專利名稱：核酸分子nrn1sr32及其在制備抗癌藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及一種核苷酸分子及其在制備抗腫瘤藥物中 的應用。
背景技術：
腫瘤疾病現(xiàn)已上升為世界第2號〃殺手〃，其死亡人數(shù)僅次于心血管病。幾 年來，國外醫(yī)學界對于腫瘤疾病的發(fā)病機理在細胞基礎上又有了新的認識?；?于對腫瘤發(fā)病機制的進一步理解，人們利用各種途徑來研制和開發(fā)能夠特異，有 效地殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無毒性的藥物。目前，對于癌癥的治療仍以化 療及放療為首選，兩者雖對腫瘤的治療取得了相當?shù)寞熜В捎谌狈δ[瘤細 胞的特異性因而具有較大的毒副作用以及某些腫瘤細胞對化療和放療處理的不 敏感，因此在很大程度上限制了它們在臨床中的應用。近年來，為了開發(fā)出能 特異性地殺傷癌細胞而對正常細胞無毒負作用的藥物，人們對癌癥的發(fā)病機制從 細胞,分子水平上的研究予以高度重視和巨額投資。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于制備抗腫瘤藥物的核苷酸分子。 本發(fā)明的另一個目的是提供上述核苷酸分子的應用。本發(fā)明提供了一種用于制備抗腫瘤藥物的核苷酸分子，它具有抑制腫瘤生 長的活性并且其序列包括5， -TCTCTTGAACCATTTGCGACCGCAGACCA-3，或者5，-UCUCUUGAACCAUUUGCGACCGCAGACCA -3，，在本發(fā)明中被稱為NRN1SR32。其中，A、 U、 G和C分別是腺嘌呤核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鳥嘌呤核苷酸和 胞嘧啶核苷酸。在本發(fā)明中，術語"核苷酸分子NRN1SR32"指具有抑制NRN1蛋白活性、并 且含有與5' -UCUCUUGAACCAUUUGCGACCGCAGACCA-3'序列高度同源的核酸序列。 該術語還包括與5' -UCUCUUGAACCAUUUGCGACCGCAGACCA -3'的同源性至少70%， 較佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷酸序列。
該術語還包括5， -UCUCUUGAACCAUUUGCGACCGCAGACCA -3'的核苷酸序列變 異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-15個，較佳地1-10 個，更佳地l-5個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加 數(shù)個(通常為10個以內(nèi)，較佳地為5個以內(nèi))核苷酸。例如，在 5， -UCUCUUGAACCAUUUGCGACCGCAGACCA-3'后(3 '端)加入若干dT (脫氧胸苷) 后形成的序列。
在本發(fā)明中的核苷酸分子，其序列可以包括5'-TCTCTTGAACCATTTGCGACCGCAGACCA-3' 或 者
5' -UCUCUUGAACCAUUUGCGACCGCAGACCAdTdT-3，。
本發(fā)明中的核苷酸分子，其序列可以包括 5' -UCUCUUGAACCAUUUGCGACCGCAGACCA-3'。
本發(fā)明中的核苷酸分子，其序列可以包括 5， -UCUCUUGAACCAUUUGCGACCGCAGACCAdTdT-3'。
本發(fā)明中的核苷酸分子，其序列可以包括5'-TCTCTTGAACCATTTGCGACCGCAGACCA-3' 或 者
5， -UCUCUUGAACCAUUUGCGACCGCAGACCAdTdT-3'。
本發(fā)明中的核苷酸分子，其序列可以是 5， -UCUCUUGAACCAUUUGCGACCGCAGACCAdTdT-3'。
本發(fā)明還提供了 一種載體，它含有序列包括5' -TCTCTTGAACCATTTGCGACCGCAGACCA-3， 或 者
5， -UCUCUUGAACCAUUUGCGACCGCAGACCAdTdT-3，的核苷酸分子。
本發(fā)明的上述載體，其序列中可以包括 5' -TCTCTTGAACCATTTGCGACCGCAGACCA-3' 或 者 5' -
UCUCUUGAACCAUUUGCGACCGCAGACCA -3'。在本發(fā)明中，可選用本領域己知的各種載體，如市售的載體。比如，選用 市售的載體，然后將含有本發(fā)明NRN1SR32核苷酸序列的 5' -UCUCUUGAACCAUUUGCGACCGCAGACCA-3，，可操作地連于表達調(diào)控序列，可以 形成重組載體。例如，可以采用慢病毒、腺病毒或者森林腦炎病毒表達系統(tǒng) (Semliki Forest Virus)。慢病毒(Lentivirus)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒亞屬，以人類 免疫缺陷病毒(human immunod efficiency virus' HIV)為代表.慢病毒不 僅具有感染分裂靶細胞并整合其基因組中，尤其是具有感染包括神經(jīng)元細胞、巨 噬細胞、肝細胞、心肌細胞和干細胞等在內(nèi)的多種非分裂細胞能力，因而，慢病 毒載體已作為基因轉(zhuǎn)移的有效工具，被廣泛應用于基因功能尤其是基因治療的研 究。如本文所用，"可操作地連于"指這樣一種情況，即線性RNA序列地某些部 分能夠影響同一線性RNA序列其他部分地活性，例如，如果信號肽RNA作為前體 表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)RNA就是可操作地連于多 肽RNA;如果啟動子控制序列地轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核 糖體結合位點被置于能使其翻譯地位置時，那么它是可操作連于編碼序列。 一般， "可操作連于"意味著相臨近，而對于本發(fā)明的核酸分子則意味著相鄰且不影響 功能。本發(fā)明中還提供了一種宿主細胞，它含有序列包括 5' -TCTCTTGAACCATTTGCGACCGCAGACCA-3， 或 者 5，-UCUCUUGAACCAUUUGCGACCGCAGACCA -3，的核苷酸分子。在本發(fā)明中，術語"宿主細胞"主要是真核細胞。常用的有CHO細胞、COS-7、 2'§3細胞，等等。另一方面，本發(fā)明還提供了上述的核苷酸分子NRN1SR32的制備方法，即按 NRN1SR32的序列，將各核糖核酸分子依次脫水縮合。本發(fā)明的核苷酸分子NRN1SR32可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。本發(fā)明 的核苷酸分子NRN1SR32序列通常可以用酶解法或人工合成的方法獲得。本發(fā)明還提供了上述的核苷酸分子NRN1SR32在制備抗腫瘤藥物中的應用。將含有NRN1SR32的細胞注射裸鼠的腫瘤中，與相同培養(yǎng)條件下不注射 NRN1SR32的裸鼠相比，瘤體的增長明顯受到抑制，而且這種現(xiàn)象隨著時間的推 移日益明顯。
本發(fā)明的核苷酸分子NRN1SR32及其類似物，當在治療上進行施用(給藥)時， 可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受 的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8,較佳地pH約為6-8，盡管pH值可 隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通 過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或 局部給藥。
以本發(fā)明的核苷酸分子NRN1SR32為例，可以將其與合適的藥學上可接受的 載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學上可接受的載體或賦 形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、 及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的核苷酸分子NRN1SR32可以 被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方 法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥 物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是
治療有效量，例如每天約i微克/千克體重-約io毫克/千克體重。此外，本發(fā)明
的NRN1SR32還可與其他治療劑一起使用。
當本發(fā)明的核苷酸分子NRN1SR32被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多 肽施用于哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在 大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約l毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素， 這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明中，所述的抗腫瘤藥物是由含有效治療量的核苷酸分子NRN1SR32和 藥學上的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。所述藥物組合物可以是針劑或者片 劑。其有效治療量可以為每天1微克/千克至10毫克/千克體重。
本發(fā)明中，所述藥物可以是針劑、粉劑或者片劑。
本發(fā)明的核苷酸分子NRN1SR32注射入裸鼠的腫瘤中，與相同培養(yǎng)條件下不注射NRN1SR32的裸鼠相比，瘤體的增長明顯受到抑制，而且這種現(xiàn)象隨著時間的推移 曰益明顯。本發(fā)明為腫瘤的治療和纟激 提供了一種新的途徑和手段。
具體實施方式
實施例NRN1SR32抑制裸鼠腫瘤生長實驗一、 實驗材料
1. 裸鼠上海斯萊克實驗動物有限公司
2. Lentivirus vector (慢病毒載體)上海吉凱基因技術有限公司二、 實驗步驟
1. 將裸鼠放入SPF級動物房(無特定病原體級實驗動物房)，使其適應培養(yǎng)環(huán)境 約一個星期。
2. 用DMEM(Dulbecco， s Medified Eagle Medium, invitrogene公司，12800-82 ) + 10%FBS培養(yǎng)S麗C一7721細胞。
3. 將SMMC—7721細胞(購自中國科學院細胞庫)用胰酶消化后離心，去上清， 用無血清的DMEM重懸，然后去上清，加入適量PBS，制成每毫升約4X107個細胞的懸 液。
4. 向4-6周齡的裸鼠的腋下注射0. 2ml約含有8X 106個單位的細胞的PBS懸液。
5. 待瘤體直徑達到3-5mm(毫米)時，按瘤體積大小將相同的2只分別歸為實驗 組和對照組，并給這2組的每只小鼠都剪耳朵編號，記，時的每只小鼠瘤體的長徑 短徑和體重。
6. 向2組小鼠的瘤體內(nèi)分別直接注射0.1ml (毫升)的病毒和病毒空載體，以注 射病毒空載體為對照。每4天重復注射一次，共注射三次。
7. 從第一次注射病毒之日開始，每3天測量并記錄每只小鼠的瘤體的長徑短徑 和體重，瘤體的體積^a62/2 (a長徑長度，b短徑長度)。約4個星期后取瘤。結果顯示，與對照組相比，注射病毒(含有NRN1SR32)的裸鼠瘤體生長明顯減慢， 注射病毒20天后，NRN1SR32組瘤體體積僅為對照組瘤體體積的40W左右。這說明， 本發(fā)明的NRN1SR32可以明顯抑制腫瘤生長。序列表〈110〉復旦大學<120>核酸分子NRN1SR32及其在制備抗癌藥物中的應用 <130> 32<140> 200810040160.3 〈141〉 2008—07-03<160> 2<170〉 Patentln version 3.1<210> 1<211> 29<212〉 ■ <213>人工合成<400> 1tctcttgaac catttgcgac cgcagacca<210> 2<211> 29<212〉 RNA <213〉人工合成〈400> 2ucucuugaac cauuugcgac cgcagacca 29
權利要求
1.一種核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制腫瘤生長的活性并且其序列包括5’-TCTCTTGAACCATTTGCGACCGCAGACCA-3’或者5’-UCUCUUGAACCAUUUGCGACCGCAGACCA-3’。
2. —種如權利要求1所述的核苷酸分子，其特征在于，它的序列包括5'-UCUCUUGAACCAUUUGCGACCGCAGACCAdTdT _3，。
3. —種如權利要求1所述的核苷酸分子，其特征在于，它的序列包括5'-TCTCTTGAACCATTTGCGACCGCAGACCA -3' 或者5' - UCUCUUGAACCAUUUGCGACCGCAGACCA -3'。
4. 一種如權利要求1所述的核苷酸分子，其特征在于，它的序列是5'-UCUCUUGAACCAUUUGCGACCGCAGACCAdTdT -3，。
5. —種如權利要求l一4中任何一種核苷酸分子的制備方法，其特征在于， 按權力要求l一4中任一種核苷酸分子的序列，將各核糖核酸基團依次脫水縮和。
6. 如權力要求l一4中任何一種核苷酸分子在制備抗腫瘤藥物中的應用。
7. 如權力要求6所述的應用，其特征是所述的抗腫瘤藥物是由含有效治療量 的權力要求l一4中任一種核苷酸分子和藥學上的載體或者賦形劑組成的藥物組合 物。
8. —種如權利要求6所述的應用，其特征是，所述藥物是針劑、粉劑或者片劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及NRN1SR32及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。腫瘤嚴重威脅著人類的健康。本發(fā)明提供了一種用于制備抗腫瘤藥物的核苷酸分子NRN1SR32，其序列包括5’-TCTCTTGAACCATTTGCGACCGCAGACCA-3’或者5’-UCUCUUGAACCAUUUGCGACCGCAGACCA-3’。含有NRN1SR32的裸鼠與相同培養(yǎng)條件下不含NRN1SR32的裸鼠相比，瘤體的增長明顯受到抑制，而且這種現(xiàn)象隨著時間的推移日益明顯。本發(fā)明為腫瘤的治療和緩解提供了一種新的途徑和手段。
文檔編號A61K9/20GK101328476SQ200810040160
公開日2008年12月24日 申請日期2008年7月3日 優(yōu)先權日2008年7月3日
發(fā)明者仙玲玲, 龍 余, 季國慶, 波 秦, 韓丁丁 申請人:復旦大學