一種生物素-親和素系統(tǒng)快速檢測卡的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本實用新型設及體外診斷試劑領領域，特別設及一種生物素-親和素系統(tǒng)快速檢 測卡。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前檢測方法常用化學發(fā)光法、固相免疫層吸法、放射免疫分析法、免疫增強比濁 法、膠體金法。運些檢測諸多方法中均存在不足，如酶聯(lián)免疫法、固相免疫層吸法、放射免疫 分析法，操作繁瑣、檢測時間長、結(jié)果重復性差、核素污染，某些方法只能進行定性檢測?；?學發(fā)光免疫分析法雖具有準確、靈敏度高、特異性強、精密度好的優(yōu)點，但其所用儀器價格 昂貴，所用試劑又為進口試劑，一般實驗室難W開展，并且不適用于急診檢驗。
[0003] 而在此基礎上建立的生物素-親和素系統(tǒng)(biotinavidin system，BAS)，是一種新 型生物反應放大系統(tǒng)，主要表現(xiàn)為靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好、適用性強等方面，被廣泛 應用于醫(yī)學各領域。親和素(Avidin，AV)是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，分子量為 68kDa，由4個亞單位組成，對生物素有非常高的親和力（結(jié)合常數(shù)高達1015M-1)。親和素的 等電點低、不含糖基、與生物素高特異性結(jié)合，在檢測運用中有高靈敏度、低非特異性的結(jié) 合等優(yōu)點，生物素易與蛋白質(zhì)、核酸類生物大分子結(jié)合，形成生物素衍生物，再與SA結(jié)合，將 信號多級放大且大分子原有生物活性得到保持，使檢測方法的靈敏度顯著提高。SA與生物 素間具有極高的親和力，其反應呈高度專一性，BSA系統(tǒng)的非特異性干擾低，且SA與生物素 的結(jié)合高速、高效，檢測時間快。酸堿、有機溶劑、變性劑均不影響SA與生物素的結(jié)合力。SA 能夠與絕大多數(shù)用于標記的物質(zhì)結(jié)合，例如大分子物質(zhì)：巧光蛋白、鐵蛋白等。BAS系統(tǒng)可顯 著提高標記免疫檢測的靈敏度，在免疫學領域中應用廣泛。
[0004] 將生物素-親和素系統(tǒng)應用于免疫組化，酶聯(lián)免疫，巧光免疫，放射免疫等檢測技 術(shù)中，可顯著地提高W上技術(shù)方法的敏感性、特異性和穩(wěn)定性，使方法更簡便，有助于臨床 快速診斷。鏈霉親和素現(xiàn)已經(jīng)廣泛應用于時間分辨免疫巧光技術(shù)定量PCR、單鏈DNA制備、生 物大分子的純化、單克隆抗體制備、生物忍片、腫瘤放射免疫診斷和治療等領域，在生物技 術(shù)領域?qū)⒉粩嗟玫叫碌膽?，應用范圍非常廣泛、應用潛力極大。利用生物素-親和素系統(tǒng) 研制檢測快速診斷試劑尚無報道。
[000引生物素-親和素系統(tǒng)檢測原理:BAS是在常規(guī)化ISA原理的基礎上，結(jié)合生物素與親 和素間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統(tǒng)。鏈霉親和素 (Streptavidin，SA)是鏈霉親 和素菌在培養(yǎng)過程中的分泌產(chǎn)物，其生物學特性與親和素 (Avidin，AV)相似，與生物素結(jié)合 常數(shù)為IQis/M，是抗原抗體反應（IOVm~l0ii/M)的一萬倍W上。生物素很易與蛋白質(zhì)（如抗 體等）W共價鍵結(jié)合。運樣，結(jié)合了巧光蛋白的親和素分子與結(jié)合有特異性抗體的生物素分 子產(chǎn)生反應，既起到了多級放大作用，又由于巧光蛋白在聚合到一定程度時發(fā)出巧光，達到 檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。鏈霉親和素是與親和素有相似生物學特性的一種蛋白 質(zhì)，鏈霉親和素與親和素一樣分子中每條膚鏈都能結(jié)合一個生物素，因此幾乎所有用于標 記的物質(zhì)均可W同親和素或鏈霉親合素結(jié)合。 【實用新型內(nèi)容】
[0006] 本實用新型的目的是提供一種生物素-親和素系統(tǒng)快速檢測卡，本實用新型的檢 測卡基于生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)、免疫層析技術(shù)和抗原抗體反應，具有靈敏度高、特 異性強、穩(wěn)定性好、適用性強等優(yōu)點，適用于臨床快速診斷。
[0007] 本實用新型的技術(shù)方案為：
[0008] -種生物素-親和素系統(tǒng)快速檢測卡，包括殼體6,所述殼體6上設有加樣孔7和觀 察孔8;所述殼體6內(nèi)設有檢測試紙條，所述檢測試紙條包括底板IW及依次設置在底板1上 的樣品墊2、含有鏈霉親和素標記的巧光蛋白和生物素標記的抗人單克隆抗體的巧光標記 物結(jié)合墊3、硝酸纖維素膜4和吸水紙5;所述硝酸纖維素膜4上設有包被有抗人單克隆抗體 化的檢測帶T和包被有羊抗鼠IgG的質(zhì)控帶C;所述樣品墊2、巧光標記物結(jié)合墊3、硝酸纖維 素膜4和吸水紙5依次搭接設置在底板1上;所述加樣孔7與樣品墊2對應設置，所述觀察孔8 與硝酸纖維素膜4對應設置。
[0009] 其中，鏈霉親和素標記的巧光蛋白中，巧光蛋白為藻膽蛋白、綠色巧光蛋白中的一 種。另外，抗人單克隆抗體I和抗人單克隆抗體具有不同的識別表位。
[0010] 作為優(yōu)選方案，所述樣品墊2、巧光標記物結(jié)合墊3、硝酸纖維素膜4和吸水紙5依次 搭接粘貼在底板1上。
[0011] 作為優(yōu)選方案，所述巧光標記物結(jié)合墊3和吸水紙5分別壓接在硝酸纖維素膜4的 兩端;所述樣品墊2壓接在巧光標記物結(jié)合墊3上。
[0012] 作為優(yōu)選方案，所述加樣孔7為圓形孔;所述觀察孔8為矩形孔。
[0013] 作為優(yōu)選方案，所述殼體6包括上蓋和底座，所述底座上設有放置檢測試紙條的凹 槽，加樣孔7和觀察孔8設置于所述上蓋上。
[0014] 本實用新型生物素-親和素系統(tǒng)快速檢測卡的工作原理如下：
[0015] 采用免疫反應的原理和生物素-親和素系統(tǒng)檢測原理，利用雙抗體夾屯、法制備而 成。所述巧光標記物結(jié)合墊3含有鏈霉親和素標記的巧光蛋白和生物素標記的抗人單克隆 抗體I，檢驗時樣本與生物素標記的抗人單克隆抗體I免疫反應，形成抗原抗體結(jié)合物，同時 生物素與鏈霉親和素標記的巧光蛋白體結(jié)合，形成抗原-抗體-生物素-鏈霉親和素-巧光蛋 白結(jié)合體，結(jié)合體隨著樣本在硝酸纖維素膜上層析流動，當復合物流層析至硝酸纖維素膜 上的檢測區(qū)處，與檢測帶上包被的抗人單克隆抗體M發(fā)生反應，從而被固定在檢測帶上，樣 本中的抗原越多，檢測帶上的復合物越多，條帶上的光密度值就越高。同時，未與抗原結(jié)合 的抗體-生物素-鏈霉親和素-巧光蛋白結(jié)合體不與檢測帶上的抗人單克隆抗體發(fā)生反應而 繼續(xù)向前移動，最后與質(zhì)控帶上的羊抗鼠IgG發(fā)生反應而固定在對照區(qū)（質(zhì)控帶)上。當樣本 中不含抗原時，則只顯示一條質(zhì)控帶。當樣本中含抗原時，檢測帶就會清晰的顯示出來。
[0016] 當反應結(jié)束后，利用免疫巧光測定儀將檢測帶和質(zhì)控帶的光密度進行分析，并將 分析的結(jié)果進行運算，從而的得到相對光密度值(RI)，然后檢測儀根據(jù)已預先設置在檢測 儀內(nèi)的標準曲線對抗原的濃度進行計算并顯示結(jié)果。
[0017] 本實用新型的有益效果為：
[0018] 1、本實用新型利用"鏈霉親和素-生物素放大系統(tǒng)"，提高檢測靈敏度，降低非特異 性結(jié)合，有利于提高檢測卡性能。
[0019] 2、本實用新型將巧光蛋白作為標記物，此標記物穩(wěn)定性良好，有利于提高檢測穩(wěn) 定性。藻膽蛋白作為巧光免疫檢測系統(tǒng)，不僅克服了人工合成巧光素造價高、合成過程中產(chǎn) 生有害物質(zhì)等缺點，