高效有機肥料及其組分的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種肥料，其包含至少一種選自由綠色木霉(NRRL?B-50520)、短尾帚霉(NRRL?B-50521)、短尾帚霉(NRRL?B-50522)及其組合組成的組的微生物；和由所述至少一種微生物施加作用以釋放氮的底物。本發(fā)明還涉及一種肥料，其包含至少一種選自角蛋白降解微生物的微生物和由所述至少一種微生物施加作用以釋放氮的角蛋白底物。本發(fā)明還涉及一種使用所述肥料來增強植物生長的方法，以及制造肥料的方法。本發(fā)明還涉及一種分離的綠色木霉菌株(NRRL?B-50520)和兩種分離的短尾帚霉菌株(NRRL?B-50521，NRRL?B-50522)。
【專利說明】高效有機肥料及其組分
[0001] 本申請要求2011年11月23日提交的美國臨時專利申請序列號61/563, 355的權 益，該申請在此通過引用整體并入。
[0002] 本申請的主題在來自美國國家科學基金會的批準號0945724的支持下做出。政府 對本發(fā)明具有一定的權利。 發(fā)明領域
[0003] 本發(fā)明涉及高效有機肥料及其組分。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 用于草坪和其它用途的肥料往往由提供氮、磷和鉀的鹽的無機混合物組成。用于 不同用途的肥料可能是液體或固體，并且含有廣泛范圍的氮：磷：鉀（"N :P :K")，以及根據 產品預定用途的其它植物營養(yǎng)物。通常，肥料制品主要由無機化合物的鹽組成，所以不適合 于有機狀態(tài)。
[0006] 許多傳統(tǒng)的肥料制品功能非常完善。然而，由于這些肥料釋放高水平的硝酸鹽進 入地下水而導致污染水，所以這些肥料制品越來越受到關注。一種肥料制品具有32:2:8 (% Ν:Ρ20:Κ205)的配方。對于此包裝的分析表明，在這32%中，3. 8%是銨化合物，53%是尿素， 39%是水溶性的Ν，并且3. 8%是其它Ν。如果這些化合物沒有被植物吸收，硝酸鹽和尿素 可立即用于滲透到地下水。不幸的是，植物通常只使用約33%的所施用總氮肥（Arnall 等，"Relationship Between Nitrogen Use Efficiency and Response Index in Winter Wheat, "J. Plant Nutr. 32:502-515(2009))，而其余部分可被代謝為氮氧化物，這些氮氧化 物是強效的溫室氣體，或以硝酸鹽和亞硝酸鹽形式浸入土壤和地表水，在那里它們可能有 毒的（飲用水的EPA極限分別是lOppm和lppm)，并且在那里它們可能會產生藻類和其它微 生物的腐爛產生厭氧區(qū)的區(qū)域，在這些區(qū)域中植物、魚和其它棲住動物無法生存。需要不具 有這些不利環(huán)境影響的肥料。
[0007] 由于監(jiān)管機構對于水體富營養(yǎng)化的關注，用于草坪用途的肥料正在被改進。出于 這個原因，含磷的草坪肥料被一些地方禁止。硝酸鹽是至少與磷一樣嚴重的污染物，并且許 多地方，如長島，打算限制這個來源的水污染。問題的嚴重性可從以下有關切薩皮克灣的 弓I文來說明（Dewar 等，"Urban Fertilizers and the Chesapeake Bay:An Opportunity for Major Pollution Reduction, Executive Summary, Environment Maryland, Research and Policy Center(2011))：
[0008] 超過26年，在切薩皮克灣地區(qū)的各州都試圖清理海灣，但它仍然因極其有害的過 量污染而堵塞。為了實現(xiàn)清潔、可持續(xù)的海灣，在海灣流域的各州必須將海灣水域的氮水平 再降低30%并且將磷再降低8% -盡管到2030年預計人口增長30%。如此規(guī)模的減少只 有政府把流域的所有營養(yǎng)物污染來源作為目標時才是可能的。
[0009] 過量的氮和磷，以及沉淀物，是海灣和流入其的水域的水質經常較差的主要原因。 約30 %的海灣的磷負荷來自于城市和郊區(qū)徑流。那些相同已開發(fā)土地占氮污染的徑流的 10%。然而，減少來自已開發(fā)土地的營養(yǎng)物徑流的措施還遠遠不夠。
[0010] 雖然馬里蘭州的監(jiān)管機構在要求農民控制來自各自田地的負載營養(yǎng)物的徑流方 面做得更好，但是該州主要忽視了該流域的主要作物：草?？v觀海灣流域，近380萬英畝為 現(xiàn)在種植草坪草，并且隨著住宅開發(fā)擴展并取代農田，種植面積也在增長。草坪草是迄今為 止馬里蘭州的最大的作物，全州栽草多達130萬英畝。與此相比，2009年馬里蘭州所有其它 作物種植面積是150萬英畝。然而，它是該州的主要作物中監(jiān)管程度最小的作物。
[0011] 當草坪草覆蓋著太多的含有氮和磷的肥料時，草坪草變成污染問題。肥料中的營 養(yǎng)物可以幫助維持健康的草坪，但是當過量時，它們會在下雨或下雪時沖到附近水體中。過 量的肥料營養(yǎng)物也可以直接滲入地下水。無論肥料是有機的或化學的，其營養(yǎng)物都會損害 海灣和當?shù)厮馈?br> [0012] 跟蹤已開發(fā)土地上的肥料使用是如此不被重視以致于該州未對它進行統(tǒng)計，但馬 里蘭州農業(yè)部的記錄顯示"非農使用"肥料銷售正在迅速趕上農場肥料銷售。最好的估計 表明，馬里蘭州的土地所有者每年在該州的草坪上施用至少8600萬磅氮肥。
[0013] 這種肥料進入河流和海灣。在巴爾的摩市郊的一個流域，研究人員發(fā)現(xiàn)一個當?shù)?河流中的營養(yǎng)物的56%來自草坪肥料。得克薩斯州、威斯康星州、明尼蘇達州、康涅狄格州 和加拿大的科學家們還證實，草坪肥料中的污染物可以顯著危害地表水質量。
[0014] 同上 1-2。
[0015] 長島的數(shù)項條例要求"因為[鎮(zhèn)區(qū)]的兒童和公民的健康、他們的水、環(huán)境和長島 海峽將會從減少使用化學肥料和草坪農藥中獲得好處，所以委員會敦促所有公民自愿避免 使用化學肥料和草坪農藥，并敦促使用有機草坪護理"。殺蟲劑/除草劑典型市政條例及規(guī) 章，康涅狄格州河聯(lián)盟。存在對于具有較低污染水可能性的有機草坪肥料的需要和潛在市 場。例如上述規(guī)章并未要求只能使用有機肥料，主要是因為不存在具有足夠性能的無污染、 有機和成本效益好的產品。
[0016] 主要使用的合成肥料在提供優(yōu)質草坪中非常有效，但它們破壞環(huán)境。不幸的是，正 如上文指出的，有機肥料本身不是靈丹妙藥。它們還可能會污染水域，因為它們仍然需要等 量的氮來提供旺盛、繁茂的草坪。通常，目前的有機肥具有嚴重的缺點。這些缺點包括不能 在施用后不久提供足夠茂盛生長的草坪，它們通常只含有7至9%的任何形式的N。這意味 著，由于使用功效取決于使用劑量，因此除非使用高的比率，否則它們不能為繁茂的綠色草 坪提供足量的N。此外，為了獲得足夠的性能，它們必須以2-6倍的Sc〇ttSR施用率來施用。 因此，重約37磅的一袋Scotts"',肥料將施肥于15, 〇〇〇平方英尺，并持續(xù)1-2個月（該公司 提倡每個生長季節(jié)施用四次）；使用低N有機肥料的等效結果將需要約3袋以提供相同的 N量。這些因素使得傳統(tǒng)的有機肥料不方便使用，當30-35磅的標準合成肥料已足夠時，顧 客通常不希望攜帶并撒施100-125磅肥料。
[0017] 需要施用這么多量的事實使得傳統(tǒng)的有機肥料不經濟。即使一袋25磅的有機肥 料比無機肥料價格稍微低一些，超過100磅的總價格也會高得多。商業(yè)無機肥料通常零售 價為約55美元一袋，而大多數(shù)有機肥料中的相同量的N將花費超過100美元。
[0018] 本發(fā)明旨在克服本領域中的這些和其它缺陷，并為傳統(tǒng)肥料的許多問題提供答案 同時為將滿足用戶的需求并且限制環(huán)境問題的新的和獨特的產品提供幾個不同的路徑。
[0019] 發(fā)明概述
[0020] 本發(fā)明涉及一種肥料，其包括至少一種選自由以下各項組成的組的微生物：綠色 木霉（Trichoderma viride)(NRRL B-50520)、短尾帚霉（Scopulariopsis brevicaulis) (NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其組合。肥料還包括由至少一種微生物施加 作用以釋放氮的底物。
[0021] 本發(fā)明的另一個方面涉及增強植物生長的方法。該方法包括提供一種肥料，其包 含至少一種選自由以下各項組成的組的微生物：綠色木霉（NRRL B-50520)、短尾帚霉（NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其組合；和由至少一種微生物施加作用以釋放氮的 底物。該方法進一步包括在與不施用肥料的植物或植物種子相比可有效地提高植物或植物 種子的生長的條件下使所述肥料與植物或植物種子接觸。
[0022] 本發(fā)明還涉及一種肥料，其包含至少一種選自角蛋白降解微生物的微生物和由至 少一種微生物施加作用以釋放氮的角蛋白底物。
[0023] 本發(fā)明的另一個方面涉及一種制造包含氨基酸和氨的肥料的方法。該方法包括提 供至少一種選自由以下各項組成的組的微生物：綠色木霉（NRRL B-50520)、短尾帚霉（NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其組合并且提供由至少一種微生物施加作用以釋放 氮的底物。該方法進一步包括在有效地使得所述至少一種微生物對底物施加作用并且產生 包含氨基酸和氨的液體懸浮液的條件下使所述至少一種微生物與底物接觸。
[0024] 本發(fā)明還涉及分離的綠色木霉菌株，其在編號NRRL B-50520下保藏于農業(yè)研究服 務培養(yǎng)物保藏中心（Agricultural Research Service Culture Collection)。
[0025] 本發(fā)明的另一個方面涉及分離的短尾帚霉菌株，其在編號NRRL B-50521下保藏于 農業(yè)研究服務培養(yǎng)物保藏中心。
[0026] 本發(fā)明的另一個方面涉及分離的短尾帚霉菌株，其在編號NRRL B-50522下保藏于 農業(yè)研究服務培養(yǎng)物保藏中心。
[0027] 本發(fā)明涉及開發(fā)可用于多種用途并且可以使來自硝酸鹽的地下水污染減至最低 或消除的高效有機肥料。它包括鑒定緩釋氮形式及其使用方法。它還包括微生物劑，這些 微生物劑可以降解氮的復雜形式，特別是從農業(yè)廢棄產物產生的蛋白質，并且將植物可利 用的氮釋放于土壤中或發(fā)酵器中。它描述了使用增強了本文所述的肥料的活性并且也提高 了植物生長和性能的作為內生植物共生體的微生物。所述肥料是遞送這些生物體的有效方 法。
[0028] 為用戶可接受的并且無污染的肥料有幾個要求。首先，需要植物能夠藉以更有效 地吸收N肥的普遍可適用的機制。實現(xiàn)此舉的一種方法是通過使用增加植物更有效地使用 氮肥（"氮利用效率"或"NUE"）的能力的內生植物共生真菌或細菌。NUE可以通過增加植 物根系生長和通過植物中的生理變化來誘導。許多微生物可潛在地用于這方面。例如，這些 微生物包括被命名為植物根際促生菌（"PGPR"）的細菌、擔子菌綱（Basidiomycete)印度梨 形孢（Piriformospora indica)，和菌根真菌，如球囊霉（Glomus)屬中的那些真菌。其它實 例包括哈茨木霉（T. harzianum)菌株RR17Bc (ATCC登記PTA9708)、哈茨木霉FllBab (ATCC 登記 PTA9709)、深綠木霉（T. atroviride)菌株 WW10TC4(ATCC PTA 登記 9707)、和綠木霉 (T. virens)菌株41 (ATCC登記20476))。這些相同的真菌還誘導植物的許多其它有益的變 化如抗病性、耐非生物脅迫如干旱和鹽，和增加植物進行光合作用的能力，從而為植物提供 了其它益處。
[0029] 對于草坪，本發(fā)明提供了功能上相當于分析為30:2:8(N:P20 5:K20)的廣泛銷售的 無機草坪肥料的分析為12-16:0-10:5-15的有機肥料。還描述了產生適合于在標準落下或 撒播肥料撒施機中分散的顆粒肥料的原型過程，所述肥料包含在本發(fā)明中要求保護的生物 體。還描述了用于制備可摻入盆栽介質中、施用于犁溝等的粉末制劑的方法，并且還描述了 液體有機肥料的制備過程。結果是新的肥料，其可被分類為有機的。
[0030] 可以通過肥料的組分來提供的另一個有用的特性是營養(yǎng)物的緩慢釋放。僅僅由可 溶性鹽組成的肥料迅速地釋放它們的營養(yǎng)物并使營養(yǎng)物被沖洗至地下水中，它們迅速成為 污染物。如本文所述，微生物，特別是所選擇的木霉屬（Trichoderma)菌株，可以顯著地促 進植物生長、提高耐非生物脅迫、增加植物氮利用效率、增加根系的生長和發(fā)育，并且顯著 地增強一般植物性能。把此類有益的微生物直接摻入肥料上或肥料中是非常有利的，這樣 使得肥料及有益微生物的益處可以同時并且在同一制品中方便地施用。然而，大多數(shù)合成 肥料的高含鹽量將嚴重損害或殺死包含在肥料內或肥料上的所施用的微生物。本發(fā)明描 述了肥料和制備主要由對微生物劑無害的蛋白質組成的肥料顆粒的方法。如果肥料被過量 施用，如果雨水或灌溉水過多，或當肥料被施用到沙質并且使營養(yǎng)物浸出的土壤時，特別可 能發(fā)生污染。因為不能預見在哪里施加肥料或如何施加肥料，氮可以呈緩慢釋放形式，使植 物能夠隨著所施用的營養(yǎng)物的緩慢釋放而吸收更多的營養(yǎng)物，而不是馬上吸收。存在兩個 基本的處理方法。首先，行業(yè)中的標準過程是產生呈各種形式的氮，其緩慢地釋放氮。當今 在商業(yè)貿易中有許多緩慢釋放的氮形式。這些形式包括脲醛、亞甲基脲、涂硫尿素 （sulfur coated urea)以及其它。這些在本領域中是眾所周知的，參見例如King等的美國專利 8, 182, 572,其在此通過引用整體并入。其次，有各種復雜的形式的氮，通常呈蛋白質、糞肥 或堆肥的形式。由于微生物活動，這些材料緩慢地釋放自身的氮。
[0031] "有機"材料可以被認證，并且與它們有關的條例依機構而定。有機材料研究所 ("0MRI"）根據自己的規(guī)范來認證產品。0MRI是具有完善認證的私人機構。許多但不是 所有的農業(yè)廢棄產物，如堆肥、糞肥等，可被認證，但是它們的制造要求比較嚴格?？梢允褂?一些定義明確的化學品，但是它們的用途受到嚴格管制。例如，只有當硝酸鈉是開采的形式 (稱為智利硝酸鹽），而不是制造的型式時，它才是可以接受的，并且即使對于這樣的材料， 其用途也是有限的。另外，近有機認證是USDA BioPreferred產品清單。具有此名稱的產 品須在總量的一定百分比下來源于生物基農產品。肥料的農場來源的產品的最低含量為 71%。這可以包括0MRI列出的許多相同材料，但也有例夕卜。例如，泥炭苔有資格獲0MRI認 證，而未由BioPreferred計劃認證。來自農場動物和植物的堆肥、糞肥、蛋白質來源對于這 兩者都是可以接受的。一個顯著的區(qū)別是，0MRI注冊的產品必須100%是其認證的產品，但 對于BioPreferred,高達29%可能是BioPreferred清單上以外的產品。因此，一些合成的 緩慢釋放的合成氮形式可用于BioPreferred產品，但不可用于0MRI標記產品。
[0032] 本發(fā)明描述有效地降解羽毛/羽毛粉中的角蛋白的微生物（即真菌）。這些微生 物將羽毛粉中的氨基酸和氨迅速釋放至半固體介質中。例如，真菌的接種物具有許多用途 并且可以被制備為干孢子制劑或液體制劑。本發(fā)明還描述了用于產生能夠被撒播的顆粒劑 的方法，所述顆粒劑含有或不含微生物的涂層，或含有或不含摻入顆粒劑內的微生物，其為 植物生長提供氮的緩慢釋放微生物活化的釋放，尤其是在與其它有益真菌組合時。微生物 活化的氮系統(tǒng)的結合幾乎未將硝酸鹽釋放至土壤中，因此，將有很少或沒有硝酸鹽釋放至 地下水中。如果微生物釋放N與可提高根系生長并且改善植物氮利用效率的其它微生物結 合，那么此環(huán)境優(yōu)勢會更大。此外，同樣的發(fā)明，加以細微的修改，可以被用來產生用作植物 肥料是非常有益的水溶性源或氨基酸和氨。
[0033] 本發(fā)明通過提供一個或多個系統(tǒng)滿足了由傳統(tǒng)肥料產生的需求，所述系統(tǒng)包含與 微生物組合具有特定組成和功能的肥料，所述微生物將復雜的蛋白質底物降解以提供營養(yǎng) 物，尤其是供植物生長的營養(yǎng)物。它還包括增強植物的生長和性能并為植物生長提供其它 優(yōu)勢的微生物（例如，內生植物共生體）。本發(fā)明的肥料是用于這些生物體的極好的遞送 劑。
[0034] 本發(fā)明預計為肥料行業(yè)提供革命性的益處。首先，本發(fā)明的肥料第一次提供完全 有機或生物優(yōu)先肥料，其與標準的廣泛銷售的無機肥料表現(xiàn)一樣良好。它也可作為與常規(guī) 無機肥料一樣便利并且易于使用的肥料，并且用作極大地減少地下水和地表水的硝酸鹽污 染的草坪肥料。本發(fā)明的肥料還提供了一種產生一類新的有機水溶性肥料的方法，所述 肥料包含立即可以氨基酸和氨形式為植物生長所利用的氮。包含立即可用氮的可為有機 (0MRI認證）種植者所利用的唯一產品是智利硝酸鹽，并且它的使用由0MRI規(guī)則來限制， 不久的將來可能禁止它用于有機用途。氨基酸與氨的混合物將是非常有用的新產品，既可 以用于其它肥料的成分，也可以作為液體獨立肥料。本發(fā)明第一次描述產生氨基酸與氨的 0MRI可注冊混合物的方法和這類產品的組成。重點是草坪肥料，它可能是要求最苛刻的材 料，并且也許是以最大量使用的材料，但原則和開發(fā)同樣適用于其它應用的肥料。具有這些 功能的廣品目如并不存在。
[0035] 附圖簡述
[0036] 圖1示出了加濕兩天前后使用涂覆有羽毛降解微生物的羽毛粉-明膠混合物制備 的干燥顆粒。涂覆于顆粒外側上的真菌適度生長。將顆粒通過加入介質來改進，所述介質 支持木霉屬迅速并且大量地生長。干燥的顆粒的直徑大約為2mm。
[0037] 圖2A-2B示出了使用本發(fā)明中所述或市售獲得的制劑的肥料比較。在圖2A中，所 使用的處理為PT (有機肥料，NRRL B-50521，和K1-K4,其包括哈茨木霉菌株RR17Bc(ATCC 登記 PTA9708)、哈茨木霉 FllBab(ATCC 登記 PTA9709)、深綠木霉菌株 WW10TC4(ATCC PTA 登記9707)、和綠木霉菌株41仏1'(1：登記20476))即8(8(；〇戊5'1<丁11什811丨丨(^1 :1<);?(具有 NRRL B-50521的有機肥料）；和C(未處理的對照）。在圖2B中，所用的處理為PT(有機肥 料，NRRL Β-50521，和Κ1-Κ4,所述同上）；0FC(不含任何真菌的有機肥料顆粒）；和Ρ (具有 NRRL B-50521的有機肥料）。
[0038] 圖3A-3D顯不使用不同施肥處理的草在一段時間內的收獲重量。
[0039] 圖4顯示了在砂：泥炭混合物中生長約6周并且用這個實例中所述的顆粒來施肥 的草皮的根發(fā)育，所述顆粒含有和不含有益微生物混合綠木霉菌株NRRL B-50521和木霉屬 菌株Kl-K4(哈茨木霉菌株RR17Bc、哈茨木霉FllBab、深綠木霉菌株WW10TC4、和綠木霉菌株 41)。標記11的皮氏培養(yǎng)皿顯示了用不帶有益微生物的顆粒施肥的草坪上的根系生長。標 記12的培養(yǎng)皿含有以約10 5cfu/g摻入顆粒中的生物體，而標記13的培養(yǎng)皿用葡聚糖混合 物中涂有有益真菌的顆粒來施肥（2%木薯淀粉葡聚糖中的10 5菌落形成單位（cfu)/ml以 形成連續(xù)的薄涂層）。
[0040] 發(fā)明詳述
[0041] 本發(fā)明涉及一種肥料，其包括至少一種選自由以下各項組成的組的微生物：綠色 木霉（NRRL B-50520)、短尾帚霉（NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其組合。肥 料還包括由至少一種微生物施加作用以釋放氮的底物。
[0042] 本發(fā)明可使用由微生物施加作用以釋放氮的各種底物來進行，所述底物包括毛 發(fā)、蹄和羽毛。在一個實施方案中，所述底物是選自由羽毛、羽毛粉和尿素的衍生物組成的 組的任何蛋白質?？梢允褂萌魏晤愋偷挠鹈?，包括但不限于雞羽毛、火雞羽毛和鴨羽毛。本 發(fā)明適用于釋放氮的所有底物材料的降解和利用。
[0043] 任何數(shù)目的生物體或有益微生物可以被添加到本發(fā)明的肥料。這些生物體包括 由 Harman 在 W0 2010/091337 中所描述的那些菌株；Harman, "Multifunctional Fungal Plant Symbionts:New Tools to Enhance Plant Growth and Productivity,，'New Phytol.189:647-49(2011) ;Lorito 等，"Translational Research on TrichodermaiFrom'Omics to the Field, ^Annu. Rev. Phytopathol. 48:395-417 (2010)； Shoresh 等,"Induced Systemic Resistance and Plant Responses to Fungal Biocontrol Agents, "Annu. Rev. Phytopathol. 48:21-43 (2010)，所述文獻在此通過引用 整體并入。其它有益生物體包括菌根真菌、植物根際促生菌、固氮螺菌和固氮根瘤菌。這 些生物體具有非常多有用的特性。真菌改變基因表達并且使植物表現(xiàn)出對致病病原體的 抗性增加（"抗生物脅迫"），表現(xiàn)出增加的耐環(huán)境脅迫如耐干旱、鹽或溫度（"耐非生物脅 迫"），并且增加氮的攝取效率（"改良的氮利用效率['NUE']"）。本發(fā)明的有益微生物 和植物內生微生物可提供改進的氮利用效率?？膳渲苹蚧旌嫌幸嫖⑸镆灾苽漕w?；蛞后w 懸浮液。這些顆?；蛞后w懸浮液可以直接混合到土壤或盆栽混合物中。本說明書中的術語 土壤用于包括能夠支持植物生長的任何介質，因此，包括常見土壤、腐殖質、糞肥，堆肥、砂 等，以及人工產生的植物生長介質。然后將制劑混合到土壤中或溫室應用的種植混合物容 積中或田間土壤的上部容積中（Harman, G.E·，"The Dogmas and Myths of Biocontrol· Changes in Perceptions Based on Research with Trichoderma harzianum T-22, 'Tlant Dis. 84:377-393 (2000)，所述文獻在此通過引用整體并入）。用于這類應用的設備和程序是 眾所周知的，并且在各種農業(yè)行業(yè)中使用。在本發(fā)明的一個實施方案中，肥料進一步包含呈 木霉屬物種形式的補充微生物。木霉屬物種可以選自由綠木霉、哈次木霉、深綠木霉及其組 合組成的組。
[0044] 木霉屬在根表皮和皮層中的細胞間生長，并誘導周圍的植物細胞沉積細胞壁 材料并且產生酚類化合物。這種植物反應限制了根內的木霉屬生長（參見Yedidia 等，''Induction and Accumulation of PR Proteins Activity During Early Stages of Root Colonization by the Mycoparasite Trichoderma harzianum Strain T-203, 'Tlant Physiol. Biochem. 38:863-873 (1999)，所述文獻在此通過引用整體并入）。內生植物共 生體具有長得多的功效時間，因為它們具有與植物一起和在環(huán)境中生長的能力；因此， 如果條件有利于它們，它們可能幾周或幾個月內具有作用。這些生物體可能在植物根 部上或植物根部中形成并且至少歷時一年生作物的一生，為植物提供益處（Harman，G. E. , "Myths and Dogmas of biocontrol. Changes in Perceptions Derived from Research on Trichoderma harzianum T-22,''Plant Dis. 84:377-393(2000)和 Harman 等，"Changing Paradigms on the Mode of Action and Uses of Trichoderma spp. for Biocontrol, "Outlooks Pest Manag. 19:24-29 (2008)，所述文獻在此通過引用整體并入）。 在根皮層中的有益生物體的活菌絲的形成導致植物的化學通訊。在一些實施方案中，肥料 含有其它補充微生物，如選自由印度梨形孢、植物根際促生菌、菌根真菌及其組合組成的組 的那些微生物。
[0045] 因此，發(fā)生植物基因表達的重新編程，并給植物帶來許多益處。根表面上的生長 或分生孢子萌發(fā)的這種能力使多種施用方法成為可能的。這些施用方法包括但不限于種 子處理、以穿透土壤容積的浸液施用至土壤或種植混合物以及在播種時的犁溝內施用、撒 播或噴霧施用到含有根部的土壤表面。它還允許使用非常少量的以種子處理施用的接種物 (10s g/公頃），但隨后導致根系上的生物體的隨后增殖，引起持續(xù)整個季節(jié)的效果，包括植 物保護、更大的根系增殖和根系深入土壤得到增強（Adams等，"Trichoderma harzianum Rifail295-22Mediates Growth Promotion of Crack Willow(Salix fragilis)Saplings in Both Clean and Metal-contaminated Soil,，'Microbial. Ecol. 54:306-313 (2007)； Harman, G. E. , "Myths and Dogmas of Biocontrol. Changes in Perceptions Derived from Research on Trichoderma harzianum T-22,''Plant Dis. 84:377-393 (2000)； Harman 等，"Changing Paradigms on the Mode of Action and Uses of Trichoderma spp. for Biocontrol，''Outlooks Pest Manag. 19:24-29 (2008);和 Harman 等，"Trichoderma Species-Opportunistic, Avirulent Plant Symbionts,'^Nature Rev. Microbiol. 2:43-56(2004)，所述文獻在此通過引用整體并入）。
[0046] 適用于本發(fā)明的木霉屬菌株（例如，綠色木霉、綠木霉、哈茨木霉和深綠木霉）是 具有定植于根系的較強能力的菌株。這種能力被稱為根際能力，它在本文中用于描述在 種植時在沒有大量水流的情況下施用種子或其它點源時能夠定植于根表面或表面加上周 圍的土壤體積（分別稱為根面和根際）的那些生物體。因此，本發(fā)明的生物體具有在根 系發(fā)育時在其中和其上增殖的生理和遺傳能力。根際能力并不是絕對的術語，并且不同 程度的這種能力可能會出現(xiàn)在菌株之間（Harman, G.E·，"The Development and Benefits of Rhizosphere Competent Fungi for Biological Control of Plant Pathogens,，'J. Plant Nutritionl5:835-843 (1992) ;Smith 的美國專利號 4, 996, 157 和 5, 165, 928,所述文 獻在此通過引用整體并入）。用于測量根際能力的程序是本領域技術人員已知的（Harman 等，"Combining Effective Strains of Trichoderma harzianum and Solid Matrix Priming to Improve Biological Seed Treatments, ''Plant Disease73:631-637(1989)； Harman, G. E. , "The Myths and Dogmas of Biocontrol.Changes in Perceptions Based on Research with Trichoderma harzianum T-22, ''Plant Disease 84:377-393(2000)； Kloepper 等，"A Review of Issues Related to Measuring Colonization of Plant Roots by Bacteria, " Can. J. Microbiol. 38:1219-1232 (1992)，所述文獻在此通過引用整 體并入）。
[0047] 本發(fā)明的肥料可以是顆粒、丸粒、粉塵、粉末、漿液、薄膜和/或液體懸浮液形式。 在一個實施方案中，所述肥料呈含有明膠作為固化劑的顆?；蛲枇Ｐ问?。明膠可以占顆粒 或丸粒的5-20重量％，或更優(yōu)選地，顆?；蛲枇５?-8重量％。在另一個實施方案中，所述 肥料包括至少1〇~4個菌落形成單位/g("cfu"）的所述底物中的至少一種微生物。在又 一個實施方案中，所述肥料呈包括氨基酸和氨的液體懸浮液形式。本發(fā)明的微生物是生長 的，因此以重量計，它們的數(shù)量是微乎其微的。KT4cfU相當于微生物制劑所占的比例僅僅 是底物中的1〇~7中的一小部分。然而，該制劑可以許多不同方法來制成，因此，顆?；蛲枇?中的木霉屬或其它微生物的濃度可以很容易地變化ΙΟΟχ。
[0048] 本發(fā)明的肥料也考慮了添加營養(yǎng)物的補充來源。這些來源包括例如土壤、水、尿 素、硝酸銨，提供氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫和其它微量營養(yǎng)物的來源。已知在植物生長和存活中 有用的至少16種化學元素。16種化學元素分為兩大類：非礦物和礦物。非礦物營養(yǎng)物包 括氫（H)、氧（0)和碳（C)并且存在于空氣和水中。其余13種營養(yǎng)物是礦物，其來自土壤， 溶解于水中并通過植物的根來吸收。礦物營養(yǎng)物可進一步分為兩組：大量營養(yǎng)物和微量營 養(yǎng)物。大量營養(yǎng)物包括但不限于隊？、5、1(、0 &、1%、似和51。微量營養(yǎng)物包括但不限于？6、 Mn、Cu、Zn、Mo、B和C1。只需要非常小（即微）量的微量營養(yǎng)物。這些營養(yǎng)物和它們對于 植物的益處為本領域技術人員所熟知。本發(fā)明的肥料也可含有選自由硝酸鹽、氨、銨鹽、氨 基酸、尿素、魚粉或提取物、堆肥提取物、海藻提取物、蝦提取物、貝類提取物及其組合組成 的組的可溶性氮源。
[0049] 本發(fā)明的底物可摻合植物營養(yǎng)物的其它來源，所述植物營養(yǎng)物包括鉀、磷、鐵或微 量營養(yǎng)物。
[0050] 在一個實施方案中，所述肥料進一步包含選自由葡聚糖、淀粉、聚氯乙烯及其組合 組成的組的非蛋白質結合劑。
[0051] 在另一個實施方案中，所述肥料可以包括選自由磷酸巖、磷酸鈉、磷酸鉀、骨粉及 其組合組成的組的磷源。
[0052] 在又一個實施方案中，所述肥料可以包括選自由氯化鉀、磷酸鉀、硫酸鉀、新澤西 綠砂、鉀的有機源、動物糞肥及其組合的組的鉀源。對于有機用途，鉀的來源包括新澤西綠 砂以及有機上所列的硫酸鉀和氯化鉀。
[0053] 該肥料可以替代地包括微量營養(yǎng)物，所述微量營養(yǎng)物選自由鹽，含有鐵、鈷、錳、 鎂、銅、鈣、硼、鋅的物質及其組合組成的組。這些容易從各種來源獲得。
[0054] 硫已經存在于包含在所述底物中的氨基酸中，包括，例如，羽毛粉。有用的肥料可 以在含有或不含其它營養(yǎng)物的情況下通過混合或添加除了 N以外的其它有機底物來源以 各種N :P :K比率來制備。在一個實施方案中，所述肥料具有介于10-20重量％之間的氮含 量。
[0055] 在一個實施方案中，所述肥料含有生長介質。本發(fā)明的生長介質可以包括但不限 于土壤、砂堆肥、泥炭、稻殼、椰纖維、椰糠（cocopeat)、含有有機和/或無機成分的無土生 長介質、人造植物生長基質、基于聚合物的生長基質、水栽營養(yǎng)物和生長溶液、有機土壤改 良劑、水和它們的混合物。
[0056] 肥料可以包括選自由水、水溶液、漿液和粉末組成的組的載體。
[0057] 或者，肥料可以包括添加劑，如但不限于，殺蟲劑、殺真菌劑、殺線蟲劑、額外有機 肥料、生物殺蟲劑、生物殺真菌劑、生物殺線蟲劑、農業(yè)或園藝佐劑、粘著劑、撒施劑、表面活 性劑、分散劑、濕潤劑、UV防護劑及其混合物。肥料也可含有有機碳來源，如但不限于，堆肥 和生物炭。
[0058] 本發(fā)明的另一個方面涉及一種肥料，其包含至少一種選自角蛋白降解微生物的微 生物和由至少一種微生物施加作用以釋放氮的角蛋白底物。
[0059] 本方面的方法按照以前的方面進行。
[0060] 在一個實施方案中，所述肥料包含至少一種選自由綠色木霉（NRRL B-50520)、短 尾帚霉（NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其組合組成的組的微生物。
[0061] 本方面的角蛋白降解微生物可以包括鏈霉菌屬（Streptomyces)的微生物，包 括但不限于除蟲鏈霉菌（Streptomyces avermitilis)、天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor)和紫紅鏈霉菌（Streptomyces violaceoruber) 〇
[0062] 本發(fā)明的這一方面可以使用以上關于任何上述植物所描述的任何添加劑及任何 應用方式來進行。
[0063] 本發(fā)明的另一個方面涉及增強植物生長的方法。該方法包括提供一種肥料，其包 含至少一種選自由以下各項組成的組的微生物：綠色木霉（NRRL B-50520)、短尾帚霉（NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其組合；和由至少一種微生物施加作用以釋放氮的 底物。該方法進一步包括在與不施用肥料的植物或植物種子相比可有效地提高植物或植物 種子的生長的條件下使所述肥料與植物或植物種子接觸。
[0064] 本方面的方法按照以前的方面進行。
[0065] 在本發(fā)明的本方面的一個實施方案中，所述肥料含有占顆?；蛲枇５?-20重 量％的明膠。
[0066] 在實施本發(fā)明的各個方面中，可以將肥料制備成含有有機或無機材料的制劑，所 述有機或無機材料有助于將生物體遞送或接觸到受體植物或植物種子。此外，在本文中 所描述的本發(fā)明的所有方面中，肥料與植物或植物種子或其它植物材料的接觸可以在將植 物、植物種子或其它植物繁殖材料引入生長介質或區(qū)域中的同時、之前或之后進行。植物、 植物種子或其它植物材料可以如上文所述但不限于在任何合適的種植介質中以及在任何 合適的環(huán)境（例如，溫室或田間環(huán)境）中形成（繁殖）。本領域技術人員將能夠容易地確立 適用于維持和/或繁殖植物的要求。
[0067] 不管生物體與植物、種子或其它植物材料進行接觸的順序，以下都是根據本發(fā)明 用于使肥料與所選擇的植物材料進行接觸的合適的方法。這些方法的非限制性實例包括撒 播施用、落下施用、旋轉施用、液體或干式犁溝施用、直接摻入到土壤或溫室種植混合物中、 噴霧施用、灌溉、注射、噴粉、?；蛴梅柿贤扛仓参锘蛑参锓N子或種植介質。也可產生適 合于落下或撒播施用的顆粒制劑、添加至盆栽混合物中或直接在田間施用的粉末狀制劑， 或使用本文描述的系統(tǒng)的液體肥料。
[0068] 可以將本發(fā)明的肥料以與常規(guī)肥料相同的方式來施用。如相關領域技術人員已 知，可以使用許多方法和設備。在一個實施方案中，本發(fā)明的微生物與底物的混合物被直接 施用到土壤或植物。在另一個實施方案中，本發(fā)明的微生物與底物的干燥粉末被施用到土 壤或植物。肥料可以通過撒施機、噴霧器以及可以自動化的其它機械化裝置施用于土壤。月巴 料可以例如通過浸泡種子和/或根，或噴到葉子上來直接施用于植物?？啥ㄆ谶M行這類施 用，如每年一次，或每個生長季節(jié)一次，或根據需要更頻繁地進行。雖然不是必需的，但是本 發(fā)明的肥料也可以與其它類型的肥料一起或輪換使用。
[0069] 可配制或混合有益微生物以制備顆粒、粉劑或液體懸浮液。可以將這些制劑直接 混合到土壤或種植混合物中。然后將制劑混合到土壤中或溫室應用的種植混合物容積中或 田間土壤的上部容積中（Harman, G, "The Myths and Dogmas of Biocontrol· Changes in Perceptions Based on Research with Trichoderma harzianum T-22， ''Plant Disease 84:377-393(2000)，所述文獻在此通過引用整體并入）。用于這類接觸的設備和程序是眾 所周知的并且在各種農業(yè)行業(yè)中使用。典型比率是每立方米種植混合物或土壤含有1〇 7至 109個菌落形成單位（cfu)的0· 2至10kg產品。
[0070] 接觸也可以通過用于溫室或苗圃土壤和土壤混合物的液體施用（浸液）來進行。 有益微生物的液體懸浮液可以通過以下方法來制備：通過將干粉制劑混合到水或其它載 體，包括肥料溶液中，或通過將含有生物體的液體制劑在水或其它水溶液，包括含有肥料的 那些溶液中稀釋。在任一情況下，該制劑可包括其它有機或無機添加劑以有助于溶解或施 用所述混合物。然后，在種植之前或當植物活躍生長時，溶液可以用于如通過田間灌溉來澆 灑種植混合物。通常，含有1〇 7至109cfu的10至400ml產品（粒徑通常為150/inn或更 小）與100L水混合以用于這樣的應用。
[0071] 種子通常通過行業(yè)中眾所周知的的方法使用漿料、薄膜包衣或丸?；?來處理(Harman 等,"Factors Affecting Trichoderma hamatum Applied to Seeds As a Biocontrol Agent, Phytopathology71 : 569-572 (1981) ；Taylor 等,"Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments, "Ann. Rev. Phytopathol. 28:321-339 (1990)，所述文獻都在此通過引用整體并入）?？梢詫⒈景l(fā)明的微 生物有效地添加到任何這樣的處理，條件是制劑不含對有益生物體有害的材料。根據討論 的生物體，這可能包括化學殺真菌劑。通常，將生物體的粉末或液體制劑（1〇 7至l〇1(lCfu/g) 懸浮于水性懸浮劑中以得到生物活性水平的生物體。液體通常含有粘合劑和其它材料以提 供良好覆蓋水平的種子，并且也可以改善其種植形狀或美化外觀。
[0072] 接觸還可以通過含有有益生物體的干粉來實現(xiàn)，這些干粉以粉劑形式施用至根、 球莖或種子。通常，將細粉末（通常為250/英寸或更?。┤鲈诜N子、球莖或根上直至最大 承載粉末（即，直到沒有更多的粉末會粘附在處理過的表面上為止）。這些粉末通常含有 10 7 至 109cfu/g。
[0073] 有益微生物的液體懸浮液可以通過以下方法來制備：通過將干粉制劑混合到水或 其它水性載體，包括肥料溶液中，或通過將含有微生物的液體制劑在水或其它水溶液中稀 釋。然后，在種植之前或當植物活躍生長時，這些溶液可以用于澆灑種植混合物。通過位于 施用所需深度的中空管，產品的液體懸浮液可在壓力下注入到適當?shù)闹参锔鶇^(qū)。用于這類 施用的設備在園藝業(yè)中是眾所周知的?；蛘?，可以將含有適當生物體的懸浮液或粉末施用 到土壤的孔或其它水性環(huán)境中?？扇缟厢槍χ苽浣核鰜碇苽洚a品的液體懸浮液。這類 材料可以被添加到其中種植種子或移栽小植物的犁溝中。用于這類施用的設備廣泛用于農 業(yè)。典型的施用率是〇. 5至10kg產品（107至109cfu/g)/公頃田地。
[0074] 顆?？梢员蝗霾サ胶猩L植物的土壤表面、種植時的土壤，或撒播到種子或 植物將被種植的土壤上。根據要處理的植物和處理的目標，典型施用率的范圍是含有 10 7至109cfu/g的1到500kg產品?；蛘?，可以制備并施用噴霧溶液以得到相似速率 (Harman, G. E.，"The Dogmas and Myths of Biocontrol. Changes in Perceptions Based on Research with Trichoderma harzianum T-22,''Plant Dis. 80:736-741 (1996) ；Lo 等，''Biological Control of Turf grass Diseases with a Rhizosphere Competent Strain of Trichoderma harzianum,''Plant Disease80:736-741 (1996) ;Lo等，''Improved Biocontrol Efficacy of Trichoderma harzianuml295_22for Foliar Phases of Turf Diseases by Use of Spray Applications,'Tlant Dis.81:1132_1138(1997)，所述文獻在 此通過引用整體并入）。
[0075] 出于本發(fā)明的目的，設計描述施用的所有方法來實現(xiàn)相同目的，即，以提供將產 生有益生物體在根系有效定植的施用方法（Harman等/'Potential and Existing Uses of Trichoderma and Gliocladium For Plant Disease Control and Plant Growth Enhancement, 〃于Trichoderma and Gliocladium, Harman等編輯，第2卷，London:Taylor and Francis(1998)中，所述文獻在此通過引用整體并入）。
[0076] 本發(fā)明可用于處理多種植物的種子。如本文所用，本發(fā)明的肥料支持或增強植物 的生長，如果土壤中的肥料在存在的情況下，或施用到根、莖、葉或植物的其它部分，植物或 植物的其它部分獲得生存力、大小、重量、發(fā)芽率、生長率，或者成熟率。因此，肥料適用于任 何種類的農業(yè)、園藝和林業(yè)實踐。肥料可在戶外或溫室中，或甚至在裝飾性工廠的內部用 于大規(guī)模的商業(yè)性農業(yè)。優(yōu)選地，肥料用于提高作物植物的生長，如但不限于谷類作物、蔬 菜作物、水果作物、花卉作物和草作物。例如，可以將肥料組合物用于雙子葉植物和單子葉 植物。更具體地說，按照本發(fā)明處理的植物包括易受真菌或植物病原體感染的任何植物。 例如，按照本發(fā)明處理的植物包括但不限于，農藝中耕或其它大田作物，其包括蕎麥、豆類 (大豆、食莢菜豆、干豆）、玉米（谷物、種子、甜玉米、青貯飼料、爆米花、高油玉米）、棉花、油 菜、豌豆（干燥、多汁）、花生、紅花和向日葵；苜蓿干草和飼料作物，其包括苜蓿、三葉草、野 豌豆和車軸草；漿果和小水果，其包括黑莓、藍莓、醋栗果、接骨木果、醋栗、越橘、羅甘莓、樹 莓、草莓、葡萄、球莖作物：大蒜、韭菜、洋蔥、青蔥、和觀賞球莖；柑橘類水果，其包括柑橘雜 交、葡萄柚、金橘、酸橙、橙子和柚子；瓜類蔬菜，其包括黃瓜、甜瓜、葫蘆、南瓜（pumpkin)、 南瓜（squash)和鮮花；花壇植物和觀賞植物；果類蔬菜，其包括茄子、甜辣椒、粘果酸漿、 番茄、藥草、香料和薄荷；水培作物，其包括黃瓜、西紅柿和萵苣；藥草和香料；葉菜類蔬菜 和油菜作物，其包括芝麻菜、芹菜、山蘿卜、菊苣、茴香、萵苣（頭和葉）、歐芹、菊苣、大黃、 菠菜、唐萵苣、花椰菜、球芽甘藍、甘藍、花椰菜、羽衣甘藍、無頭甘藍、大頭菜、芥菜和蘆筍； 豆類蔬菜和大田作物，其包括食莢菜豆和干豆、扁豆、多汁和干豌豆、花生和大豆；梨果類水 果，其包括梨和溫柏溫柏；作物，其包括甜菜根、甜菜、紅甜菜、胡蘿卜、塊根芹、菊苣、山葵、 歐洲防風草、蘿卜大頭菜、婆羅門參、蕪菁；遮陰和其它苗圃作物，其包括落葉樹（楓木、橡 木）、觀賞植物、葡萄、柑橘、松樹；小粒谷類作物，其包括黑麥、小麥、高粱和小米；核果，其 包括杏、櫻桃、油桃、桃子、李子、李子干、木本堅果：杏仁、山毛櫸堅果、巴西堅果、灰核桃，腰 果、栗子、榛子、山核桃、澳洲堅果、美洲山核桃、開心果和核桃；塊莖作物，其包括馬鈴薯、紅 薯、山藥、菊芋、木薯和姜。其它實例包括與草坪草、草皮、運動場、公園、已建和新建高爾夫 球場發(fā)球臺、球穴區(qū)、球道和深草區(qū)、種子產生和草皮生產相關的那些草。可處理的植物還 包括矮牽牛、天竺葵、一品紅、菊花、康乃馨和百日草。
[0077] 本發(fā)明的植物生長的增強可能會呈更大的根群、更大的生根深度、更大的芽群、更 大的芽葉長度、增加的葉綠度、增加的產量、以及改善的群叢和活力的形式。植物的生長可 以通過除了上面列出的外在特性以外的其它方法來確立和確定。本領域技術人員將能夠容 易地確立物理、生化或基因測試以確定和/或定量植物生長或存活力。
[0078] 由本文公開的肥料定植于根部植物得到許多優(yōu)勢。一個優(yōu)勢是通過微生物菌株對 于病原微生物（參見Chet, L，"Trichoderma_Application，Mode of Action, and Potential as a Biocontrol Agent of Soilborne Plant Pathogenic Fungi,，' 于 Innovative Approaches to Plant Disease Control,第 l37_l6〇 頁，1. Chet 編輯，J. Wiley and Sons:New York(1987)中，所述文獻在此通過引用整體并入）或其它有害的土壤微生物區(qū) 系的直接作用來防止植物患?。˙akker等，"Microbial Cyanide Production in the Rhizosphere in Relation to Potato Yield Reduction and Pseudomonas spp-Mediated Plant Growth-Stimulation, " Soil Biol. Bio-Chem. 19:451-457 (1987)，所述文獻在此通 過引用整體并入）。由于抗性的系統(tǒng)性誘導抗性，微生物提供針對植物病原體的防護。這 使得植物在由施用微生物廣泛分隔（時間上或空間上）的點處得到保護（參見Harman 等,"Trichoderma Species-Opportunistic, Avirulent Plant Symbionts, " Nature Microbiol. Rev. 2:43-56,（2004)，所述文獻在此通過引用整體并入）。例如，通過誘導抗性， 即使當本文所公開的微生物只存在于根上，它們也可以控制葉面病原體。
[0079] 另一個優(yōu)勢是，本發(fā)明的肥料可以提供針對因干旱（缺水）、疾病或其它不利植物 生長條件而產生的非生物脅迫的保護。很多時候，可以將植物培植在這樣的氣候下，其中作 物暴露于許多生物和非生物脅迫如植物疾病和干旱。干旱條件影響植物的基因表達、氨基 酸范譜和光合作用從而誘導產生脅迫。在用本發(fā)明的肥料處理的植物中，這些反應中的大 多數(shù)可能會延遲。通過在田間用本發(fā)明的微生物處理植物，有可能提高植物對干旱的耐受 性。對干旱、疾病和脅迫性具有提高的耐受性的植物將通過使作物產量和盈利能力穩(wěn)定而 有利于農民。
[0080] 在本發(fā)明公開的肥料中使用的微生物可能導致根部更大且更深，并且大概通過提 高氮吸收而減少植物生長對氮的需求。此能力還可以用于減少植物生產者的氮需求。這些 菌株還可以提高植物對干旱的耐受性。
[0081] 要理解本發(fā)明的相關性，考察植物產量穩(wěn)定水平是很重要的。植物一般用增加 的產量和生長至某點對應于增加的氮肥水平，然后產量增加趨向平穩(wěn)；這就是產量穩(wěn)定水 平，超過所述水平氮肥的使用不再使產量增加。已經顯示用本發(fā)明的微生物（即綠色木 霉（NRRL B-50520)、短尾帚霉（NRRL B-50521)和短尾帚霉（NRRL B-50522))處理過的種 植種子即使在氮顯著缺乏條件下也能增加植物生長和生產力（參見Harman, G.，"Myths and Dogmas of Biocontrol. Changes in Perceptions Derived from Research on Trichoderma harzianum T-22,''Plant Dis. 84:377-393(2000) ;Harman 等，"Enhancing Crop Performance and Pest Resistance with Genes from Biocontrol Fungi,，' 于 M. Vurro, J. Gressel, T. Butt, G. E. Harman, A. Pilgeram, R. J. St. Ledger 和 D. L. Nuss (編 輯),Enhancing Biocontrol Agents and Handling Risks 第 114-125 頁.I0S Press, Amsterdam(2001) ;Harman 等，''Trichoderma Species-Opportunistic, Avirulent Plant Symbionts, " Nature Rev. Microbiol. 2:43-56(2004)，所述文獻在此通過引 用整體并入）。在存在共生生物防治真菌的情況下生長的植物經常更綠且更有活力 (Harman, G.，''Myths and Dogmas of Biocontrol. Changes in Perceptions Derived from Research on Trichoderma harzianum T-22,''Plant Dis. 84:377-393(2000)，所述文獻在 此通過引用整體并入）。先前的研究已經發(fā)現(xiàn)，與不存在哈茨木霉時相比，在其存在時，用少 于40-50%的氮肥達成產量穩(wěn)定水平（Harman等/'Enhancing Crop Performance and Pest Resistance with Genes from Biocontrol Fungi," 于 M. Vurro, J. Gressel, T. Butt, G. E. Harman, A. Pilgeram, R. J. St. Ledger 和 D. L. Nuss (編輯），Enhancing Biocontrol Agents and Handling Risks 第 114-125 頁.I0SPress，Amsterdam(2001)中，所述文獻在此通過引 用整體并入）。這意味著，可以降低該量的氮肥比率而不會使產量減少。這極有可能減少從 土壤中放出的N 20,因為施用的總肥料減少，并且更大比例的施用氮必須由植物吸收，而預 期植物代謝中的氮需求不發(fā)生改變，因此，在植物中獲得添加 N的唯一途徑是通過增強的N 使用效率。
[0082] 本發(fā)明的另一個方面涉及制造包含氨基酸和氨的肥料的方法。該方法包括提供 至少一種選自由以下各項組成的組的微生物：綠色木霉（NRRL B-50520)、短尾帚霉（NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其組合，并且提供由至少一種微生物施加作用以釋 放氮的底物。該方法進一步包括在有效地使得所述至少一種微生物對底物施加作用并且產 生包含氨基酸和氨的液體懸浮液的條件下使所述至少一種微生物與底物接觸。
[0083] 本發(fā)明的這一方面可以使用以上關于任何上述植物所描述的任何添加劑及任何 應用方式來進行。
[0084] 在本方面的這個方面，由于發(fā)酵，肥料可以呈全部或部分底物（即，角蛋白）的液 化形式。這樣的發(fā)酵將產生氨基酸、肽和/或氨。
[0085] 本發(fā)明的另一個方面涉及分離的綠色木霉菌株，其在編號NRRL B-50520下保藏于 農業(yè)研究服務培養(yǎng)物保藏中心。分離的綠色木霉菌株可以是生物學上純的形式。
[0086] 本發(fā)明的另一個方面涉及分離的短尾帚霉菌株，其在編號NRRL B-50521下保藏于 農業(yè)研究服務培養(yǎng)物保藏中心。分離的短尾帚霉菌株可以是生物學上純的形式。
[0087] 本發(fā)明的另一個方面涉及分離的短尾帚霉菌株，其在編號NRRL B-50522下保藏于 農業(yè)研究服務培養(yǎng)物保藏中心。分離的短尾帚霉菌株可以是生物學上純的形式。 實施例
[0088] 提供下列實施例以說明本發(fā)明的實施方案，而絕不是意欲限制其范圍。
[0089] 實施例1-降解廢物蛋白質的有效微生物的分離
[0090] 在農業(yè)廢棄物中存在的最廣泛的一種蛋白質是角蛋白。這是毛發(fā)、羽毛和其它類 似物質的結構成分。雖然角蛋白一般在土壤中或其它地方緩慢地降解，但是也有使該底物 降解相對快速的微生物。
[0091] 本發(fā)明的生物體可以在液體發(fā)酵中生長并且將釋放氨和氨基酸。對于本文所述的 菌株NRRL的使用，可以使用附加的營養(yǎng)物，如胰酶解酪蛋白大豆肉湯（Difco公司產品）。 將1至10% w/v的羽毛粉添加到含胰酶解酪蛋白大豆肉湯的水中，并將該混合物通過高壓 滅菌消毒。當將生物體添加到這個無菌介質中時，羽毛粉被降解。氨從羽毛粉中釋放產生 堿性環(huán)境。由于高pH下的氨是強揮發(fā)性的，因此這種材料的存在易于通過氣味檢測。收獲 和連續(xù)移除氨的系統(tǒng)都是現(xiàn)成的，并且是本領域技術人員已知的。一種方法是簡單地使封 閉的無菌閉環(huán)置于包括無菌空氣噴射裝置的發(fā)酵容器外面。當空氣被引入通過發(fā)酵液時， 氨將會被移除，并且可以通過傳遞至酸性溶液中而被截留，醋將是令人滿意的酸性溶液。這 將導致可以很容易地用作肥料的乙酸銨的形成，而這種噴射步驟將導致氨富集供進一步使 用。如果還需要移除氨基酸，此步驟可以通過使所述發(fā)酵液穿過適當?shù)碾x子交換樹脂來實 現(xiàn)，可將氨基酸從離子交換樹脂上洗脫，并由此富集。同時，該噴射過程將移除使pH值升高 的過量的氨從而使發(fā)酵繼續(xù)進行。這可以被開發(fā)成用于有效生產氨的連續(xù)流動系統(tǒng)。
[0092] 本發(fā)明試圖確定使蛋白質降解的有效微生物。要實現(xiàn)這一點，將羽毛粉與泥炭苔 混合并將混合物潤濕（組成：1L泥炭苔、1L羽毛粉和400ml水），連續(xù)兩天使混合物高壓滅 菌，并用lg堆肥雞糞來接種混合物。泥炭苔被用作增積/通氣組分，并且堆肥雞糞被認為 是角蛋白（即羽毛）降解的微生物的良好來源。在接種六天內，存在強的氨氣味，表明羽 毛降解成氨，所述氨是用于植物的優(yōu)良天然營養(yǎng)物。在氨氣味介質中存在的生物體在根據 制造商的指示制備的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（"PDA"）（ "Difco"）和胰酶解酪蛋白大豆瓊脂 ("TSA"）（ "Difco"）上使用稀釋技術進行涂板。在一般為真菌介質的PDA上的微生物生 長通常較差，但在為水解的大豆蛋白的TSA上，許多真菌生長。奇怪的是，這些微生物僅由 顯然能夠在羽毛粉上生長良好的三種不同的微生物組成，而在堆肥中出現(xiàn)的其它大多數(shù)豐 富的微生物不能在羽毛粉上良好生長。通過單一孢子分離、獲得這些真菌的純的形式并儲 存在-20°C的硅膠上，這是保存真菌的非常好的方式。
[0093] 將從雞糞堆肥中分離的真菌接種到胰酶解酪蛋白大豆肉湯（"TSB"）并且生長三 天。在TSB中獲得所有微生物的良好生長，并且將50ml活躍生長的培養(yǎng)物加入具有法蘭蓋 的無菌塑料盒中所包含的羽毛粉：泥炭混合物中，所述法蘭蓋為盒的內含物提供良好通氣。 經過六天的生長，將樣品移除、提取并確定可溶性氮化合物的水平。提取物針對氨基酸（茚 三酮法）或氨（Nessler試劑；LaMotte測試試劑盒）進行了分析。
[0094] 用獲得的真菌獲得有希望的結果。以賴氨酸為標準，對照樣品的氨水平為約 19 μ g/ml，而三個菌株的值分別為600 μ g/g、3240 μ g/g和4900 μ g/g。對于相同三個菌株 來說，相同樣品的氨基酸水平是2800 μ g/g、3003 μ g/g和5600 μ g/g，而對照值為約3 μ g/ ml。這些測定均重復多次，結果相似。特別是若干菌株比任何其它測試的微生物能更有效 地降解角蛋白。
[0095] 實施例2-角蛋白降解真菌和細菌的鑒定
[0096] 將以上實施例1中鑒定的真菌送到USDA典型培養(yǎng)物保藏中心以保藏在它們的專 利集合中。針對綠色、棕色和白色孢子菌株，這些菌株分別被命名為NRRL B-50520、NRRL B-50521和NRRL B-50522。這些真菌被鑒定為綠色木霉（NRRL B-50520)和短尾帚霉（NRRL B-50521和NRRL B-50522是該真菌的兩個分離株）。這兩個物種有帚狀分生孢子，但分生 孢子的排列的細微差異清楚地將它們置于各自的屬中。也對各分離株的ITS區(qū)進行測序并 通過GenBank BLAST查詢進行了評估。結果是，它們的身份被確認如下：
[0097] NRRL B-50520-綠色木霉
[0098] NRRL B-50521-短尾帚霉
[0099] NRRL B-50522-短尾帚霉
[0100] 綠色木霉具有非常低的風險特征。美國環(huán)境保護局指出，相對于使用該屬中的菌 株作為真菌病原體的生物控制劑，"該機構預計，多孢木霉和綠色木霉的當前注冊地點不 需要額外的健康影響數(shù)據"（木霉屬物種概要文件，注冊審查：初始文案，美國環(huán)境保護局 (2007年4月），所述文獻在此通過引用整體并入）。這同樣適用于木霉屬中的大多數(shù)其它 真菌。
[0101] 最近的評論列出了產生角蛋白酶的生物體（Brandelli等，"Biochemical Features of Microbial Keratinases and Their Production and Applications，''Applied Microbiology and Biotechnology 85:1735-1750(2010)，所述文 獻在此通過引用整體并入）。短尾帚霉被描述為角蛋白酶的產生者，但綠色木霉不是。然 而，有來自印度的通過綠色木霉菌株產生角蛋白酶的單個報告（Jyoti等，"Keratinolytic Enzymes From Trichoderma viride and Graphium cuneiferum Isolated From Poultry Farms at Jabalpur，India，"Cryptogamic Botany4:30_33(1993)，所述文獻在此通過引用 整體并入）。
[0102] 實施例3-生產可用制劑的方法
[0103] 羽毛粉是粗糙的棕色粉末。在許多應用中使用的干肥料需要以顆粒形式通過落下 或旋轉分散系統(tǒng)來施用。因此，開發(fā)了用于制備可用顆粒的方法。需要固化并且制作直徑 尺寸為2-5毫米的顆粒的方法。初始顆粒通過以下制備：將足量的水添加至羽毛粉末以制 成漿料，然后將明膠溶解于該漿料直至相對于羽毛粉末為約7%的最終濃度。將此材料以 薄片形式分散并干燥，結果獲得硬棕色薄片。隨后將此研磨并過篩以得到所需尺寸的顆粒。 應理解的是，類似的組合物可被擠出并干燥以得到適當大小的顆粒。類似地，這些混合物也 可以在造粒設備中使用，隨后適當?shù)卦O定大小。
[0104] 因此產生的顆粒不含任何添加的的微生物。制造顆?；蛲枇５哪承┫到y(tǒng)涉及加 熱和施加壓力，因此開發(fā)了用于丸粒的涂布程序。將已知能提供益處（包括增強的氮利 用效率）的木霉屬菌株的分生孢子添加至〇· 1% Crystal Tex(木薯右旋糖酐，National Starch)以得到約105個菌落形成單位/ml的懸浮液。將該混合物施加到干燥丸粒的表面 以得到光滑且連續(xù)的涂層，所述涂層不明顯地增加顆粒的尺寸。因此，活的真菌被施用為干 涂層。從這個位置，當丸粒濕潤時，這些真菌立即生長（圖1)。
[0105] 在以后的實驗中，將菌株直接添加至混合物同時潤濕并且然后將其擠出以形成丸 粒進行檢查。此方法效果非常好并且只要干燥溫度保持在38°C或以下生物體保持穩(wěn)定。選 擇適當?shù)奈⑸矬w（即微生物）有助于獲得最佳效果。這些微生物有兩個功能：（1)某些 微生物具有使羽毛粉或其它抗性蛋白質降解的能力，并且（2)某些微生物作為內生植物共 生體。在本發(fā)明的實驗中，在不存在微生物的情況下，如通過草坪植物返青判斷的N只在施 用后4-6周出現(xiàn)。而此時，在存在降解微生物的情況下，大部分N已經被釋放。內生植物微 生物有很多功能，其中之一是提高植物氮利用效率（"NUE"）。如果包含此微生物組分，則 肥料的有效N值增大。因此，當包括NUE貢獻時，14% N肥料中的N量實際上變成28%。如 果本發(fā)明與具有30% N的標準合成肥料競爭且并與其一樣有效，那么上述情況是本發(fā)明的 有用的方面。植物仍然需要相同水平的N來茁壯成長，因此本發(fā)明中的肥料在相同的施用 率下變得同樣有效（對經濟競爭力有用）的唯一方法是通過使用NUE增強生物體。
[0106] 標準合成肥料含有高水平的鹽，并且這些成分的滲透勢和直接影響對于微生物是 致命的。然而，在本發(fā)明中，合成鹽幾乎完全消除，并且因此，含有微生物的顆粒對于微生物 是安全的。大多數(shù)顆粒是蛋白質，它對于微生物是無毒的。因此，微生物劑的涂布或直接混 合是本發(fā)明的一個構成。
[0107] 可以將微生物組分和非生物組分配制成單一顆?；蚱渌旌衔?。在文獻中存在很 多以下情況：其中，例如，添加至土壤或生活在土壤中的微生物增加植物生長，包括NUE。然 而，用戶不愿意施用多個不同的生物體和其它產品來實現(xiàn)有價值的結果。把所有的生物和 非生物組分納入單一產品或顆粒是本發(fā)明的一個構成。
[0108] 本發(fā)明的這一實施方案提供了幾乎完全由蛋白質組成的顆粒。蛋白質是12-14% N，因此因為明膠和羽毛粉都是動物蛋白，所以獲得了必需值。
[0109] 對于一些應用，顆粒產品對于一些應用是沒有必要的。常常將粉末用作例如植物 生長介質的組分，以及作為直接添加到田間或花園的材料，諸如這樣的顆粒的典型氮值是 12-14 %?？芍苯邮褂帽疚闹兴枋龅挠鹈酆臀⑸锏幕旌衔铩?br> [0110] 此外，可以將任何數(shù)目的添加物制成這種基本顆粒或粉末。一個實例是如上文實 施例2中從生長介質中提取的液體氨和氨基酸混合物。這可以干燥粉末或顆粒形式直接使 用，或濃縮以得到更高水平的N。由于羽毛粉或明膠提供很少的立即可用的N，因此這樣的 添加可用于提供立即返綠。其它合適的氮源是魚粉或提取物、堆肥提取物、海藻提取物、海 洋動物如蝦或貝類提取物。無機源包括硝酸鹽、無機氨源等。此外，可以加入有機上所列的 產品，如來自綠砂的K或有機上所列的硫酸鉀，以及未列出的其它K源。類似地，P可以以 骨粉（有機）形式提供或來自各種無機鹽。對于草坪施用，P是被禁止的，并且羽毛粉或明 膠組分的使用是因為P是不存在的。
[0111] 實施例4-用于草的肥料
[0112] 肥料的非常苛刻的用途是施用到草坪、運動場、公園、高爾夫球場及其它類似用途 中的草上。肥料必須提供極具吸引力的表面并且持續(xù)相當長一段時間。制備顆粒以含有 73. 8 %的羽毛粉、13%的智利硝酸鹽、7. 3%的明膠和5. 7%的新澤西州綠砂（K源）。智利 硝酸鹽是目前有機認證的，并含有16 %的N，所以其氮含量只比蛋白成分的含量高一點。作 為對比，所生產的制劑相對于分析為30:2:8N :P:K(以N、已05和1(20形式）的廣泛使用的 家用肥料ScottsK Turf Builder?來進行測試。通過比較可以預料，所制備的肥料的分析是 15-16:0:0. 3,所以它不是完整的肥料。P不包括在內，因為存在導致富營養(yǎng)化的磷污染水 體的危險，所以這在許多司法管轄區(qū)是不被允許的。N水平比Scotts'肥料的N水平低高達 50 %，并且K水平是次優(yōu)的。因此，如果本發(fā)明的肥料制劑的性能接近于Sc〇ttsU的性能，它 說明了（a)顯著量的N從肥料中釋放，（b)草坪植物中由所添加的真菌誘導了 N吸收功效 提高，并且（c)有較少可用的N滲入地下水。畢竟，植物還需要相同量的N來生長，如果只 添加一半的氮，那么必須有更大的N吸收，并且只能有滲入地下水的少量的氮。
[0113] 在幾乎不含有游離氮的1:1沙壤土：泥炭混合物中種植的一年生黑麥草中進行測 試。將一年生黑麥草種植在淺苗床中并在種植后約兩周幼苗已形成后，施用各種肥料。顆 粒以1χ施用率來施用，這是以ScottsK Turf BuildeP的推薦施用率來施用的肥料水平。此 夕卜，每次處理以此施用率兩次施用。第一個實驗中包含如下的一些處理：
[0114] ?無處理對照
[0115] ?施用無任何微生物的顆粒
[0116] ?施加有B-50520的顆粒
[0117] ?涂覆有B-50521的顆粒
[0118] ?涂覆有B-50522的顆粒
[0119] ?涂覆有B-50520+木霉屬菌株K1-K4的顆粒（在下一個實施例中描述）
[0120] ?涂覆有B-50521+木霉屬菌株K1-K4的顆粒
[0121] ?涂覆有B-50522+木霉屬菌株K1-K4的顆粒。
[0122] · Scotts* Turf Builder1、肥料
[0123] 全部以lx和2x施用率來施用。在本實施例中，K1-K4由以下菌株組成：哈茨木 霉菌株RR17Bc (ATCC登記PTA9708);哈茨木霉FllBab (ATCC登記PTA9709)、深綠木霉菌株 WW10TC4 (ATCC PTA 登記 9707)和綠木霉菌株 41 (ATCC 登記 20476)。
[0124] 這些試驗的結果是成功的，并總結于圖2A-2B和圖3A-3D。
[0125] 在圖2A中，所使用的處理為PT(有機肥料，NRRL B-50521，和K1-K4,其包括 哈茨木霉菌株RR17Bc (ATCC登記PTA9708)、哈茨木霉FllBab (ATCC登記PTA9709)、 深綠木霉菌株WW10TC4 (ATCC PTA登記9707)，和綠木霉菌株41 (ATCC登記20476)); STB =Sc〇ttsuTurf Builder"; P =具有NRRL B-50521的有機肥料；和C =未處理的對照。 在圖2B中，所用的處理為PT (有機肥料和NRRL B-50521) ;0FC =無任何真菌的有機肥料顆 粒；P (具有NRRL B-50521的有機肥料）。圖2A-2B顯示通過將顆粒分散于草生長的土壤的 表面上來施肥之后約10天的生長。生長增加主要是可用的可溶氮引起的。正如所見，與沒 有這種生物體的任何處理相比，在存在NRRL B-50521的情況下，使用有機肥料的草的生長 基本上更大。使用NRRL B-50520或NRRL B-50522可見類似的結果。在這個時間段，與商 業(yè)草坪肥料相比，草的生長也更大。與沒有顆粒的對照相比，有機肥料對照也生長更好；這 部分地可以歸因于作為起始肥料添加至顆粒中的少量有機智利硝酸鹽（主要是NaN0 3)。這 說明了包括微生物介導的緩慢釋放氮的本文公開的本發(fā)明的效用。
[0126] 圖3A-3D含有顯示隨時間的生長的圖。為了獲得這些數(shù)據，將草從淺苗床上剪斷、 干燥并稱重以模擬割草事件（在圖2A-2B中，準備草用于切割），并且這在整個實驗過程中 持續(xù)進行。所有切割均在同一天進行，所以圖代表在上一次切割與下一次切割之間收獲的 草量，并且收獲后的天數(shù)代表進行切割時施肥后的天數(shù)。
[0127] 在播種后第7天，未處理過的草，在其最高切割水平下，是800毫克/淺苗床，此后 的切割重量下降到非常低的水平（圖3A)。lx施用率下的有機肥料類似于未處理的對照， 但在2x施用率下，重量顯著較大。第一次切割時的有機肥料較高，這無疑代表了在顆粒中 提供的智利硝酸鹽提供的氮。一個星期后，草重量下降，然后再次增加（圖3A)。這第二次 增加無疑是由于羽毛粉被天然土壤微生物區(qū)系水解。
[0128] 標準ScottsK Turf Builder"最初在?χ水平下支持適度生長，但在第二次切割 時此生長增加。在第三次切割時生長再次下降，并且最終在最后一次切割時再次增加（圖 3B)。這可能反映了不同氮源的可用性的變化。然而，在雙倍施用率下，草產量在第二次和 第三次切割時極低（圖3B)。這是由在這個施用水平下草的燒傷造成的，這從未發(fā)生于任何 基于羽毛粉的系統(tǒng)中。
[0129] 在lx施用率下，菌株NRRL B-50520產生顯著優(yōu)于對照有機肥料的草切割產量結 果（圖3A和3C)。菌株NRRL B-50521產生了氮的迅速釋放，如由第一次切割時非常高的草 產量所證明，但然后在大多數(shù)情況下，草產量在第二次切割時大幅度下降。這是由于非常高 的可溶性氮釋放然后將底物耗盡引起的。
[0130] 在這些實驗中，應當指出的是，ScottsK:J把料相對是完全肥料，同時，如前所述，所 采用的試驗材料不含有磷并且鉀的水平不足。
[0131] 實施例5_用不同材料施肥的土壤和草中的可溶性氮化合物的庫大小
[0132] 在上述實施例中表明通過其它方法制備的肥料將具有低水平的硝酸鹽滲入地下 水。如果這是真的，那么硝酸鹽的水平應比用標準的化學肥料施肥的土壤中更低。同時，由 于羽毛粉的降解導致氨基酸和氨釋放，其它形式的可溶性氮應增加。這些化合物將僅通過 土壤微生物區(qū)系的活性隨著時間的推移而被轉化成硝酸鹽。然而，氨基酸和氨有可能被植 物（或微生物區(qū)系）迅速吸收，因此庫大小將不會積累到大的水平。因此，與具有標準的化 學肥料的土壤相比，在具有本發(fā)明的樣品的土壤中，任何形式的游離氮的量可能更小。來自 施肥九天后采樣的土壤的數(shù)據列于以下表1中。每3. 6ml提取緩沖液提取lg 土壤，并且上 文描述的比色測試用于測量提取物中的可溶性氮。關于氨基酸的水平，數(shù)據基于用賴氨酸 作為標準的稀釋曲線。所有這些測定都在lx施肥率下進行。
[0133] 蓋丄.土壤中的不同形式的可溶性氮的量
【權利要求】
1. 一種肥料，其包含： 至少一種選自由以下各項組成的組的微生物：綠色木霉（NRRL B-50520)、短尾帚霉 (NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其組合，以及 由所述至少一種微生物施加作用以釋放氮的底物。
2. 如權利要求1所述的肥料，其中所述底物是選自由以下各項組成的組的蛋白質：羽 毛、羽毛粉和尿素衍生物。
3. 如權利要求1所述的肥料，其進一步包含： 呈木霉屬物種形式的補充微生物。
4. 如權利要求3所述的肥料，其中所述補充微生物選自由以下各項組成的組：綠木霉、 哈茨木霉、深綠木霉及其組合。
5. 如權利要求1所述的肥料，其進一步包含： 選自由以下各項組成的組的補充微生物：印度梨形孢、植物根際促生菌、菌根真菌及其 組合。
6. 如權利要求1所述的肥料，其中所述肥料呈顆粒、丸粒、粉塵、粉末、漿液、薄膜和/或 液體懸浮液形式。
7. 如權利要求6所述的肥料，其中所述肥料呈顆粒或丸粒形式，所述顆?；蛲枇：?明膠作為固化劑。
8. 如權利要求1所述的肥料，其中所述肥料在所述底物中包含至少ΚΓ4個菌落形成單 位/g的所述至少一種微生物。
9. 如權利要求1所述的肥料，其中所述肥料具有介于10-20重量％之間的氮含量。
10. 如權利要求1所述的肥料，其中所述肥料進一步包含： 非蛋白質結合劑，其選自由葡聚糖、淀粉、聚氯乙烯及其組合組成的組。
11. 如權利要求1所述的肥料，其中所述肥料進一步包含： 可溶性氮源，其選自由硝酸鹽、氨、銨鹽、氨基酸、尿素、魚粉或提取物、堆肥提取物、海 藻提取物、蝦提取物、貝類提取物及其組合組成的組。
12. 如權利要求1所述的肥料，其中所述肥料進一步包含： 磷源，其選自由磷酸巖、磷酸鈉、磷酸鉀、骨粉及其組合組成的組。
13. 如權利要求1所述的肥料，其中所述肥料進一步包含： 鉀源，其選自由氯化鉀、磷酸鉀、硫酸鉀、新澤西州綠砂、鉀的有機來源及其組合組成的 組。
14. 如權利要求1所述的肥料，其中所述肥料進一步包含： 微量營養(yǎng)物，其選自由鹽，含有鐵、鈷、錳、鎂、銅、鈣、硼、鋅的物質及其組合組成的組。
15. 如權利要求1所述的肥料，其中所述肥料進一步包含： 生長介質。
16. 如權利要求15所述的肥料，其中所述生長介質選自由以下各項組成的組：土壤、砂 堆肥、泥炭、稻殼、椰纖維、椰糠、含有有機和/或無機成分的無土生長介質、人造植物生長 基質、基于聚合物的生長基質、水栽營養(yǎng)物和生長溶液、有機土壤改良劑、水及其混合物。
17. 如權利要求1所述的肥料，其中所述肥料進一步包含： 選自由水、水溶液、漿液和粉末組成的組的載體。
18. 如權利要求1所述的肥料，其中所述肥料進一步包含： 添加劑，其選自由以下各項組成的組：殺蟲劑、殺真菌劑、殺線蟲劑、額外有機肥料、生 物殺蟲劑、生物殺真菌劑、生物殺線蟲劑、農業(yè)或園藝佐劑、粘著劑、撒施劑、表面活性劑、分 散劑、濕潤劑、UV防護劑及其混合物。
19. 如權利要求1所述的肥料，其中所述肥料進一步包含： 選自由堆肥和生物炭組成的組的有機碳源。
20. -種肥料，其包含： 至少一種選自角蛋白降解微生物的微生物，以及 角蛋白底物，其由所述至少一種微生物施加作用以釋放氮。
21. 如權利要求20所述的肥料，其中所述至少一種微生物選自由綠色木霉（NRRL B-50520)、短尾帚霉（NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其組合組成的組。
22. 如權利要求20所述的肥料，其進一步包含： 至少一種選自由除蟲鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、紫紅鏈霉菌及其組合組成的組的微生物。
23. 如權利要求20所述的肥料，其進一步包含： 呈木霉屬物種形式的補充微生物。
24. 如權利要求23所述的肥料，其中所述補充微生物選自由以下各項組成的組：綠木 霉、哈次木霉、和深綠木霉及其組合。
25. 如權利要求20所述的肥料，其進一步包含： 選自由以下各項組成的組的補充微生物：印度梨形孢、植物根際促生菌、菌根真菌及其 組合。
26. 如權利要求20所述的肥料，其中所述肥料呈顆粒、丸粒、粉塵、粉末、漿液、薄膜和/ 或液體懸浮液形式。
27. 如權利要求20所述的肥料，其中所述肥料呈含有氨基酸和氨的液體懸浮液形式。
28. -種增強植物生長的方法，所述方法包括： 提供肥料，其包含： 至少一種選自由以下各項組成的組的微生物：綠色木霉（NRRL B-50520)、短尾帚霉 (NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其組合，以及 由所述至少一種微生物施加作用以釋放氮的底物；并且 在與不施用所述肥料的植物或植物種子相比可有效地增強所述植物或植物種子的生 長的條件下使所述肥料與所述植物或植物種子接觸。
29. 如權利要求28所述的方法，其中所述底物是選自由以下各項組成的組的蛋白質： 羽毛、羽毛粉和尿素衍生物。
30. 如權利要求28所述的方法，其進一步包含： 呈木霉屬物種形式的補充微生物。
31. 如權利要求30所述的肥料，其中所述補充微生物選自由以下各項組成的組：綠木 霉、哈次木霉和深綠木霉及其組合。
32. 如權利要求28所述的方法，其進一步包含： 選自由以下各項組成的組的補充微生物：印度梨形孢、植物根際促生菌、菌根真菌及其 組合。
33. 如權利要求28所述的方法，其中所述肥料呈顆粒、丸粒、粉塵、粉末、漿液、薄膜和/ 或液體懸浮液形式。
34. 如權利要求33所述的方法，其中所述肥料呈顆?；蛲枇Ｐ问剑鲱w?；蛲枇：?有明膠作為固化劑。
35. 如權利要求34所述的方法，其中所述明膠占顆粒或丸粒的5-20重量％。
36. 如權利要求33所述的肥料，其中所述肥料呈含有氨基酸和氨的液體懸浮液形式。
37. 如權利要求28所述的方法，其中所述肥料具有介于10-20重量％之間的氮含量。
38. 如權利要求28所述的方法，其中所述肥料進一步包含： 非蛋白質結合劑，其選自由葡聚糖、淀粉、聚氯乙烯及其組合組成的組。
39. 如權利要求28所述的方法，其中所述肥料進一步包含： 可溶性氮源，其選自由硝酸鹽、無機氨源、氨、銨鹽、氨基酸、尿素、魚粉或提取物、堆肥 提取物、海藻提取物、蝦提取物、貝類提取物及其組合組成的組。
40. 如權利要求28所述的方法，其中所述肥料進一步包含： 磷源，其選自由磷酸巖、磷酸鈉、磷酸鉀、骨粉及其組合組成的組。
41. 如權利要求28所述的方法，其中所述肥料進一步包含： 鉀源，其選自由氯化鉀、磷酸鉀、硫酸鉀、新澤西州綠砂、鉀的有機來源及其組合組成的 組。
42. 如權利要求28所述的方法，其中所述肥料進一步包含： 微量營養(yǎng)物，其選自由鹽，含有鐵、鈷、錳、鎂、銅、鈣、硼、鋅的其它物質及其組合組成的 組。
43. 如權利要求28所述的方法，其中肥料進一步包含： 生長介質。
44. 如權利要求43所述的方法，其中在所述植物或所述植物種子處于所述生長介質中 之前進行所述接觸。
45. 如權利要求43所述的方法，其中在所述植物或所述植物種子處于所述生長介質中 之后進行所述接觸。
46. 如權利要求43所述的方法，其中所述生長介質選自由以下各項組成的組：土壤、砂 堆肥、泥炭、稻殼、椰纖維、椰糠、含有有機和/或無機成分的無土生長介質、人造植物生長 基質、基于聚合物的生長基質、水栽營養(yǎng)物和生長溶液、有機土壤改良劑、水及其混合物。
47. 如權利要求28所述的方法，其中所述肥料進一步包含： 選自由水、水溶液、漿液和粉末組成的組的載體。
48. 如權利要求28所述的方法，其中所述肥料進一步包含： 添加劑，其選自由以下各項組成的組：殺蟲劑、殺真菌劑、殺線蟲劑、額外有機肥料、生 物殺蟲劑、生物殺真菌劑、生物殺線蟲劑、農業(yè)或園藝佐劑、粘著劑、撒施劑、表面活性劑、分 散劑、濕潤劑和UV防護劑及其混合物。
49. 如權利要求28所述的方法，其中所述肥料進一步包含： 選自由堆肥和生物炭組成的組的有機碳源。
50. 如權利要求28所述的方法，其中所述植物或植物種子選自由以下各項組成的組： 蕎麥、豆類、玉米、棉花、油菜、豌豆、花生、紅花、向日葵、苜蓿、三葉草、野豌豆、車軸草、黑 莓、藍莓、醋栗果、接骨木果、醋栗、越橘、羅甘莓、樹莓、草莓、葡萄、大蒜、韭菜、洋蔥、青蔥、 觀賞球莖植物、柑橘雜種、葡萄柚、金橘、酸橙、橙子、柚子、黃瓜、甜瓜、葫蘆、南瓜、南瓜、鮮 花、花壇植物和觀賞植物、茄子、甜辣椒、粘果酸漿、番茄、藥草、香料、薄荷、芝麻菜、芹菜、山 蘿卜、菊苣、茴香、萵苣、歐芹、菊苣、大黃、菠菜、唐萵苣、花椰菜、球芽甘藍、甘藍、花椰菜、羽 衣甘藍、無頭甘藍、大頭菜、芥菜、蘆筍、扁豆、梨、榲梓、甜菜根、甜菜、紅甜菜、胡蘿卜、塊根 芹、菊苣、山葵、歐洲防風草、蘿卜大頭菜、婆羅門參、蕪菁、落葉樹、觀賞植物、柑橘、松樹、黑 麥、小麥、高粱、小米、杏、櫻桃、油桃、桃子、李子、李子干、杏仁、山毛櫸堅果、巴西堅果、灰胡 桃、腰果、栗子、榛子、山核桃、澳洲堅果、美洲山核桃、開心、果、核桃、馬鈴薯、紅薯、山藥、菊 芋、木薯、姜和草坪草。
51. 如權利要求28所述的方法，其中所述接觸通過以下方式進行：撒播施用、落下施 用、旋轉施用、液體或干式犁溝內施用、直接摻入到土壤或溫室種植混合物中、噴霧施用、灌 溉、注射、噴粉、擠出、?；⒒蛴盟龇柿贤扛菜鲋参锘蛩鲋参锓N子。
52. 如權利要求28所述的方法，其中所述植物生長增強呈更大的根群、更大的生根深 度、更大的芽群、更大的芽葉長度、增加的葉綠度、增加的產量和改善的群叢和活力的形式。
53. -種制造含有氨基酸和氨的肥料的方法，所述方法包括： 提供至少一種選自由以下各項組成的組的微生物：綠色木霉（NRRL B-50520)、短尾帚 霉（NRRL B-50521)、短尾帚霉（NRRL B-50522)及其組合； 提供由所述至少一種微生物施加作用以釋放氮的底物；并且 在有效地使得所述至少一種微生物對所述底物施加作用并且產生含有氨基酸和氨的 液體懸浮液的條件下使所述至少一種微生物與所述底物接觸。
54. -種肥料，其通過如權利要求53所述的方法來生產。
55. -種分離的綠色木霉菌株，其在編號NRRL B-50520下保藏于農業(yè)研究服務培養(yǎng)物 保減中心。
56. 如權利要求55所述的分離的綠色木霉菌株，其為生物學上純的。
57. -種分離的短尾帚霉菌株，其在編號NRRL B-50521下保藏于農業(yè)研究服務培養(yǎng)物 保減中心。
58. 如權利要求57所述的分離的短尾帚霉菌株，其為生物學上純的。
59. -種分離的短尾帚霉菌株，其在編號NRRL B-50522下保藏于農業(yè)研究服務培養(yǎng)物 保減中心。
60. 如權利要求59所述的分離的短尾帚霉菌株，其為生物學上純的。
【文檔編號】C05F11/08GK104203871SQ201280062108
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2012年11月21日 優(yōu)先權日:2011年11月23日
【發(fā)明者】G·E·哈曼, X·雷 申請人:康奈爾大學