專(zhuān)利名稱(chēng)：：刺五加有效組分及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種治療腫瘤疾病的中藥提取物,具體地說(shuō)涉及從刺五加中提取的有效組分，制劑及其制備方法與用途。繁紋不腫瘤是一種常見(jiàn)病、多發(fā)病，其中惡性腫瘤是目前危害人類(lèi)健康最嚴(yán)重的一類(lèi)疾病。目前業(yè)內(nèi)對(duì)惡性腫瘤的治療主要還是以手術(shù)、放療、化療為主，但許多化學(xué)抗癌藥物在作用于耙細(xì)胞時(shí)往往累及正常細(xì)胞，造成嚴(yán)重的副反應(yīng)，植物藥的遺傳毒性不明顯，中草藥在抗癌抗突變方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景，而且中藥在對(duì)腫癯的輔助治療中也起到不容忽視的作用。紫杉醇即是典型的從植物中獲得的具有良好抗痛活性的天然化合物，現(xiàn)己開(kāi)發(fā)為抗腫瘤藥物。目前我國(guó)危害性最為嚴(yán)重的腫癯為肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、白血病及淋巴瘤等。特別是肝癌的發(fā)生率近年來(lái)有所增加。值得重視，這些腫瘤的病因?qū)W、發(fā)病學(xué)及其防治，均為我國(guó)腫瘤研究的重點(diǎn)。尋找高效低毒的抗癌藥物以及抗癌輔助藥物是當(dāng)前腫癯研究的重要內(nèi)容。我國(guó)藥用生物資源十分豐富，其生理活性物質(zhì)是研究和發(fā)現(xiàn)新藥先導(dǎo)化學(xué)物，開(kāi)發(fā)新藥的天然寶庫(kù)。目前，我國(guó)從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)，用于開(kāi)發(fā)成治療腫瘤疾病、安全性好、毒性低的新藥還很少，從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)，開(kāi)發(fā)成具有抗腫瘤療效的新藥，具有重要應(yīng)用價(jià)值和廣闊發(fā)展前景。刺五加,別名五加皮、刺拐棒。其化學(xué)成分為含刺五加甙(eleuth國(guó)油A，B,c,D,E,F,G)和多糖等。其性味性溫，味辛、微苦。其功能主治為益氣健脾，補(bǔ)腎安神。用于脾腎陽(yáng)虛、體虛乏力、食欲不振、腰膝酸痛、失眠多夢(mèng)。
發(fā)明內(nèi)容-本發(fā)明的目的在于提供一種刺五加的有效組分。本發(fā)明的另一目的在于提供上述刺五加有效組分的制備方法。本發(fā)明還提供含有上述刺五加有效組分的制劑及該組分的用途。本發(fā)明的刺五加有效組分，其制備過(guò)程包括以下步驟歩驟l:用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對(duì)刺五加進(jìn)行提取，歩驟2:提取液經(jīng)過(guò)色譜柱層析得洗脫液；歩驟3:用制備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動(dòng)相為水和乙腈，收集23.9-29.1或33,4-39.5分鐘洗脫液得到有效組分1(或稱(chēng)為C04),有效組分2(或稱(chēng)為C06)。其中歩驟1中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸&酯乙醇=1-5:1-5,優(yōu)選為乙酸ZJI-乙醇=1-2:1-2,最優(yōu)選為乙酸乙酯乙醇-l:l。所述步驟中，步驟l具體為取刺五加藥材，以乙酸乙酯:乙醇=1-5:卜5為溶劑，回流提取，將提取液與藥渣分離，分離后得到的提取液為提取物l,歩驟2具體為將提取物l過(guò)正相硅膠柱，先用石油醚乙酸乙酯=47-53:1作為流動(dòng)相洗脫，然后改換氯仿甲醇8-13:1作為流動(dòng)相，得洗脫液，步驟3具體為用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的洗脫液，流動(dòng)相為水-A和乙腈-B,進(jìn)行梯度洗脫，流速為9-llml/min,柱溫為室溫，收集23.9-29.1或33.4-39.5分鐘洗脫液得到有效組分，歩驟3中所述梯度洗脫程序如下表i洗脫梯度表Time(min)靖B(%)090103060405059555595流速為10ml/min,柱溫為室溫樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時(shí)間段23.9-29.1或33.4-39.5分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。本發(fā)明優(yōu)選的刺五加有效組分制備方法，包括下列步驟將刺五加藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1:0.8-1.2)，加熱回流0.8-1.2小時(shí)，提取1-3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸臠，并將其與桂膠進(jìn)行拌樣，用正相硅膠柱對(duì)其進(jìn)行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(47-53:l)作為流動(dòng)相，得洗脫液I,棄之，然后改換氯仿和甲醇(8-13:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液n,將洗脫液II濃縮干燥后得樣品用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動(dòng)相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為9-llml/min,柱溫為本發(fā)明最優(yōu)選的刺五加有效組分制備方法，包括下列歩驟將刺五加藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:l),加熱回流l小時(shí)，提取2次，合并濾液得提取液將提取液濃縮成浸裔，并將其與硅膠進(jìn)行拌樣，用正相硅膠柱對(duì)其進(jìn)行分離,首先用石油醚和乙酸乙酯(50:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液I,棄之，然后改換氯仿和甲醇(10:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品:制備色譜的分離條件:色譜柱為制備柱(ZorbaxSB-C18:21.2咖x250nra),流動(dòng)相為水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序如下Time(min)A(%)剛0卯1030405059555595流速為1(tel/min,柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時(shí)間段23.9-29.1或33.4-39.5分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。本發(fā)明23.9-29.1或33.4-39.5分鐘收集的有效組分成分如下表表2成分表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明還提供用本發(fā)明的中藥有效組分作為藥物活性成分制備成的藥物組合物，本發(fā)明的藥物組合物，包括有效組分，根據(jù)霈要該組合物還可以加入藥物可接受的載體。本發(fā)明的組合物，是單位劑量的藥物制劑形式，所述單位劑量形式是指制劑的單位，如片劑的每片，膠囊的每粒膠囊，口服液的每瓶，顆粒劑每袋等，本發(fā)明的組合物其中的有效組分，其在制劑中所占重量百分比可以是0.1-99.9%,其余為藥物可接受的載體。本發(fā)明的組合物，通過(guò)將上述有效組分和藥物可接受的載體混合制備得到。本發(fā)明的組合物,其藥物制劑形式可以是任何可藥用的劑型,這些劑型包括-片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜?jiǎng)婌F劑、滴劑、貼劑。本發(fā)明的制劑，雌的是口服劑型，如膠囊劑、片劑、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑、丹劑、膏劑等。本發(fā)明的組合物，其口服給藥的制劑可含有常用的賦形擁，諸如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑和濕潤(rùn)劑，必要時(shí)可對(duì)片劑進(jìn)行包衣。適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類(lèi)似的填充劑。適宜的崩解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉。適宜的潤(rùn)滑劑包括，例如硬脂酸鎂。適宜的藥物可接受的濕潤(rùn)劑包括十二烷基硫酸鈉?？赏ㄟ^(guò)混合，填充，壓片等常用的方法制備國(guó)體口服組合物。進(jìn)行反復(fù)棍合可使活性物質(zhì)分布在整個(gè)使用大量填充劑的那些組合物中?？诜后w制劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖槳?jiǎng)┗螋齽?，或者可以?-種在使用前可用水或其它適宜的載體復(fù)配的干燥產(chǎn)品。這種液體制劑可含有常規(guī)的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、輕乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇防腐劑，例如對(duì)羥基苯甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常規(guī)的香味劑或著色劑。對(duì)于注射劑，制備的液體單位劑型含有本發(fā)明的活性物質(zhì)和無(wú)菌載體。根據(jù)載體和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的制備通常是通過(guò)將活性物質(zhì)溶解在一種載體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過(guò)濾消毒，然后密封。輔料例如一種局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑也可以溶解在這種載體中。為了提高其穩(wěn)定性，可在裝入小瓶以后將這種組合物冰凍，并在真空下將水除去，本發(fā)明的組合物，在制備成藥劑時(shí)可選擇性的加入適合的藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氮酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、EDTA二鈉、E13TA藥鈉，一價(jià)堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷鵬、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸銬、碳酸氧鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、e—環(huán)糊精、磷脂類(lèi)材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸轉(zhuǎn)、硬脂酸鎂等。本發(fā)明的組合物在使用時(shí)根據(jù)病人的情況確定用法用量，可每日服三次，每次l-20劑，如l-20袋或粒或片。本發(fā)明還提供本發(fā)明的中藥有效組分和藥物組合物在抗腫瘤方面的應(yīng)用。以下為抗腫瘤藥理實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù).-對(duì)23.9-29.1或33.4-39.5分鐘段組分的活性蹄選，在細(xì)胞水平上檢測(cè)有效組分對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用?；钚院Y選藥理模娥HI^)腫癯細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與種板細(xì)胞培養(yǎng)使用RPM,1斜0(Gibco)添加2g/L碳離鈉pm,胎牛血清(四季靑)1(m混合培養(yǎng)HL60細(xì)胞，密度霱低于106個(gè)/mL。計(jì)算霜要細(xì)胞總暈NT-pcelNiC-1xVT(^2M04個(gè)/mL》，其中VT0.1mLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量，吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中，取1(^iL,加胎盤(pán)藍(lán)稀釋?zhuān)?jì)算計(jì)數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL,則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為NU4"04x2xV個(gè)，其中V為離心前離心管中的溶液體積，離心(恥Orad/mln,10min),吸去上清液，加入培養(yǎng)液V1mL,吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2-NT/NxV1,在細(xì)胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍歡打、混勻，取該液，每孔加入150珠，種板后選取4孔加入200/iL培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，剩余孔加入200/iLPBS,以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案刺五加C04有效組分加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。簾蕩溶解,若有大量液滴粘壁,可適當(dāng)離心,可儲(chǔ)存^2CFC,在新的96孔板中加入220//L/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.卿1_藥*入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入50/iL,此時(shí)藥物,1000倍，即終濃度為50ng/nC,孵育4助，每個(gè)濃度設(shè)4M行復(fù)孔，每板設(shè)明性對(duì)照組(細(xì)胞中加入空白洛液，空白溶液配法—加入20(V/L的培養(yǎng)液，將吸取0.80^0!/130加入混勻)，及陽(yáng)性對(duì)照組(順鉬終濃度知g/mL)。SRB染色細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，每孔加入40%(質(zhì)紫/體積)的三氯乙酸(TCA)IOOia闔定細(xì)胞，室溫放置5mln,41C冰箱中放置1h。培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA,在空氣中干燥后，每孔加0.4%的SRB100w1_(1%色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20min,棄去各孔內(nèi)液體后用1%乙酸洗滌5遍，去除未結(jié)合的染料，空氣中干燥后用1Ommol/LTris150wL/孔溶解，振蕩5min,使用酶標(biāo)儀(ELx800)測(cè)定，所用波長(zhǎng)為4恥師，抑制率的計(jì)算抑制率按如下公式計(jì)算抑制率(％)s藥物,一空白ffl^值x1(Mj%陰性對(duì)照^值一空白組4值藥效結(jié)果見(jiàn)表3。表3,HL^60腫癯細(xì)胞抑制率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>藥理模荊K562腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)勾種板細(xì)胞培養(yǎng)使用RPMI1640(Gibco)添加2g/L碳酸氫鈉]卯y。，小牛血清(賽樂(lè))10%,非必霜氨基酸(Qibco)i^泡合培養(yǎng)K562細(xì)胞，計(jì)箅霈要細(xì)胞總量NT-peel!nnL-lxVT(^8xl03個(gè)/mL),其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量，吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中，取10jiiL,加10-胎盤(pán)藍(lán)稀釋?zhuān)?jì)算計(jì)數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL,則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個(gè)，其中V為離心前離心管中的溶液體積，離心(卯0rad/fflto,ltoin)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液VlmL,吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2-NT/NxV1,在細(xì)胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100疼，孵育24h,種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空A對(duì)照，剩余孔加入100jtLPBS,以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案刺五加C04有效組分加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL,震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心，可儲(chǔ)存-20-C,鄰孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150/iL。在新的鄰孔板中加入220/dV孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88mL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入50^L,此時(shí)藥物稀釋l卿倍，即終濃度為50ftgWL,孵育48h,每個(gè)濃度設(shè)4(2)個(gè)平行復(fù)孔，每板設(shè)明性對(duì)照組(細(xì)胞中加入空白溶液，空白溶液配法一加入的培養(yǎng)液，將吸取0.88/tLDMSO加入混勻)，陽(yáng)性對(duì)照組(阿霉素終濃度4;tgAnL)。SRB染色細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)來(lái)后，取出培養(yǎng)板，每孔加入40%(質(zhì)影體積)的三氯乙酸(TCA)70WL尚定細(xì)胞，4X:冰箱中放置lh。培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中干燥后，每L加0.4M的SRm00wL(1%色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20mta，棄去各孔內(nèi)液體后用淺乙酸洗滌5遍,去除未結(jié)合的染料,空氣中干燥后用lOmmol/LTrisl5(JwU孔溶解，振蕩5min，使用酶標(biāo)儀(EIjc800)測(cè)定，所用波長(zhǎng)為490nm,抑制率的計(jì)算抑制率按如下公式計(jì)算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>藥效結(jié)果見(jiàn)表4。表4,K562腫癯細(xì)胞抑制率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>藥理模型MCF-7腫癯細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)ij種板細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM髙糖型(CMbco)〖添加3.7g^碳酸貧鈉〗90%,小牛血清(賽樂(lè))10%,非必霈氨基酸(Gibco)la/?；旌吓囵B(yǎng)MCF-7細(xì)胞。計(jì)算需要細(xì)胞總^NTspcellnnL4xVT(p-2xl03個(gè)/mL),其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量，吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中，取10^L,加10itL胎盤(pán)藍(lán)稀釋?zhuān)?jì)算計(jì)數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL,則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個(gè)，其中V為離心前離心管中的溶液體積，離心(900radtoin,吸去上清液，加入培養(yǎng)液VlmL,吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2-NT/NxVl。在細(xì)胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、泡勻，取該液，每孔加入100pL,孵育24h,種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，剩余孔加入lQ0;tLPBS,以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案刺五加C04有效組分根據(jù)所稱(chēng)量的藥品的重紫，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL,簾蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心?？蓛?chǔ)存-2(fC,96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150mL。在新的96孔板中加入220^孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88/iL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入50&,此時(shí)藥物稀釋1000倍，即終濃度為S0pgfaL,孵育48h,每個(gè)濃度設(shè)4(2)個(gè)平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對(duì)照組(細(xì)胞中加入空內(nèi)溶液，空A溶液配法一加入2QOpL的培養(yǎng)液，將吸取0.88^LDMSO加入泡勻)，陽(yáng)性對(duì)照組(阿霉素終濃度4^g/mL)。MTT比色法測(cè)定取出培養(yǎng)板，去處每孔上清，加入培養(yǎng)液一MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液-10:1)1加mL,孵育4h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150-的DMSO,振蕩lOmk,550nm酶標(biāo)儀(Kx8加)測(cè)定，抑制率的計(jì)g抑制率按如下公式計(jì)算藥物腺值一空AMt抑制率(％)明性對(duì)照組4值一空f(shuō)t^值藥效結(jié)果見(jiàn)表5，表5,MCF-7腫癯細(xì)胞抑制率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>藥理模型KB腫癯細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與種板細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM高糖型(Gibco)揮加3.7g/L碳酸氫鈉〗90%,小牛血清(賽樂(lè))10%,非必需氣基酸(Gibeo)m混合培養(yǎng)KB細(xì)胞，計(jì)算霜要細(xì)胞總量NT-pcellitiL4xVT0^x103個(gè)AniL),其中VTMUmLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量，吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中，取10pL,加10fiL胎盤(pán)藍(lán)稀釋?zhuān)?jì)算計(jì)數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL,則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為NU4xl04x2xV個(gè)，其中V為離心前離心管中的溶液體積.離心(900rad/Wn，l(taia),吸去上淸液，加入培養(yǎng)液VlmL,歡打，使細(xì)胞泡勻，吸取V2niL加入到細(xì)胞檑中，使V2-NTVNxVl，在細(xì)胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、泡勻，取該液，每孔加入l(XViL,孵育24h,種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空A對(duì)照，剰余孔加入100/tLPBS,以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)，給藥方案刺五加C04有效組分根據(jù)所稱(chēng)量的藥品的重量，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mgfeiL,展蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心，可儲(chǔ)存-2(^C,96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150ML,在新的96孔板中加入220^孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88^藥液加入泡勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入50^L,此時(shí)藥物稀釋1000倍，即終濃度為50抖gtoL,孵育48h,每個(gè)濃度設(shè)4(2)個(gè)平行復(fù)孔，每板設(shè)陰艦躐組(細(xì)胞中加入空白瘠液，空白溶液配^~ftj入200處的培養(yǎng)液，將吸取0.88nLDMSO加入泡勻)，陽(yáng)艦照組(阿每素終濃度4pg/mL)。MTT比色法測(cè)定取山培養(yǎng)板，去處每孔上淸，加入培養(yǎng)液一MTT混合溶液(培養(yǎng)液:MTT溶液-10:1)lOO/iL,醉育4h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150/iL的DMSO,振蕩ltoin,550ran酶標(biāo)儀(Mx800)測(cè)定，抑制率的計(jì)貧抑制率按如下公式計(jì)算抑制率(％):藥物&^值—^白^^值x10Q%膽杜甜廂拍J抬一存向鉑^推藥效結(jié)果見(jiàn)表6a表6,KB腫癯細(xì)胞抑制率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>藥理模型H印G2腫癯細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與種板細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸教鈉9TO,胎牛血淸(四季靑)10%,非必霈氮基酸(Gibco)1餳混合培養(yǎng)H呼G2細(xì)胞，計(jì)算霈要細(xì)胞總量,pcellnnL-lxVTOB-2xl03個(gè)/mL),其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余紫，吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中，取10-L,加10ML胎盤(pán)藍(lán)稀釋?zhuān)?jì)算計(jì)數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL,則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個(gè)，其中V為離心前離心管中的溶液體積，離心(900radtain,10min),吸去上清液，加入培養(yǎng)液VlmL,吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞瞎中，使V2-NT/NxV1,在細(xì)胞瞎中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100pL,孵育24h,種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，剩余孔加入咖/JLPBS,以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)，給藥方案刺五加C04有效組分根據(jù)所稱(chēng)量的藥品的重量,根據(jù)所稱(chēng)量的藥品的重量，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mgteL,簾蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心,可儲(chǔ)存-20°0,96孔板換液,每孔加入新鮮培養(yǎng)液150pL。在新的鄰？L板中加入220mL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88疼藥液加入泡勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入50itL,此時(shí)藥物稀釋1000倍，即終濃度為50/tgfaL,孵育48h,每個(gè)濃度設(shè)4(2)個(gè)平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對(duì)照組(細(xì)胞中加入空白自，空白溶液配法~~加入200pL的培養(yǎng)液，將吸取0.88^LDMSO加入混勻)，陽(yáng)艦照組(阿霧素終濃度4pg/taL),MTT比色法測(cè)定取出培養(yǎng)板，去處每孔上清，加入培養(yǎng)液-MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液=10:1)100pL,孵育他，吸棄培#,毎孔加入150mL的DMSO，振蕩550nm酶標(biāo)儀(Ek800)測(cè)定，抑制率的計(jì)貧抑制率按如下公式計(jì)算抑制率(％)=藥物tu值一空ntu值陰性對(duì)瓶ffl^值一空rttw值藥效結(jié)果見(jiàn)表7。表7，H印G2腫癯細(xì)胞抑制率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>本發(fā)明的有益效果為1.本發(fā)明的提取分離工藝中使用了正相硅膠柱，能有效地除去糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等雜質(zhì)，提高有效成分的含量，同時(shí)采用了制備色譜，能快速準(zhǔn)確的得到有效成分。2.本發(fā)明提供的刺五加有效組分化學(xué)成分簡(jiǎn)單明確，在藥31研究上更易于闡明其作用機(jī)制，在生產(chǎn)中更易于藥物的質(zhì)量控制。本發(fā)明提供的方法首次從刺五加藥材中得到含有C05有效組分,并首次將其在多種腫瘤細(xì)胞株上進(jìn)行藥效篩選，由于成分確切，含量明確，制備工藝便捷，活性好，適宜開(kāi)發(fā)成抗腫瘤中藥新藥。圖1為本發(fā)明刺五加有效組分1的HPLC分析圖。圖2為本發(fā)明刺五加有效組分2的HPLC分析圖。具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容，該實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而對(duì)本發(fā)明并沒(méi)有限制。實(shí)施例1刺五加有效組分的制備取刺五加藥材250g,將其粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:l),加熱回流l小時(shí)，提取2次，濾液合并得提取液。將提取液濃縮成浸裔得26.7g,將浸裔和硅膠拌樣，用正相硅膠柱進(jìn)行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(50:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液I,然后改換氯仿和甲醇(10:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液II，濃縮干燥后得4，0g樣品。用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品。制備色譜的分離條件色譜柱為Agient制備柱(ZorbaxSB-CW:21.2mmx250咖)，流動(dòng)相為水(A)和乙腈(B),梯度洗脫程序如下-<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>流速為lCM/min,柱溫為室溫，樣品用IO纖乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時(shí)間段23.9-29.1或33.4-39.5分鐘收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分組分1(0.llg)和2(0.18g)。實(shí)施例2刺五加有效組分的分析對(duì)實(shí)施例1的刺五加有效組分的HPLC-ELSD聯(lián)用分析色譜條件色譜柱AgilentZorbaxSB-C18柱(4.6,X150mm,5Pm):采用梯度洗脫，流動(dòng)相A相為0.2%冰醋酸水溶液，流動(dòng)相B相為含0.2%冰醋酸的乙腈溶液梯度洗脫程序如下O分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為90%的0.2i冰醋酸水溶液、流動(dòng)相B為10%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液10分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為50%的0.2%冰醋酸水溶液、流動(dòng)相B為50%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液30分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為5%的0.2%冰醋酸水溶液、流動(dòng)相B為95%的0.2%*醋酸的乙腈溶液35分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為5*的0.2%冰醋酸水溶液、流動(dòng)相B為959fe的0.2i冰醋酸的乙腈。溶液流速0.5raL，irf';檢測(cè)波長(zhǎng)全波長(zhǎng)；柱溫30";ELSD漂移管溫度105氮?dú)饬魉?.0L/min供試品溶液的制備稱(chēng)取本發(fā)明有效組分，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。測(cè)定方法精密吸取供試品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定。實(shí)施例3刺五加有效組分制劑取實(shí)施例1的剌五加有效組分1或2,0.5g與10.5g聚乙二醇-柳OO混合均勻，加熱熔融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至6-81C液體石蠟中，除油，制得滴丸400粒。實(shí)施例4刺五加有效組分制劑取實(shí)施例1的刺五加有效組分1或2,0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸鈉0.9g和蒸餾水lml,上述組分混合均勻后，冷凍千燥，分裝500支，即得，實(shí)施例5刺五加有效組分制劑取降香油1.5g,加入到13邁l飽和的羥丙基e-環(huán)糊精中，攪拌溶解，濾過(guò)，濾葉低溫干燥，的降香油和羥丙基e-環(huán)糊精的包合物粉末。除上述降香油合羥丙基e-環(huán)糊精的包合物粉末外，再取實(shí)施例1的刺五加有效組分1或2,0.5g、甘露醇5.5g、依地酸鈣鈉0.9g和蒸餾水2in1,上述組分混勻后，冷凍干燥，分裝300支，即得。實(shí)施例6刺五加有效組分的制備操作歩驟同實(shí)施例l,條件改為乙酸乙酯和乙酵(1:5)，正相硅膠柱分離，首先用石油醚和乙酸乙酯47:l作為流動(dòng)相，得洗脫液I,然后改換氯仿和甲醇(8:1)作為流動(dòng)相。實(shí)施例7刺五加有效組分的制備操作步驟同實(shí)施例l,條件改為乙酸乙酯和乙醇(5:1),正相桂膠柱分離，首先用石油醚和乙酸乙酯53:l作為流動(dòng)相，得洗脫液I,然后改換氯仿和甲醇(13:1)作為流動(dòng)相。實(shí)施例8刺五加有效組分的制備操作步驟同實(shí)施例l,條件改為乙酸乙酯和乙醇(1:2),正相硅膠柱分離，首先用石油醚和乙酸乙酯47:l作為流動(dòng)相，得洗脫液I,然后改換氯仿和甲醇(8:1)作為流動(dòng)相。實(shí)施例9剌五加有效組分的制備操作步驟同實(shí)施例l,條件改為乙酸乙酯和乙醇(2:1)，正相硅膠柱分離，首先用石油醚和乙酸乙酯53:l作為流動(dòng)相，得洗脫液I,然后改換氯仿和甲醇(13:1)作為流動(dòng)相。權(quán)利要求1、一種刺五加有效組分，其特征在于，其制備過(guò)程包括以下步驟步驟1用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對(duì)刺五加進(jìn)行提取，步驟2提取液經(jīng)過(guò)色譜柱層析得洗脫液；步驟3用制備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動(dòng)相為水和乙腈，收集23.9-29.1或33.4-39.5分鐘洗脫液得到有效組分。2、權(quán)利要求1的有效組分，其特征在于，步驟1中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇-l-5:l-5。3、權(quán)利要求1的有效組分，其特征在于，步驟l中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯-乙醇=1-2:1-2。4、權(quán)利要求1的有效組分，其特征在于，步驟1中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸S酯乙醇=1:1。5、權(quán)利要求l的有效組分，其特征在于，所述步驟中，步驟l為取刺五加藥材，以乙酸乙酯:乙醇-l-5:l-5為溶劑，回流提取，將提取液與藥渣分離，分離后得到的提取液為提取物l,步驟2為將提取物l過(guò)正相硅膠柱，先用石油醚乙酸乙酯=47~53:1作為流動(dòng)相洗脫，然后改換氯仿甲醇8~13:1作為流動(dòng)相，得洗脫液，步驟3為用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的洗脫液，流動(dòng)相為水-A和乙腈-B，進(jìn)行梯度洗脫，6、權(quán)利要求5的有效組分，其特征在于，所述梯度洗脫程序如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>流速為lQml/inin,柱溫為室溫樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時(shí)間段23.9-29.1或33.4>39.5分鐘收集溶液,溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分，7、含有權(quán)利要求14任何一項(xiàng)有效組分的藥物組合物。8、權(quán)利要求1的有效組分的制備方法，其特征在于，其制備過(guò)程包括以下步驟:歩驟l:用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對(duì)刺五加進(jìn)行提取，步驟2:提取液經(jīng)過(guò)色譜柱層析得洗脫液步驟3:用制備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動(dòng)相為水和乙腈，收集23.9-29.1或33.4^39.5分鐘洗脫液得到有效組分。9、權(quán)利要求8的有效組分的制備方法，其特征在于，所述步驟中，步驟l為取刺五加藥材，以乙酸乙酯:乙醇-l-5:l-5為溶劑，回流提取，將提取液與藥渣分離，分離后得到的提取液為提取物l,歩驟2為將提取物l過(guò)正相硅膠柱，先用石油醚乙酸乙酯47~53:1作為流動(dòng)相洗脫，然后改換氯仿甲醇8~13:1作為流動(dòng)相，得洗脫液，步驟3為用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的洗脫液，流動(dòng)相為水-A和乙腈-B，梯度洗脫程序如下Time(mi&)，B(%)0卯103060405059555595流速為10mlAnto，柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時(shí)間段23.9-29.1或33.冬39.5分鐘收集溶液,溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。10、權(quán)利要求9的有效組分的制備方法，其特征在于，步驟如下將刺五加藥材粉碎后加入乙酸乙酯乙醉一:l,加熱回流l小時(shí)，提取2次，合并濾液得提取液將提取液濃縮成浸裔，并將其與硅膠進(jìn)行拌樣，用正相娃膠柱對(duì)其進(jìn)行分離，首先用石油醚乙酸乙酯-50:l作為流動(dòng)相，得洗脫液I,棄之,然后改換氯仿甲醇《0:1作為流動(dòng)相，得洗脫液n,將洗脫液n濃縮干燥后得樣品用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱Z(油axSB-C:i8;21.:tenx25Qmm，流動(dòng)相為水A和乙腈B,梯度洗脫程序如下..畢)乖)0卯10306040505955559S流速為1(tol/fflk,柱溫為室溫樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時(shí)間段23.9-29.1或33.4~39.5分鐘收集溶液,溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。全文摘要本發(fā)明涉及刺五加有效組分及其制備方法與用途，本發(fā)明的刺五加有效組分，其制備過(guò)程包括以下步驟步驟1用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對(duì)刺五加進(jìn)行提取，步驟2提取液經(jīng)過(guò)色譜柱層析得洗脫液；步驟3用制備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動(dòng)相為水和乙腈，收集23.9-29.1或33.4-39.5分鐘洗脫液得到有效組分。文檔編號(hào)A61K125/00GK101347478SQ20071012327公開(kāi)日2009年1月21日申請(qǐng)日期2007年7月20日優(yōu)先權(quán)日2007年7月20日發(fā)明者靂劉,強(qiáng)史,水文波,程翼宇,靜竇,葛志偉,慶賀,陽(yáng)霍申請(qǐng)人:天津天士力制藥股份有限公司