專利名稱：鏈親和素-白細(xì)胞介素2融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體涉及來源于動(dòng)物的多肽，特別是白細(xì)胞介素-2。
技術(shù)背景白細(xì)胞介素-2 (Interleukin-2， IL-2)是一種T細(xì)胞生長(zhǎng)因子和信號(hào)調(diào)節(jié)分子，有很重要 的免疫調(diào)節(jié)作用。有如下功能促進(jìn)T細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞毒T細(xì)胞、NK細(xì)胞和單核細(xì)胞 活性；誘導(dǎo)B細(xì)胞生長(zhǎng)和抗體產(chǎn)生；誘導(dǎo)周圍血中淋巴細(xì)胞衍生為L(zhǎng)AK細(xì)胞；誘導(dǎo)繼發(fā)的 細(xì)胞因子分泌，如TNFa、 GM-CSF、 IFN等；增強(qiáng)T細(xì)胞表面的IL-2受體的表達(dá)。因此，IL-2 具有抗病毒、抗腫瘤和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用。IL-2基因常用來修飾腫瘤細(xì)胞，制備腫瘤 細(xì)胞疫苗，以增強(qiáng)腫瘤抗原的免疫原性。通過原位基因轉(zhuǎn)染(或轉(zhuǎn)導(dǎo))在腫瘤病灶局部實(shí)現(xiàn) IL-2持續(xù)有效表達(dá)的治療策略，已在表淺膀胱癌的臨床前研究中顯示出誘人的前景。但是， 用基因修飾法制備腫瘤細(xì)胞疫苗存在如下固有缺陷修飾效率一般都較低(尤其是原位基因 轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo))，并取決于腫瘤細(xì)胞類型；因影響因素較多，致使治療基因的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物的 有效濃度在周部難于達(dá)到并較長(zhǎng)時(shí)間地維持，從而實(shí)際抗腫瘤的臨床效果非常有限；因個(gè)體 差異和獲得腫瘤標(biāo)本時(shí)腫瘤細(xì)胞的成活狀態(tài)不一致，往往有些病人因無法提供成活狀態(tài)較好 的腫瘤細(xì)胞，最終不能制成自體腫瘤細(xì)胞疫苗；往往有潛在的病毒載體安全性問題(所謂"遺 傳毒性")和免疫原性問題(反復(fù)使用同一病毒載體會(huì)影響導(dǎo)入基因的表達(dá)效率)；很難同時(shí) 高效表達(dá)多個(gè)具有協(xié)同作用的免疫刺激因子，并對(duì)它們的表達(dá)量進(jìn)行精確控制。此外，基因 修飾的自體腫瘤細(xì)胞疫苗制備比較費(fèi)時(shí)，不易大規(guī)模開展和廣泛使用。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可以對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行快速表面修飾并能夠永久地錨 定在腫瘤細(xì)胞表面的新型白細(xì)胞介素-2。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是一種融合蛋白，該蛋白由接頭肽連接一鏈親和素和一白細(xì)胞介素-2構(gòu)成，其中所述的接 頭肽的氨基酸序列為Ser Ser GIy Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。本發(fā)明融合蛋白中的鏈親和素位于接頭肽的N端或C端；其中鏈親和素位于接頭肽的N 端的融合蛋白(如SEQN0.2)的活性比鏈親和素位于接頭肽的C端的融合蛋白(如SEQN0.1) 高兩倍以上。本發(fā)明融合蛋白可通過將鏈親和素基因、白細(xì)胞介素-2基因以及連接所述的鏈親和素和
白細(xì)胞介素-2的接頭多核苷酸通過基因重組、轉(zhuǎn)化構(gòu)建工程菌表達(dá)獲得，其中基因重組和轉(zhuǎn) 化的方法均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟識(shí)的技術(shù)。為了便于融合蛋白的分離純化，本發(fā)明所述的融合蛋白的鏈親和素部分的末端還可以連 接有純化標(biāo)簽，如本發(fā)明融合蛋白SEQN0.3的鏈親和素的C端連有組氨酸標(biāo)簽、本發(fā)明融 合蛋白SEQN0.4的鏈親和素的N端連有組氨酸標(biāo)簽。本發(fā)明還提供一種編碼本發(fā)明融合蛋白的多核苷酸，該多核苷酸由成熟鏈親和素cDNA、 成熟白細(xì)胞介素-2 cDNA通過TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGG GGC GGATCC連接而成；該多核苷酸中成熟鏈親和素cDNA的末端還可以連接有CAT CAT CAC CAT CAC CAT。將所述的編碼本發(fā)明融合蛋白的多核苷酸通過基因重組插入到原核表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn) 化大腸桿菌可獲得高效表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的工程菌；所述的原核表達(dá)載體可以是pET24a 或pET24d，大腸桿菌為BL21 (DE3)。本發(fā)明融合蛋白在上述工程菌中主要以包涵體的形式存在，從包涵體中分離純化蛋白并 復(fù)性處理后，即可獲得本發(fā)明融合蛋白。本發(fā)明融合蛋白采用富含甘氨酸和絲氨酸的鏈接肽連接白細(xì)胞介素-2和鏈親和素，此15 肽非常靈活，有助于融合蛋白中各單元蛋白質(zhì)分子的獨(dú)立折疊，從而保存各自的生物活性， 使融合蛋白具有鏈親和素和白細(xì)胞介素-2的雙重活性，可通過鏈親和素與生物素的強(qiáng)力結(jié)合 將白細(xì)胞介素-2錨定在生物素化的腫瘤細(xì)胞表面，且能在Y射線滅活腫瘤細(xì)胞表面穩(wěn)定存在， 并仍保持白細(xì)胞介素-2的活性。經(jīng)本發(fā)明融合蛋白表面修飾的腫瘤疫苗具有預(yù)防和治療腫瘤的作用，可用于制備預(yù)防性 和治療性腫瘤的疫苗。本發(fā)明所述的腫瘤疫苗是將本發(fā)明融合蛋白錨定在生物素化的腫瘤細(xì) 胞表面獲得的。本發(fā)明所述的腫瘤疫苗的制備充分利用了蛋白質(zhì)的氨基(即-NH2)易生物素化以尿生物 素與鏈親和素高效而強(qiáng)有力幾乎不可逆的結(jié)合這兩個(gè)特性，先用生物素化試劑將生物素化學(xué) 交聯(lián)到欲修飾的腫瘤細(xì)胞表面，然后本發(fā)明融合蛋白借助鏈親和素與生物素的特異結(jié)合將白 細(xì)胞介素-2迅速永久地錨定在腫瘤細(xì)胞表面，從而使白細(xì)胞介素-2在局部達(dá)到持續(xù)有效的治 療濃度；再者，由于一個(gè)鏈親和素蛋白可結(jié)合四個(gè)生物素，因此本發(fā)明融合蛋白錨定到腫瘤 細(xì)胞的量是可以精確控制的。


圖1是IL2 -L-SA-6His-pET24重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖。 圖2是6His-SA-L-IL2-pET24重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖
圖3是融合蛋白IL2-L-SA-6His的SDS-PAGE電泳圖，其中1是分子量標(biāo)準(zhǔn)，2是工程 菌誘導(dǎo)前，3是工程菌誘導(dǎo)后；4是包涵體，5是Ni-NTA柱層析后；6是2-Iminobiotin親和柱層析后。圖4是用抗IL-2單克隆抗體及熒光標(biāo)記的二抗經(jīng)流式細(xì)胞儀對(duì)錨定在生物素化的 816110表面上本發(fā)明融合蛋白進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果，左峰為未修飾的細(xì)胞(陰性對(duì)照)，而右峰 為本發(fā)明融合蛋白錨定修飾的細(xì)胞。圖5是用PHA刺激人外周血淋巴細(xì)胞MTT法對(duì)錨定在生物素化的B16.F10表面上本發(fā) 明融合蛋白的IL-2進(jìn)行生物活性測(cè)定的結(jié)果，以錨定在生物素化的B16.F10表面上GFP-L-SA為陰性對(duì)照；其中，表示本發(fā)明融合蛋白，+表示融合蛋白0 丄-8八。圖6是接種本發(fā)明腫瘤疫苗后的預(yù)防腫瘤小鼠模型的腫瘤生長(zhǎng)情況曲線圖，以GFP-L-SA 修飾的B6.F10腫瘤細(xì)胞疫苗為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，其中實(shí)線表示本發(fā)明融合蛋白組，虛線表示 GFP-L-SA對(duì)照組。圖7是接種本發(fā)明腫瘤疫苗后的預(yù)防腫瘤小鼠模型的小鼠存活情況曲線圖，以GFP-L-SA 修飾的B6.F10腫瘤細(xì)胞疫苗為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，其中實(shí)線表示本發(fā)明融合蛋白組，虛線表示 GFP-L-SA對(duì)照組。圖8是接種本發(fā)明腫瘤疫苗后的治療腫瘤小鼠模型的小鼠存活情況曲線圖，以GFP-L-SA 修飾的B6.F10腫瘤細(xì)胞疫苗為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，其中實(shí)線表示本發(fā)明融合蛋白組，虛線表示 GFP-L-SA對(duì)照組。下面將通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明以及本發(fā)明具有的技術(shù)效果。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)所用的材料及設(shè)備如下細(xì)胞株、菌株與質(zhì)粒B16.F10 (鼠黑色素瘤細(xì)胞株)；菌株S"印tomyces oWcftm'!'(親和素 鏈霉菌，ATCC)， DH5a和BL21 (DE3);原核表達(dá)質(zhì)粒pET24a (Kana、 Novagen)。主要生化試劑及材料DNeasy組織試劑盒和質(zhì)粒DNA的制備試劑盒(Qiagen)，寡核苷 酸的合成(Sigma), Trizol, Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶，Platinum尸;5c DNA聚合酶和T4 DNA連接 酶(Invitrogen); IL-2標(biāo)準(zhǔn)品(R&D Systems),瓊脂糖和SDS-PAGE (Biorad); 2-Iminobiotin (Sigma)和Ni-NTA(Qiagen)填料；Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce)和抗IL-2單克隆抗體(BD Biosciences Pharmingen)。DNA片段的連接、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選，限制性內(nèi)切酶分析，SDS-聚丙烯酰胺凝膠點(diǎn)泳
等常規(guī)方法均參照文獻(xiàn)(Sambrook J， et al. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2nd edition, 1989)或廠家提供的產(chǎn)品說明書；DNA 序列分析在大連寶生物工程公司的DNA測(cè)序服務(wù)中心完成。 例1融合蛋白IL2 -L-SA-6His的制備1、 用DNeasy組織試劑盒從親和素鏈霉菌抽提出細(xì)菌的基因組DNA，然后用其作為模板， 通過Platinum/ 々DNA聚合酶進(jìn)行PCR制備成熟鏈親和素cDNA 。弓I物5'GGAATTCTCAAGCGGGGGCAGCGGGGGCGGAGGCAGCGGCGGGGGCG GATCCG CCGACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCC 3' (78nt)和 5'GTGGTGCTCGAGCTGCTGAACGGCGTCGAGCGGGTTGCC 3， (39nt)。反應(yīng)條件變性94。C， 2min，循環(huán)(94°C， 15s—60°C， 15s—68°C， 30s) 25輪，最后 68°C， 5min。2、 用Trizol抽提起PHA-活化的外周血淋巴細(xì)胞的總RNA，并以其作為模板，進(jìn)行 RT-PCR制備成熟IL-2 cDNA。引物5， CATGCCATGGCTCCTACTTCAAGTTCTACAAAG 3， (33nt)禾口 5， GGAATTCAGTCAGTGTTGAGATGATGCTTTG 3， (31nt)反應(yīng)條件變性94。C， 2rain，循環(huán)(94°C， 15s—60°C， 15s—68°C， 30s) 25輪，最后 68。C， 5min。3、 構(gòu)建IL2-L-SA-6His-pET24重組質(zhì)粒制備的IL-2 cDNA (不含終止碼，兩端分別含NcoI和EcoRI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn))和SA cDNA (不含終止碼，兩端分別含EcoRI和Xhol限制性內(nèi)切酶位點(diǎn))，將上述IL-2和SA基因片段 克隆于pET-24d載體中，獲得IL2-L-SA-6His-pET24重組表達(dá)質(zhì)粒(結(jié)構(gòu)圖如圖1所示)。其 中L為富含甘氨酸、絲氨酸的連接肽(17肽)。重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)DNA序列分析鑒定，驗(yàn)證其 正確無誤。4、 構(gòu)建IL2-L-SA-6His-pET24/BL21 (DE3)工程菌IL2-L-SA-6His-pET24重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞后，用含卡那霉素 的LB平皿篩選。挑取轉(zhuǎn)化平皿上的單菌落接種于加有卡那霉素(20ng/ml)的LB培養(yǎng)基中。 經(jīng)37。C搖床培養(yǎng)擴(kuò)增至吸光度A600為0. 4 0. 5時(shí)，加入終濃度為0. lmmol/L的IPTG， 37 。C誘導(dǎo)表達(dá)4h，離心(8000gX 10min)收獲菌體，將細(xì)胞破碎后用12%的SDS-PAGE檢測(cè)分析融 合蛋白的表達(dá)情況。5、 融合蛋白IL2 -L-SA-6His的表達(dá)融合蛋白6His-SA-L-IL2在菌體中主要以包涵體的形式存在，其表達(dá)量達(dá)20 30%。 6、 從包涵體中獲得融合蛋白IL2-L-SA-6Hisa. 制備包涵體5克菌體懸于100ml lxPBS中，冰浴中超聲(電流270mA), 30秒X10 次(每次間隔30秒);接著于4'C離心10分鐘(8000g)，將沉淀懸浮于100ml lxPBS (內(nèi)含4mol/L 尿素，0.5%Triton X-100, 20mmol/L EDTA)中進(jìn)行漂洗，隨后離心(1000gX10分鐘)收集沉 淀；漂洗兩次后，溶于10Ommol/L磷酸鈉緩沖液，8mol/L尿素(pH 8.0)中，15000gX 15分鐘，取上清液。b. Ni-NTA柱層析將步驟a得到的上清液上樣于Ni-NTA柱(2.6X5cm)，用平衡液 (100讓ol/L磷酸鈉緩沖液，8mol/L尿素，pH8.0)進(jìn)行沖洗至樣品八28()恢復(fù)至基線；然后用洗 脫液(100mmol/L磷酸鈉緩沖液，8mol/L尿素，pH4.5)進(jìn)行洗脫，洗脫液經(jīng)SDS-PAGE鑒定， 收集融合蛋白質(zhì)峰(融合蛋白IL2 -L-SA-6His的分子量為34KD)。c. 透析復(fù)性將Ni-NTA柱層析純化獲得的IL2-L-SA-6His融合蛋白調(diào)至OD28()=0.2， 在大于20倍體積的透析液(100mmol/L NaHC03, 1.0mol/L尿素，lmmol/L還原型谷胱苷肽, 0.2mmol/L氧化型谷胱苷肽，pH 9.0)中4'C透析復(fù)性12小時(shí)；然后在50mmol/L NaHC03， 500mmol/LNaCl， pH 11中繼續(xù)透析6小時(shí)；離心除去不溶物，收集上清。d. 2-Iminobiotin親和柱層析用平衡液(50mmol/LNaHCO3， 500mmol/LNaCl， pHll) 洗脫5個(gè)柱體積后(柱體積0.5X2cm)，將收集的已復(fù)性融合蛋白質(zhì)液上親和層析柱，并用平 衡液洗脫至樣品A加恢復(fù)至基線；然后，用50mmol/LNaAc，pH4.0洗脫，分管收集各洗脫峰， 并用10x平衡液(500mmol/LNaHCO3， 5mol/LNaCl， pH 11)將收集的融合蛋白質(zhì)液調(diào)至 pH8.0，并過濾除菌分裝，儲(chǔ)存于—20°C。所得融合蛋白IL2 -L-SA-6His用SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如圖3所示。7、 利用PHA剌激人外周血淋巴細(xì)胞對(duì)IL-2的活性進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得的IL-2活性為 lxl06U/mg。例2融合蛋白6His-SA-L-IL2的制備1、 制備成熟鏈親和素cDNA:方法與例1同。 引物5， GGAATTCCATATGCATCATCACCATCACCATGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGG 3'(55nt)和5'GGAATTCGGCGGATCCGCCCCCGCCGCTGCCTCCGCCCCCGCTGCCCCCGCTCGT CTGCTGAACGGCGTCGAGCGGGTTGCC 3， (82nt)。2、 制備成熟IL-2 cDNA:方法與例1同。 引物 ， GGAATTCATGGCTCCTACTTCAAGTTCTAC 3， (30nt)和5， CCCAAGCTTTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGCTTTG 3, (36nt)。3、 構(gòu)建6His-SA-L-IL2-pET24重組質(zhì)粒制備的SA cDNA (不含終止碼，兩端分別含Ndel和EcoRI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn))和IL-2 cDNA (兩端分別含EcoRI和HindIII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn))，將上述SA和IL-2基因片段克隆于 pET-24a載體中，獲得6His-SA-L-IL2-pET24重組表達(dá)質(zhì)粒(結(jié)構(gòu)圖如圖2所示)。其中L為 富含甘氨酸、絲氨酸的連接肽。重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)DNA序列分析鑒定，驗(yàn)證其正確無誤。4、 構(gòu)建6His-SA-L-IL2-pET24/BL21 (DE3)工程菌方法與例1同。5、 融合蛋白6His-SA-L-IL2的表達(dá)融合蛋白6His-SA-L-IL2在菌體中主要以包涵體的形式存在，6His-SA-L-IL2融合蛋白的 分子量為33KD，其表達(dá)量達(dá)20 30%。6、 從包涵體中獲得融合蛋白6His-SA-L-IL2:方法與例1同。7、 利用PHA刺激人外周血淋巴細(xì)胞對(duì)IL-2的活性進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得的IL-2活性為 2xl06U/mg，是IL2-L-SA-6His融合蛋白相應(yīng)比活的2倍。例3 IL2-L-SA-6His或6His-SA-L-IL2融合蛋白修飾的腫瘤疫苗的制備 將107個(gè)B16.F10細(xì)胞懸浮在lml 1 XPBS中，加入0.5mg Sulfo-NHS-LC-Biotin并混勻 后，室溫下作用30分鐘；用1XPBS洗滌細(xì)胞3次后，每106個(gè)B16.F10細(xì)胞加入200ng IL2-L-SA-6His或6His-SA-L-IL2融合蛋白，冰上作用30分鐘；1XPBS洗滌細(xì)胞1次后，然 后用Y射線滅活(20000md)即可。例4本發(fā)明融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的修飾效果及其穩(wěn)定性檢測(cè)用抗IL-2單克隆抗體及熒光標(biāo)記的二抗經(jīng)流式細(xì)胞儀對(duì)錨定在生物素化的B16.F10表面 上的IL2-L-SA-6His或6His-SA-L-IL2融合蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖4，幾乎100%的腫瘤細(xì) 胞被修飾，且腫瘤細(xì)胞表面有大量的IL-2。對(duì)錨定在腫瘤細(xì)胞表面的IL2-L-SA-6His融合蛋 白的穩(wěn)定性經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析表明，在一周內(nèi)這些錨定的融合蛋白在細(xì)胞表面的數(shù)量無 顯著下降。例5對(duì)錨定在生物素化的B16.F10表面上的本發(fā)明融合蛋白進(jìn)行IL-2生物活性的測(cè)定首先將表面己錨定了 IL2-L-SA-6His或6His-SA-L-IL2融合蛋白的106個(gè)B16.F10經(jīng)超聲破碎，離心收集其不溶的膜性成分；然后將其懸浮于100nl完全培養(yǎng)基中，用PHA剌激人外周血淋巴細(xì)胞MTT法對(duì)其中的IL-2進(jìn)行生物活性測(cè)定，結(jié)果如圖5所示，活化的淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖依賴于已錨定修飾細(xì)胞的不溶膜性成分的劑量，表明IL2-L-SA-6His或6His-SA-L-IL2融合蛋白錨定在細(xì)胞表面后仍然能保持IL-2的生物活性。
例6本發(fā)明融合蛋白修飾的B6.F10腫瘤細(xì)胞疫苗預(yù)防腫瘤的效果(1) 材料本發(fā)明腫瘤疫苗制備方法見實(shí)施例3; GFP-L-SA-6His (即綠色熒光蛋白和鏈親和素的 融合蛋白)修飾的、y射線滅活(20000rad)的B6.F10腫瘤細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照。(2) 方法分別將106個(gè)GFP-L-SA-6His修飾的、y射線滅活(20000rad)的B6.F10腫瘤細(xì)胞以及 本發(fā)明腫瘤疫苗接種于C57BL/6小鼠左肋腹部的皮內(nèi)，14天后加強(qiáng)一次；7天后，將105未 經(jīng)任何處理的B6.F10腫瘤細(xì)胞接種于小鼠右肋腹部的皮下，然后觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況和小鼠 在40天內(nèi)的成活情況(3) 結(jié)果有20%的免疫小鼠獲得100%的保護(hù)(即無腫瘤生長(zhǎng))，陰性對(duì)照組全部有腫瘤生長(zhǎng)(圖 6)。同時(shí)，本發(fā)明腫瘤疫苗的預(yù)防接種組的生存數(shù)及生存期顯著高于GFP修飾的陰性對(duì)照組 (圖7)。例7本發(fā)明融合蛋白修飾的B6.F10腫瘤細(xì)胞疫苗治療腫瘤的效果。(1) 材料見實(shí)施例6。(2) 方法將1()S個(gè)未經(jīng)任何處理的B6.F10腫瘤細(xì)胞接種于小鼠右肋腹部的皮下；4， 11和18天后， 分別將106 GFP-L-SA-6His或IL2-L-SA-6His修飾的、y射線滅活(20000rad)的B6.F10腫 瘤細(xì)胞接種于C57BL/6小鼠左肋腹部的皮內(nèi)，然后觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況和小鼠在40天內(nèi)的 成活情況。(3) 結(jié)果如圖8所示,本發(fā)明腫瘤疫苗治療組的生存數(shù)及生存期顯著高于GFP修飾的陰性對(duì)照組。SEQUENCE LISTING〈110〉南方醫(yī)科大學(xué)<120〉鏈親和素/白細(xì)胞介素2融合蛋白<160〉 4<170> Patentln version 3.3<210> 1<211〉 3i0<212> PRT <213〉人工序列<220〉<221〉 CHAIN〈222〉 (1)..(136) <223〉人成熟IL-2<220><221〉 DOMAIN<222〉 (137)..(151)
<223〉甘氨酸和絲氨酸的鏈接肽(L),此15肽非常靈活，有助于融合蛋白中各單元 蛋白質(zhì)分子的獨(dú)立折疊，從而保存各自的生物活性，最終提高融合蛋白的雙 重活性。 .<220〉〈221〉 CHAIN〈222〉 (152)..(310)<223〉鏈霉菌成熟的全長(zhǎng)鏈親和素(SA)<400〉 1Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu GIu 15 10 15His Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr 20 25 30Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro 35 40 45Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu 50 55 60
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe His 65 70 75 80
Leu Arg Pro Arg Asp Leu lie Ser Asn He Asn Val lie Val Leu Glu 85 90 95
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr 100 105 110
Ala Thr lie Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp He Thr Phe Cys Gin Ser 115 120 125
He lie Ser Thr Leu Thr Glu Phe Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gin 145 150 155 160
Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly He Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gin Leu 165 170 175
Gly Ser Thr Phe lie Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly 180 185 190<formula>formula see original document page 13</formula>
〈210〉 2
<211〉 299
<212〉 PRT <213〉人工序列
<220〉
<221> CHAIN
<222> (1)..(147)
<223〉鏈親和素；與成熟的全長(zhǎng)相比，在N-端缺失了 13個(gè)氨基酸。 <220〉
<221〉 DOMAIN
<222> (148)..(165)
<223>連接肽，并且其3'端含有BamHI和EcoRI的酶切位點(diǎn)。 <220>
<221> CHAIN
<222〉 (166)..(299) <223〉人成熟IL2。
<400> 2
Met Glu Ala Gly lie Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gin Leu Gly Ser Thr 15 10 15
Phe He Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu 20 25 30
Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr 35 40 45
Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr 50 55 60
Val Ala T卬Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80
Ser Gly Gin Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg He Asn Thr Gin Trp 85 90 95
Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu 100 105 110
Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser He 115 120 125
Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala 130 135 140
Val Gin Gin Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160
Gly Ser Ala Glu Phe Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr 165 170 175
Gin Leu Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp' Leu Gin Met lie Leu Asn 180 185 190
Gly lie Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe 195 200 205
Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys 210 215 220
Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gin 225 230 235 240
Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu lie Ser Asn lie Asn 245 250 255
Val lie Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu 260 265 270
Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr lie Val Glu Phe Leu Asn Arg T卬lie 275 280 285
Thr Phe Cys Gin Ser lie lie Ser Thr Leu Thr 290 295
<210〉 3
<211> 316
<212> PRT <213>人工序列
<220>
<221〉 CHAIN
<222> (1)..(136)
<223>人成熟IL-2的cDNA
<220〉
〈221> DOMAIN <222> (137)..(151)
<223〉富含甘氨酸和絲氨酸的鏈接肽(L),此15肽非常靈活，有助于融合蛋白中各 單元蛋白質(zhì)分子的獨(dú)立折疊，從而保存各自的生物活性，最終提高融合蛋白 的雙重活性。
<220>
<221> CHAIN
<222> (152)..(310)
<223>鏈霉菌成熟的全長(zhǎng)鏈親和素。
<220〉
<221〉 PEPTIDE
<222〉 (311)..(318) <223〉組氨酸標(biāo)簽
〈400> 3
Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu 15 10 15
His Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr 20 25 30
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro 35 40 45
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu 50 55 60
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe His 65 70 75 80
Leu Arg Pro Arg Asp Leu lie Ser Asn lie Asn Val lie Val Leu Glu 85 90 95
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr 100 105 110
Ala Thr lie Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp He Thr Phe Cys Gin Ser 115 120 125
lie lie Ser Thr Leu Thr Glu Phe Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gin 145 150 155 160
Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly lie Thr Gly Thr T卬Tyr Asn Gin Leu 165 170 175
Gly Ser Thr Phe He Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly 180 185 190
Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr
195
200
205
Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu
210
215
220
Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala
225
230
235
240
Thr Thr T卬Ser Gly Gin Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg lie Asn
245
250
255
Thr Gin Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys
260
265
270
Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala
275
280
285
Pro
290
295
300
Leu Asp Ala Val Gin Gin Leu Glu His His His His His His
305
310
315
<210〉 4
<211〉 305
〈212〉 PRT <213〉人工序列
<220>
〈221> PEPTIDE
<222> (2)..(7)
〈223〉 組氨酸標(biāo)簽
<220〉
<221〉 CHAIN
<222〉 (8)..(153)
<223〉鏈親和素；與成熟的全長(zhǎng)相比，在N-端缺失了 13個(gè)氨基酸。 <220〉
<221〉 DOMAIN
<222> (154),.(171)
<223〉連接肽，并且其3'端含有BamHI和EcoRI的酶切位點(diǎn)。 <220>
<221> CHAIN
<222〉 (173)..(305)<223> 人成熟IL2<400〉 4Met His His His His His His Glu Ala Gly He Thr Gly Thr Trp Tyr51015Asn Gin Leu Gly Ser Thr Phe lie Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala202530Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr354045505560Thr Ala Leu Gly T卬Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala65707580His Ser Ala Thr Thr T卬Ser Gly Gin Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala859095Arg He Asn Thr Gin T卬Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn 100 105 110Ala T卬Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys 115 120 125Pro Ser Ala Ala Ser He Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn 130 135 140Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gin Gin Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Phe Met Ala Pro Thr Ser 165 170 175Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp 180 185 190Leu Gin Met lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu 195 200 205Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu 210 215 220Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu 225 230 235 240Val Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp 245 250 255Leu lie Ser Asn lie Asn Val lie Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu 260 265 270Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr lie Val Glu 275 280 285Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Cys Gin Ser lie lie Ser Thr Leu 290 295 300Thr 30權(quán)利要求
1、一種融合蛋白，該蛋白由接頭肽連接一鏈親和素和一白細(xì)胞介素-2構(gòu)成，其中所述的接頭肽的氨基酸序列為Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種融合蛋白，其特征在于所述的鏈親和素位于接頭肽的N端。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ.N0 2。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種融合蛋白，其特征在于所述的鏈親和素位于接頭肽的C端。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的的鏈親和素部分的末端連接有純 化標(biāo)簽。
6、 一種基因，該基因編碼權(quán)利要求l、 2、 3或4融合蛋白。
7、 一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有權(quán)利要求5所述的基因。
8、 一種工程菌，該工程菌轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體。
9、 權(quán)利要求l、 2、 3或4所述的融合蛋白在制備腫瘤疫苗中的應(yīng)用。
10、 一種腫瘤疫苗，該腫瘤疫苗是將權(quán)利要求l、 2、 3或4所述的融合蛋白錨定到經(jīng)過 生物素化的腫瘤細(xì)胞的表面獲得的。
全文摘要
本發(fā)明提供一種融合蛋白，該蛋白由接頭肽連接一鏈親和素和一白細(xì)胞介素-2構(gòu)成，其中所述的接頭肽的氨基酸序列為SerSerGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。本發(fā)明融合蛋白同時(shí)具有鏈親和素和白細(xì)胞介素-2的活性，可通過鏈親和素與生物素的強(qiáng)力結(jié)合將白細(xì)胞介素-2錨定在生物素化的腫瘤細(xì)胞表面，且能在γ射線滅活腫瘤細(xì)胞表面穩(wěn)定存在，并仍保持白細(xì)胞介素-2的活性。經(jīng)本發(fā)明融合蛋白表面修飾的腫瘤疫苗具有預(yù)防和治療腫瘤的作用，可用于制備預(yù)防和治療腫瘤的疫苗。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101148477SQ200710030119
公開日2008年3月26日 申請(qǐng)日期2007年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月6日
發(fā)明者周明乾, 林來新妹, 胡志明, 高基民 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)