活性?；蛘?，轉(zhuǎn)錄核酸不需要翻譯，而是以反義或發(fā)夾下調(diào)的方法抑制內(nèi)源性基因的表達(dá)。此外，轉(zhuǎn)錄的核酸可能被翻譯成多肽或蛋白質(zhì)產(chǎn)物。多肽可能是一個非全長，突變或修飾后的內(nèi)源性蛋白的變體。本文中所使用的術(shù)語 “載體”是指一種核酸分子，具有運(yùn)送被鏈接于其上的另一種核酸的能力。一種載體類型是 “質(zhì)粒”，它指的是環(huán)形雙鏈DNA，附加的DNA片段可以被連接到其中。另一種載體類型是病毒載體，其中，附加的DNA片段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在其被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體)。其他載體整合到被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的基因組中，并因此隨宿主細(xì)胞的基因組的復(fù)制而被復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)被操作連入的基因的表達(dá)。這種載體，在此統(tǒng)稱為“表達(dá)載體”。一般來說，在重組DNA技術(shù)中通用的表達(dá)載體效用往往是質(zhì)粒的形式。在目前的規(guī)范中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用， 因?yàn)橘|(zhì)粒是載體最常用的形式。然而，本發(fā)明旨在包括其他形式的表達(dá)載體，如病毒載體或植物轉(zhuǎn)化載體，二元的或其他方式，它們提供相同的功能。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體包括本發(fā)明中的核酸以一種合適的形式在一個宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，這意味著重組表達(dá)載體包括一個或多個調(diào)控序列，該序列基于對用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的選擇，也就是操作鏈接到被表達(dá)的核酸序列上。在一個重組表達(dá)載體中，“操作鏈接”是為了表示插入的核苷酸序列是被鏈接到調(diào)控序列上，以一種允許核苷酸序列表達(dá)的方式(例如，在一種體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或者在宿主細(xì)胞中，當(dāng)載體被導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中時)。
術(shù)語“調(diào)控序列”意在包括啟動子，增強(qiáng)子和其他表達(dá)調(diào)控元件(例如，多聚腺苷酸(polyA)信號)。例如，這種調(diào)控序列在Goeddel (1990)被描述。調(diào)控序列包括那些在許多類型的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列進(jìn)行組成型表達(dá)的序列，以及那些只在某些宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸表達(dá)的序列(如組織特異性調(diào)控序列)或誘導(dǎo)啟動子(例如，對非生物因素的響應(yīng)誘導(dǎo)，如環(huán)境條件，熱，干旱，營養(yǎng)狀況或細(xì)胞的生理狀況，或生物的例如病原響應(yīng))。 合適的啟動子的例子包括，例如組成型啟動子，ABA誘導(dǎo)型啟動子，組織特異性啟動子以及非生物或生物誘導(dǎo)的啟動子。這對于設(shè)計表達(dá)載體的技術(shù)人員將是不勝感激的，他們可以依靠這樣的因子，選擇被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，選擇目的蛋白的表達(dá)水平，以及選擇表的的時間和位置，等等。本發(fā)明的表達(dá)載體可以被引入到宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生由本發(fā)明所述的核酸編碼的蛋白質(zhì)或多肽，包括融合蛋白或多肽(例如，PK220蛋白，PK220蛋白突變形式，融合蛋白等)。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體可被設(shè)計用于在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)H(220基因， PK220蛋白質(zhì)，或其中的部分。例如，PK220基因或H(220蛋白質(zhì)可以在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)，如大腸桿菌，昆蟲細(xì)胞(用桿狀病毒表達(dá)載體)，酵母細(xì)胞，植物細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞中在Goeddel (1990)進(jìn)一步討論。另外，重組表達(dá)載體可在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，例如，使用T7啟動子調(diào)控序列和T7聚合酶。
在一個實(shí)施例中，使用植物表達(dá)載體，本發(fā)明的核酸在植物細(xì)胞中表達(dá)。植物表達(dá)載體系統(tǒng)的例子包括腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒，或部分來自于農(nóng)桿菌，花椰菜花葉病毒 DNA(CaMV)，以及如 pB1121 載體。
對于植物表達(dá)，重組表達(dá)盒將包含，除冊220核酸外，還有能在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動子區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(假如缺乏轉(zhuǎn)錄編碼序列)，和可選的轉(zhuǎn)錄終止/加尾序列。 終止/加尾區(qū)域可從與啟動子序列相同的基因或不同的基因中獲得。在表達(dá)盒的5’和3’ 端引入獨(dú)特的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，為便于允許插入一個預(yù)先存在的載體。
合適的啟動子的例子包括來自于植物病毒啟動子，如來自于從菜花花葉病毒 (CaMV)的35S啟動子(Odell et al.，1985)，來自于基因的啟動子，例如水稻肌動蛋白 (McElroy et al·，1990)，泛素(Christensen et al.，1992)，pEMU(Last et al.，1991)， MAS (Velten et al.，1984)，玉米 H3 組蛋白(Lepetit et al. , 1992 and Atanassvoa et al.，1992)，衍生自農(nóng)桿菌T-DNA的5'-或3'-啟動子，Smas啟動子，肉桂醇脫氫酶啟動子(U. S. Pat. No. 5，683，439)，Nos啟動子，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶啟動子， GRP1-8啟動子，ALS啟動子(W0 96/30530)，合成啟動子，例如Rsyn7，SCP和UCP啟動子，核酮糖-1，3-二磷酸羧化酶，水果特異性啟動子，熱休克啟動子，種子特異性啟動子以及其他來自于各種植物基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，例如，包括不同的植物堿轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，例如，章魚堿，甘露堿和胭脂堿。在某些情況下，與插入基因(如H(220)相關(guān)的啟動子可能被用來表達(dá)插入的結(jié)構(gòu)目的基因，例如野生型AtfK220啟動子(PpK)。與冊220編碼核酸序列連接的用于在植物細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控元件包括，終止子，加尾序列和核酸序列編碼信號肽，使蛋白在植物細(xì)胞中定位或從細(xì)胞中分泌。這些調(diào)控元件的添加以及將這些元件與H(220基因的調(diào)控元件進(jìn)行交換的方法是已知，包括但不限于，3’終止和/或加尾區(qū)域，例如，農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因(Nos)的3’終止和/或加尾區(qū)域(Bevan et al. , 1983)；馬鈴薯蛋白酶抑制基因II (PIN II) (Keil et al.，1986)，以及此處引用的文獻(xiàn))；以及An et al. (1989)； 以及 CaMV 19S 基因(Mogen et al.，1990)。
植物信號序列，包括但不限于，信號肽編碼DNA/RNA序列，引導(dǎo)蛋白至植物細(xì)胞外的基質(zhì)中(Dratewka-Kos et al.，1989)和皺葉煙草的延伸基因(De Loose et al.，1991)，或是將蛋白引導(dǎo)至液泡中的信號肽，如甘薯儲藏蛋白基因(Matsuoka et al. , 1991)和大麥外源凝集素基因(Wilkins et al.，1990)，或是造成蛋白質(zhì)分泌的信號，例如1 (Lund et al.，1992)，或那些引導(dǎo)蛋白至質(zhì)體的信號，例如油菜籽enoyl-ACP還原酶(Verwoert et al. , 1994)對于本發(fā)明都是有用的。
在另一個實(shí)施方案中，重組表達(dá)載體，能夠指導(dǎo)優(yōu)選核酸序列在特定細(xì)胞型中表達(dá)(例如，組織特異性調(diào)控元件用于表達(dá)核酸)。組織特異性調(diào)控元件在本領(lǐng)域中眾所周知。例如，與1々頂數(shù)據(jù)庫中定義為At2g44790(P4790)的編碼序列相關(guān)的啟動子是一個根特異性啟動子。與本發(fā)明中的核酸序列尤其有關(guān)的是在植物中具有可操作性的表達(dá)系統(tǒng)。 其中包括，在組織特異性啟動子控制下的表達(dá)系統(tǒng)，以及那些在各種植物組織中具有可操作性的啟動子所涉及的系統(tǒng)。各種發(fā)起人于各種植物組織可操作.. 器官特異性啟動子也是眾所周知的。例如，查爾酮合成酶-A基因(van der Meer et al. ,1990)或二氫黃酮醇_4_還原酶(dfr)啟動子(Elomaa et al. , 1998)指導(dǎo)的在特定花卉組織中表達(dá)。此外，同樣可用的啟動子還包括patatin class I啟動子，僅在馬鈴薯塊莖轉(zhuǎn)錄激活，可用于目的基因在塊莖(BeVan，1986)中的表達(dá)。另一個馬鈴薯特異性啟動子是顆粒-綁定的淀粉合成酶(GBSS)啟動子(Visser et al.，1991)。
適合目的器官的其他器官特異性啟動子可以利用已知的程序進(jìn)行分離。這些控制序列通常在目的器官中伴隨著基因獨(dú)特的表達(dá)。在典型的高等植物中，每個器官含有成千上萬的mRNA，而這些mRNA在其他器官系統(tǒng)中是沒有的(Goldberg綜述，1986)。
由此產(chǎn)生的表達(dá)系統(tǒng)被連接入或者構(gòu)建引入德奧重組載體中，該載體適用于植物轉(zhuǎn)化。載體可能還包含一個選擇標(biāo)記基因，通過它可以培養(yǎng)鑒定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。標(biāo)記基因可以編碼抗生素抗性。這些抗性標(biāo)記包括G418，潮霉素，博萊霉素，卡那霉素和慶大霉素。 或者標(biāo)記基因可以編碼除草劑抗性基因，能夠耐受草銨膦或草甘膦類型的除草劑。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞后，那些含有載體的細(xì)胞可以通過它們在含有特定抗生素或除草劑的培養(yǎng)基中的生長能力來確定。通常，也包括允許載體被克隆至細(xì)菌或噬菌體宿主中的細(xì)菌或病毒的復(fù)制起始序列，優(yōu)選包括廣泛宿主范圍的原核起始復(fù)制。對于細(xì)菌，還應(yīng)包括合適的選擇標(biāo)記， 允許進(jìn)行含有目標(biāo)構(gòu)建體的細(xì)菌細(xì)胞的篩選。合適的原核篩選標(biāo)記還包括對于如卡那霉素或四環(huán)素等抗生素的抗性。
其他的編碼附加功能的DNA序列也可以含在載體中，在本領(lǐng)域中是眾所周知的。 例如，在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的情況下，也將包括T-DNA的序列，用于隨后的植物染色體的轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的另一個方面涉及到宿主細(xì)胞，本發(fā)明的重組表達(dá)載體被引入其中。術(shù)語 “宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”是可以互換使用的。據(jù)了解，這些術(shù)語不僅指特定的主體細(xì)胞，同樣也指此細(xì)胞的后代或潛在的后代。由于要么突變或環(huán)境影響，某些修飾可能存在于隨后的子代中，這樣的后代事實(shí)上可能不會與親代細(xì)胞相同，但仍然包括在此處所用的這個詞的范圍內(nèi)。
載體DNA可以被引入到原核或真核細(xì)胞中，通過傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)。如本文所用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”的本意指的是各種公認(rèn)的技術(shù)，用于將外來的核酸(如DNA) 引入宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞，例如培養(yǎng)中的原核或真核宿主細(xì)胞，可用于生產(chǎn)(即表達(dá))本發(fā)明所述的多肽，該多肽由本發(fā)明所述的多核苷酸的開放閱讀框所編碼。因此，本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞用于生產(chǎn)多肽的方法。在一項(xiàng)具體實(shí)施方案中，該方法包括在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(其中編碼本發(fā)明的多肽的重組表達(dá)載體已被引入)，使細(xì)胞產(chǎn)生多肽。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，該方法還包括從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞中分離多肽的方法。
許多的細(xì)胞類型可以作為合適的宿主細(xì)胞用于表達(dá)本發(fā)明中的多肽，多肽由多核苷酸形式的開放閱讀框編碼。植物宿主細(xì)胞包括，例如，能夠作為合適的宿主細(xì)胞用于表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸的植物細(xì)胞，包括，表皮細(xì)胞，葉肉和其他地面組織，葉片、莖、花器官中的維管組織，和各種植物的物種的根，如擬南芥、煙草、甘藍(lán)型油菜、玉米、水稻、棉花和大豆。
編碼非全功能的PK220蛋白的PK220核酸的表達(dá)，在顯性/隱性抑制方法中會很有用。PK220突變多肽，或其部分，在植物中表達(dá)，使其擁有部分的功能。突變的多肽，例如， 可以具有結(jié)合到其他分子的能力，但阻止復(fù)合體的適當(dāng)活性，從而造成PK220活性的總體抑制。
轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞以及轉(zhuǎn)基因植物 本發(fā)明包括原生質(zhì)體，植物細(xì)胞，植物組織和植物(如單子葉和雙子葉植物)，使用PK220核酸、含有PK220核酸的載體或含有PK220核酸的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。本文所用的“植物”是指不僅包括完整植物，同樣也包括其中的部分(即，細(xì)胞和組織，包括例如葉， 莖，芽，根，花，果實(shí)和種子)。
該植物可以是任何植物類型，包括，例如，來自于以下屬類的物種擬南芥，油菜， 水稻，玉米，高粱，短柄，芒草，棉花，小麥，大豆，豌豆，綠豆，番茄，紅車軸，大麻，南瓜，羅莎， 葡萄，核桃，草莓，蓮花，苜蓿，紅豆草，葫蘆，豇豆，柑橘，亞麻，天竺葵，木薯，胡蘿卜，蘿卜， 芥，顛茄，辣椒，曼陀羅，天仙子，煙草，馬鈴薯，矮牽牛，洋地黃，馬約喇納，菊苣，向日葵，萵苣，雀麥，蘆筍，金魚草，萱草，Nemesis,天竺葵，稷，狼尾草，毛茛屬，千里光，美人襟，黃瓜， Browaalia,黑麥草，燕麥，大麥，黑麥，云杉，可可，胡楊。
本發(fā)明還包括細(xì)胞，組織，例如包括葉，莖，芽，根，花，果實(shí)和種子，以及從轉(zhuǎn)化的植物中衍生的后代。
已知有多種方法用于將外源基因引入植物中，這些方法可用于將基因插入到植物宿主中，包括生物和物理的植物轉(zhuǎn)化標(biāo)準(zhǔn)步驟(見，例如Miki et al. , (1993) "Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants，，，In :Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson, eds., CRC Press, Inc. , Boca Raton, pages 67-88 ；Andrew Bent in,Clough SJ and Bent AF, (1998)“Floral dipping :a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana”)。隨宿主植物的不同選擇不同的方法，包括化學(xué)轉(zhuǎn)染方法，例如鈣磷酸，聚乙二醇(PEG)轉(zhuǎn)化， 微生物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，如農(nóng)桿菌(Horsch et al.，1985)，電穿孔轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，微注射，花浸漬和基因槍法。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 將表達(dá)載體引入植物中最廣泛使用的方法是建立于根瘤農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌的天然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)上的，農(nóng)桿菌是植物病原細(xì)菌，病原細(xì)菌可遺傳轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。根瘤農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌的Ti和Ri質(zhì)粒，分別攜帶用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的響應(yīng)基因(見，例如，Kado,1991)。農(nóng)桿菌載體系統(tǒng)的詳述和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的方法請見Gruberet al. (1993) 禾口 Moloney et al.，(1989)。
轉(zhuǎn)基因擬南芥植株可容易制備，通過浸泡開花植物到農(nóng)桿菌培養(yǎng)基中的方法，該方法是建立在Andrew Bent in, Clough SJ and Bent AF，1998的方法基礎(chǔ)上的?！痘ɑ芙n一種簡化方法用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥》。野生型植物生長到同時含有未開和已開的花朵。將植物倒置如農(nóng)桿菌培養(yǎng)溶液中1分鐘，該溶液含有合適的基因構(gòu)建體。然后將植物向左水平放置在托盤中，加蓋兩天保持濕度，然后向右翻轉(zhuǎn)裝到袋子中，繼續(xù)生長和萌發(fā)種子。然后收獲成熟的種子。
直接基因轉(zhuǎn)移 一個普遍適用的植物轉(zhuǎn)化方法是基因槍微粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中DNA置于大小為1 至4微米的微粒表面。使用基因槍裝置將表達(dá)載體引入到植物組織中，基因槍將微粒加速到300-600米/秒，足以穿透植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜(Sanford et al.，1993 ；Klein et al.，
1992)。
植物轉(zhuǎn)化也可以通過氣溶膠束注入器(ABI)的方法來實(shí)現(xiàn)，見 U. S. Pat. 5，240，842和U. S. Pat. 6，809，232所述。氣溶膠束技術(shù)是用來加速濕或干粒子的速度使粒子穿透活細(xì)胞。氣溶膠束技術(shù)利用惰性氣體射流擴(kuò)展，它從一個高氣壓區(qū)域通過一個小孔，進(jìn)入低氣壓區(qū)。膨脹氣體加速氣溶膠液滴，其中包含的核酸分子被導(dǎo)入細(xì)胞或組織中。加速粒子定位于沖擊首選的目標(biāo)，例如植物細(xì)胞。這些粒子被構(gòu)建成一個個尺寸足夠小的液滴，使得細(xì)胞能忍受滲透壓。使用本應(yīng)用領(lǐng)域中人員所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織生長來制備植物。
轉(zhuǎn)化子的再生 從任一單一植物原生質(zhì)體或不同的外植體開發(fā)或再生植株的技術(shù)是眾所周知的 (ffeissbach and ffeissbach, 1988) 0這種再生和成長過程通常包括的步驟有，轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇，通過植株扎根階段的胚胎發(fā)育，培養(yǎng)這些分化的細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因胚胎和種子以同樣方式再生。由此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因根苗然后種植于適當(dāng)?shù)闹参锷L培養(yǎng)基中，如土壤等。
可以通過本領(lǐng)域熟知的方法，見(Horsch et al，1985)，實(shí)現(xiàn)含有外源基因的植物的開發(fā)和再生，該基因編碼的有益多肽是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)從葉片外植體引入的。在此過程中， 在含有篩選試劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)基能夠誘導(dǎo)被轉(zhuǎn)化的植株的根系的再生，如 (Fraley et al.，1983)所述。特別的是，U. S. Pat. No. 5，349，124 (本文特別納入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)) 詳細(xì)介紹了基因轉(zhuǎn)化的生菜細(xì)胞和由此的得到的植株的制備方法，該植物表達(dá)了對鱗翅目幼蟲具有殺蟲活性的雜種晶體蛋白。
此過程通常會在兩到四個月內(nèi)生芽，然后將這些芽轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)母T導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有選擇性試劑劑和抗生素，以防止細(xì)菌滋生。為了形成植株，然后將在含有選擇性試劑下生根的小芽轉(zhuǎn)培至土壤或其他培養(yǎng)基中來促使在根的生產(chǎn)。這些步驟不盡相同，主要依賴于所用的特定植株，這些不同的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。
優(yōu)選的是，再生植株是自花授粉，以提供純合轉(zhuǎn)基因植物，或者由再生植株的獲得花粉，與重要農(nóng)藝性狀的種-生植物雜交，優(yōu)選自交系植物。相反地，來自于重要系品植物的花粉用于給再生植株授粉。本發(fā)明中含有目的多肽的轉(zhuǎn)基因植物的種植使用的是本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的方法。
14 優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物是一種獨(dú)立分裂的，能夠?qū)K220基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)移至其后代。 更優(yōu)選的是，轉(zhuǎn)基因植物對于基因構(gòu)建體是純合的，能夠在性狀分配時，將此基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)移至所有的后代。從轉(zhuǎn)基因植物得到的種子可以生長在外地或溫室中國，以及由此產(chǎn)生的性成熟的轉(zhuǎn)基因植物是自授粉的從而產(chǎn)生真正的的自交產(chǎn)生真正的育種植物。從這些植物得到的后代變成了真正的育種系，可用于評估PK220基因表達(dá)的降低。
制備轉(zhuǎn)基因植物的方法 本發(fā)明還包括生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，相對于野生型植物，轉(zhuǎn)基因植物具有以下特點(diǎn)增加的水分利用效率，降低的低溫敏感性以及在低氮條件下，幼苗生長抑制減少。該方法包括在一個或多個植物細(xì)胞中引入一種化合物，該化合物抑制或降低植物中PK220基因的表達(dá)或活性，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，以及從轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中再生轉(zhuǎn)基因植物。該化合物可以是，例如，(i)PK220多肽；(ii)PK220核酸，類似物，同系物，同源基因，部分基因，變種或其互補(bǔ)序列；(iii)降低PK220核酸表達(dá)的核酸。降低PK220核酸表達(dá)的核酸可以包括啟動子或增強(qiáng)子元件。該P(yáng)K220核酸可以是內(nèi)源性的或外源性的，例如，擬南芥的PK220核酸可以導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜和玉米種中。優(yōu)選的是，對于被轉(zhuǎn)化物種，該化合物是H(220內(nèi)源性核酸序列。另外，對于被轉(zhuǎn)化物種，該化合物可以是H(220外源性核酸序列，并且，相對于內(nèi)源性靶序列，該化合物具有至少70 %，75 %，80 %，85 %，90 %或更高的同源性。
與野生型植物(即未轉(zhuǎn)化的)相比，轉(zhuǎn)基因植物在不同的方面的有不同的表型。通過不同的表型，意味著該植物具有一個或多個特點(diǎn)，與野生型植物不同。例如，當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物與一種化合物接觸，該化合物降低了 PK220核酸的表達(dá)或活性，那么該植物相對于野生型植物，具有一種表型，如增加的水分利用效率，降低的低溫敏感性以及在低氮條件下，幼苗生長抑制減少。
該植物可以是任何植物類型，包括，例如，來自于以下屬類的物種擬南芥，油菜， 水稻，玉米，高粱，短柄，芒草，棉花，小麥，大豆，豌豆，綠豆，番茄，紅車軸，大麻，南瓜，羅莎， 葡萄，核桃，草莓，蓮花，苜蓿，紅豆草，葫蘆，豇豆，柑橘，亞麻，天竺葵，木薯，胡蘿卜，蘿卜， 芥，顛茄，辣椒，曼陀羅，天仙子，煙草，馬鈴薯，矮牽牛，洋地黃，馬約喇納，菊苣，向日葵，萵苣，雀麥，蘆筍，金魚草，萱草，Nemesis,天竺葵，稷，狼尾草，毛茛屬，千里光，美人襟，黃瓜， Browaalia,黑麥草，燕麥，大麥，黑麥，云杉，可可，胡楊。
實(shí)施例 高水分利用效率突變株hwel 16的鑒定 一株擬南芥EMS突變體(哥倫比亞背景)最初被確定為具有耐旱屬性。該突變體用于測試最佳和干旱條件下的水分利用效率。結(jié)果表明，該突變體耐旱的性質(zhì)是由于其具有較高的水分利用效率，無論在水脅迫或最佳水分條件下。因此，此突變株被命名為 hwell6。
基于圖譜的hwell6克隆 通過hwell6突變株與擬南芥的蘭茨貝格生態(tài)型(Ler)交叉，產(chǎn)生F2種群，用于基于圖譜的克隆，通過測定突變株的耐旱性，以及因此確認(rèn)突變株具有高水分利用效率特點(diǎn)。 經(jīng)5天干旱處理，測定F2種群的單位干重失水率水，得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行常規(guī)化，用于QTL分析，與hwell6突變株和兩種野生型生態(tài)型對比，每單位F2植株干燥失重是衡量一在5天的干旱處理和數(shù)據(jù)分析的QTL是相對于twel 16突變體和野生型的兩個生態(tài)型，蘭茨貝格株和哥倫比亞株。收集表型實(shí)驗(yàn)中來自于所有的F2和對照植物的葉片組織，用于基因型分析。 用Mapmaker3. 0和WinQTLCart2進(jìn)行QTL分析。為了進(jìn)一步確定QTL峰內(nèi)的突變，使用了芹菜內(nèi)切酶I (CEL I)。
使用CEL I核酸酶的突變檢測 芹菜內(nèi)切酶I (CEL I)，能夠在堿基對替換的位點(diǎn)高度的異性的切割DNA，而堿基對替換造成了野生型和突變體的等位基因之間的錯配，因此芹菜內(nèi)切酶I被報道用于檢測 EMS 突變株中的突變位點(diǎn)(Yang et al. ,2000 ；Oleykowski et al.，1998)。
使用hwell6或親代哥倫比亞株基因組DNA為模板，通過優(yōu)化的PCR擴(kuò)增得到約 5kb的DNA片段。擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合在一起，然后進(jìn)行一個變性和退火循環(huán)形成異源雙鏈 DNA。42°C下使用CEL I溫浴20分鐘，在異源雙鏈DNA的突變點(diǎn)處切割。使用瓊脂糖凝膠電泳和EB染色觀察DNA片段。
使用此方法擴(kuò)增51Λ的PCR產(chǎn)物，引物為SEQ ID NO :102和SEQ ID N0:104，模板為hwell6，和哥倫比亞型對照。形成的異源雙鏈PCR產(chǎn)物經(jīng)CEL I酶切后產(chǎn)生了小片段 (1.4和3. 6kb)。使用引物SEQ ID NO :104和SEQ ID NO 105擴(kuò)增重疊的亞片段(約3kb)， 進(jìn)一步確定突變位點(diǎn)。亞片段經(jīng)測序后，發(fā)現(xiàn)hwell6中的C核苷酸突變?yōu)門核苷酸。
由于核酸序列SEQ ID NO :1和3中的874位核苷酸的C到T的轉(zhuǎn)變，產(chǎn)生了氨基酸的改變，292位的氨基酸由亮氨酸(L)的密碼子(CTT)改變?yōu)楸奖彼?F)的密碼子(TTT)， 因此有益突變被鑒定。含有突變的基因被確定是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Ser/Thr PK) 0野生型基因被確定為與GenBank登錄號At2g25220相同。該絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶在本文中被稱為AtH(220，hwell6的確定突變形式被稱為AtPK22oL292F。
轉(zhuǎn)錄評估 Northern分析和RT-PCR檢測表明，相對于野生型對照，tiwe 116中的AtH(220基因的表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄尺度未發(fā)生改變。
部分AtPK220L292F和AtPK220序列的初始克隆 基于TAIR 的注釋，AtPK220L292F(AtPK220L292F(p))的部分序列和 AtPK220AtPK220 (P))的部分序列采用RT-PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，使用如下引物SEQ ID NO: 106和SEQ ID NO :107，分別含有BamH I和I^st I酶切位點(diǎn)用于克隆，模板的RNA分別分離自tiWell6和對照植物(哥倫比亞型)。產(chǎn)生的部分AtfK220I^92F核苷酸序列見SEQ ID NO :5，對應(yīng)的氨基酸序列見SEQ ID NO :6。產(chǎn)生的部分AtH(220核苷酸序列見SEQ ID NO: 7，對應(yīng)的氨基酸序列見SEQ ID NO :8ο 大腸桿菌表達(dá)的部分AtfK220I^92F蛋白的激酶活性分析 PCR產(chǎn)物用BamH I和I3St I消化，并插入到表達(dá)載體pMAL_c2 (New England Biolabs,Beverly,ΜΑ)中與malE基因形成一種符合讀碼框的融合蛋白，用于表達(dá)麥芽糖結(jié)合蛋白MBP-AtPK220L292F(p)和MBP_AtPK220 (P)。融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，采用淀粉親和層析法進(jìn)行純化，如制造商(New England Biolabs)所述。含有融合蛋白的組分經(jīng)匯集和濃縮(Centripr印-30濃縮器，Amicon)。采用SDS-PAGE電泳方法分析其表達(dá)水平，融合蛋白的大小和純度。
活性分析參照(Huang et al. ,2000)的方法進(jìn)行。激酶自動磷酸化分析混合物 (30 μ 1)包含激酶反應(yīng)緩沖液中蛋白激酶(50mM Tris, pH 7. 5，IOmM MgCl2, IOmM MnCl2),IyCi [γ -32ρ]ΑΤΡ 以及 IOng 純化的 AtPK220L292F (P)或 MBP_AtPK220 (P)。對于反磷酸化分析，每個檢測反應(yīng)中添加髓鞘堿性蛋白(3yg)。通過添加酶起始反應(yīng)。室溫下孵育30 分鐘后，加入30 μ 1 Laemmli樣品緩沖液終止反應(yīng)(Laemmli，1970)。樣品在95°C反應(yīng)5分鐘，然后上樣于15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠。使用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行凝膠染色，然后脫色，烘干。采用Kodak X-Omat AR膜檢測32P標(biāo)記的條帶。
野生型的MBP_AtPK220(p)融合蛋白能夠在體外活性檢測中磷酸化人工底物，表明檢測系統(tǒng)是有效的，MBP-AtPK220(p)融合蛋白具有活性能力。與此相反，hwell6的突變形式，MBP-AtPK220L292F(p)，不能催化模式底物的磷酸化反應(yīng)。單點(diǎn)突變足以消除hwell6 的AtfK220(p)基因的活性。
AtPK220全長cDNA序列的分離 1々頂數(shù)據(jù)庫中AtPK220(At2g25220)的注釋確定了 5'起始密碼子，終止信號和 3' UTR序列。注釋序列的5'部分分析表明了可選的5'序列和啟動子的位置。為了確定 AtPK220基因的5'區(qū)域以及類似的起始密碼子，使用了 SMART RACE方法(快速cDNA末端擴(kuò)增，CloneTech)。
設(shè)計特異性的引物SEQ ID NO :108，用于5，RACE，得到了 450bp的PCR產(chǎn)物。由 450bp的PCR產(chǎn)物測序得到的數(shù)據(jù)表明，TAIR中注釋的AtPK220缺失了 5，端的186bp，其中包括39bp的5' UTR區(qū)序列和147bp的編碼序列。在TA^的基因組注釋中，還缺失了一個位于AtPK220起始密碼ATG的上游324bp的內(nèi)含子。
將5 ‘ RACE結(jié)果和TA^數(shù)據(jù)庫注釋相組合，得到全長的AtfK220的cDNA序列 (SEQ ID NO 9)。該序列被確定長度為lM2bp，其中包括39bp的5' UTR, 204bp的3' UTR 和1299bp的編碼區(qū)。該AtH(220編碼區(qū)被確定為序列SEQ ID NO :1，編碼432個氨基酸的蛋白質(zhì)，如序列SEQ ID N0:2所示。比較AtfK220和其最接近的同源基因，At4g32000，結(jié)果顯示在AtH(220中存在51bp的額外序列，包括序列SEQ ID NO 9的368-418核苷酸序列。 這個序列提供了一個用于下調(diào)構(gòu)建體的靶序列，該構(gòu)建體被設(shè)計用來專門下調(diào)AtfK220基因，而不是非-靶基因，如At4g32000。
AtPK220的序列分析表明，該絲氨酸/蘇氨酸激酶屬于類受體蛋白激酶家族，具有信號肽(1-29)，胞外域(30-67)，單跨膜域(68-88)，ATP結(jié)合域(152-175，由Prosite 測定)，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性域067-279，由MterPro法測定)以及一個激活環(huán) (289-298,303-316)。
AtPK220 恢復(fù) hwell6 突變株 構(gòu)建野生型AtPK220表達(dá)的構(gòu)建體，并將之轉(zhuǎn)化至hwell6突變株。構(gòu)建體在CaMV 35S啟動子作用下進(jìn)行組成型表達(dá)，并稱構(gòu)建體為35S-AtPK220。
35S-AtPK220 使用引物對SEQ ID NO :109和SEQ ID NO :110，擴(kuò)增的片段包含全長的AtPK220開放閱讀框(ORF)。使用引物對SEQ ID NO :111和SEQ ID NO :110，擴(kuò)增的片段包含AtH(220 的一部分0RF。擴(kuò)增的片段用限制性內(nèi)切酶Sma I和BamH I消化，并克隆至經(jīng)相同的限制性內(nèi)切酶消化的PEGAD載體。經(jīng)PCR及隨后的限制性酶切產(chǎn)生的包含AtPK220全長開放閱讀框的片段如序列SEQ ID N0:10所示。經(jīng)PCR及隨后的限制性酶切產(chǎn)生的包含部分AtfK220 的ORF的片段如序列SEQ ID NO 11所示。
35S-AtPK220構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至擬南芥hwell6中。轉(zhuǎn)基因株被恢復(fù)并推進(jìn)到T3純合品系。測試這些品系的抗旱性和水分利用效率特征。35S-AtPK220構(gòu)建體恢復(fù)了野生型的表型。
T-DNA敲除品系及生理評估 AtPK220及兩個相近的的同源基因的SALK T-DNA敲除品系，通過ABRC獲得并推進(jìn)純合性。兩個基因的 TAIR 登錄號為 AT4G32000(SEQ ID NO :16)和 AT5G11020 (SEQ ID NO: 18)。它們?nèi)缦滤校? AtPK220 :SALK147838 ； AtPK32000 (AT4G32000) :SALK_060167，SALK_029937 and SALK_121979 ； AtPKl 1020(AT5G1 1020) :SAIL_1260_H05 經(jīng)RT-PCR或Northern檢測分析基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明，敲除株的目的基因顯著減少或者完全消失。這些基因敲除品系用于生理評估。只有AtfK220(SAL_147838)的基因敲除品系具有有顯著的抗旱性和較高的水分利用效率，表明AtPK220是目的基因并負(fù)責(zé) hwell6的水分利用效率表型。密切相關(guān)的基因AT4G32000和AT5G11020是非功能性冗余的，這些基因的抑制不足以產(chǎn)生hwell6表型型。
擬南芥中冊220蛋白活性的抑制 基因活性的抑制可以通過多種方式的技術(shù)方法獲得，例如，反義表達(dá)，RNAi或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，體內(nèi)突變，顯性負(fù)向途徑或者制備突變種群，通過篩選方法選擇適當(dāng)?shù)钠废档取Ｋ峁┑睦诱f手段，這里提供的所述方法的離子用于制備具有抑制PK220基因的表達(dá)或活性的植物。
通過RNAi 下調(diào) PK220 使用發(fā)夾(HP)構(gòu)建體設(shè)計用于H(220的RNAi抑制。構(gòu)建體由AtH(220 cDNA序列的 288bp 或 154bp 組成，分別稱之為(270)PK220 和(150)PK220。288bp ^ (270)PK220 片段含有IObp的內(nèi)含子序列，在構(gòu)建這些PCR產(chǎn)物的過程中包含在PCR引物中?？梢允褂眠@些片段構(gòu)建載體，在所選的啟動子的控制下來驅(qū)動表達(dá)，此過程對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見。在這些實(shí)施例中，組成型啟動子(35S CaMV)，或天然AtfK220啟動子(PPK)被使用。AtPK220基因的兩個片段，或部分被選擇，以最接近的同源At4g32000為對照，AtPK220 的不同區(qū)域被選定，首先是的Q70)PK220片段(SEQ ID NO 13)，第二是154bp的 (150)PK220 片段(SEQ ID NO: 12)。
35S-HP-At(270)PK220 及 35S_HP_At(150) H(220 發(fā)夾結(jié)構(gòu)(HP)35S-HP-At Q70) PK220 和 35S_HP_At (150) PK220 構(gòu)建體的生成如下。分別采用引物對 SEQ ID NO :134/SEQ ID NO :115 禾口 SEQ ID NO :114/SEQ ID NO :115 進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到(270)PK220和(150) ΡΚ220的正義片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)&ic I酶切，并分別插入到二元載體pBI121t⑶S的Mc I位點(diǎn)。由此產(chǎn)生的載體隨后用于亞克隆O70) PK220和(150) PK220的反義片段，反義片段分別采用引物對SEQ ID NO :112/SEQ ID NO: 117和SEQ ID NO :116/SEQ ID NO :117進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到。載體和PCR產(chǎn)物都用BamH I和Xba I消化用于亞克隆。
Pre-HP-At (270) PK220 及 Pre-HP-At (150) PK220 Ppk-HP-At (270) PK220 和 Pre-HP-At (150) PK220 構(gòu)建體分別由；35S-HP_At (270)
18PK220 或;35S-HP-At(150)PK220 制備得到，通過使用 AtPK220 啟動子序列(SEQ ID NO 14) 替換35S啟動子序列。通過Hind III和)(ba I雙酶切將35S啟動子序列從35S_HP_At (270) PK220和35S-HP-At (150)PK220除去。線性化的質(zhì)粒然后用DNA聚合酶I的Klenow片段產(chǎn)生平末端并自我連接，形成一個新的質(zhì)粒，其中的)(ba I位點(diǎn)恢復(fù)，而Hind III位點(diǎn)消失。 使用該恢復(fù)的)(ba I位點(diǎn)，一個AtfK220啟動子的NheI DNA片段被克隆至HP-At (270)和 HP-At (150)序列的上游，產(chǎn)生最終的質(zhì)粒 Pre-HP-At (270)H(220 和 Pre-HP-At (150)H(220。 AtfK220啟動子序列(SEQ ID NO 14))從擬南芥(哥倫比亞型)的基因組中進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 使用引物對 SEQ ID NO :135/SEQ ID N0:136。
P4790-HP-At (270) PK220 為了特異性下調(diào)內(nèi)源性AtfK220，強(qiáng)力的根系啟動子P479tl被鑒定發(fā)現(xiàn)在擬南芥的根中能高表達(dá)，特別是在內(nèi)皮層，周皮層和軸管中。P479tl啟動子與At2g44790編碼序列相關(guān)， P4790的表達(dá)特征與野生型AtPK220的表達(dá)是相似的。該P(yáng)479tl用于替換35S-HP-At (270) PK220 中的35S啟動子。以擬南芥(Col)為模板，使用引物SEQ ID NO :151和SEQ ID NO :152擴(kuò)增At2g44790。擴(kuò)增的啟動子片段為1475bp長，正好位于TA^注釋中At2g44790的起始密碼子ATG的上游。1475bp的P479tl片段被確定為SEQ ID N0:150。通過引物設(shè)計在啟動子的 5’和3’端引入Hind III和Xba I酶切位點(diǎn)。通過HindIII/Xbal雙酶切，將啟動子序列替換35S-HP-At(270)H(質(zhì)粒中的35S啟動子，得到最終的構(gòu)建體pBI-P4790-HP_At (270) H(。
使用RNAi下調(diào)油菜中的BnPK220 35S-HP-Bn(340)PK 為了下調(diào)油菜種屬中的AtfK220同源基因，制備了一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)，采用BnPK220的 338bp的片段(SEQ ID NO ；153)作為正義和反義部分，pBI300t⑶S作為載體。根據(jù)&JK220 序列設(shè)計兩對具有獨(dú)特酶切位點(diǎn)的引物SEQ ID NO :154/SEQ ID NO :155;以及SEQ ID NO: 156/SEQ ID N0:157。以甘藍(lán)型油菜的cDNA為模板分別用兩對引物擴(kuò)增338bp長的PCR 片段。McI片段插入到pBI300t⑶S載體的McI位點(diǎn)，以反義方向位于t⑶S間隔區(qū)的下游。產(chǎn)生的質(zhì)粒，隨后在)(bal和BamHI位點(diǎn)用于以正義的方向克隆^CbaI-BamI片段。載體pBI121t⑶S經(jīng)內(nèi)部的NPTII篩選標(biāo)記基因修飾，命名為pBI300。pBI121載體內(nèi)的NPT II基因含有一個點(diǎn)突變(3383位置的G到T，氨基酸改變E182D)。為了將基因恢復(fù)到野生型版本，該載體的NheI-BstBI片段Q715-3648位置)被來自于質(zhì)粒pRD400的相應(yīng)的 NheI-BstBI 片段所替換(PNAS，87 :3435-3439,1990 ；Gene, 122 :383-384,1992)。
P4790-HP-Bn (340) PK At2g44790的P479tl啟動子用于控制發(fā)夾結(jié)構(gòu)的表達(dá)來下調(diào)油菜種屬的內(nèi)源性 BnPK220o 質(zhì)粒;35S-HP_Bn (340) I3K 經(jīng) Hind III 和 Xba I 酶切后，用 P479tl 啟動子替換 35S 啟動子。
通過反義下調(diào)H(220 制備構(gòu)建體35S—antisenseAtPK220用來通過反義下調(diào)AtH(220的表達(dá)。使用引物對SEQ ID NO :106/SEQ ID NO 113進(jìn)行PCR產(chǎn)生反義片段。合成的產(chǎn)物用BamHI和XbaI 消化產(chǎn)生一個1177bp的序列，含有1160bp的AtH(220基因(SEQ ID NO: 11)。包括有，5' 端IObp的內(nèi)含子序列，以及從PCR引物中保留的3'端7bp的3' UTR序列。以與35S啟動子反義的方向，將1177bp的片段克隆到pBI121 w/o⑶S載體上的BamHI和)(baI位點(diǎn)。
通過AmiRNA 下調(diào) PK220 構(gòu)建一個人造小RNA(amiRNA)用于在擬南芥中下調(diào)AtPK220的表達(dá)。以擬南芥(Col)基因組為模板，利用PCR擴(kuò)增擬南芥中包含micr0RNA319a基因的DNA片段(SEQ ID NO :148)，引物為 SEQ ID NO :141 和 SEQ ID NO :142。miR319a 的骨架然后用于構(gòu)建 amiRPK220 (SEQ ID NO 149)，其中，利用重組PCR方法將miRNA319a中正義及反義方向的 21bp的片段用AtPK220中的21bp的DNA片段替換。設(shè)計三對引物用于構(gòu)建過程SEQ ID NO :141/SEQ ID NO :144 ；SEQ ID NO :143/SEQ ID NO :146 以及 SEQ ID NO :145/SEQ ID NO 142。最后的PCR產(chǎn)物用BamHI和)(baI酶切，然后克隆到載體pBI121w/o⑶S中，用于轉(zhuǎn)化擬南芥或選擇的其他植物物種。
通過顯性-隱性策略抑制冊220 35S-AtPK220L292F 為了非功能AtPK220序列的表達(dá)，用RT-PCR擴(kuò)增來自hwe 116的AtPK220L292F， 采用正向和反向引物SEQ ID N0:118和SEQ ID NO 1100 PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamHI 和XbaI消化(SEQ ID NO :121)，連入雙元載體pB1121w/oGUS。SEQ ID NO :121的序列包含 AtPK220L292F開放閱讀框(SEQ ID NO :3)，在5'端多了 3bp，以及3'端多了 7bp，這是從 UTR序列(SEQ ID NO :121)中衍生出來的。最終的構(gòu)建體，35S_AtPK220L292F，用于產(chǎn)生擬南芥和油菜轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)一步得到純合體用于生理評估。此外，載體用來轉(zhuǎn)化所選的植物品種，可以是雙子葉植物或單子葉植物。
P4790-AtPK220L292F 根啟動子P479tl的HindlII-XbaI酶切片段，用于替換pBI300中的35S啟動子，然后 AtPK220L292F序列通過XbaI和BamHI消化置于P479tl的下游，來產(chǎn)生P479tl-驅(qū)動的顯性-隱形構(gòu)建體。所得的質(zhì)粒，然后用于油菜的轉(zhuǎn)化。此外，載體用來轉(zhuǎn)化所選的植物品種，可以是雙子葉植物或單子葉植物。
利用RNAi下調(diào)單子葉植物的AtfK220同源基因 PBdUBQ—HP—Bd(272)PK 構(gòu)建一個表達(dá)盒，插入到連個不用的載體骨架中，第一個是插入到pUCAP載體的 PacI-AscI 位點(diǎn)，第二個是插入到 pBF012 載體的 PacI-AscI 位點(diǎn)。pBF012 與 pBINPLUS/ARS 是基本相同的，除了通過FseI消化及自我連接，切除了馬鈴薯-Ubi3驅(qū)動的NPTII表達(dá)盒。
二穗短柄草的H(220(BdPK220)被擴(kuò)增，使用不同的引物組合SEQ ID NO :158(bffET XbaI F)加SEQ ID NO :159 (bffET BamHI R)，引物中分別含有XbaI位或BamHI位點(diǎn)，以及 SEQ ID NO :158(bWET XbaI F)力口 SEQ ID NO 160 (bWET ClaI R)，引物中分別含有XbaI 位或 ClaI位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化后，得到272bp的片段(SEQ ID NO :161)。
發(fā)夾間隔序列，BdWx內(nèi)含子1 (SEQ ID NO :164)，被擴(kuò)增，使用引物SEQ ID N0: 162 (bffx BamHI F)加 SEQ ID NO :163(bffx ClaI R)，引物中分別含有 BamHI 位點(diǎn)或 ClaI 位點(diǎn)，然后用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化。二穗短柄草的fe基因是水稻蠟質(zhì)基因GBSS的同源基因，盡管內(nèi)含子的保守性較小。
三個片段連接到一起，插入到pUCAP載體的多克隆位點(diǎn)，產(chǎn)生了兩側(cè)分別為方向相反的BcK272)PK220靶序列包圍的Bdffx內(nèi)含子1序列。二穗短柄草泛素(BdUBQ)啟動子包含一個內(nèi)部的BamH I位點(diǎn)，因此，使用引物SEQ ID NO :200 (WET BamH I endl)和SEQID NO :165 (WET BamH I end2)擴(kuò)增RNAi結(jié)構(gòu)盒，這會產(chǎn)生BamH I粘性末端而不需要消化。RNAi的BamH I片段，然后連接至pUCAP的BamH I位點(diǎn)，載體中已經(jīng)包含BdUBQ啟動子和BdUBQT終止子，產(chǎn)生中間克隆pBF067。使用引物SEQ ID NO 166 (BdUBQ PvuI F)和SEQ ID NO 167 (BdUBQT PacI R)擴(kuò)增pBF067中完整的插入片段，經(jīng)PVuI和PacI消化，隨后連接至pUCAP或pBF012載體的I^acI位點(diǎn)，載體中在AscI-PacI位點(diǎn)處已經(jīng)包含一個BdG0S2 驅(qū)動的突變NPTII篩選標(biāo)簽，分別得到質(zhì)粒PBF108和pBF109。該NPTII突變基因常見于克隆載體。只有一個堿基對與野生型不同。
此表達(dá)盒位于pUCAP的I^acI-AscI位點(diǎn)，用于構(gòu)建穿梭/轟炸載體PBF108，以及位于pBF012的I^acI-AscI位點(diǎn)用于構(gòu)建雙元載體raF109。
PBdUBQ—HP—Pv(251)PK 構(gòu)建了一個表達(dá)盒插入到兩個不同的載體骨架中，第一個是插入到pUCAP載體的 PacI-AscI位點(diǎn)，第二個是插入到pBF012載體的I3acI-AscI位點(diǎn)。柳枝稷的PK220基因中長 25Ibp的片段(Pv(251)PK220)被定義為SEQ ID NO 168，用不同的引物組合進(jìn)行擴(kuò)增=SEQ ID NO 169 (PvffET XbaI F)力口 SEQ ID NO 170 (PvffET BamHI R)以及 SEQ ID NO 169 (PvffET XbaI F)力口 SEQ ID NO 17l(PvWET ClaI R)。PCR產(chǎn)物經(jīng)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化。因?yàn)殛P(guān)于PVWx內(nèi)含子1序列的信息不存在，所以在本構(gòu)建物中BdWx內(nèi)含子1被用來作為間隔序列。該序列使用引物 SEQ ID NO 162 (bffx BamHI F)加 SEQ ID NO :163(bffx ClaI R)進(jìn)行擴(kuò)增并用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化。
三個片段連接到一起，插入到pUCAP載體的多克隆位點(diǎn)的^CbaI處，產(chǎn)生了兩側(cè)分別為方向相反的Pv 051) PK220靶序列包圍的BdWx內(nèi)含子1序列。因?yàn)闆]有可用的PvUBQ啟動子序列，因此在本構(gòu)建體中使用了 BdUBQ的啟動子和終止子。該BdUBQ子含有一個內(nèi)部的 BamH I 位點(diǎn)，因此，使用引物SEQ ID NO 172 (PvffET BamHI endl)禾口 SEQ ID NO 173 (PvffET BamHI end2)擴(kuò)增RNAi結(jié)構(gòu)盒，這會產(chǎn)生BamH I粘性末端而不需要消化。RNAi的BamH I 片段，然后連接至PUCAP的BamH I位點(diǎn)，載體中已經(jīng)包含BdUBQ啟動子和BdUBQT終止子，產(chǎn)生中間克隆 PBF152。使用引物 SEQ ID NO 166 (BdUBQ PvuI F)和 SEQ ID NO 167 (BdUBQT PacI R)擴(kuò)增pBF152中完整的插入片段，經(jīng)PVuI和I^acI消化，隨后連接至pUCAP或pBFO 12 載體的PacI位點(diǎn)，載體中在Asc I-PacI位點(diǎn)處已經(jīng)包含一個BdG0S2驅(qū)動的野生型NPTI，分別得到質(zhì)粒pBF169和pBF170。
PsbUBQ—HP—Sb(261)PK 構(gòu)建了一個表達(dá)盒插入到兩個不同的載體骨架中，第一個是插入到pUCAP載體的 PacI-AscI位點(diǎn)，第二個是插入到pBF012載體的PacI-AscI位點(diǎn)。雙色高粱H(220基因 (SbPK220)中長沈Ibp的片段(SbQ61)H(220)被定義為SEQ ID NO :174，用不同的引物組合進(jìn)行擴(kuò)增:SEQ ID NO 175 (SbffET XbaI F)加 SEQID NO 176 (SbffET BamHI R)以及 SEQ ID NO 175 (SbffET XbaI F)加 SEQ ID NO 177 (SbffET ClaI R)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化得到Sb(261)PK220片段。發(fā)夾間隔序列，Sbffx內(nèi)含子1 (SEQ ID NO :178)，被擴(kuò)增， 使用引物 SEQ ID NO 179 (SbffxBamHI)加 SEQ ID NO 180 (Sbffx ClaI R)，然后用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化。三個片段連接到一起，插入到PUCAP載體的多克隆位點(diǎn)的^CbaI處，產(chǎn)生了兩側(cè)分別為方向相反的SbTOT靶序列包圍的Sbffx內(nèi)含子1序列。使用引物SEQ ID NO 181 (SbffET BamHI end 1)和 SEQ ID NO 182 (SbffET BamHI end2)，通過 PCR 擴(kuò)增在 RNAi 表達(dá)盒上加上BamH I粘性末端。RNAi的BamH I片段，然后連接至pUCAP的BamH I位點(diǎn)，載體中已經(jīng)包含BdUBQ啟動子和BdUBQT終止子，產(chǎn)生中間克隆pBF151。使用引物SEQ ID NO: 192 (SbUBQ PvuI F)和 SEQ ID NO :167 (BdUBQT PacI R)擴(kuò)增 pBF151 中完整的插入片段， 經(jīng)PVuI和I^acI消化，隨后連接至pUCAP或pBF012載體的I^acI位點(diǎn)，載體中在AscI-PacI 位點(diǎn)處已經(jīng)包含一個BdG0S2驅(qū)動的野生型NPTII，分別得到質(zhì)粒pBF158和pBF171。
使用引物SEQID NO :184(SbG0S2 HindlII F)禾口 SEQ ID NO 185 (SbG0S2 HindlII R)，利用PCR擴(kuò)增來自于高粱基因組序列中被鑒定為SbG0S2啟動子的序列，G0S2啟動子的一個IOOObp的片段，被確定SEQ ID NO 183，用PCR擴(kuò)增并使用HindlII酶切位點(diǎn)克隆。
使用引物SEQID NO 187 (SbUBQ PstI F)禾口 SEQ ID NO 188 (SbUBQ PstI R)，利用 PCR擴(kuò)增來自于高粱基因組序列中被鑒定為SbUBQ啟動子的序列，UBQ啟動子的一個IOOObp 的片段，被確定SEQ ID NO: 186，用PCR擴(kuò)增并使用Pst I酶切位點(diǎn)克隆。
使用引物SEQ ID NO 190 (SbUBQT KpnI F)和 SEQ ID NO 191 (SbUBQT KpnI R)， 利用PCR擴(kuò)增來自于高粱基因組序列中被鑒定為SbUBQ終止子的序列，UBQ終止子的一個 239bp的片段，被確定SEQ ID NO 189，用PCR擴(kuò)增并使用Kpn I酶切位點(diǎn)克隆。
巨芒草(MgH(220)RNA 干擾 通過發(fā)夾策略設(shè)計用于下調(diào)的表達(dá)載體的構(gòu)建可遵循同樣的策略制定，如上所述。得到的構(gòu)建體可能包含以下元件，一個BdG0S2-wtNPT11-BdUBQT篩選標(biāo)簽表達(dá)盒以及一個BdUBQ-(MgPK220發(fā)夾-RNAi表達(dá)盒)_BdUBQT，位于所選的載體中，例如pUCAP和 PBF012。
AtPK220啟動子的分離和克隆 使用擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)基因組DNA為模板，用PCR的方法分離AtPK220 啟動子。5'端引物，SEQ ID NO :119，依據(jù)相鄰基因設(shè)計，3'端引物，SEQ ID N0:120，位于 AtPK220基因起始密碼子ATG上游25bp處。將擴(kuò)增產(chǎn)物用BamH I和Sma I消化，克隆至 PBllOl中。酶切消化片段，SEQ ID NO 14，長度為1510bp。得到的構(gòu)建體命名為PAtPK22(1-GUS。
使用⑶S分析檢測AtfK220啟動子的活性 利用花朵浸漬法將PAtPK22(rGUS轉(zhuǎn)化至擬南芥植物中，轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)步至T3純合性。收集T3開花植物的各種組織，包括幼苗，葉，莖，花，角果和根，在X-Gluc溶液中37°C過夜染色，用乙醇溶液脫色，在顯微鏡下檢查。結(jié)果表明，AtPK220啟動子主要在根組織的內(nèi)皮層和周皮層細(xì)胞中表達(dá)，也在葉毛和萌發(fā)種子的種皮中有所發(fā)現(xiàn)。觀察結(jié)果的重要意義在于，PAtPK220-GUS基因的表達(dá)是受到水分脅迫抑制的。
擬南芥AtfK220蛋白的亞細(xì)胞定位 在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)一個全長野生型AtfK220-GFP用于測定天然蛋白的亞細(xì)胞定位。由引物對SEQ ID NO :109和SEQ ID NO :110擴(kuò)增產(chǎn)生的片段用Sma I和BamH I 消化，得到一段含有AtfK220全長開放閱讀框的片段，如SEQ ID NO 10所示，克隆至pEGAD 質(zhì)粒的SmaI和BamHI位點(diǎn)，位于綠色熒光蛋白(GFP)下游，編碼框相對應(yīng)。此外，使用引物對SEQ ID NO :198和SEQ ID NO :199，擴(kuò)增AtPK220編碼序列，通過Age I酶切pEGAD質(zhì)粒及擴(kuò)增的AtPK220片段，將AtPK220插入GFP的上游，并與GFP編碼框相對應(yīng)。
將35S-GFP-AtPK220和35S_AtPK220_GFP構(gòu)建體，轉(zhuǎn)化至擬南芥植株中，純合的轉(zhuǎn)基因植株(根組織)被用于在熒光共焦顯微鏡下進(jìn)行GFP信號的篩查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沿細(xì)胞質(zhì)膜檢測到綠色熒光，這表明AtPK220蛋白是與根的細(xì)胞膜有關(guān)，并且AtfK220的功能可能是，作為對感知的受體激酶或環(huán)境信號傳感器。
通過5'和3' RACE分離甘藍(lán)型油菜的&JK220 為了從油菜中分離AtfK220的同源基因，利用AtfK220序列在NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫 (nr/nt,est)以及TIGR(DFCI)甘藍(lán)型油菜EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST搜索(BlastN)。基于最高相似度的序列，設(shè)計一對引物，SEQ ID NO :122和SEQ ID NO 123，用來PCR擴(kuò)增BnPK220 的一部分片段。使用甘藍(lán)油菜葉片中分離的mRNA和基因組DNA作為這些擴(kuò)增反應(yīng)的模板。 通過PCR，以油菜基因組DNA為模板，得到一個約500bp的DNA片段。該P(yáng)CR產(chǎn)物序列分析表明，它與AtPK220的核苷酸序列以及內(nèi)含子組成方面具有高度同源性。
基于&ιΗ(220的部分序列，進(jìn)行了 5'和3' RACE用來分離&ιΗ(220的全長cDNA。 對于3' RACE，使用正向引物SEQ ID NO 124，以及嵌套引物SEQ ID NO :125。對于5' RACE, 設(shè)計了向引物SEQ ID NO 126，以及嵌套引物SEQ ID N0:127。用于3' RACE或5' RACE 的RACE-ready cDNA是由甘藍(lán)型油菜嫩葉片中分離的RNA制備的。
5' RACE產(chǎn)生的擴(kuò)增DNA片段長度約為650bp ;3' RACE產(chǎn)生的約為Ikb大小。這兩種RACE片段額序列分析表明，其與AtfK220具有高度的序列相似性。通過組合5' RACE、 部分BnPK220片段以及3' RACE產(chǎn)物，得到BnPK220序列的全長mRNA。
使用PCR 引物 SEQ ID NO :128 和 SEQ ID NO 129，通過 RT-PCR 方法擴(kuò)增 BnPK220 的全長cDNA。該cDNA含有1302個核苷酸組成的開放閱讀框(SEQ ID NO 25)，編碼433個氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID N0:26)。使用來自甘藍(lán)型油菜的cDNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到另一個 BnPK220 的全長 cDNA。該 cDNA(SEQ ID N0:193)與 SEQ ID NO :25 的同源性為 98. 6%， 編碼的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 194)與SEQ ID NO 26的同源性為99. 3%0 利用5' RACE分離大豆的全長GmPK220 通過NCBI的EST數(shù)據(jù)庫的BlastN分析檢索，發(fā)現(xiàn)一個AtfK220的同源物，是大豆 (櫓豆)的EST基因，登錄號為CX709060. 1。根據(jù)這個同源物，從大豆EST數(shù)據(jù)庫中檢索到含有13個EST的單一基因簇。由這13個EST組成的一個重疊群，涵蓋了大多數(shù)的基因序列。
通過該重疊群以及5' RACE和3' RACE結(jié)果的組合，確定了 GmPK220的全長序列(SEQ ID N0:41)。進(jìn)行 5' RACE，引物 SEQ ID NO 130 用于首次 RACE PCR，引物 SEQ ID NO :131用于嵌套RACE PCR。進(jìn)行3' RACE，引物SEQ ID NO :137用于首次RACE PCR，引物 SEQ ID NO :138用于嵌套RACE PCR。GmPK220編碼的蛋白質(zhì)如SEQ ID NO :42所示。
通過數(shù)據(jù)庫檢索分離0sPK220 (大米)序列 水稻基因組(Oryza sativa，粳稻品種)已經(jīng)完全測序并公開提供。通過水稻EST 數(shù)據(jù)庫的BLAST搜索以及基因組序列數(shù)據(jù)庫的BLASTp搜索，確定了 AtPK220在水稻中的同源基因。具有最高得分的目的序列被確定為登錄號0s05g0319700。
0s05g0319700 簡稱為 0sPK220，如 SEQ ID NO :59 所示，編碼的蛋白質(zhì)如 SEQ ID NO 60所示。
ZmPK220 (玉米)序列的分離 通過TIGR的EST數(shù)據(jù)庫的BLAST搜索，發(fā)現(xiàn)了兩個候選同源基因，一個是單一基因登錄號TC333547，第二個登錄號是C0439063。
登錄號TC333547的長度為2125個核苷酸，包含一個1377個核苷酸的開放閱讀框 (SEQ ID NO :77)，編碼458個氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO :78)。翻譯的蛋白是全長的，比 AtPK220稍大。C-端激酶結(jié)構(gòu)域與擬南芥和玉米的蛋白序列是高度保守的，然而，N-端序列的變數(shù)較多。
C0439063是一個簡短的EST序列，缺少了 5 ‘端的序列。通過RACE方法獲得缺失的序列。依據(jù)C0439063和AtPK220之間的對比校準(zhǔn)，設(shè)計兩個5 ‘ RACE引物。首次5 ‘ RACE 引物為SEQ ID NO :132和嵌套5' RACE引物為SEQ ID N0:133。同樣進(jìn)行3' RACE，引物 SEQ ID NO :139 用于首次 RACE PCR，引物 SEQ ID NO :140 用于嵌套 RACE PCR?；?5，RACE 和3，RACE結(jié)果以及C0439063EST序列，組合得到ZmPK220(SEQ ID NO :79)序列。相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO 80所示。
序列分析表明，與TC333547相比，C0439063與水稻0sH(220有較高的序列相似性。
二穗短柄草(Bd)BdPK220序列的分離 短柄草是模式單子葉植物之一，主要用于功能基因組研究。從公共ESTs或GSk 組合得到重疊群，根據(jù)同源比對，它涵蓋了 BdPK220的3'部分。根據(jù)重疊群設(shè)計引物 Bd8IRARl (SEQ ID NO 195)和 Bd81RAR2 (SEQ ID NO 196)，使用短柄草葉片的 cDNA 進(jìn)行RACE反應(yīng)，得到了約650bp的單一片段。將RACE序列和重疊群進(jìn)行組合，得到了全長 BdPK220序列(SEQ ID NO : )，它編碼一個461個氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO :197)。
通過數(shù)據(jù)庫檢索確定(}SH(220 (棉花)序列 通過棉花(Gossypium) TIGR-EST數(shù)據(jù)庫的BLAST搜索，確定了一個序列簇，定義登錄號TC79117，其與AtPK220具有很高的相似性。這個序列簇具有有兩個重疊的EST序列， TC79117在這里被稱為(}SH(220，由1086個核苷酸的開放閱讀框組成(SEQ ID NO :81)。最大的開放閱讀框編碼361個氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID N0:82)。
在限水條件下，hwell6突變體耐旱表型的發(fā)現(xiàn)，以及在干旱和最適條件下具有高水分利用效率 兩組植物生長(每個3英寸的盆5株，裝有等量的無土栽培混合液)在最適條件的生長箱中(22°C，18hr光照，150uE，相對濕度70% )，直到開花的第一天(n = 6/項(xiàng)目/處理)。從第一朵花開，所有的植物提供相同數(shù)量的水(最優(yōu)級)，但一組植物用于最適處理， 另一組用于干旱處理。在最適處理中，每天稱量盆重，測定每日的水分損失，然后澆水回升到最適水平。在干旱處理中，每天稱量盆重，測定水分損失，并允許干旱。在第0，2和4天收獲干旱和最適處理?xiàng)l件下的植物，來進(jìn)行芽苗生物量測定。與對照相比，在干旱條件下， 相對于芽苗干重，較低的水分損失表示耐旱的表型。在處理期間，累積的芽苗干重與水分損失的比率，提供了水分利用效率(WUE)的測定方法。植物hwell6推遲了 1至2天開花。在干旱條件下，hwell6的相對芽苗生物量的水損失值，明顯比親本對照低(22%)。這一結(jié)果表明，該突變體是耐旱的。另外還發(fā)現(xiàn)，在最適條件下，hwell6突變株的相對芽苗生物量的水損失值，同樣明顯比親本對照低(41%)。這一結(jié)果與較高的水分利用效率的表型是一致的。效率的計算表明，在干旱(表1)和最適(表2)兩種條件下，突變體hwell6水分利用更有效，因?yàn)樗幂^少的水積累了更多的芽苗生物量(干旱)，或同樣的生物量而使用較少的水(最適)。
表1干旱條件下的水分利用效率(WUE)
權(quán)利要求
1.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包含使用載體來轉(zhuǎn)化植物、植物組織培養(yǎng)物、或植物細(xì)胞，載體中含有一種核酸構(gòu)建物能夠抑制PK220基因的表達(dá)或活性，從而獲得PK220表達(dá)或活性水平降低的植物、組織培養(yǎng)物或植物細(xì)胞。從植物組織培養(yǎng)物或植物細(xì)胞中培育或再生所述的植物，其中水分利用效率提高的植物被制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，所述的核酸構(gòu)建體包含一個編碼H(220多肽的核酸序列的反義序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，所述的核酸構(gòu)建體包含一個組成型啟動子，誘導(dǎo)型啟動子或組織特異性啟動子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中，組織特異性啟動子是一個根啟動子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中核酸構(gòu)建體包含長度至少為21個核苷酸的H(220序列或其互補(bǔ)序列。
6.由權(quán)利要求1-5中任一方法制備的植物。
7.—種轉(zhuǎn)基因種子，由權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因植物制備，其中，所述的種子產(chǎn)生的植物具有相對于野生型植物增加的水分利用效率。
8.一種植物，該植物在H(220基因中具有一個非天然存在的突變，其中，所述的植物具有降低的PK220表達(dá)或活性，并且所述的植物相對于野生型對照，具有提高的水分利用效率。
9.一種種子，由權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因植物制備，其中，所述的種子產(chǎn)生的植物具有相對于野生型植物增加的水分利用效率。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過對植物內(nèi)部基因表達(dá)的操作，獲得所需植物表型的方法。該方法涉及抑制PK220基因的表達(dá)水平或者活性的手段，相對于野生型對照植物，其中所需的表型例如水分利用率有所提高。本發(fā)明還涉及到核酸序列以及有用的構(gòu)建物等方法，以及構(gòu)建和分離具有降低的PK220表達(dá)或活性的植物的方法。
文檔編號C12N15/82GK102203261SQ200980131323
公開日2011年9月28日 申請日期2009年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月13日
發(fā)明者萬江欣, 黃雅凡, 楊書軍, 蒙妮卡·庫澤馬 申請人:波夫曼斯種植公司