專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種刺五加有效組分及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬中藥提取物，具體地說(shuō)涉及從刺五加中提取的有效組分，及其制備方法，以及該有效組分在制備治療、預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用。技術(shù)背景腫瘤是一種常見(jiàn)病、多發(fā)病，其中惡性腫瘤是目前危害人類(lèi)健康最嚴(yán)重的一類(lèi)疾病。目前業(yè)內(nèi)對(duì)惡性腫瘤的治療主要還是以手術(shù)、放療、化療為主，但許多化學(xué)抗癌藥物在作用于靶細(xì)胞時(shí)往往累及正常細(xì)胞，造成嚴(yán)重的副反應(yīng)。植物藥的遺傳毒性不明顯，中草藥在抗癌抗突變方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景，而且中藥在對(duì)腫瘤的輔助治療中也起到不容忽視的作用。紫杉醇即是典型的從植物中獲得的具有良好抗癌活性的天然化合物，現(xiàn)已開(kāi)發(fā)為抗腫瘤藥物。目前我國(guó)危害性最為嚴(yán)重的腫瘤為肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、白血病及淋巴瘤等。特別是肝癌的發(fā)生率近年來(lái)有所增加。值得重視，這些腫瘤的病因?qū)W、發(fā)病學(xué)及其防治，均為我國(guó)腫瘤研究的重點(diǎn)。尋找高效低毒的抗癌藥物以及抗癌輔助藥物是當(dāng)前腫瘤研究的重要內(nèi)容。我國(guó)藥用生物資源十分豐富，其生理活性物質(zhì)是研究和發(fā)現(xiàn)新藥先導(dǎo)化學(xué)物，開(kāi)發(fā)新藥的天然寶庫(kù)。目前，我國(guó)從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)，用于開(kāi)發(fā)成治療腫瘤疾病、安全性好、毒性低的新藥還很少，從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)，開(kāi)發(fā)成具有抗腫瘤療效的新藥，具有重要應(yīng)用價(jià)值和廣闊發(fā)展前景。刺五力口為五力口禾斗植物刺五力口Acanthopanaxsenticosus(Rupr.etMaxim.)harms的干燥根及根莖或莖。在我國(guó)，刺五加作為藥物被廣泛應(yīng)用已有悠久的歷史，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品。主要分布于我國(guó)東北，華北地區(qū)，尤己黑龍江省野生資源豐富，蘊(yùn)藏量大。刺五加中含有紫丁香苷(刺五加苷B)等多種五加苷，此外還含金絲桃苷，苦杏仁苷，木脂素，多糖及多種微量元素等物質(zhì)。刺五加提取物具有抗腫瘤活性，能增強(qiáng)化療藥物的抗癌效應(yīng)且降低其毒性(鄭虎古等，中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用(第三巻)，1998，2734)，對(duì)血小板聚集有明顯的抑制作用(楊秋生等，首都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1991，12(3):171)，刺五加多糖具有免疫調(diào)節(jié)功能，能促使荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞數(shù)顯著增加(張明溪等，時(shí)珍國(guó)藥雜志，1998，9(1):37)等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種刺五加有效組分，該有效組分主要含有化合物A:Anhydrochiisanogenoicacid，化合物B:OplopanaxogeninA，其中化合物A的含量為50~70°/。，化合物B的含量為20~40%。優(yōu)選A的含量為55~65%，B的含量為2535。/。。A的結(jié)構(gòu)式為-B的結(jié)構(gòu)式為:OH本發(fā)明的另一目的是提供該刺五加有效組分的制備方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)將刺五加藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進(jìn)行拌樣，用正相硅膠柱對(duì)其進(jìn)行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動(dòng)相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇作為流動(dòng)相，得洗脫液n，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動(dòng)相為水和乙腈，梯度洗脫，收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。優(yōu)選的刺五加有效組分制備方法，包括下列步驟將刺五加藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1:0.81.2)，加熱回流0.81.2小時(shí)，提取1~3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進(jìn)行拌樣，用正相硅膠柱對(duì)其進(jìn)行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(4753:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(813:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件-色譜柱為制備柱，流動(dòng)相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為9llml/min，柱溫為室溫，收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。最佳的刺五加有效組分制備方法，包括下列步驟將刺五加藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:l)，加熱回流l小時(shí)，提取2次，合并濾液得提取液；將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進(jìn)行拌樣，用正相硅膠柱對(duì)其進(jìn)行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(50:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(10:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱(ZorbaxSB-C18;21.2mmx250mm)，流動(dòng)相為水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序如下O分鐘時(shí)，流動(dòng)相為80%的水溶液和20%的乙腈溶液；5分鐘時(shí)，流動(dòng)相為80%的水溶液和20%的乙腈溶液；19分鐘時(shí)，流動(dòng)相為50%的水溶液和50%的乙腈溶液；60分鐘時(shí)，流動(dòng)相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液；64分鐘時(shí)，流動(dòng)相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液；流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時(shí)間段32.0~36.0min收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供該刺五加有效組分在制備治療、預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的刺五加有效組分可以作為活性成分，加入藥劑學(xué)上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學(xué)上記載的方法制成制劑。本發(fā)明的刺五加有效組分還可以作為活性成分之一，加入其他抗腫瘤藥物，加入藥劑學(xué)上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學(xué)上記載的方法制成制劑。所述藥物的制劑形式包括液體制劑、固體制劑、膠囊劑、膠丸劑。包括注射液、滴注液、粉針劑、顆粒劑、片劑、沖劑、散劑、口服液、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、崩解劑、口崩片、微丸等。本發(fā)明的有益效果為1.本發(fā)明的提取分離工藝中使用了正相硅膠柱，能有效地除去糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等雜質(zhì)，提高有效成分的含量，同時(shí)采用了制備色譜，能快速準(zhǔn)確的得到有效成分。2.本發(fā)明提供的刺五加有效組分化學(xué)成分簡(jiǎn)單明確，在藥理研究上更易于闡明其作用機(jī)制，在生產(chǎn)中更易于藥物的質(zhì)量控制。3.本發(fā)明提供的方法首次從刺五加中得到A、B等幾個(gè)成分的組合物，并首次將其在多種腫瘤細(xì)胞株上進(jìn)行藥效篩選，得到較好的藥理活性。具體實(shí)施方式本發(fā)明結(jié)合下面實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容，該實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而并非對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例一刺五加有效組分的制備將200g刺五加藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1:0.8)，加熱提取1次得提取液，將提取液濃縮成浸膏7.8g，并將其與硅膠進(jìn)行拌樣，用正相硅膠柱對(duì)其進(jìn)行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(53:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(13:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品2.6g;用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動(dòng)相為水和乙腈，梯度洗脫。樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時(shí)間段32.036.0min收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分0.16g。實(shí)施例二刺五加有效組分的制備將500g刺五加藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:1.2)，加熱回流0.81.2小時(shí)，提取3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏15.1g，并將其與硅膠進(jìn)行拌樣，用正相硅膠柱對(duì)其進(jìn)行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(47:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(8:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品5.8g;用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動(dòng)相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為9llml/min，柱溫為室溫。樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時(shí)間段32.036.0min收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分0.33g。實(shí)施例三刺五加有效組分的制備取刺五加藥材250g，將其粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:l)，加熱回流1小時(shí)，提取2次，濾液合并得提取液。將提取液濃縮成浸膏得8.0g，將浸膏和硅膠拌樣，用正相硅膠柱進(jìn)行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(50:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液I，然后改換氯仿和甲醇(10:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液II，濃縮干燥后得2.8g樣品。用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品。制備色譜的分離條件色譜柱為Agient制備柱(ZorbaxSB-C18;21.2mmx250mm)，流動(dòng)相為水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序如下O分鐘時(shí)，流動(dòng)相為80%的水溶液和20%的乙腈溶液；5分鐘時(shí)，流動(dòng)相為80%的水溶液和20%的乙腈溶液；19分鐘時(shí)，流動(dòng)相為50%的水溶液和50%的乙腈溶液;60分鐘時(shí)，流動(dòng)相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液；64分鐘時(shí)，流動(dòng)相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液；流速為10ml/min，柱溫為室溫。樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時(shí)間段32.0~36.0min收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分0.18g。實(shí)施例四刺五加有效組分HPLC-ELSD分析色譜條件色譜柱AgilentZorbaxSB-C18柱(4.6mmxl50mm,5pm);采用梯度洗脫，流動(dòng)相A相為0.2。/。冰醋酸水溶液，流動(dòng)相B相為含0.2n/。冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序如下O分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為90%的0.2%冰醋酸水溶液、流動(dòng)相B為10%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；10分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為50%的0.2%冰醋酸水溶液、流動(dòng)相B為50%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；30分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為5%的0.2%冰醋酸水溶液、流動(dòng)相B為95%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；35分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為5%的0.2%冰醋酸水溶液、流動(dòng)相B為95%的0.2%冰醋酸的乙腈。溶液流速0.5mL'min人檢測(cè)波長(zhǎng)全波長(zhǎng)；柱溫3(TC。ELSD參數(shù)氮?dú)饬魉?.0L/min;漂移管溫度105°C。供試品溶液的制備稱(chēng)取本品，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。測(cè)定方法精密吸取供試品溶液，注入液相色譜儀，依色譜分析條件測(cè)定，即得。本發(fā)明中，A的結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>本發(fā)明中，B的結(jié)構(gòu)式為:實(shí)施例五刺五加有效組分制劑取實(shí)施例三的刺五加有效組分0.5g與10.5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至68t:液體石蠟中，除油，制得滴丸400粒。實(shí)施例六刺五加有效組分制劑取實(shí)施例三的剌五加有效組分0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸鈉0.9g和蒸餾水lml，上述組分混合均勻后，冷凍干燥，分裝500支，即得。實(shí)施例七刺五加有效組分制劑取降香油L5g，加入到13ml飽和的羥丙基P-環(huán)糊精中，攪拌溶解，濾過(guò)，濾液低溫干燥，得降香油和羥丙基P-環(huán)糊精的包合物粉末。除上述降香油合羥丙基P-環(huán)糊精的包合物粉末外，再取實(shí)施例三的刺五加提取物0.5g、甘露醇5.5g、依地酸鈣鈉0.9g和蒸餾水2ml，上述組分混勻后，冷凍干燥，分裝300支，即得。實(shí)施例八刺五加有效組分制劑取實(shí)施例三的刺五加有效組分適量用4(TC注射用水溶解，加入適量藥用載體等滲劑，調(diào)節(jié)溶液的pH值為7.0-8.0，加注射用水至全量，用超濾器超濾除熱源，測(cè)定pH值后，用膜過(guò)濾，分裝后，高壓滅菌，檢驗(yàn)、包裝，即得。實(shí)施例九刺五加有效組分制劑取實(shí)施例三的刺五加有效組分與花生油按2:18的比例水溶式不銹鋼攪拌灌中，同時(shí)加入適量明膠和甘油混合，放出再用膠體磨磨漿，磨出的混合液攪拌，制成藥液；將甘油與蒸餾水在40-50。C溫度下攪拌混溶，再將甘油液溫至80-90°C，取明膠加入其中混合攪拌，直至全部溶化成膠液，然后在60'C溫度下使膠液靜置4小時(shí)，用制板機(jī)制成膠板供制丸工序使用；將上述制成的藥液和膠板送入壓丸機(jī)制丸，然后在22-25'C溫度下吹風(fēng)4小時(shí)作滾筒定型，又在25-30'C溫度下吹風(fēng)干燥16-20小時(shí)，檢選合格膠丸，用95%乙醇清洗，在25-30'C下吹風(fēng)干燥4小時(shí)，即得。實(shí)施例十剌五加有效組分制劑取實(shí)施例三的刺五加有效組分適量與微晶纖維素混合均勻，加3%聚維酮乙醇溶液制軟材，過(guò)18目篩制顆粒，60。C干燥l小時(shí)，整粒，加入滑石粉適量，混勻，壓片，即得。實(shí)施例十一刺五加有效組分的藥理實(shí)驗(yàn)藥理模型HL60腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與種板細(xì)胞培養(yǎng)使用RPMI1640(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，胎牛血清(四季青)10%，非必需氨基酸(Gibco)1。/?；旌吓囵B(yǎng)HL60細(xì)胞，密度需低于1(^個(gè)/mL。計(jì)算需要細(xì)胞總量NT=pcell，mL"xVT(P=2xl04個(gè)/mL)，其中Vf0.1mLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中。取10pL，加10pL胎盤(pán)藍(lán)稀釋?zhuān)?jì)算計(jì)數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)Nl，則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為Nl/4x10、2xV個(gè)，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液V，mL，吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V^Nt/NxV,。在細(xì)胞槽中再加入Vt-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入10(HiL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，剩余孔加入100)iLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案刺五加有效組分用DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150pL。在新的96孔板中加入220]iL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88pL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入50pL，此時(shí)藥物稀釋1000倍，即終濃度為50ng/mL。孵育48h。每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行復(fù)孔，每板設(shè)空白組(blank,只加培養(yǎng)液，不含細(xì)胞)，及陰性對(duì)照組(negative,細(xì)胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200|iL的培養(yǎng)液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)。SRB染色細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，每孔加入40%(質(zhì)量/體積)的三氯乙酸(TCA)10(HiL固定細(xì)胞，室溫放置5min，4"C冰箱中放置1h。培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中干燥后，每孔加0.4。/。的SRB100pL(1%色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20min，棄去各孔內(nèi)液體后用1%乙酸洗滌5遍，去除未結(jié)合的染料，空氣中干燥后用lOmmoI/LTrisl50ioL/孔溶解，振蕩5min，使用酶標(biāo)儀(ELx800)測(cè)定，所用波長(zhǎng)為490nm。抑制率的計(jì)算抑制率按如下公式計(jì)算抑制率(％)=藥物歸-空白歸xl00%陰性對(duì)照組^值一空白組j值藥效結(jié)果見(jiàn)表l。根據(jù)HL60腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果，刺五加有效組分對(duì)抑制HL60腫瘤細(xì)胞增殖有非常顯著效果。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2.2藥理模型K562腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與種板細(xì)胞培養(yǎng)使用RPMI1640(Gibco)[添加2g/L碳酸氫鈉]90%，小牛血清(賽樂(lè))10%，非必需氨基酸(Gibco)1。/?；旌吓囵B(yǎng)K562細(xì)胞。計(jì)算需要細(xì)胞總量NT-pcdl'mL"xVT(p-8x103個(gè)/mL)，其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中。取10|iL，加10pL胎盤(pán)藍(lán)稀釋?zhuān)?jì)算計(jì)數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個(gè)，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液V1mL，吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2=NT/NxVl。在細(xì)胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100pL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，剩余孔加入100pLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案刺五加有效組分加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心?？蓛?chǔ)存-20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150pL。在新的96孔板中加入220piL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88pL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入50pL，此時(shí)藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pg/mL。孵育48h。每個(gè)濃度設(shè)4(2)個(gè)平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對(duì)照組(細(xì)胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200ML的培養(yǎng)液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，陽(yáng)性對(duì)照組(阿霉素終濃度4pg/mL)。SRB染色細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，每孔加入40%(質(zhì)量/體積)的三氯乙酸(TCA)70pL固定細(xì)胞，4。C冰箱中放置1h。培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中干燥后，每孔加0.4%的SRB100pL(1%色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20min，棄去各孔內(nèi)液體后用1%乙酸洗滌5遍，去除未結(jié)合的染料，空氣中干燥后用10mmol/LTrisl50piL/孔溶解，振蕩5min，使用酶標(biāo)儀(ELx800)測(cè)定，所用波長(zhǎng)為490nm。抑制率的計(jì)算抑制率按如下公式計(jì)算抑制率(％)=藥畫(huà)-空白歸xl00%陰性對(duì)照^值一空白組^值藥效結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)K562腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果，刺五加有效組分對(duì)抑制K562腫瘤細(xì)胞增殖有非常顯著效果。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.3藥理模型MCF-7腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與種板細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，小牛血清(賽樂(lè))10%，非必需氨基酸(Gibco)P/。混合培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞。計(jì)算需要細(xì)胞總量NT-pcell'mL"xVT(p-2x103個(gè)/mL)，其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中。取10^iL，加l(HiL胎盤(pán)藍(lán)稀釋?zhuān)?jì)算計(jì)數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個(gè)，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min,10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液V1mL,吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2-NT/NxVl。在細(xì)胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100pL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，剩余孔加入100mLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案刺五加有效組分根據(jù)所稱(chēng)量的藥品的重量，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心?？蓛?chǔ)存-20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150^iL。在新的96孔板中加入220pL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88^L藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入50ML，此時(shí)藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pg/mL。孵育48h。每個(gè)濃度設(shè)4(2)個(gè)平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對(duì)照組(細(xì)胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200|iL的培養(yǎng)液，將吸取0.88mLDMSO加入混勻)，陽(yáng)性對(duì)照組(阿霉素終濃度4pg/mL)。MTT比色法測(cè)定取出培養(yǎng)板，去除每孔上清，加入培養(yǎng)液一MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液=10:1)lOO[iL，孵育4h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150^L的DMSO，振蕩10min，550nm酶標(biāo)儀(Elx800)測(cè)定。抑制率的計(jì)算抑制率按如下公式計(jì)算抑制率(％)=藥物^值—空白腺值xl00%陰性對(duì)照組^值一空白組^值藥效結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)MCF-7腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果，刺五加有效組分對(duì)抑制MCF-7腫瘤細(xì)胞增殖有非常顯著效果。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.4藥理模型KB腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與種板細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，小牛血清(賽樂(lè))10%，非必需氨基酸(Gibco)1%混合培養(yǎng)KB細(xì)胞。計(jì)算需要細(xì)胞總量NT-pcellTnL"xVT(p-2xl03個(gè)/mL)，其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中。取10^iL，加l(HiL胎盤(pán)藍(lán)稀釋?zhuān)?jì)算計(jì)數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為NL/4x104x2xV個(gè)，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液V1mL，吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2=NT/NxVl。在細(xì)胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100^iL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，剩余孔加入100^PBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案刺五加有效組分根據(jù)所稱(chēng)量的藥品的重量，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心?？蓛?chǔ)存-20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150pL。在新的96孔板中加入220pL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88(xL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入50^iL，此時(shí)藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pg/mL。孵育48h。每個(gè)濃度設(shè)4(2)個(gè)平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對(duì)照組(細(xì)胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200^iL的培養(yǎng)液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，陽(yáng)性對(duì)照組(阿霉素終濃度4pg/mL)。MTT比色法測(cè)定取出培養(yǎng)板，去除每孔上清，加入培養(yǎng)液一MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液-10:1)100^L，孵育4h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150pL的DMSO，振蕩10min，550nm酶標(biāo)儀(Elx800)測(cè)定。抑制率的計(jì)算抑制率按如下公式計(jì)算抑制率(％)=藥物m^值-空自纟Mtxl00%陰性對(duì)照鄉(xiāng)I^值一空白組^值藥效結(jié)果見(jiàn)表4。根據(jù)KB腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果，刺五加有效組分對(duì)抑制KB腫瘤細(xì)胞增殖有非常顯著效果。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2.5藥理模型HepG2腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與種板細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，胎牛血清(四季青)10%，非必需氨基酸(Gibco)1%混合培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。計(jì)算需要細(xì)胞總量NT-pcell，mL"xVT(p-2x103個(gè)/mL)，其中VT-0.1mLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中。取10jxL，加10^iL胎盤(pán)藍(lán)稀釋?zhuān)?jì)算計(jì)數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個(gè)，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液VlmL，吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2-NT/NxVl。在細(xì)胞槽中再加入VT—V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100pL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，剩余孔加入100pLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案刺五加有效組分根據(jù)所稱(chēng)量的藥品的重量，根據(jù)所稱(chēng)量的藥品的重量，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心。可儲(chǔ)存-20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150mL。在新的96孔板中加入220ioL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88|oL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入50^iL，此時(shí)藥物稀釋1000倍，即終濃度為50jig/mL。孵育48h。每個(gè)濃度設(shè)4(2)個(gè)平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對(duì)照組(細(xì)胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200pL的培養(yǎng)液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，陽(yáng)性對(duì)照組(阿霉素終濃度4!ag/mL)。MTT比色法測(cè)定取出培養(yǎng)板，去除每孔上清，加入培養(yǎng)液一MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液-10:1)100pL，孵育4h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150^iL的DMSO,振蕩10min，550nrn酶標(biāo)儀(Elx800)測(cè)定。抑制率的計(jì)算抑制率按如下公式計(jì)算抑制率(％)=藥物謹(jǐn)-空白歸xl00%陰性對(duì)照組^值一空白組^值藥效結(jié)果見(jiàn)表5。根據(jù)H印G2腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果，刺五加有效組分對(duì)抑制H印G2腫瘤細(xì)胞增殖有非常顯著效果。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>權(quán)利要求1.一種刺五加有效組分，其特征是該有效組分主要含有化合物AAnhydrochiisanogenoicacid，化合物BOplopanaxogeninA，其中化合物A的含量為50～70％，化合物B的含量為20～40％?；衔顰的結(jié)構(gòu)式為id="icf0001"file="S2008100613908C00011.gif"wi="65"he="66"top="88"left="78"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>化合物B的結(jié)構(gòu)式為id="icf0002"file="S2008100613908C00012.gif"wi="75"he="69"top="175"left="72"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種刺五加有效組分的制備方法，其特征是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)將刺五加藥材粉碎后加入1:0.8L2的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流0.8-1.2小時(shí)，提取13次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進(jìn)行拌樣，用正相硅膠柱對(duì)其進(jìn)行分離，首先用4753:1的石油醚和乙酸乙酯作為流動(dòng)相，得洗脫液I，棄之，再用813:1的氯仿和甲醇作為流動(dòng)相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的目的物；制備色譜的分離條件為色譜柱為制備柱，流動(dòng)相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為911ml/min，柱溫為室溫，收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種刺五加有效組分的制備方法，其特征是所述梯度洗脫程序?yàn)?分鐘時(shí)，流動(dòng)相為80%的水溶液和20%的乙腈溶液；5分鐘時(shí)，流動(dòng)相為80%的水溶液和20%的乙腈溶液；19分鐘時(shí)，流動(dòng)相為50%的水溶液和50%的乙腈溶液；60分鐘時(shí)，流動(dòng)相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液；64分鐘時(shí)，流動(dòng)相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種刺五加有效組分的制備方法，其特征是色譜分離后，在32.036.0min時(shí)間段收集溶液。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種刺五加有效組分在制備治療、預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種刺五加有效組分的應(yīng)用，其特征是所制備的藥物還含有制劑允許的藥物賦形劑或載體。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種刺五加有效組分的應(yīng)用，其特征是所制備的藥物還含有其他抗腫瘤藥物。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種刺五加有效組分的應(yīng)用，其特征是所述藥物的制劑形式為液體制劑、固體制劑、膠囊劑或膠丸劑。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種剌五加有效組分的應(yīng)用，其特征是所述藥物的給藥方式為口服給藥或注射給藥。全文摘要本發(fā)明提供一種刺五加有效組分，主要含有化合物AAnhydrochiisanogenoicacid和化合物BOplopanaxogeninA，其中A的含量為50～70％，B的含量為20～40％。藥材通過(guò)加熱提取，濃縮，硅膠柱分離，洗脫，洗脫液濃縮干燥，再用液相色譜繼續(xù)分離，收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。本發(fā)明提供的刺五加有效組分可在制備治療、預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明方法設(shè)計(jì)合理，能快速準(zhǔn)確的得到有效成分，在生產(chǎn)中更易于藥物的質(zhì)量控制。文檔編號(hào)C07J63/00GK101264113SQ200810061390公開(kāi)日2008年9月17日申請(qǐng)日期2008年4月25日優(yōu)先權(quán)日2008年4月25日發(fā)明者靂劉,水文波,程翼宇,葛志偉申請(qǐng)人:浙江大學(xué)