專利名稱：核酸分子cxsi32及其在制備抗癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種核苷酸分子及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤疾病現(xiàn)已上升為世界第2號〃殺手〃，其死亡人數(shù)僅次于心血管病。幾年來， 國外醫(yī)學(xué)界對于腫瘤疾病的發(fā)病機理在細胞基礎(chǔ)上又有了新的認識。基于對腫瘤發(fā) 病機制的進一步理解，人們利用各種途徑來研制和開發(fā)能夠特異，有效地殺傷腫瘤細 胞而對正常細胞無毒性的藥物。目前，對于癌癥的治療仍以化療及放療為首選，兩 者雖對腫瘤的治療取得了相當(dāng)?shù)寞熜?，但由于缺乏對腫瘤細胞的特異性因而具有較大 的毒副作用以及某些腫瘤細胞對化療和放療處理的不敏感，因此在很大程度上限制了 它們在臨床中的應(yīng)用。近年來，為了開發(fā)出能特異性地殺傷癌細胞而對正常細胞無 毒負作用的藥物，人們對癌癥的發(fā)病機制從細胞，分子水平上的研究予以高度重視和 巨額投資。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于制備抗腫瘤藥物的核苷酸分子。 本發(fā)明的另一個目的是提供上述核苷酸分子的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種用于制備抗腫瘤藥物的核苷酸分子，它具有抑制腫瘤生長的 活性并且其序列包括5' -AACGAACCGGUAAAUCUGC-3'或者5' - AACGAACCGGTAAATCTGC -3，。在本發(fā)明中被稱為CXSI32。
其中，A、 T、 U、 G和C分別是腺嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、 鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸。在本發(fā)明中，術(shù)語"核苷酸分子CXSI32 "該術(shù)語還包括 5' -AACGAACCGGUAAAUCUGC-3，或者5， - AACGAACCGGTAAATCTGC _3，的核苷酸序列 變異形式。這些變異形式包括若干個(通常為1-15個，較佳地1-10個，更佳地l-5 個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數(shù)個(通常為IO個以 內(nèi)，較佳地為5個以內(nèi))核苷酸。例如，在5' -AACGAACCGGUAAAUCUGC-3'后(3 '端) 加入若干dT (脫氧胸苷)后形成的序列。
本發(fā)明中，CXSI32可以是具有抑制腫瘤生長的活性并且包括 5' -AACGAACCGGUAAAUCUGC-3， dTdT的序列。
本發(fā)明中，CXSI32可以是具有抑制腫瘤生長的活性并且是 5' -AACGAACCGGUAAAUCUGC-3' dTdT的序列。
本發(fā)明中，CXSI32可以是具有抑制腫瘤生長的活性并且是5'-AACGAACCGGTAAATCTGC -3， 的序列。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，與CXSI32連接成 為重組載體。例如，可以采用慢病毒、腺病毒或者森林腦炎病毒表達系統(tǒng)(Semliki Forest Virus)。慢病毒(Lentivirus)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒亞屬，以人類免疫缺陷病毒 (human immunod efficiency virus, HIV)為代表.慢病毒不僅具有感染分裂革巴 細胞并整合其基因組中，尤其是具有感染包括神經(jīng)元細胞、巨噬細胞、肝細胞、心肌 細胞和干細胞等在內(nèi)的多種非分裂細胞能力，因而，慢病毒載體已作為基因轉(zhuǎn)移的有 效工具，被廣泛應(yīng)用于基因功能尤其是基因治療的研究。
另一方面，本發(fā)明還提供了上述的核苷酸分子CXSI32的制備方法，即按CXSI32 的序列，將各核糖核酸分子依次脫水縮合。
本發(fā)明的核苷酸分子CXSI32可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。本發(fā)明的核苷 酸分子CXSI32序列通?？梢杂妹附夥ɑ蛉斯ず铣傻姆椒ǐ@得。
本發(fā)明還提供了上述的核苷酸分子CXSI32在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。 實驗表明，將本發(fā)明的CXSI32轉(zhuǎn)入H1299細胞，結(jié)果表明，H1299細胞呈現(xiàn)出 明顯的G1期阻滯。
4本發(fā)明的CXSI32還可抑制腫瘤細胞增殖。將CXSI32或者含有CXSI32的細胞施 用于裸鼠，與相同培養(yǎng)條件下未施用CXSI32的裸鼠相比，前者瘤體的增長明顯受到 抑制，而且這種現(xiàn)象隨著時間的推移日益明顯。
本發(fā)明的核苷酸分子CXSI32及其類似物，當(dāng)在治療上進行施用(給藥)時，可提 供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載 體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì) 的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給 藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
以本發(fā)明的核苷酸分子CXSI32為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián) 用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類 載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物
制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的核苷酸分子CXSI32可以被制成針劑形式，例如 用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠 囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和 膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千 克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的CXSI32還可與其他治療劑一起使用。 當(dāng)本發(fā)明的核苷酸分子CXSI32被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多肽施用 于哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況 下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約l毫克/千克體 重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技 能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明中，所述的抗腫瘤藥物是由含有效治療量的核苷酸分子CXSI32和藥學(xué)上 的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。所述藥物組合物可以是針劑或者片劑。其有效 治療量可以為每天1微克/千克至10毫克/千克體重。所述藥物可以是針劑、粉劑或 者片劑。
本發(fā)明的核苷酸分子CXSI32加入H1299，結(jié)果細胞呈現(xiàn)出明顯的Gl期阻滯； 施用于裸鼠時，與相同培養(yǎng)條件下的對照裸鼠相比，瘤體的增長明顯受到抑制，而且 這種現(xiàn)象隨著時間的推移日益明顯。本發(fā)明為腫瘤的治療和緩解提供了一種新的途徑
5和手段。
具體實施例方式
實施例一 CXSI32對細胞周期的影響
采用上海吉凱基因技術(shù)有限公司的GeneChem Easy-siRNA合成的CXSI32。 用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染siRNA的實驗操作步驟
(1) 細胞于轉(zhuǎn)染前一天接種于24孔板，所加培養(yǎng)基體積為500ul。轉(zhuǎn)染時細胞 融合率應(yīng)為40%-50%.
(2) 配制工作母液2. 5nmo1 (l.OOD)的雙鏈siRNA中加入125ul 1 XUniversal Buffer,得到濃度為20uM的siRNA母液。
(3) 以下稀釋步驟(4和5)中可以用不含血清的Opti-MEM(Invitrogen)，也可 以用其他不含血清的培養(yǎng)基。
(4) 對于24孔板的每個孔，用0.84ug siRNA雙鏈。把3ul20uM的siRNA雙鏈 與50ul0pti-MEM混合。
(5) 將Lip。fectamine 2000試劑盒輕柔搖勻，取lul Lipofectamine 2000試 劑在另一管中與50ul Opti-MEM混合，室溫下孵育5分鐘。
(6) 把稀釋后的siRNA與稀釋后的Lipofectamine 2000進行混合，輕輕混勻。 室溫下溫育20分鐘。
(7) 把siRNA與Lipofectamine 2000的混合液加入培養(yǎng)細胞，輕輕混勻然后將 細胞放入培養(yǎng)箱。
(8) 在檢測RNAi效果之前一般無需換液。但如果轉(zhuǎn)染試劑有明顯細胞毒性，可 在轉(zhuǎn)染滿3小時時換液。
結(jié)果，細胞呈現(xiàn)出明顯的G1期阻滯。
實施例二抑制裸鼠腫瘤生長
2.1裸鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司)成瘤大量培養(yǎng)檢測SK-H印1細胞， 胰酶消化，離心收獲所培養(yǎng)的細胞，用PBS洗滌后計數(shù)，重懸于PBS，并將細胞用一 次性注射器對裸鼠進行皮下注射，每組注射》5只，(雌性，30-40天)，每只裸鼠的 細胞注射量為200 W，細胞數(shù)約為106， 一周后腫瘤長出。2.2病毒注射當(dāng)腫瘤體積長至10-30 mm3體積時，將20 W含有3 X 107 TU 滴度病毒的PBS用注射器直接注射進入腫瘤內(nèi)。實驗組注射LV-CXSI32病毒，對照 組注射LV-non-silencing病毒。兩天后，再用同樣的方法和劑量注射一次病毒。
2.3腫瘤監(jiān)測和瘤塊切取每天檢測小鼠的狀態(tài)，每三天測量一次腫瘤的體積。 實驗組和對照組小鼠各五只進行測量，從感染第29天起，實驗組腫瘤和對照組腫瘤 體積出現(xiàn)顯著差異。32天后，處死小鼠，并從皮下取出瘤塊進行稱量。
結(jié)果顯示，與對照組相比，注射了含有CXSI32的裸鼠瘤體生長明顯減慢。這說 明，本發(fā)明的CXSI32可以明顯抑制腫瘤生長。
權(quán)利要求
1. 一種核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制腫瘤生長的活性并且其序列包括5’-AACGAACCGGUAAAUCUGC-3’或者5’-AACGAACCGGTAAATCTGC-3’。
2. 如權(quán)利要求l所述的一種核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制腫瘤生長 的活性并且其序列包括5， -AACGAACCGGUAAAUCUGC-3' dTdT。
3. 如權(quán)利要求l所述的一種核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制腫瘤生長 的活性并且其序列是5' -AACGAACCGGUAAAUCUGC-3' dTdT。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制腫瘤生長 的活性并且其序列是5' - AACGAACCGGTAAATCTGC -3'。
5. —種如權(quán)利要求l-4中任一種核苷酸分子的制備方法，其特征在于，按權(quán) 利要求1-4中任一種核苷酸分子的序列，將各核糖核酸基團或者脫氧核糖核酸基團 依次脫水縮合。
6. 如權(quán)利要求1-4中任一種核苷酸分子在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種核苷酸分子及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種用于制備抗腫瘤藥物的核苷酸分子，它具有抑制腫瘤生長的活性并且其序列包括5’-AACGAACCGGUAAAUCUGC-3’或者5’-AACGAACCGGTAAATCTGC-3’。在本發(fā)明中被稱為CXSI32。本發(fā)明的核苷酸分子CXSI32可以細胞停止于G1期；施用于裸鼠時，與相同培養(yǎng)條件下的對照裸鼠相比，瘤體的增長明顯受到抑制。
文檔編號C07H21/00GK101503449SQ200810033578
公開日2009年8月12日 申請日期2008年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月5日
發(fā)明者龍 余, 翔 王 申請人:復(fù)旦大學(xué)