專利名稱：能夠感染犬科動(dòng)物的流感病毒及其用途的制作方法
相關(guān)申請的參考
本申請是2006年4月21日提交的申請美國序列號11/409,416的部分繼續(xù)申請；并且本申請要求2005年10月19日提交的美國序列號60/728,449；2005年12月29日提交的美國序列號60/754,881；2006年1月14日提交的美國序列號60/759,162；2006年1月23日提交的美國序列號60/761,451；和2006年3月3日提交的美國序列號60/779,080的優(yōu)先權(quán)，將它們的公開都完整(包括發(fā)明簡述、詳述、實(shí)施例、權(quán)利要求、摘要、附圖、表、核酸序列、氨基酸序列和圖)引入本文作為參考。
背景技術(shù)：
“狗舍咳嗽”或者感染性氣管支氣管炎(ITB)是狗中的急性、傳染性呼吸系統(tǒng)感染，其特征主要是咳嗽(Ford et al，1998)。犬ITB被認(rèn)為是世界上狗的最普遍的感染性呼吸系統(tǒng)疾病，并且當(dāng)狗在高密度群體環(huán)境如狗舍中居住時(shí)，爆發(fā)可以達(dá)到流行性比例。多數(shù)爆發(fā)是由于直接的狗-狗接觸或者呼吸系統(tǒng)分泌物的氣霧化(Ford et al，1998)。臨床病征由細(xì)菌和病毒的一種或者組合感染引起，所述細(xì)菌和病毒可以在上呼吸道和下呼吸道的上皮組織中建群。犬科動(dòng)物副流感病毒(CPiV)和支氣管博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)細(xì)菌是從受侵襲的狗分離的最常見的生物，但是幾種其他病毒，如犬科動(dòng)物瘟熱病毒(CDV)和犬科動(dòng)物腺病毒-1和-2(CAV-1，CAV-2)，以及細(xì)菌如鏈球菌(Streptococcus sp.)、Pasteurella multicoda和大腸桿菌(Escherichia coli)可以影響臨床過程和結(jié)果(Ford et al，1998)。盡管在高密度群體中爆發(fā)最有效和快速發(fā)生，具有高的發(fā)病率，但是并發(fā)的呼吸系統(tǒng)感染和死亡是不常見的。盡管可以發(fā)生威脅生命的繼發(fā)性細(xì)菌性肺炎，但是多數(shù)ITB病例是自身限制性的并且在沒有任何治療下消退(Fordet al，1998)。
在1992年7月，推測為“狗舍咳嗽”的呼吸系統(tǒng)感染在新英格蘭(NewEngland)、佛羅里達(dá)(Florida)、西弗吉尼亞(West Virginia)、威斯康辛(Wisconsin)、堪薩斯(Kansas)、科羅拉多(Colorado)、俄克拉荷馬(Oklahoma)和亞利桑那州(Arizona)的幾個(gè)靈

賽場(greyhound track)變得流行。從獸醫(yī)了解到，多數(shù)受侵襲的狗具有后來消退的輕微咳嗽，但是一打以上的靈

患上了急性出血性肺炎，接著快速死亡(Greyhound DailyNews，1999)。
在1998年下半年到1999年上半年，在美國的競賽靈

狗舍中發(fā)生了幾次“狗舍咳嗽”爆發(fā)，導(dǎo)致強(qiáng)制關(guān)閉賽場和隔離美國的所有競賽靈

數(shù)周(Greyhound Daily News，1999)。在佛羅里達(dá)的一個(gè)賽場(Palm BeachKennel Club)，在一天中幾乎40％的狗群體中記錄到咳嗽(來自WilliamDuggar博士的個(gè)人交流)。類似于1992年的爆發(fā)，該咳嗽在多數(shù)靈

中消退，但是佛羅里達(dá)的10只狗死于“狗舍咳嗽”非特征性的出血性肺炎綜合征(Putnam，1999)。
在2003年3月-4月，在美國東部的靈

賽場發(fā)生“狗舍咳嗽”的另一次爆發(fā)。認(rèn)為該爆發(fā)在佛羅里達(dá)的四個(gè)賽場開始，并且因此幾乎三周中止比賽和狗的隔離。在West Palm Beach的賽場幾乎25％的狗受到侵襲，而St.Petersburg的Derby Lane中1400條狗幾乎50％發(fā)生咳嗽。再一次，多數(shù)狗恢復(fù)，但是一些狗死于呼吸系統(tǒng)感染。僅在Derby Lane的呼吸爆發(fā)的估計(jì)的經(jīng)濟(jì)影響為2百萬美元。
沒有公開的報(bào)導(dǎo)記載在1992、1998-1999或2003年在競賽靈

狗舍中“狗舍咳嗽”流行的病因或者臨床病理。假定該感染是由于CPiV和/或支氣管博德特氏菌狗舍咳嗽的兩種最常見的病因。未證實(shí)的交流，如網(wǎng)站已經(jīng)將在一些咳嗽的狗中報(bào)導(dǎo)的致命的出血性肺炎規(guī)因于β-溶血性馬鏈球菌獸瘟亞種(Streptococcus equi subspecies zooepidemicus)，并且將該綜合征稱作“犬鏈球菌中毒性休克”。
病毒從一個(gè)宿主物種傳染到另一個(gè)是流感病毒的生態(tài)學(xué)和流行病學(xué)的關(guān)鍵特征(Webster，1998)。流感病毒的物種間傳染的兩個(gè)基本機(jī)制是可能的(Webster et al.，1992；Lipatov et al.，2004)。一種是基本上未變的病毒從一個(gè)物種直接轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物種。該機(jī)制的實(shí)例包括最近的家禽流感病毒的H5N1亞型對人的感染(Subbarao et al.，1998；Peiris et al.，2004；Guan etal.，2004)和可能地1918年的大流行，稱作西班牙流感(Reid et al.，2004)。第二種機(jī)制是流感病毒基因組的區(qū)段化性質(zhì)的結(jié)果。用來自不同物種的病毒共感染宿主可以導(dǎo)致區(qū)段化病毒基因的重排列，和產(chǎn)生能夠感染其他物種的重組體。例如，鳥類和人流感病毒之間基因重排列產(chǎn)生的新的病毒在1957和1968年導(dǎo)致人類流感大流行(Webster et al.，1992；Lipatov et al.，2004；Kawaoka et al.，1989)。
未改變的流感病毒從自然宿主物種向不同物種的多數(shù)直接傳播是最終事件，因?yàn)樵谛挛锓N的個(gè)體之間的持續(xù)傳播不能發(fā)生。多種病毒-宿主相互作用是復(fù)制和水平傳播所必須的并且為流感病毒在新的宿主中的永續(xù)性提供了強(qiáng)大的屏障(Webby et al.，2004)。因此，流感病毒的新的宿主特異性譜系的建立是不常見的并且僅僅在馴養(yǎng)的家禽、豬、馬和人類中發(fā)生(Webster et al.，1992；Lipatov et al.，2004)。
因?yàn)榱鞲胁《靖腥镜膰?yán)重性質(zhì)，所以仍然需要診斷、預(yù)防和治療流感病毒感染的方法。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及分離的流感病毒，其能夠感染犬科動(dòng)物和在犬科動(dòng)物中引起呼吸系統(tǒng)疾病。本發(fā)明還涉及用于誘導(dǎo)針對本發(fā)明的流感病毒的免疫應(yīng)答的組合物和方法。本發(fā)明還涉及用于鑒定本發(fā)明的病毒和診斷本發(fā)明的病毒對動(dòng)物的感染的組合物和方法。
本發(fā)明的一方面涉及保護(hù)犬科動(dòng)物免于犬科動(dòng)物流感的疫苗和方法、包含此類疫苗的藥盒，和使用此類疫苗的方法。該保護(hù)包括防止流感和/或其一種或多種(通常兩種或多種)癥狀、減輕其危險(xiǎn)、延遲其發(fā)作、減少其擴(kuò)散、將其減輕、抑制和/或消除。認(rèn)為本發(fā)明的疫苗、藥盒和方法一般適用于犬科動(dòng)物。犬科動(dòng)物包括野生的、動(dòng)物園的和馴養(yǎng)的犬科動(dòng)物，包括狼、郊狼和狐貍。犬科動(dòng)物還包括狗，尤其馴養(yǎng)的狗，如純種和/或雜種陪伴狗、表演狗、役用狗、放牧狗、獵狗、守衛(wèi)狗、警犬、賽犬和/或?qū)嶒?yàn)用狗。
本發(fā)明還部分涉及保護(hù)犬科動(dòng)物免于流感病毒感染(例如，預(yù)防、減輕危險(xiǎn)、延遲發(fā)作、抑制、減輕或消除流感病毒感染)的方法。該方法包括施用治療有效量的疫苗，其包含至少一種馬流感病毒抗原、至少一種H3流感病毒抗原，和/或至少一種H7流感病毒抗原。
本發(fā)明還部分涉及保護(hù)犬科動(dòng)物免于犬科動(dòng)物流感病毒引起的呼吸系統(tǒng)損傷(例如，預(yù)防、減輕危險(xiǎn)、延遲發(fā)作、抑制、減輕或消除呼吸系統(tǒng)損傷)的方法。該方法包括對犬科動(dòng)物施用治療有效量的疫苗，其包含至少一種馬流感病毒抗原、至少一種H3流感病毒抗原，和/或至少一種H7流感病毒抗原。
本發(fā)明還部分涉及保護(hù)犬科動(dòng)物免于犬科動(dòng)物流感病毒感染引起的在鼻或口分泌物中具有犬科動(dòng)物流感病毒(例如，預(yù)防、減輕危險(xiǎn)、延遲發(fā)作、抑制、減輕或消除鼻或口分泌物中的犬科動(dòng)物流感病毒)的方法。該方法包括對犬科動(dòng)物施用治療有效量的疫苗，其包含至少一種馬流感病毒抗原、至少一種H3流感病毒抗原，和/或至少一種H7流感病毒抗原。
本發(fā)明還部分涉及犬科動(dòng)物流感疫苗。在一些實(shí)施方案中，例如，該疫苗包含治療有效量的至少一種馬流感病毒抗原、至少一種H3流感病毒抗原，和/或至少一種H7流感病毒抗原。
本發(fā)明還部分涉及用于保護(hù)犬科動(dòng)物免于流感病毒感染的藥盒。該藥盒包含治療有效量的疫苗，該疫苗包含至少一種馬流感病毒抗原、至少一種H3流感病毒抗原，和/或至少一種H7流感病毒抗原。此外，所述藥盒包含至少一種下面的 用于對犬科動(dòng)物施用所述疫苗的裝置， 可藥用賦形劑，其幫助將疫苗施用于犬科動(dòng)物， 可藥用賦形劑，其增強(qiáng)犬科動(dòng)物對所述疫苗的免疫應(yīng)答， 將被犬科動(dòng)物與疫苗同時(shí)消費(fèi)的食物，和/或 將被犬科動(dòng)物與疫苗同時(shí)消費(fèi)的飲食(treat)。
申請人:的本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)將在閱讀該說明書后對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
附圖簡述

圖1A-1B顯示了血凝素基因之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。圖1A顯示了來自代表性犬、人、鳥類、豬和馬分離群，包括作為外類群的A/Budgerigar/Hokkaido/1/77(H4)的HA基因樹。圖1B顯示了使用A/Duck/Ukraine/63(H3)作為外類群，犬流感病毒HA基因與同一時(shí)期的和較老的馬HA基因的樹。通過近鄰連接方法從核苷酸序列推論出系統(tǒng)樹并且顯示了≥90％的自展分析值。條形表示核苷酸改變數(shù)目/水平樹枝的單位長度。
圖2A-2B顯示了在肺中流感H3抗原的免疫組織化學(xué)檢測。用針對HA血凝素的小鼠單克隆抗體檢測肺組織切片并通過免疫過氧化物酶反應(yīng)檢測結(jié)合(褐色沉淀)。圖2A顯示了來自具有自發(fā)疾病的靈

的支氣管上皮。檢測支氣管上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和呼吸道腔和肺泡腔中巨噬細(xì)胞中的病毒H3抗原。圖2B顯示了用A/canine/Florida/43/2004(H3N8)接種后5天，來自狗的支氣管上皮。在支氣管上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中檢測到病毒H3抗原。比例尺，66μm。
圖3顯示了在死于與流感病毒感染有關(guān)的出血性肺炎的靈

支氣管中特征性組織學(xué)改變。對組織用H&E染色。上圖具有纖毛上皮細(xì)胞、粘液細(xì)胞和基細(xì)胞的正常支氣管。下圖來自患有自發(fā)性流感的靈

的支氣管。支氣管纖毛上皮細(xì)胞有壞死和糜爛。比例尺，100μm。
圖4A-4B顯示了在H3血凝素基因中的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。圖4A顯示了犬科動(dòng)物流感病毒HA基因與同一時(shí)期的和較老的馬HA基因的系統(tǒng)樹。圖4B顯示了犬科動(dòng)物流感病毒HA蛋白質(zhì)與同一時(shí)期的和較老的馬HA基因的系統(tǒng)樹。通過近鄰連接方法從基因或者氨基酸序列推論出系統(tǒng)樹并且顯示了≥80％的自展分析值。條形表示氨基酸改變數(shù)目/水平樹枝的單位長度。
圖5顯示了在死于與流感病毒感染有關(guān)的肺炎的狗的肺中支氣管和支氣管腺的上皮細(xì)胞中流感病毒H3蛋白質(zhì)。上圖支氣管中纖毛上皮細(xì)胞的糜爛。組織用H&E染色。下圖在支氣管(左)和支氣管腺(右)上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中流感病毒H3蛋白質(zhì)。將組織用針對流感病毒H3的單克隆抗體染色，通過免疫過氧化物酶反應(yīng)檢測(褐色沉淀)并用蘇木精復(fù)染。
圖6A-6D顯示了從擴(kuò)增10倍連續(xù)體外稀釋的轉(zhuǎn)錄的RNA標(biāo)準(zhǔn)得到的H3和基質(zhì)基因(圖6A和圖6B)的擴(kuò)增圖。通過起始RNA濃度的對數(shù)值對從每次稀釋得到的閾值循環(huán)數(shù)(Ct)作圖，構(gòu)造H3和基質(zhì)基因(圖6C和圖6D)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖7顯示用10倍連續(xù)稀釋的病毒原種(包括A/Wyoming/3/2003和A/canine/FL/242/2003)測試Directigen Flu A的靈敏性。紫色三角形指示陽性結(jié)果。
序列簡述 SEQ ID NO1是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PB2蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
SEQ ID NO2是SEQ ID NO1編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO3是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PB1蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
SEQ ID NO4是SEQ ID NO3編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO5是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
SEQ ID NO6是SEQ ID NO5編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO7是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NS蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
SEQ ID NO8是SEQ ID NO7編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO9是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NP蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
SEQ ID NO10是SEQ ID NO9編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO11是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
SEQ ID NO12是SEQ ID NO11編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO13是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼MA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
SEQ ID NO14是SEQ ID NO13編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO15是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼HA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Florida/43/04)的核苷酸序列。
SEQ ID NO16是SEQ ID NO15編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO17是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PB2蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
SEQ ID NO18是SEQ ID NO17編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO19是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PB1蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
SEQ ID NO20是SEQ ID NO19編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO21是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
SEQ ID NO22是SEQ ID NO21編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO23是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NS蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
SEQ ID NO24是SEQ ID NO23編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO25是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NP蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
SEQ ID NO26是SEQ ID NO25編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO27是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
SEQ ID NO28是SEQ ID NO27編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO29是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼MA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
SEQ ID NO30是SEQ ID NO29編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO31是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼HA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(FL/242/03)的核苷酸序列。
SEQ ID NO32是SEQ ID NO31編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO33是SEQ ID NO16中顯示的HA蛋白質(zhì)的成熟形式，其中已經(jīng)除去了N-末端16個(gè)氨基酸的信號序列。
SEQ ID NO34是SEQ ID NO32中顯示的HA蛋白質(zhì)的成熟形式，其中已經(jīng)除去了N-末端16個(gè)氨基酸的信號序列。
SEQ ID NO35是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO36是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO37是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO38是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO39是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO40是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO41是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO42是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO43是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO44是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO45是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO46是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO47是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PB2蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO48是SEQ ID NO47編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO49是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PB1蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO50是SEQ ID NO49編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO51是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO52是SEQ ID NO51編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO53是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NS蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO54是SEQ ID NO53編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO55是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NP蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO56是SEQ ID NO55編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO57是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO58是SEQ ID NO57編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO59是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼MA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO60是SEQ ID NO59編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO61是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼HA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Miami/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO62是SEQ ID NO61編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO63是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PB2蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO64是SEQ ID NO63編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO65是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PB1蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO66是SEQ ID NO65編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO67是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼PA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO68是SEQ ID NO67編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO69是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NS蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO70是SEQ ID NO69編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO71是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NP蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO72是SEQ ID NO71編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO73是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼NA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO74是SEQ ID NO73編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO75是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼MA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO76是SEQ ID NO75編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO77是可以根據(jù)本發(fā)明使用的編碼HA蛋白質(zhì)的犬科動(dòng)物流感病毒(Jacksonville/2005)的核苷酸序列。
SEQ ID NO78是SEQ ID NO77編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO79是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO80是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO81是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO82是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO83是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO84是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO85是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO86是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO87是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO88是可以根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸。
發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及分離的流感病毒，其能夠感染犬科動(dòng)物和引起呼吸系統(tǒng)疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的流感病毒包含編碼具有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一個(gè)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或者其功能和/或免疫原性片段或者變體的多核苷酸。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77中任一個(gè)所示的核苷酸序列，或者其片段或者變體。本發(fā)明的流感病毒可以具有H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8和H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16的HA亞型或N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9的NA亞型。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的流感病毒是亞型H3。根據(jù)本文描述的方法，可以從受感染的狗分離病毒并在細(xì)胞或者蛋中培養(yǎng)。在示例的實(shí)施方案中，流感病毒是甲型流感病毒。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的流感病毒的一種或多種基因或者基因組區(qū)段的全部或者部分的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含流感血凝素(HA)基因、神經(jīng)氨酸酶(NA)基因、核蛋白(NP)基因、基質(zhì)蛋白(MA或者M(jìn))基因、聚合酶堿性(PB)蛋白基因、聚合酶酸性(PA)蛋白基因、非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白基因，或者這些基因任一種的功能片段或者變體。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含血凝素(HA)基因或者其功能片段或者變體。在另一實(shí)施方案中，HA基因編碼血凝素蛋白質(zhì)，其與馬H3共有序列的氨基酸序列相比，具有如下一個(gè)或多個(gè)83位的絲氨酸；222位的亮氨酸；328位的蘇氨酸；和/或483位的蘇氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，HA基因編碼具有SEQ ID NO16、32、62或78中所示的氨基酸序列的多肽，或者其功能和/或免疫原性片段或者變體。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，HA基因包含SEQ ID NO15、31、61或77中所示的核苷酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一個(gè)中所示的氨基酸序列的多肽，或者其功能和/或免疫原性片段或者變體。在特定實(shí)施方案中，編碼SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78中所示的氨基酸序列的多核苷酸分別包含SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77中所示的核苷酸序列，或者編碼SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一項(xiàng)的功能和/或免疫原性片段或者變體的序列。從而，本發(fā)明涉及多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一項(xiàng)中所示的核苷酸序列，或者SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一項(xiàng)的片段或者變體，包括簡并變體。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸可以包含SEQ ID NO3的核苷酸1-2271；SEQ ID NO5的核苷酸1-2148；SEQ ID NO7的核苷酸1-657；SEQ ID NO9的核苷酸1-1494；SEQ IDNO11的核苷酸1-1410；SEQ ID NO13的核苷酸1-756；SEQ ID NO15的核苷酸1-1695；SEQ ID NO19的核苷酸1-2271；SEQ ID NO21的核苷酸1-2148；SEQ ID NO23的核苷酸1-657；SEQ ID NO25的核苷酸1-1494；SEQ ID NO29的核苷酸1-756；SEQ ID NO31的核苷酸1-1695；SEQ ID NO47的核苷酸1-2277；SEQ ID NO49的核苷酸1-2271；SEQ IDNO51的核苷酸1-2148；SEQ ID NO53的核苷酸1-690；SEQ ID NO55的核苷酸1-1494；SEQ ID NO57的核苷酸1-1410；SEQ ID NO59的核苷酸1-756；SEQ ID NO61的核苷酸1-1695；SEQ ID NO63的核苷酸1-2277；SEQ ID NO65的核苷酸1-2271；SEQ ID NO67的核苷酸1-2148；SEQ ID NO69的核苷酸1-690；SEQ ID NO71的核苷酸1-1494；SEQ IDNO73的核苷酸1-1410；SEQ ID NO75的核苷酸1-756；和SEQ ID NO77的核苷酸1-1695。在本發(fā)明的范圍內(nèi)預(yù)期的病毒多核苷酸和多肽序列的核苷酸和氨基酸序列已經(jīng)保存在GenBank，檢索號為DQ124147到DQ124161和DQ124190，將其公開引入本文作為參考。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的流感病毒的多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及主題多肽的功能和/或免疫原性片段和變體。預(yù)期的多肽包括本發(fā)明的流感病毒的HA蛋白、NA蛋白、NS蛋白、核蛋白、聚合酶堿性蛋白、聚合酶酸性蛋白，和基質(zhì)蛋白。在一個(gè)示例的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽具有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一項(xiàng)所示的氨基酸序列，或者其功能和/或免疫原性片段或變體。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸序列的多核苷酸表達(dá)構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體包含多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的多肽，或者其功能和/或免疫原性片段或變體。在特定實(shí)施方案中，編碼SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78中所示的氨基酸序列的多核苷酸分別包含SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一個(gè)中所示的核苷酸序列，或者編碼SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一個(gè)的功能和/或免疫原性片段或變體的序列。從而，本發(fā)明涉及包含多核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體，所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一個(gè)中所示的核苷酸序列，或者SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77任一個(gè)的片段或者變體，包括簡并變體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體提供了本發(fā)明的有效連接的多核苷酸的過表達(dá)。
本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體一般包括在預(yù)計(jì)的宿主細(xì)胞中有功能的調(diào)節(jié)元件，在所述宿主細(xì)胞中將表達(dá)該表達(dá)構(gòu)建體。從而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇用于例如人類宿主細(xì)胞、哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞、昆蟲宿主細(xì)胞、酵母宿主細(xì)胞、細(xì)菌宿主細(xì)胞、和植物宿主細(xì)胞的調(diào)節(jié)元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)元件是在犬科動(dòng)物細(xì)胞中有功能的調(diào)節(jié)元件。調(diào)節(jié)元件包括啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列、翻譯終止序列、增強(qiáng)子、和多聚腺苷酸化元件。如本文所用的，術(shù)語“表達(dá)構(gòu)建體”指核酸序列的組合，其提供了有效連接的核酸序列的轉(zhuǎn)錄。如本文所用的，術(shù)語“有效連接”指所述的元件的并列，其中所述元件處于允許它們以它們預(yù)期的方式發(fā)揮功能的關(guān)系中。通常，有效連接的元件為鄰接的關(guān)系。
本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體可以包含有效連接到編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸序列的啟動(dòng)子序列。使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以將啟動(dòng)子摻入多核苷酸中。在本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體中可以使用啟動(dòng)子的多個(gè)拷貝或者多個(gè)啟動(dòng)子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，啟動(dòng)子與表達(dá)構(gòu)建體中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離可以與它與天然遺傳環(huán)境中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離相同。在該距離中允許一定的變化而不實(shí)質(zhì)性降低啟動(dòng)子活性。在表達(dá)構(gòu)建體中通常包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。優(yōu)選地，與本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體結(jié)合的啟動(dòng)子提供了本發(fā)明的有效連接的多核苷酸的過表達(dá)。
與本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體用于真核細(xì)胞中的啟動(dòng)子可以是病毒或者細(xì)菌來源的。病毒啟動(dòng)子包括，但不限于，巨細(xì)胞病毒(CMV)基因啟動(dòng)子、SV40早期或者晚期啟動(dòng)子，或者勞斯肉瘤病毒(RSV)基因啟動(dòng)子。細(xì)胞來源的啟動(dòng)子包括，但不限于，結(jié)蛋白基因啟動(dòng)子和肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子。適于與本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體用于酵母細(xì)胞的啟動(dòng)子包括，但不限于，3-磷酸甘油酸酯激酶啟動(dòng)子、甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、醇脫氫酶-2啟動(dòng)子，和己糖激酶啟動(dòng)子。
如果在植物細(xì)胞中提供或者向植物細(xì)胞中導(dǎo)入表達(dá)構(gòu)建體，那么可以使用植物病毒啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CaMV)35S(包括增強(qiáng)的CaMV35S啟動(dòng)子(見，例如，美國專利號5,106,739和An，1997))或者CaMV 19S啟動(dòng)子?？梢杂糜谥参镏斜磉_(dá)構(gòu)建體的其他啟動(dòng)子包括，例如，prolifera啟動(dòng)子、Ap3啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子、根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)的T-DNA1′-或2′-啟動(dòng)子、多聚半乳糖醛酸酶啟動(dòng)子、來自牽?；ǖ牟槎厦窤(CHS-A)啟動(dòng)子、煙草PR-1a啟動(dòng)子、泛蛋白啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、alcA基因啟動(dòng)子、pin2啟動(dòng)子(Xu et al.，1993)、玉米WipI啟動(dòng)子、玉米trpA基因啟動(dòng)子(美國專利號5,625,136)、玉米CDPK基因啟動(dòng)子、和RUBISCO SSU啟動(dòng)子(美國專利號5,034,322)。根特異的啟動(dòng)子，如美國專利號6,455,760或美國專利號6,696,623或公布的美國專利申請?zhí)?0040078841；20040067506；20040019934；20030177536；20030084486；或20040123349中描述的任一種啟動(dòng)子序列可以用于本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體。組成性啟動(dòng)子(如CaMV、泛蛋白、肌動(dòng)蛋白或者NOS啟動(dòng)子)、發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(如可以通過熱、光、激素或者化學(xué)品誘導(dǎo)的那些啟動(dòng)子)也預(yù)期用于本發(fā)明的多核苷酸表達(dá)構(gòu)建體。也可以使用組織特異性啟動(dòng)子，例如，果實(shí)特異性啟動(dòng)子，如番茄的E8啟動(dòng)子(檢索號AF515784；Good et al.(1994))。也可以使用種子特異性啟動(dòng)子，如來自β-菜豆蛋白基因(例如，菜豆的)或者大豆球蛋白基因(例如，大豆的)的啟動(dòng)子，和其他啟動(dòng)子。
對于在原核系統(tǒng)中表達(dá)，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體可以包含啟動(dòng)子，如堿性磷酸酶啟動(dòng)子、色氨酸(trp)啟動(dòng)子、λPL啟動(dòng)子、β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子、乳糖啟動(dòng)子、phoA啟動(dòng)子、T3啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、或者tac啟動(dòng)子(de Boeret al.，1983)。
本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體可以任選含有轉(zhuǎn)錄終止序列、翻譯終止序列、編碼信號肽的序列，和/或增強(qiáng)子元件。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)可以通常從真核生物或者病毒基因序列的3’非翻譯區(qū)得到。轉(zhuǎn)錄終止序列可以位于編碼區(qū)的下游以提供有效終止。信號肽序列是通常存在于蛋白質(zhì)的氨基末端的短氨基酸序列，其負(fù)責(zé)有效連接的成熟多肽重定位到多種不同的翻譯后細(xì)胞目的地，從特定細(xì)胞器隔室到蛋白質(zhì)作用部位和細(xì)胞外環(huán)境。通過使用有效連接的信號肽序列將基因產(chǎn)物靶向預(yù)期的細(xì)胞和/或細(xì)胞外目的地預(yù)期用于本發(fā)明的多肽。典型的增強(qiáng)子是順式作用元件，其增加基因轉(zhuǎn)錄并且可以包括在表達(dá)構(gòu)建體中。典型的增強(qiáng)子元件是本領(lǐng)域中已知的，并且包括，但不限于，CaMV 35S增強(qiáng)子元件、巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件，和SV40增強(qiáng)子元件。增強(qiáng)基因表達(dá)的內(nèi)含子介導(dǎo)的增強(qiáng)子元件也是本領(lǐng)域中已知的。這些元件必須存在于轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)并且是方向依賴性的。
指導(dǎo)從表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的mRNA的多聚腺苷酸化的DNA序列也可以包括在表達(dá)構(gòu)建體中，并且包括，但不限于，章魚堿合酶或者胭脂氨酸合酶信號。
表達(dá)構(gòu)建體還可以包括一種或多種顯性選擇標(biāo)記基因，包括，例如，編碼抗生素抗性和/或除草劑抗性用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因?？股乜剐曰蚩梢蕴峁σ环N或多種下面的抗生素的抗性潮霉素、卡那霉素、博來霉素、G418、鏈霉素、巴龍霉素、新霉素和大觀霉素。通過新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT II)可以提供卡那霉素抗性。除草劑抗性基因可以提供對膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶或者草甘膦的抗性。用于細(xì)胞轉(zhuǎn)化篩選的其他標(biāo)記包括，但不限于，編碼β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、胭脂氨酸合成酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、綠色熒光蛋白(GFP)或者增強(qiáng)的GFP的基因(Yang et al.，1996)。
本發(fā)明還涉及包含編碼本發(fā)明多肽的本發(fā)明的多核苷酸序列的多核苷酸載體?？梢栽诒景l(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體或者多核苷酸的5’和3’末端包括獨(dú)特的限制酶位點(diǎn)以允許插入到多核苷酸載體中。如本文所用的，術(shù)語“載體”指任一遺傳元件，包括例如，質(zhì)粒、粘粒、染色體、噬菌體、病毒等等，其當(dāng)與適當(dāng)?shù)目刂圃Y(jié)合時(shí)能夠復(fù)制并且可以在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移多核苷酸序列。載體含有允許載體在所選的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核苷酸序列。許多載體可以用于表達(dá)和/或克隆，并且包括，但不限于，pBR322、pUC系列、M13系列、pGEM系列、和pBLUESCRIPT載體(Stratagene，La Jolla，CAand Promega，Madison，WI)。
本發(fā)明還涉及寡核苷酸探針和引物，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物，其可以與本發(fā)明多核苷酸的編碼或非編碼序列雜交。本發(fā)明的寡核苷酸探針可以用于檢測流感病毒核酸序列的方法中。本發(fā)明的寡核苷酸引物可以用于PCR方法和涉及核酸擴(kuò)增的其他方法中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的探針或引物可以與本發(fā)明的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交。本發(fā)明的探針和引物可以任選包含檢測標(biāo)記或者報(bào)道分子，如熒光分子、酶、放射性部分，等等。本發(fā)明的探針和引物對于使用它們的方法或測定法可以是任何合適的長度。通常，本發(fā)明的探針和引物將長為10到500個(gè)或者更多核苷酸。在本發(fā)明的范圍內(nèi)預(yù)期長為10到20、21到30、31到40、41到50、51到60、61到70、71到80、81到90、91到100或101個(gè)或更多核苷酸的探針和引物。在一個(gè)實(shí)施方案中，探針和引物長為9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸的任一個(gè)。本發(fā)明的探針和引物可以與所述多核苷酸序列具有完全(100％)的核苷酸序列同一性，或者序列同一性可以小于100％。例如，探針或引物和序列之間的序列同一性可以為99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％或者任一其他百分?jǐn)?shù)序列同一性，只要該探針或引物可以在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的多核苷酸的核苷酸序列雜交。本發(fā)明的示例的探針和引物包括具有SEQ ID NO35、SEQ ID NO36、SEQID NO37、SEQ ID NO38、SEQ ID NO39、SEQ ID NO40、SEQ ID NO41、SEQ ID NO42、SEQ ID NO43、SEQ ID NO44、SEQ ID NO45和SEQ ID NO46的任一個(gè)中所示的核苷酸序列，或者SEQ ID NO35-46的任一個(gè)的功能片段或者變體的那些探針和引物。
如本文所用的，術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”指單鏈或者雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或者混合的脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，將包括天然核苷酸的已知的類似物，其可以以類似于天然存在的核苷酸的方式發(fā)揮功能。多核苷酸序列包括可以轉(zhuǎn)錄成RNA的DNA鏈序列和可以翻譯成蛋白質(zhì)的RNA鏈。本發(fā)明的任一核酸、多核苷酸或者寡核苷酸的互補(bǔ)序列也預(yù)期在本發(fā)明的范圍內(nèi)。多核苷酸序列還包括全長序列以及衍生自全長序列的較短的序列。本發(fā)明還包括序列與本文公開的多核苷酸互補(bǔ)的那些多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸和多肽可以以純化或者分離的形式提供。
因?yàn)檫z傳密碼的簡并性，多種不同的多核苷酸序列可以編碼本發(fā)明的多肽。在Lewin(1985)中描述了顯示所有可能的三聯(lián)體密碼子(并且其中U也代表T)和每個(gè)密碼子編碼的氨基酸的表格。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠產(chǎn)生編碼與本發(fā)明的多肽相同或者基本相同的多肽的備選的多核苷酸序列。這些簡并變體和備選多核苷酸序列在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文使用的，對“基本上相同”的序列的引用指編碼氨基酸替代、缺失、添加或者插入的序列，其不實(shí)質(zhì)上改變本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽的功能和/或免疫原性活性。
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的本發(fā)明的多核苷酸的變體。變體序列包括那些序列，其中該序列的一個(gè)或多個(gè)核苷酸已經(jīng)被替代、缺失和/或插入?？梢蕴娲鶧NA的天然核苷酸的核苷酸具有堿基部分，其可以包括，但不限于，次黃苷、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、次黃嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、5-甲基胞嘧啶，和三苯甲基化堿基。序列中核苷酸的糖部分還可以是經(jīng)修飾的并且包括，但不限于，阿拉伯糖、木酮糖和己糖。此外，可以用乙?；?、甲基和/或硫代基團(tuán)修飾核苷酸的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶堿基。使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以制備和測試含有核苷酸替代、缺失、和/或插入的序列。
本發(fā)明的范圍內(nèi)還預(yù)期與本發(fā)明的多肽中那些特別示例或者天然存在的氨基酸不同的氨基酸替代。例如，非天然氨基酸可以替代多肽的氨基酸，只要具有替代氨基酸的多肽基本上保留與沒有替代的氨基酸的多肽相同的功能活性。非天然氨基酸的實(shí)例包括，但不限于，鳥氨酸、瓜氨酸、羥脯氨酸、高絲氨酸、苯基甘氨酸、?；撬?、碘代酪氨酸、2，4-二氨基丁酸、α-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸、6-氨基己酸、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、正亮氨酸、正纈氨酸、肌氨酸、高瓜氨酸、半胱磺酸、τ-丁基甘氨酸、τ-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟-氨基酸、設(shè)計(jì)者氨基酸，如β-甲基氨基酸、C-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸、和一般的氨基酸類似物。非天然氨基酸還包括具有衍生的側(cè)基的氨基酸。此外，蛋白質(zhì)中的任一氨基酸可以為D(右旋)型或者L(左旋)型。本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括本發(fā)明多肽的蛋白質(zhì)序列的等位基因變體。
氨基酸可以一般以下面的類別分類非極性的、不帶電的極性的、堿性的和酸性的。保守替代(其中具有一個(gè)類別氨基酸的本發(fā)明的多肽用相同類別的另一氨基酸替代)落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要具有替代的多肽仍然保留與不具有該替代的多肽基本上相同的功能活性。編碼序列中具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代的多肽的多核苷酸包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。下面的表11提供了屬于每個(gè)類別的氨基酸的實(shí)例列表。在表12中定義了單字母氨基酸縮寫。
使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法可以產(chǎn)生本發(fā)明的流感病毒多肽的片段和變體并且使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測試功能或者免疫原性的存在。例如，為了測試本發(fā)明的神經(jīng)氨酸酶多肽的片段和/或變體，可以測定酶促活性。從而，普通技術(shù)人員可以容易制備和測試本發(fā)明多肽的片段和變體，并確定該片段或變體是否相對于全長或者非變異多肽保持活性。
本發(fā)明范圍內(nèi)預(yù)期的多核苷酸和多肽也可以按照與本文特別示例的本發(fā)明的那些序列的更具體的同一性和/或相似性范圍定義。序列同一性將通常大于60％，優(yōu)選大于75％，更優(yōu)選大于80％，甚至更優(yōu)選大于90％，并且可以大于95％。與本文示例的序列相比，序列的同一性和/或相似性可以為49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。除非另外指出，如本文使用的，兩個(gè)序列的百分比序列同一性和/或相似性可以使用Karlin和Altschul(1990)的，如在Karlin和Altschul(1993)中改進(jìn)的算法確定。這種算法整合到Altschul et al.(1990)的NBLAST和XBLAST程序中?？梢杂肗BLAST程序，得分＝100，字長＝12進(jìn)行BLAST搜索，以得到具有所希望的百分比序列同一性的序列。為了得到用于比較目的的缺口比對，可以使用如Altschul et al.(1997)的Gapped BLAST。當(dāng)利用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，可以使用各自程序(NBLAST和XBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。見NCBI/NIH網(wǎng)站。
本發(fā)明還預(yù)期這樣的多核苷酸分子，其具有與本文示例的多核苷酸序列足夠同源的序列，從而允許與該序列在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)格條件和標(biāo)準(zhǔn)方法(Maniatis et al.，1982)下雜交。如本文使用的，雜交的“嚴(yán)格”條件指這樣的條件，其中通常在6x SSPE，5x Denhardt溶液，0.1％SDS，0.1mg/ml變性DNA中低于DNA雜交分子的解鏈溫度(Tm)20-25℃下過夜進(jìn)行。通過下面的公式描述解鏈溫度Tm(Beltz et al.，1983) Tm＝81.5C+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-600/雙鏈體長度(以堿基對計(jì))。
通常如下進(jìn)行洗滌 (1)在1x SSPE，0.1％SDS中室溫下洗滌兩次，每次15分鐘(低嚴(yán)格洗滌)。
(2)在0.2x SSPE，0.1％SDS中Tm-20℃下洗滌一次15分鐘(中等嚴(yán)格洗滌)。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的流感病毒的基因編碼的病毒蛋白質(zhì)和肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒蛋白是成熟HA蛋白。在特定實(shí)施方案中，成熟的HA蛋白包含下面的一個(gè)或多個(gè)82位的絲氨酸；221位的亮氨酸；327位的蘇氨酸；和/或482位的蘇氨酸。在示例的實(shí)施方案中，成熟的HA蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO33或SEQ ID NO34中所示的氨基酸序列，或者SEQ IDNO33或SEQ ID NO34的功能和/或免疫原性片段或變體。在另一實(shí)施方案中，病毒蛋白是NA蛋白、NS蛋白、PB蛋白、PA蛋白、或者M(jìn)A蛋白。本發(fā)明的病毒蛋白質(zhì)和肽可以用于產(chǎn)生特異結(jié)合所述蛋白質(zhì)或肽的抗體。本發(fā)明的病毒蛋白質(zhì)和肽還可以用作疫苗組合物中的免疫原。
本發(fā)明還涉及用于誘導(dǎo)針對流感病毒的免疫應(yīng)答的組合物和方法，所述流感病毒能夠感染易感的宿主動(dòng)物和引起呼吸系統(tǒng)疾病。本發(fā)明可以用于在易感的宿主動(dòng)物中誘導(dǎo)針對任一亞型的流感病毒的免疫應(yīng)答。例如，流感病毒可以是H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16的HA亞型，和N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9的NA亞型。在一個(gè)實(shí)施方案中，HA亞型是H3或者H5。在另一實(shí)施方案中，NA亞型是N7或者N8。在特定實(shí)施方案中，誘導(dǎo)針對亞型H3N8的流感病毒的免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主動(dòng)物是犬科動(dòng)物。犬科動(dòng)物包括野生的、動(dòng)物園的和馴養(yǎng)的犬科動(dòng)物，如狼、郊狼和狐貍。犬科動(dòng)物還包括狗，尤其馴養(yǎng)的狗，如純種和/或雜種陪伴狗、表演狗、役用狗、放牧狗、獵狗、守衛(wèi)狗、警犬、賽犬和/或?qū)嶒?yàn)用狗。在特定實(shí)施方案中，宿主動(dòng)物是馴養(yǎng)的狗，如靈

。在一個(gè)實(shí)施方案中，對動(dòng)物施用有效量的本發(fā)明的免疫原性組合物，其足以誘導(dǎo)針對本發(fā)明的流感病毒的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以是體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。在特定實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是保護(hù)性免疫應(yīng)答，其能夠在免疫后在一定的時(shí)間段內(nèi)預(yù)防或者減小受免疫的宿主動(dòng)物中的病毒感染。從而，本發(fā)明還涉及疫苗組合物和方法，其為接種的動(dòng)物提供了針對本發(fā)明病毒的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
如本文所用的，本發(fā)明的疫苗或者免疫原性組合物可以包含無細(xì)胞的完整病毒，包括減毒的或者失活的病毒，或者病毒的部分，包括亞病毒顆粒(包括“分離疫苗”，其中處理病毒體以除去一些或者全部病毒脂類)、病毒蛋白質(zhì)(包括個(gè)體蛋白質(zhì)和多種蛋白質(zhì)的大分子復(fù)合體)、多肽、和肽，以及病毒感染的細(xì)胞系，或者這些任一種的組合。包含病毒感染的細(xì)胞系的疫苗或者免疫原性組合物可以包含多種細(xì)胞系，每種用不同的病毒毒株感染。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以用用一種或多種滅活的(例如，殺死的)和/或活的減毒流感病毒疫苗或者包含來自一種或多種病毒隔離群的一種或多種流感病毒抗原的疫苗免疫犬科動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，流感病毒是馬流感病毒。在另一實(shí)施方案中，流感病毒是馬流感病毒，其編碼或表達(dá)與犬科動(dòng)物流感病毒多肽具有至少約90％，或者至少約95％，或至少約96％、或97％、或98％、或99％或更高氨基酸序列同一性的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明疫苗中的流感抗原與犬科動(dòng)物流感病毒的HA抗原和/或NA抗原具有至少約96％序列同一性。
滅活疫苗的一個(gè)實(shí)例是EQUICINE IITM，其已經(jīng)由Intervet Inc.(Millsboro，DE，USA)作為液體疫苗上市。EQUICINE IITM含有滅活的A/Pennsylvania/63流感病毒(″A/Pa/63″)和A/equine/Kentucky/93流感病毒(″A/KY/93″)與卡波姆(carbopol)(即

(Intervet Inc.))。更具體地，一劑EQUICINE IITM含有106.0EID50滅活的A/Pa/63、106.7 EID50滅活的A/KY/93、0.25％體積的卡波姆，和足夠產(chǎn)生總體積1ml的PBS。
滅活疫苗的另一實(shí)例是馬流感病毒A/equine/Ohio/03(″Ohio 03″)。在一些實(shí)施方案中，這種疫苗含有CARBIGENTM，其是可以通過商業(yè)途徑從MVP Laboratories，Inc.(Ralston，NE)得到的乳化的基于聚合物的佐劑。在這種疫苗中，劑量單位通常包含至少約250HA單位病毒、約250到約12,500HA單位病毒，或約1000到約6200HA單位病毒。CARBIGENTM的推薦濃度為約5到約30％(按質(zhì)量計(jì))。
活的減毒疫苗的一個(gè)實(shí)例是凍干疫苗形式的改性的活的equine/Kentucky/91(″A/KY/91″)流感，其可以用水重構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，用足夠?qū)⒁呙鐒┝窟_(dá)到1ml總體積的疫苗級水進(jìn)行重構(gòu)。此類疫苗的方面在例如美國專利號6,436,408；6,398,774；和6,177,082中討論，將它們完整引入本專利作為參考。當(dāng)重構(gòu)時(shí)，這種疫苗的一個(gè)劑量可以例如含有每毫升107.2TCID50的A/KY/91、每毫升0.015克N-Z AMINE ASTM、每毫升0.0025克明膠，和每毫升0.04克D乳糖。N-Z AMINE ASTM是通過酪蛋白的酶促水解產(chǎn)生的氨基酸和肽的精制來源。N-Z AMINE ASTM由Kerry Bio-Science(Norwich，NY，USA)上市。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，疫苗包含在HA編碼序列中與Florida/43/2004具有至少約93％同源性的H3流感抗原，例如equine/New Market/79毒株。優(yōu)選的同源性為至少約96％，例如，equine/Alaska/1/91和equine/Santiago/85毒株。在下面的實(shí)施例中，將equine/Kentucky/91、equine-2/Kentucky/93、equine-1/Pennsylvania/63和equine Ohio/03流感抗原摻入疫苗中。優(yōu)選的疫苗還包括包含equine/Wisconsin/03、equine/Kentucky/02、equine/Kentucky/93和equine/New Market 2/93的疫苗。在下面的實(shí)施例中，使用H3N8病毒。然而，認(rèn)為根據(jù)本發(fā)明也可以使用其他H3流感病毒。
可以通過常規(guī)手段制備活的減毒疫苗。此類手段一般包括例如，通過體外傳代改變致病毒株、冷適應(yīng)、通過遺傳操作改變生物的致病性、制備嵌合體、在病毒載體中插入抗原、選擇無毒性野生型毒株，等等。
在一些實(shí)施方案中，通過細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物、非宿主動(dòng)物或者卵進(jìn)行野生型病毒的連續(xù)傳代得到活的減毒病毒毒株。在此類傳代中基因突變的積累通常導(dǎo)致生物對最初宿主的毒性的不斷喪失。
在一些實(shí)施方案中，通過用減毒的突變病毒和致病病毒共同感染允許細(xì)胞制備活的減毒病毒毒株。期望的所得重組病毒具有減毒病毒的安全性和編碼來自致病病毒的保護(hù)性抗原的基因。
在一些實(shí)施方案中，通過冷適應(yīng)制備活的減毒病毒毒株。冷適應(yīng)的病毒具有僅在上呼吸道中發(fā)現(xiàn)的溫度下復(fù)制的優(yōu)點(diǎn)。產(chǎn)生冷適應(yīng)馬流感病毒的方法已經(jīng)在美國專利號6,177,082中描述。期望的所得冷適應(yīng)病毒賦予一種或多種下面的表型冷適應(yīng)、溫度敏感性、顯性干涉，和/或減毒。
在一些實(shí)施方案中，通過分子手段制備活的減毒病毒毒株，如點(diǎn)突變、缺失、或插入以將致病病毒轉(zhuǎn)化為與最初病毒相比不致病或者致病性降低的病毒，而保留最初病毒的保護(hù)性質(zhì)。
在一些實(shí)施方案中，通過將保護(hù)性抗原的候選基因克隆到非致病性或致病性降低的病毒或其他生物的基因組中制備活的減毒病毒。
使用常規(guī)方法失活病毒可以制備失活的(如，“殺死的”)病毒疫苗。通常，此類病毒包括可以增強(qiáng)免疫應(yīng)答的賦形劑，以及疫苗中常規(guī)使用的其他賦形劑。例如，在下面的實(shí)施例中，EQUICINE IITM包含

通過用滅活化學(xué)品(例如，福爾馬林、β丙內(nèi)酯(″BPL″)、溴乙胺(″BEA″)、和二元氮丙啶(″BEI″))處理病毒或者通過非化學(xué)方法(例如，熱、凍/融或聲處理)使得病毒不能復(fù)制來完成病毒的滅活。
在下面的實(shí)施例中，用equine/Ohio/03用作攻擊病毒。已知其與Florida/43/04隔離群具有約99％同源性，并且表明在狗中誘導(dǎo)感染癥狀和血清轉(zhuǎn)變。實(shí)施例18闡明了馬流感疫苗在狗中的功效，顯示了在用包含CARBIGENTM佐劑的疫苗組合物中滅活的Ohio 03抗原接種的狗中血凝抑制(或″HI″或″HAI″)效價(jià)。表29顯示了接種前、接種后和二次接種后，以及攻擊后的效價(jià)。結(jié)果顯示了接種的狗的接種后每個(gè)階段的HI效價(jià)，對于對照有很小的或者沒有增加。表30闡明了來自相同研究的臨床病征、病毒分離和組織病理學(xué)結(jié)果。盡管被攻擊的動(dòng)物不顯示出臨床病征、病毒脫落，或者陽性組織病理學(xué)，但是陽性HI效價(jià)(表29)表明在經(jīng)免疫的動(dòng)物中顯著的抗體效價(jià)。
應(yīng)該指出本發(fā)明也包括其他H3流感病毒抗原疫苗。提供本說明書中描述的實(shí)施例和下面的實(shí)施例來闡明本發(fā)明的和它的優(yōu)選實(shí)施方案，并且它們不限制要求保護(hù)的發(fā)明的范圍。
還應(yīng)該指出根據(jù)本發(fā)明可以使用不同于H3流感病毒抗原的流感抗原。此類抗原包括例如，來自equine/PA/63的那些抗原，其是馬A1亞型(H7N7)。預(yù)期一種或多種此類此類抗原可以與或不與一種或多種H3流感抗原使用。
通常，以治療有效量施用疫苗。“治療有效量”是足夠在犬科動(dòng)物患者中誘導(dǎo)針對靶抗原的保護(hù)應(yīng)答的量。通常，如果劑量防止流感或其一種或多種(通常兩種或多種)癥狀、延遲其發(fā)作、減少其擴(kuò)散、使其減輕、抑制或消除，那么所述劑量是“治療有效的”。典型的流感癥狀包括例如，發(fā)熱(對于狗，通常≥103.0°F；≥39.4℃)、咳嗽、打噴嚏、組織病理學(xué)病變、眼分泌物、鼻分泌物、嘔吐、腹瀉、抑郁、體重減輕、作嘔、咯血、和/或聽得見的啰音。其他通常更嚴(yán)重的癥狀可以包括例如，肺、縱隔、或胸膜腔中出血；氣管炎；支氣管炎；毛細(xì)支氣管炎；支持性支氣管肺炎；和/或肺的上皮層和氣管腔中嗜中性粒細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞滲入。
疫苗可以作為組合療法的部分施用，組合療法即包括疫苗自身外，還包括施用一種或多種額外的活性劑、佐劑、療法等等的療法。在該情況中，應(yīng)該認(rèn)識到如果將僅僅施用疫苗，那么構(gòu)成“治療有效”量的疫苗的量可以小于將構(gòu)成“治療有效”量的疫苗的量。其他療法可以包括本領(lǐng)域中已知的那些，如抗病毒藥療法、鎮(zhèn)痛劑、退熱藥療法、祛痰藥、抗炎藥物、抗組胺藥、治療流感病毒感染引起的細(xì)菌感染的抗生素、休息，和/或施用液體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗與博德特氏菌疫苗、腺病毒疫苗和/或副流感病毒疫苗組合施用。
在一些實(shí)施方案中，例如，活的減毒疫苗的典型劑量為至少約103pfu/犬科動(dòng)物，更典型地約103到約109pfu/犬科動(dòng)物。在本專利中，“pfu”指“噬斑形成單位”。在一些實(shí)施方案中，活的減毒疫苗的典型劑量為至少約103TCID50/犬科動(dòng)物，更典型地約103到約109TCID50/犬科動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，活的減毒疫苗的典型劑量為至少約103EID50/犬科動(dòng)物，更典型的約103到約109EID50/犬科動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，被殺死的疫苗的典型劑量為至少約40HA單位，通常約40到約10,000HA單位，更通常為約500到約6200HA單位。在一些實(shí)施方案中，劑量為約6100到約6200HA單位。
在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，疫苗包含活的減毒疫苗，其濃度比免疫原性水平高至少約100.5pfu/犬科動(dòng)物。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，疫苗包含活的減毒疫苗，其濃度比免疫原性水平高至少約100.5TCID50/犬科動(dòng)物。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，疫苗包含活的減毒疫苗，其濃度比免疫原性水平高至少約100.5EID50/犬科動(dòng)物。
通過本領(lǐng)域公知的攻擊劑量滴定研究技術(shù)可以通過實(shí)驗(yàn)確定免疫原性水平。此類技術(shù)通常包括用不同劑量的疫苗接種許多犬科動(dòng)物，然后用毒性病毒攻擊所述犬科動(dòng)物以確定最小保護(hù)劑量。
影響優(yōu)選劑量方案的因素可以包括例如，受試者的類型(例如，物種和品種)、年齡、體重、性別、飲食、活動(dòng)、肺大小和狀況；施用途徑；使用的具體疫苗的功效、安全性，和免疫力持續(xù)時(shí)間分布；是否使用遞送系統(tǒng)；和疫苗是否作為藥物和/或疫苗組合的部分施用。從而，使用的實(shí)際劑量可以對于特定動(dòng)物不同，并且因此，可以偏離上面給出的典型劑量。使用常規(guī)手段，確定此類劑量調(diào)整在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力之內(nèi)。還應(yīng)該指出活的減毒病毒通常能夠自身增殖；從而，施用的此類病毒的特定量不一定是關(guān)鍵的。
設(shè)想疫苗可以一次施用于犬科動(dòng)物患者；或者備選地，在幾天、幾周、幾個(gè)月或幾年內(nèi)兩次或多次施用。在一些實(shí)施方案中，施用疫苗至少兩次。在一些此類實(shí)施方案中，例如，施用疫苗兩次，第二次劑量(例如，加強(qiáng)劑量)在第一次劑量后至少約2周施用。在一些實(shí)施方案中，施用疫苗兩次，第二次劑量在第一次劑量后不大于約2周施用。在一些實(shí)施方案中，第二次劑量在第一次劑量后約2周到約4年施用、第一次劑量后約2到約8周、或第一次劑量后約3到約4周施用。在一些實(shí)施方案中，第二次劑量在第一次劑量后約4周施用。在上面的實(shí)施方案中，第一次和隨后的劑量例如可以改變量和/或形式。然而，通常，劑量是相同的量和形式。當(dāng)僅僅施用一次劑量時(shí)，該單次劑量中疫苗的量通常包含治療有效量的疫苗。然而，當(dāng)施用一次以上的劑量時(shí)，那些劑量中疫苗的量可以一起構(gòu)成治療有效量。
在一些實(shí)施方案中，在流感感染犬科動(dòng)物受者之前施用疫苗。在此類實(shí)施方案中，例如，可以施用疫苗以預(yù)防、降低危險(xiǎn)或延遲流感發(fā)作或其一種或多種(通常兩種或多種)流感癥狀。
在一些實(shí)施方案中，在流感感染犬科動(dòng)物受者后施用疫苗。在此類實(shí)施方案中，例如，疫苗可以減輕、抑制或消除流感或一種或多種(通常兩種或多種)流感癥狀。
疫苗的優(yōu)選組成取決于例如，疫苗是否是滅活的疫苗、活的減毒疫苗還是兩者。它還取決于施用疫苗的方法。設(shè)想疫苗將包含一種或多種常規(guī)的可藥用載體、佐劑、其他免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑、和/或載體(總稱為“賦形劑”)。通常選擇此類賦形劑以與疫苗中的活性成分相容。賦形劑的用途是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
術(shù)語“可藥用的”以形容詞用于指修飾的名詞適于用于藥品中。當(dāng)它用于例如描述藥物疫苗中的賦形劑時(shí)，它表征該賦形劑與組合物中的其他成分是相容的并且不會(huì)不利地?fù)p害預(yù)期的受者犬科動(dòng)物。
可以通過常規(guī)方法施用疫苗，所述方法包括例如，粘膜途徑(如鼻內(nèi)、經(jīng)口、氣管內(nèi)和眼)，和腸胃外施用。粘膜施用對于活的減毒疫苗是尤其有利的。腸胃外施用對于滅活疫苗尤其有利。
粘膜疫苗可以是例如液體劑型，如可藥用的乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑和酏劑。適于此類疫苗的賦形劑包括例如，常用于本領(lǐng)域中的惰性稀釋劑，如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖、淀粉粉末、鏈烷酸的纖維素酯、纖維素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸和硫酸的鈉和鈣鹽、明膠、阿拉伯膠、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮，和/或聚乙烯醇。賦形劑還可以包含多種濕潤劑、乳化劑、懸浮劑、調(diào)味劑(例如，增甜)和/或芳香劑。
經(jīng)口粘膜疫苗可以例如被壓片或包膠以方便施用。此類膠囊劑或片劑可以含有控釋制劑。對于膠囊劑、片劑和丸劑的情況，劑型還可以含有緩沖劑，如檸檬酸鈉，或碳酸鎂或鈣或碳酸氫鎂或鈣。還可以用腸包衣制備片劑和丸劑。
設(shè)想可以通過犬科動(dòng)物患者的飲用水和/或食物施用疫苗。還設(shè)想可以以膳食(treat)或玩具的形式施用疫苗。
“腸胃外施用”包括皮下注射、粘膜下層注射、靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、胸骨內(nèi)注射、經(jīng)皮注射、和灌注?？勺⑸涞闹苿?例如，無菌可注射的水性或油性混懸劑)可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的用合適的賦形劑配制，所述賦形劑為如載體、溶劑、分散劑、濕潤劑、乳化劑和/或懸浮劑。這些通常包括例如，水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苯甲醇、1，3-丁二醇、林格液、等滲氯化鈉溶液、溫和的不揮發(fā)油(例如，合成的甘油一酯或二酯)、脂肪酸(例如，油酸)、二甲基乙酰胺、表面活性劑(例如，離子和非離子去污劑)、丙二醇，和/或聚乙二醇。賦形劑還可以包括少量的其他輔助物質(zhì)，如pH緩沖劑。
疫苗可以包括增強(qiáng)犬科動(dòng)物患者免疫應(yīng)答(其可以包括抗體應(yīng)答、細(xì)胞應(yīng)答或兩者)，從而增強(qiáng)疫苗有效性的一種或多種賦形劑。此類賦形劑(或“佐劑”)的使用在使用滅活疫苗時(shí)可以尤其有益。佐劑可以是對犬科動(dòng)物患者免疫系統(tǒng)的細(xì)胞具有直接影響的物質(zhì)(例如，細(xì)胞因子或卡介苗(“BCG”))或間接影響的物質(zhì)(脂質(zhì)體)。通常合適的佐劑的實(shí)例包括油(例如，礦物油)、金屬鹽(例如，氫氧化鋁或磷酸鋁)、細(xì)菌組分(例如，細(xì)菌脂多糖、弗氏佐劑，和/或MDP)、植物組分(例如，QuilA)，和/或一種或多種具有載體作用的物質(zhì)(例如，皂土、乳膠顆粒、脂質(zhì)體，和/或Quil A、ISCOM)。如上面提到的，佐劑還包括例如CARBIGENTM和卡波姆。應(yīng)該認(rèn)識到本發(fā)明包括包含佐劑的疫苗以及不包含任何佐劑的疫苗。
設(shè)想為了保存可以將疫苗凍干(或者減少液體體積)，然后在施用之前或施用時(shí)用液體重構(gòu)。此類重構(gòu)可以用如疫苗級水實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明還包括適于用于進(jìn)行上述方法的藥盒。藥盒包含含有上述疫苗的劑型。藥盒還包含至少一種額外的組分，和通常，關(guān)于使用該疫苗和額外組分的說明書。所述額外組分可以是例如，一種或多種額外成份(如一種或多種上面討論的賦形劑、食品，和/或膳食(treat))，其可以在施用前或施用期間與疫苗混合。額外組分可以備選(或額外)包含用于對犬科動(dòng)物患者施用疫苗的一種或多種裝置。此類裝置可以是例如，注射器、吸入器霧化器、吸管、鑷子，或任何醫(yī)學(xué)上可接受的遞送載體。在一些實(shí)施方案中，所述裝置適于皮下施用疫苗。在一些實(shí)施方案中，所述裝置適于鼻內(nèi)施用疫苗。
也可以使用藥學(xué)或生物領(lǐng)域中已知的其他賦形劑和施用方式。
本發(fā)明的疫苗或者免疫原性組合物還包含重組的基于病毒載體的構(gòu)建體，其可以包含例如編碼本發(fā)明的流感病毒的HA蛋白、NA蛋白、核蛋白、聚合酶堿性蛋白、聚合酶酸性蛋白，和/或基質(zhì)蛋白的基因。可以用于制備重組載體/病毒構(gòu)建體的任何合適的病毒載體預(yù)期用于本發(fā)明。例如，來自腺病毒、禽痘、皰疹病毒、牛痘、金絲雀痘、昆蟲痘、豬痘、西尼羅病毒和本領(lǐng)域已知的其他病毒的病毒載體可以用于本發(fā)明的組合物和方法中?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)遺傳工程技術(shù)構(gòu)建編碼和表達(dá)組分的重組多核苷酸載體。此外，本文描述的多種疫苗組合物可以單獨(dú)使用和相互組合使用。例如，動(dòng)物的初次免疫可以使用重組的基于載體的構(gòu)建體，其具有單個(gè)或者多個(gè)毒株組分，然后用包含失活病毒或者失活的病毒感染的細(xì)胞系的疫苗組合物二次加強(qiáng)。使用本發(fā)明的疫苗組合物的其他免疫方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的并且預(yù)計(jì)在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明還涉及重排列病毒，其包含本發(fā)明的流感病毒的至少一種基因或者基因組區(qū)段和來自本發(fā)明的不同的流感病毒或者來自不同于本發(fā)明病毒的流感病毒的病毒基因或者基因組區(qū)段的剩余部分。通過本發(fā)明的供體流感病毒的核酸與受體流感病毒的核酸的遺傳重排列，然后選擇包含供體病毒的核酸的重排列病毒，可以產(chǎn)生重排列病毒。產(chǎn)生和分離重排列病毒的方法是本領(lǐng)域中公知的(Fields et al.，1996)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重排列病毒包含人類、鳥類、豬或者馬流感病毒的基因或者基因組區(qū)段。本發(fā)明的重排列病毒可以包括來自供體和受體流感病毒的核酸的任一組合，只要重排列病毒包含來自本發(fā)明的供體流感病毒的至少一個(gè)基因或者基因組區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方案中，受體流感病毒可以是馬流感病毒。
病毒蛋白質(zhì)的天然的、重組的或者合成的多肽，和其肽片段也可以用作根據(jù)本發(fā)明方法的疫苗組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗組合物包含犬科動(dòng)物流感病毒的多核苷酸或多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗組合物包含編碼具有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一個(gè)中所示氨基酸序列的多肽，或者其功能和/或免疫原性片段或變體的多核苷酸。在特定實(shí)施方案中，編碼SEQ IDNO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78中所示氨基酸序列的多核苷酸分別包含SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77中所示核苷酸序列，或者編碼SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一個(gè)的功能和/或免疫原性片段或變體的序列。在另一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸可以包含SEQ ID NO3的核苷酸1-2271；SEQ ID NO5的核苷酸1-2148；SEQ ID NO7的核苷酸1-657；SEQ ID NO9的核苷酸1-1494；SEQ ID NO11的核苷酸1-1410；SEQ IDNO13的核苷酸1-756；SEQ ID NO15的核苷酸1-1695；SEQ ID NO19的核苷酸1-2271；SEQ ID NO21的核苷酸1-2148；SEQ ID NO23的核苷酸1-657；SEQ ID NO25的核苷酸1-1494；SEQ ID NO29的核苷酸1-756；SEQ ID NO31的核苷酸1-1695；SEQ ID NO47的核苷酸1-2277；SEQ ID NO49的核苷酸1-2271；SEQ ID NO51的核苷酸1-2148；SEQ IDNO53的核苷酸1-690；SEQ ID NO55的核苷酸1-1494；SEQ ID NO57的核苷酸1-1410；SEQ ID NO59的核苷酸1-756；SEQ ID NO61的核苷酸1-1695；SEQ ID NO63的核苷酸1-2277；SEQ ID NO65的核苷酸1-2271；SEQ ID NO67的核苷酸1-2148；SEQ ID NO69的核苷酸1-690；SEQ ID NO71的核苷酸1-1494；SEQ ID NO73的核苷酸1-1410；SEQ IDNO75的核苷酸1-756；SEQ ID NO77的核苷酸1-1695。在另一實(shí)施方案中，疫苗組合物包含具有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一個(gè)所示氨基酸序列的多肽或其功能和/或免疫原性片段或變體。在另一實(shí)施方案中，疫苗組合物包含馬流感病毒的多核苷酸或多肽，其中所述多核苷酸或多肽與犬科動(dòng)物流感多核苷酸或多肽具有至少約90％、或者至少約95％、或至少約96％、或97％、或98％、或99％或更高序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，來自多種毒株的病毒多肽可以組合在疫苗組合物中并且用于接種宿主動(dòng)物。例如，基于來自至少兩種不同毒株的本發(fā)明的流感病毒的病毒HA蛋白質(zhì)的多肽可以組合在疫苗中。該多肽可以與一種毒株同源或者可以包含“雜合”或“嵌合”多肽，其氨基酸序列來自結(jié)合或者連接來自至少兩種不同毒株的多肽。制備病毒多肽的步驟是本領(lǐng)域公知的。例如，使用固相合成方法(Merrifield，1963)可以合成病毒多肽和肽。使用重組DNA技術(shù)也可以產(chǎn)生病毒多肽和肽，其中編碼病毒蛋白質(zhì)或者肽的多核苷酸分子在宿主細(xì)胞，如細(xì)菌、酵母或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)，并且使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化表達(dá)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的疫苗組合物還包括裸核酸組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸可以包含編碼本發(fā)明的流感病毒的HA和/或NA蛋白質(zhì)的核苷酸序列。核酸接種的方法是本領(lǐng)域中已知的并且描述于例如美國專利號6,063,385和6,472,375。核酸可以為質(zhì)粒或者基因表達(dá)盒的形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，將核酸包裹在脂質(zhì)體中提供，將所述脂質(zhì)體施用于動(dòng)物。
可以為根據(jù)本發(fā)明使用的疫苗組合物和免疫原，如多肽和核酸提供可藥用載體或者稀釋劑?？梢愿鶕?jù)制備藥學(xué)上有用的組合物的已知方法配制用于本發(fā)明的化合物和組合物。在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知和容易得到的許多來源中詳細(xì)描述了制劑。例如，E.W.Martin，Easton Pennsylvania，MackPublishing Company，19th ed.，1995的Remington’s PharmaceuticalScience描述了可以用于本發(fā)明的制劑。通常，將配制本發(fā)明的組合物使得有效量的免疫原與合適的載體組合以便促進(jìn)組合物的有效施用。用于本發(fā)明方法中的組合物還可以為多種形式。這些包括例如，固體、半固體和液體劑型，如片劑、丸劑、粉劑、液體溶液劑或混懸劑、栓劑、注射液和灌注液，和噴霧劑。優(yōu)選的形式取決于預(yù)期的施用方式和治療應(yīng)用。組合物還優(yōu)選包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)的可藥用載體和稀釋劑。用于本發(fā)明肽模擬物的載體或稀釋劑的實(shí)例包括，但不限于，水、鹽水、油，包括礦物油、乙醇、二甲基亞砜、明膠、環(huán)糊精、硬脂酸鎂、葡萄糖、纖維素、糖、碳酸鈣、甘油、氧化鋁、淀粉和等同的載體和稀釋劑，或者這些任一種的混合物。本發(fā)明免疫原的制劑還可以包含懸浮劑、保護(hù)劑、潤滑劑、緩沖劑、防腐劑和穩(wěn)定劑。為了提供施用此類劑量用于所希望的治療性治療，本發(fā)明的藥物組合物將有利地包含基于包括載體或稀釋劑的總組合物的重量按重量計(jì)約0.1％到45％，特別1到15％的一種或多種免疫原。
通過本領(lǐng)域公知的方法可以制備本發(fā)明的疫苗和免疫原性組合物。例如，通常將疫苗或者免疫原制備為注射劑，例如，液體溶液劑或者混懸劑。以與劑量制劑相容的方式和在受體中治療有效和免疫原性的量施用疫苗或者免疫原。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定具體疫苗或者免疫原制劑的最佳劑量和施用模式。
還可以以多抗原肽(MAP)構(gòu)建體的形式提供本發(fā)明的肽和/或多肽。已經(jīng)在Tam(1988)描述了MAP構(gòu)建體的制備。MAP構(gòu)建體利用賴氨酸殘基的核心基質(zhì)，其上合成多個(gè)拷貝的免疫原(Posnett et al.，1988)?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的方法制備并在疫苗組合物中施用多種MAP構(gòu)建體，每種含有相同或者不同的免疫原。在一個(gè)實(shí)施方案中，為MAP構(gòu)建體提供一種或多種佐劑和/或與一種或多種佐劑一起施用。還產(chǎn)生了本發(fā)明的流感多肽并且作為包含一種或多種多肽的大分子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)施用。公布的美國專利申請US2005/0009008描述了產(chǎn)生作為流感病毒疫苗的病毒樣顆粒的方法。
根據(jù)本發(fā)明的方法，將本文描述的疫苗和免疫原性組合物施用于易感宿主，通常犬科動(dòng)物，并且更通常為馴養(yǎng)的狗，以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫以抵抗病毒對宿主隨后的攻擊或者感染的有效量和方式施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主動(dòng)物是犬科動(dòng)物。犬科動(dòng)物包括野生的、動(dòng)物園的和馴養(yǎng)的犬科動(dòng)物，如狼、郊狼和狐貍。犬科動(dòng)物還包括狗，尤其馴養(yǎng)的狗，如純種和/或雜種陪伴狗、表演狗、役用狗、放牧狗、獵狗、守衛(wèi)狗、警犬、賽犬和/或?qū)嶒?yàn)用狗。在特定實(shí)施方案中，宿主動(dòng)物是馴養(yǎng)的狗，如靈

。通常腸胃外、通過注射，例如皮下、腹膜內(nèi)或者肌內(nèi)注射施用疫苗或者免疫原。其他合適的施用方式包括經(jīng)口或者經(jīng)鼻施用。通常，將疫苗或者免疫原施用于動(dòng)物至少兩次，每次施用之間為一周或多周的間隔。然而，設(shè)想用于初次和加強(qiáng)施用疫苗或者免疫原的其他方案，并且該方案可以取決于從業(yè)醫(yī)生的判斷和被治療的具體宿主動(dòng)物。
使用本領(lǐng)域中已知的方法，可以將疫苗制劑中的病毒和病毒感染的細(xì)胞失活或者減毒。例如，通過暴露于低聚甲醛、福爾馬林、β-丙內(nèi)酯(BPL)、溴乙胺(BEA)、二元氮丙啶(BEI)、苯酚、紫外線、高溫、凍融、聲處理(包括超聲處理)等可以失活或者減毒完整病毒和受感染的細(xì)胞。疫苗劑量中無細(xì)胞的完整病毒的量將通常為約0.1mg到約5mg，更通常約0.2mg到約2mg。包含病毒感染的細(xì)胞系的疫苗制劑的劑量將通常含有每劑約106到約108個(gè)細(xì)胞，更通常每劑約5x106到約7.5x107個(gè)細(xì)胞。用于動(dòng)物的劑量中蛋白質(zhì)或肽免疫原的量可以從約0.1μg到10000μg，或約1μg到5000μg，或約10μg到1000μg，或約25μg到750μg，或約50μg到500μg，或100μg到250μg，取決于接受劑量的動(dòng)物的大小、年齡等等。
本發(fā)明的免疫原性或者疫苗組合物，如病毒或者病毒感染的細(xì)胞或者病毒蛋白質(zhì)或肽可以與佐劑組合，通常剛好在施用前組合。設(shè)想用于疫苗制劑的佐劑包括蘇氨?；邗６?MDP)(Byars et al.，1987)、皂苷、Cornebacterium parvum、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、鋁，或者這些任一種的混合物。適于用于本發(fā)明的方法和疫苗的多種其他佐劑，如明礬，是本領(lǐng)域中公知的，并且設(shè)想用于本發(fā)明。
本發(fā)明還涉及特異結(jié)合本發(fā)明的蛋白質(zhì)或者肽的抗體。本發(fā)明的抗體包括單克隆和多克隆抗體組合物。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。在本發(fā)明中設(shè)想完整抗體和其抗原結(jié)合片段。從而，例如，合適的抗原結(jié)合片段包括Fab2、Fab和Fv抗體片段。本發(fā)明的抗體可以用可檢測部分，如熒光分子標(biāo)記(例如，螢光素或者酶)。
本發(fā)明還涉及用于檢測和鑒定本發(fā)明的流感病毒和診斷本發(fā)明的流感病毒對動(dòng)物的感染的方法和組合物。本發(fā)明的方法包括檢測來自動(dòng)物的生物樣品中犬科動(dòng)物流感的存在。樣品中犬科動(dòng)物流感的檢測可用于診斷動(dòng)物中的犬科動(dòng)物流感。該信息又可以提供基于區(qū)分隨時(shí)間存在的犬科動(dòng)物流感的水平來預(yù)后動(dòng)物的能力，并且可以幫助選擇動(dòng)物的治療劑和治療，和幫助監(jiān)測療法。該方法還提供了確立在測試的動(dòng)物中不存在犬科動(dòng)物流感的能力。
檢測動(dòng)物中犬科動(dòng)物流感的能力允許評估不同的地理位置中犬科動(dòng)物流感的爆發(fā)。該信息還允許早期檢測從而可以隔離受感染的動(dòng)物，以限制疾病的傳播，和允許早期干預(yù)治療選擇。此外，得到該信息可以為準(zhǔn)備治療許多患病動(dòng)物的醫(yī)學(xué)人員提供指導(dǎo)，包括裝備藥材供應(yīng)，和如果可以得到，疫苗。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涉及從受試動(dòng)物，如犬科動(dòng)物收集生物樣品。生物樣品可以是任一種生物樣品，包括細(xì)胞、組織、毛發(fā)、全血、血清、血漿、乳頭抽吸物、肺灌洗液、腦脊液、唾液、汗液和淚液。
動(dòng)物受試樣品可以來自懷疑具有犬科動(dòng)物流感病毒的動(dòng)物，無論該動(dòng)物是否顯示出疾病癥狀。還可以提供對照樣品或者從已知沒有犬科動(dòng)物流感的動(dòng)物收集?？梢蕴峁╊~外的對照例如，以減少假陽性和假陰性結(jié)果，和證實(shí)測定中的試劑主動(dòng)檢測犬科動(dòng)物甲型流感病毒。
除了檢測生物樣品中犬科動(dòng)物流感的存在或不存在，本發(fā)明中使用的檢測方法可以檢測犬科動(dòng)物流感病毒中的突變，如核酸序列的改變，其可以由環(huán)境、藥物治療、遺傳操作或者突變、損傷、食物的改變、衰老或者動(dòng)物的任何其他的特征引起。突變還可以導(dǎo)致犬科動(dòng)物甲型流感變得抵抗以前有效的藥物，或者使得病毒感染和在不同物種的動(dòng)物或者人類中繁殖。例如，已經(jīng)表明鳥類甲型流感病毒感染其他動(dòng)物和人。
在用于檢測動(dòng)物中流感病毒的一個(gè)實(shí)施方案中，通過收集高質(zhì)量的樣品、它們快速運(yùn)輸?shù)綑z測設(shè)施、和在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)前合適的保存方便了診斷。在含有受感染的細(xì)胞和分泌物的樣品中最佳地檢測到病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，在臨床癥狀發(fā)作后前3天內(nèi)采集用于直接檢測病毒抗原和/或核酸和/或病毒分離的樣品。多種類型的樣本適于診斷上呼吸道的病毒感染，包括，但不限于，鼻拭子、鼻咽拭子、鼻咽抽吸物、鼻洗液和喉嚨拭子。除了拭子外，還可以采集組織或者血清的樣品，并且還可以進(jìn)行侵入性步驟。
在一個(gè)實(shí)施方案中，收集呼吸系統(tǒng)樣品并以1-5ml病毒運(yùn)送培養(yǎng)基運(yùn)輸。滿足多種病毒的回收的多種培養(yǎng)基可通過商業(yè)途徑獲得。向運(yùn)送培養(yǎng)基中加入臨床樣品。還可以用病毒運(yùn)送培養(yǎng)基運(yùn)送鼻或者鼻咽拭子。運(yùn)送培養(yǎng)基的一個(gè)實(shí)例是10克小牛肉浸汁和2克牛白蛋白級分V，加入到無菌蒸餾水至400m。也可以加入抗生素，如0.8ml硫酸慶大霉素溶液(50mg/ml)和3.2ml兩性霉素B(250μg/ml)。優(yōu)選通過過濾消毒培養(yǎng)基。鼻洗液，如無菌鹽水(0.85％NaCl)也可以用于收集呼吸系統(tǒng)病毒的樣品。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在臨床癥狀發(fā)生后不久，優(yōu)選不遲于7天內(nèi)，從急性期動(dòng)物的1-5ml量的全血收集血清。還例如在癥狀發(fā)生后約14天收集恢復(fù)期血清樣品。在中和試驗(yàn)中，血清樣品可以用于檢測抗呼吸系統(tǒng)病毒的抗體。
在一個(gè)實(shí)例中，可以在一定期限內(nèi)(例如，每天一次，每周一次，每月一次，每半年一次或者每年一次)從個(gè)體動(dòng)物收集樣品。在一定時(shí)期內(nèi)從個(gè)體動(dòng)物得到多個(gè)樣品可以用于驗(yàn)證來自更早檢測的結(jié)果，和/或鑒定對特定治療，例如，對所選的治療藥物的應(yīng)答或者抗性。
本發(fā)明的方法可以用于檢測來自動(dòng)物的受試樣品中一種或多種病理物質(zhì)的存在，和每種病理物質(zhì)的水平?？梢允褂糜糜跈z測病理物質(zhì)的任何方法，包括但不限于，抗體測定法，包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、間接熒光抗體(IFA)檢測、血細(xì)胞凝集，和血細(xì)胞凝集抑制(HI)測定法，和蛋白質(zhì)印跡。也可以使用已知的細(xì)胞培養(yǎng)方法。使用細(xì)胞培養(yǎng)物的免疫熒光或者細(xì)胞培養(yǎng)基(上清液)的HI測定法，可以進(jìn)一步鑒定陽性培養(yǎng)物。
此外，可以使用檢測核酸(DNA或者RNA)或者蛋白質(zhì)的方法。此類方法包括，但不限于，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)PCR測試和實(shí)時(shí)測試，和定量核酸酶保護(hù)測定法?？衫猛ㄟ^商業(yè)途徑可獲得的測試試劑盒用于進(jìn)行這些測定法。例如，QIAGEN(Valencia，CA)出售一步RT-PCR試劑盒，和病毒RNA提取試劑盒。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法利用對本發(fā)明的病毒或病毒蛋白質(zhì)特異的抗體。在特定實(shí)施方案中，利用對本發(fā)明病毒的HA蛋白質(zhì)特異的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用對本發(fā)明病毒的NP蛋白質(zhì)特異的抗體。從動(dòng)物得到合適的樣品，如來自鼻或者鼻咽區(qū)域的樣品，并從中分離病毒或者病毒蛋白質(zhì)。然后對病毒組分篩選對蛋白質(zhì)，如本發(fā)明病毒的HA或者NP特異的抗體的結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，從動(dòng)物得到血清樣品(或者其他含有抗體的樣品)并對血清篩選結(jié)合本發(fā)明病毒的蛋白質(zhì)的抗體的存在。例如，可以進(jìn)行ELISA測定，其中平板壁具有結(jié)合到壁的HA和/或NP蛋白質(zhì)，或者其肽片段。然后將平板壁與來自受試動(dòng)物的血清或者抗體接觸。動(dòng)物中特異結(jié)合HA和/或NP蛋白質(zhì)的抗體的存在表明該受試動(dòng)物受到或者已經(jīng)受到本發(fā)明的流感病毒的感染。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過測定生物樣品中抗病理物質(zhì)的抗體的存在或不存在，檢測病理物質(zhì)的存在。在動(dòng)物受感染后可以在血液檢驗(yàn)中檢測到抗體之前，需要一定的時(shí)間(例如，數(shù)月)?？贵w一旦形成，通常持續(xù)許多年，甚至在成功地治療該疾病之后。發(fā)現(xiàn)針對犬科動(dòng)物甲型流感病毒的抗體不能指出感染是最近的還是在過去的某個(gè)時(shí)間。
還可以用液體進(jìn)行抗體測試?？贵w測定法包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、間接熒光抗體(IFA)測定法，和蛋白質(zhì)印跡。優(yōu)選地，使用多種測定法，如ELISA或者IFA，接著通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行抗體測試。在兩步方法中，使用ELISA或者IFA測定法，接著通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行抗體測定法。認(rèn)為ELISA是比IFA更可靠和更準(zhǔn)確的測定法，但是如果不能利用EILSA，那么可以使用IFA。蛋白質(zhì)印跡測試(其是更特異的測試)也可以在所有動(dòng)物中進(jìn)行，尤其在那些在ELISA或者IFA測定中檢測為陽性或者臨界陽性(含糊的)的動(dòng)物中進(jìn)行。
可以用于檢測流感病毒的其他基于抗體的測試包括血細(xì)胞凝集抑制測定法。如所述的使用雞或者火雞紅細(xì)胞(Burleson et al.，1992)和Kendal etal.，1982)，可以檢測來自動(dòng)物的生物樣品中的血細(xì)胞凝集活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的流感或者HA蛋白或者肽與含有血清或者抗體的測試樣品接觸。然后加入來自動(dòng)物如鳥的紅細(xì)胞(RBC)。如果存在抗HA的抗體，那么RBC將不凝集。如果不存在抗HA的抗體，那么在HA存在下，RBC將凝集。對標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞凝集抑制測定法的變更和修改是本領(lǐng)域中已知的并且設(shè)想在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
通過從樣品如鼻或者鼻咽拭子分離病毒，可以確定動(dòng)物的感染。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，包括細(xì)胞培養(yǎng)和雞胚接種，可以進(jìn)行病毒分離。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以用基于核酸的測定法檢測本發(fā)明的病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，從動(dòng)物得到核酸樣品并將該核酸進(jìn)行PCR，如果該核酸含有對本發(fā)明的流感病毒特異的序列，那么使用的引物將產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。在特定實(shí)施方案中，在測定中將RT-PCR用于本發(fā)明病毒。在示例的實(shí)施方案中，用實(shí)時(shí)RT-PCR測定本發(fā)明的流感病毒。PCR、RT-PCR和實(shí)時(shí)PCR方法是本領(lǐng)域中已知的并且已經(jīng)在美國專利號4,683,202；4,683,195；4,800,159；4,965,188；5,994,056；6,814,934；和Saiki et al.(1985)；Sambrooket al.(1989)；Lee et al.(1993)；和Livak et al.(1995)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，PCR測定法使用對流感基質(zhì)(MA)基因和/或HA基因特異的寡核苷酸。還可以對擴(kuò)增產(chǎn)物測序以確定該產(chǎn)物是否具有本發(fā)明的流感病毒的序列。其他基于核酸的測定法可以用于檢測和診斷本發(fā)明病毒的病毒感染并且設(shè)想此類測定法在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將含有核酸的樣品進(jìn)行基于PCR的擴(kuò)增，使用正向和反向引物，其中所述引物對病毒多核苷酸或者基因序列特異。如果樣品中的核酸是RNA，那么可以進(jìn)行RT-PCR。對于實(shí)時(shí)PCR，將可檢測的探針與引物一起使用。
對許多循環(huán)流感病毒的血凝素(HA)基因特異的引物組是已知的，并且正在被不斷開發(fā)出來。流感病毒基因組是單鏈RNA，并且必須使用逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)聚合酶進(jìn)行DNA拷貝(cDNA)。例如，使用RT-PCR對RNA基因組的擴(kuò)增需要一對寡核苷酸引物，其通?；诩仔土鞲胁《緛喰偷囊阎腍A序列和神經(jīng)氨酸酶(NM)-1設(shè)計(jì)?？梢赃x擇引物使得它們將特異擴(kuò)增僅一種病毒亞型的RNA。使用亞型特異的引物產(chǎn)生的DNA可以通過分子遺傳學(xué)技術(shù)如測序進(jìn)一步分析。試驗(yàn)優(yōu)選用陽性對照進(jìn)行，或者產(chǎn)物通過測序并與已知序列比較來驗(yàn)證。不存在目標(biāo)PCR產(chǎn)物(即，“陰性”結(jié)果)不能排除病毒的存在。然后可以在幾小時(shí)內(nèi)從臨床拭子或者感染的細(xì)胞培養(yǎng)物得到結(jié)果。甲型流感病毒的PCR和RT-PCR試驗(yàn)由Fouchier et al.，2000和Maertzdorf et al.，2004描述。
本發(fā)明還涉及篩選對本發(fā)明的病毒具有抗病毒活性的化合物或藥物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的病毒感染的細(xì)胞與受試化合物或者藥物接觸。然后測定接觸后病毒的量或者病毒活性?？梢赃x擇顯示出抗病毒活性的那些化合物或者藥物用于進(jìn)一步評估。
本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的流感病毒感染的分離的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是犬科動(dòng)物細(xì)胞，如犬科動(dòng)物腎上皮細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及用編碼本發(fā)明多肽的本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。優(yōu)選地，在本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體中提供所述多核苷酸序列。更優(yōu)選地，所述表達(dá)構(gòu)建體提供了在細(xì)胞中過表達(dá)有效連接的本發(fā)明的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，用多核苷酸序列轉(zhuǎn)化細(xì)胞，所述多核苷酸序列包含編碼SEQ IDNO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一個(gè)中顯示的氨基酸序列，或者其功能片段或者變體的序列。在特定實(shí)施方案中，用編碼SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78中所示的氨基酸序列的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分別包含SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77中所示的核苷酸序列，或者編碼SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一個(gè)的功能片段或者變體的序列。從而，本發(fā)明涉及用包含SEQ IDNO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一個(gè)中所示的核苷酸序列或者SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一個(gè)的片段或者變體，包括簡并變體的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，例如，植物細(xì)胞，包括原生質(zhì)體，或者轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，例如，細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌或者枯草芽孢桿菌。動(dòng)物細(xì)胞包括人細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，部分犬科動(dòng)物細(xì)胞、鳥類細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞。植物細(xì)胞包括，但不限于，雙子葉植物細(xì)胞、單子葉植物細(xì)胞和針葉樹細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及表達(dá)和產(chǎn)生本發(fā)明的病毒蛋白或者多肽的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明設(shè)想用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化或者經(jīng)育種而含有本發(fā)明的多核苷酸的植物、植物組織和植物細(xì)胞。優(yōu)選地，在植物、植物組織或者植物細(xì)胞中過表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。植物可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的流感疫苗組合物并且可以通過植物的消費(fèi)施用疫苗(見，例如，美國專利號5,484,719和6,136,320)。
本發(fā)明還涉及用于檢測病毒或者診斷本發(fā)明的病毒感染的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包含本發(fā)明的抗體，其特異結(jié)合本發(fā)明的流感病毒，或者其抗原性部分。在另一實(shí)施方案中，試劑盒包含本發(fā)明的一種或多種多肽或者肽。在特定實(shí)施方案中，所述多肽具有SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一個(gè)中所示的氨基酸序列，或者其功能和/或免疫原性片段或變體。在另一實(shí)施方案中，試劑盒包含一種或多種本發(fā)明的多核苷酸或者寡核苷酸。在特定實(shí)施方案中，所述多核苷酸具有SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77任一個(gè)中所示的核苷酸序列，或者其片段或者變體。試劑盒可以任選包含一種或多種對照抗體、對照多肽或者肽，和/或?qū)φ斩嗪塑账峄蛘吖押塑账?。試劑盒的抗體、多肽、肽、多核苷酸和/或寡核苷酸可以在合適的容器或者包裝中提供。
本申請還涉及雜種狗作為流感病毒感染和發(fā)病機(jī)理模型的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，對雜種狗接種本發(fā)明的流感病毒，如犬科動(dòng)物流感病毒。任選地，接種后可以對狗施用治療劑。在用病毒接種之前，還可以對狗施用組合物用于產(chǎn)生針對流感病毒的免疫應(yīng)答?？梢栽诮臃N之前和/或之后得到組織、血液、血清和其他生物樣品并使用本領(lǐng)域中已知的方法檢查病毒的存在和組織的發(fā)病機(jī)理，所述方法包括，但不限于，PCR、RT-PCR、核酸測序，和免疫組織化學(xué)。
將犬科動(dòng)物流感病毒毒株(稱作“A/canine/Florida/43/2004”和“A/canine/Florida/242/2003”)于2006年10月9日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108。將犬科動(dòng)物病毒毒株(稱作“canine/Jax/05”和“canine/Miami/05”)于2006年10月17日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，VA20108。已經(jīng)將主題病毒毒株保藏在這樣的條件下，其確保在本專利申請待決期間，根據(jù)37 CFR 1.14和35 U.S.C.122授權(quán)的專利和商標(biāo)委員(Commissioner of Patents and Trademarks)決定的人可以得到所述培養(yǎng)物。在提交主題申請的副本或其后續(xù)申請的國家，如需要可以按照所述國家的外國專利法獲得所述保藏物。然而，應(yīng)該理解保藏物的可得性不構(gòu)成實(shí)施本發(fā)明而損害政府行為授予的專利權(quán)的許可。
此外，將根據(jù)微生物保藏布達(dá)佩斯條約的規(guī)定保藏主題病毒保藏物并且可以被公眾獲得，即將進(jìn)行所有必要的管理以保存它而確保在供應(yīng)保藏物樣品的最近請求后至少5年的期間內(nèi)和在任何情況下，保藏日后的至少30年期間內(nèi)或者可以出版公開該培養(yǎng)物的任何專利的可實(shí)施期間內(nèi)是存活的和未受污染的。保藏人承認(rèn)當(dāng)請求時(shí)，由于保藏物的條件保藏機(jī)構(gòu)不能提供樣品時(shí)而更換保藏物的的義務(wù)。當(dāng)公開該保藏物的專利被授權(quán)時(shí)，主題培養(yǎng)保藏物對公眾可得性的所有限制都將被不能改變地廢除。
表57闡明了在鑒定為A/canine/Florida/43/2004(Ca/Fla/43/04)的犬科動(dòng)物流感病毒以及H3N8馬隔離群以及canine/Florida/242/2003隔離群的血凝素(或“HA”)、神經(jīng)氨酸酶(或“NA”)和核蛋白(NP)基因編碼的氨基酸之間的相似性。
本文公開的任一實(shí)施方案的任一元素可以與本文的任何其他元素或者實(shí)施方案組合，并且特別設(shè)想此類組合在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本文提及或者引用的所有專利、專利申請、臨時(shí)申請和出版物都完整(包括所有圖和表)引入本文作為參考，直到它們與本說明書的明確教導(dǎo)不一致的程度。
實(shí)施例1-6的材料和方法 從靈

收集血液和鼻拭子 從在賽跑狗舍中經(jīng)歷呼吸系統(tǒng)疾病爆發(fā)的臨床上患病的或者正常的靈

通過頸靜脈穿刺收集急性和恢復(fù)期血液樣品。在急性樣品后4到12周收集恢復(fù)期樣品。收獲血清并在-80℃保存。收集鼻拭子并在遞交用于細(xì)菌分離之前置于具有炭的Amies運(yùn)送培養(yǎng)基(Becton Dickinson Biosciences)中。
靈

的尸體剖檢 由佛羅里達(dá)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院(University of Florida College of VeterinaryMedicine(UF CVM))的解剖病理學(xué)處(Anatomic Pathology Service)對2004年1月在佛羅里達(dá)賽場的爆發(fā)中死亡的8只靈

的5只進(jìn)行完全的尸體剖檢。另一只狗的尸體剖檢在私立的獸醫(yī)診所進(jìn)行，將組織遞交到UF CVM用于組織病理學(xué)診斷。將組織用10％中性緩沖福爾馬林固定，包埋在石蠟中，并對5-μm切片用蘇木精和伊紅染色用于組織病理學(xué)診斷或者處理用于如下述的免疫組織化學(xué)。遞交未固定的組織用于細(xì)菌培養(yǎng)并且也保存在-80℃。
犬科動(dòng)物呼吸系統(tǒng)病原體的血清學(xué)試驗(yàn) 將配對的急性和恢復(fù)期血清樣品遞交給康耐爾大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院(CornellUniversity College of Veterinary Medicine)的動(dòng)物健康診斷實(shí)驗(yàn)室(AnimalHealth Diagnostic Laboratory(AHDL))，對犬瘟熱病毒、2型腺病毒和副流感病毒進(jìn)行血清中和測定?？贵w效價(jià)表達(dá)為抑制細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒感染的血清的最終稀釋度。血清轉(zhuǎn)變表明病毒感染，將血清轉(zhuǎn)變定義為急性和恢復(fù)期樣品之間抗體效價(jià)升高≥4倍。沒有檢測到對這些病毒病原體的血清轉(zhuǎn)變。
犬科動(dòng)物細(xì)菌呼吸系統(tǒng)病原體的微生物試驗(yàn) 將配對的鼻拭子和死后組織遞交給UF CVM的診斷臨床微生物學(xué)/寄生蟲學(xué)/血清學(xué)處(Diagnostic Clinical Microbiology/Parasitology/SerologyService)用于細(xì)菌分離和鑒定。在非選擇培養(yǎng)基以及選擇博德特氏菌(Bordetella)種(Regan-Lowe；Remel)和支原體(Mycoplasma)種(Remel)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)樣品。在沒有報(bào)告生長前，保持所有培養(yǎng)物21天。還將一些靈

的鼻拭子遞交給堪薩斯州立大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院(Kansas State UniversityCollege of Veterinary Medicine)的診斷醫(yī)學(xué)/病理生物學(xué)系(Department ofDiagnostic Medicine/Pathobiology)用于細(xì)菌培養(yǎng)。在所檢驗(yàn)的70只臨床上患病的狗中，從1只狗的鼻腔分離支氣管博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)，而從33只狗的鼻腔回收支原體。通常用化膿性鼻涕從狗的鼻腔回收出血敗血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)。在2004年1月的爆發(fā)中死亡的兩只狗在死亡后肺中具有大腸桿菌的不足的生長，一只狗具有大腸桿菌和犬鏈球菌(Streptococcus canis)的不足的生長，另一只具有銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和酵母的不足的生長。從死亡狗的氣管或者肺中沒有分離到支氣管博德特氏菌或者支原體。
從死后組織分離病毒 將冷凍的組織解凍并在10倍體積的補(bǔ)充0.5％牛血清白蛋白(BSA)和抗生素的極限必需培養(yǎng)基(MEM)中勻漿。通過離心除去固體碎片并將上清液接種到培養(yǎng)的細(xì)胞或者10天齡的含胚的雞蛋中。將來自死亡靈

的組織勻漿物接種到不同的細(xì)胞培養(yǎng)物中，該培養(yǎng)物支持多種病毒病原體的復(fù)制。細(xì)胞培養(yǎng)物包括Vero(非洲綠猴腎上皮細(xì)胞，ATCC No.CCL-81)、A-72(犬腫瘤成纖維細(xì)胞，CRL-1542)、HRT-18(人直腸上皮細(xì)胞，CRL-11663)、MDCK(犬腎上皮細(xì)胞，CCL-34)、原代犬腎上皮細(xì)胞(AHDL，CornellUniversity)、原代犬肺上皮細(xì)胞(AHDL)和原代牛睪丸細(xì)胞(AHDL)。在補(bǔ)充2.5ug/mL TPCK-處理的胰蛋白酶(Sigma)的MEM中培養(yǎng)MDCK和HRT細(xì)胞；在補(bǔ)充10％胎牛血清和抗生素的MEM中培養(yǎng)剩余的細(xì)胞系。在25cm2瓶中37℃下在含有5％CO2的增濕空氣中培養(yǎng)細(xì)胞。用經(jīng)補(bǔ)充的MEM接種對照培養(yǎng)物。每天觀察培養(yǎng)物的形態(tài)改變并在接種后5天收獲。將收獲的液體和細(xì)胞通過離心澄清并如對最初接種所描述的接種在新鮮細(xì)胞上；進(jìn)行兩次盲法傳代。使用雞或者火雞血紅細(xì)胞如所述的(Burleson etal.，1992；Kendal et al.，1982)測定澄清的上清液中的血細(xì)胞凝集活性。對于雞胚中的病毒分離，將0.1mL組織勻漿物接種在尿膜囊中并在35℃下培養(yǎng)48小時(shí)。兩次盲法傳代后，如所述的測定尿囊液中的血細(xì)胞凝集活性(Burleson et al.，1992；Kendal et al.，1982)。
RT-PCR、核苷酸測序和系統(tǒng)進(jìn)化分析 使用RNeasy試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明，從組織培養(yǎng)物上清液或者尿囊液提取總RNA。使用一步RT-PCR試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明將總RNA(10ng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。如以前描述的(Klimov et al.，1992a)，使用通用的基因特異性引物組進(jìn)行cDNA中8種流感病毒基因的編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增。所得DNA擴(kuò)增子用作Applied Biosystems 3100自動(dòng)化DNA測序儀上的自動(dòng)化測序的模板，使用循環(huán)測序染料終止化學(xué)(ABI)。用GCG

版本10.0(Accelyrs)(Womble，2000)分析核苷酸序列。用Phylogeny Inference

版本3.5估計(jì)系統(tǒng)發(fā)生和從核苷酸序列計(jì)算自展值(Felsenstein，1989)。使用

程序(Kumar et al.，2004)中實(shí)現(xiàn)的Tamura-Neigamma模型，將系統(tǒng)樹與近鄰連接分析產(chǎn)生的那些系統(tǒng)樹比較，并通過

4.0 Beta程序(Sinauer Associates)證實(shí)。
狗的實(shí)驗(yàn)接種 使用四只6個(gè)月齡的特定無病原體的小獵兔犬[2只雄性和2只雌性(Liberty Research)]。體檢和基線血試驗(yàn)，包括全血細(xì)胞計(jì)數(shù)/微分、血清化學(xué)小組和尿分析確定動(dòng)物是健康的。將它們養(yǎng)在試驗(yàn)動(dòng)物照料評估和認(rèn)證協(xié)會(huì)(Association for Assessment and Accreditation of LaboratoryAnimal Care)認(rèn)證的BSL 2-增強(qiáng)型設(shè)施中。每天兩次持續(xù)7天記錄基線直腸溫度。通過異丙酚(

Zeneca Pharmaceuticals，0.4mg/kg體重以生效)的靜脈內(nèi)注射麻醉狗用于用氣管內(nèi)插管進(jìn)行插管法。每只狗接種總劑量為106.6半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCID50)的A/Canine/Florida/43/2004(Canine/FL/04)(H3N8)病毒，將一半的劑量通過氣管內(nèi)插管施用于遠(yuǎn)端氣管并將另一半劑量通過導(dǎo)管施用于鼻道深處。接種后(p.i.)14天，每天兩次進(jìn)行體檢和直腸溫度記錄。通過頸靜脈穿刺在接種后0、3、5、7、10和14天收集血樣(4mL)。在接種后0到5、7、10和14天用聚酯拭子(FisherScientific)從每只狗收集鼻和鼻咽樣品。將拭子置于病毒運(yùn)送培養(yǎng)基(Remel)中并保存在-80℃。通過在接種后5天靜脈內(nèi)接種Beuthanasia-

溶液(1mL/5kg體重；Schering-Plough Animal Health Corp)對兩只狗實(shí)施安樂死(1只雄性和1只雌性)并在第14天對剩下的2只狗進(jìn)行尸體剖檢。如所述的處理用于組織學(xué)分析的組織。用于病毒培養(yǎng)的組織在-80℃保存。該研究得到佛羅里達(dá)大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)(University ofFlorida Institutional Animal Care and Use Committee)的批準(zhǔn)。
病毒從實(shí)驗(yàn)接種的狗的脫落 通過離心澄清拭子運(yùn)送培養(yǎng)基制備的肺勻漿物和拭子提取物的連續(xù)稀釋液用補(bǔ)充0.5％BSA和抗生素的MEM建立。如所述的(Burleson et al.，1992)使用單層MDCK細(xì)胞在6孔組織培養(yǎng)板中進(jìn)行噬菌斑測定。用含有0.8％瓊脂糖和1.5ug/mL TPCK-胰蛋白酶的補(bǔ)充的MEM覆蓋接種的細(xì)胞單層。在固定和用結(jié)晶紫染色前，在含有5％CO2的增濕的空氣中37℃下培養(yǎng)細(xì)胞72小時(shí)。病毒濃度表達(dá)為每克組織或者每個(gè)拭子的噬斑形成單位(PFU)。
免疫組織化學(xué) 在Bond-RiteTM載玻片(Richard-Allan Scientific，Kalamazoo，MI)上封固來自靈

和小獵兔犬的脫蠟和再水化的5-μm肺組織切片并隨后用蛋白酶K(DakoCytomation，Carpenteria，CA)接著用過氧化物酶封閉試劑(

EnVisionTM Peroxidase Kit，Dako Corp.)處理。將切片與抗犬瘟熱病毒(VMRD，Inc.)、犬2型腺病毒(VMRD，Inc.)、犬副流感病毒(VMRD，Inc.)或者甲型流感H3(Chemicon International，Inc.)的單克隆抗體的1∶500稀釋液在室溫下溫育2小時(shí)。對照包括用小鼠IgG(1mg/mL，Serotec，Inc.)溫育相同的切片，并溫育單克隆抗體與正常的犬肺切片。用一級抗體處理后，用二級免疫過氧化物酶和過氧化物酶底物試劑(

EnVisionTMPeroxidase Kit，Dako Corp.)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明溫育切片。將切片用蘇木精復(fù)染，用Clarifier#2和Bluing Reagent(Richard-Allan Scientific，Kalamazoo，MI)處理，脫水，并用Permount(ProSciTech)蓋片。
血細(xì)胞凝集抑制(HI)測定法 在37℃下用受體破壞酶(RDE，Denka)(1份血清∶3份RDE)溫育血清樣品16小時(shí)，然后在56℃熱失活60分鐘。在37℃下在MDCK細(xì)胞中培養(yǎng)Influenza A/Canine/FL/04(H3N8)病毒36-48小時(shí)。收獲病毒培養(yǎng)上清液，通過離心澄清，并在-80℃保存。如以前描述的進(jìn)行HI測定法(Kendalet al.，1982)。簡言之，將25μl中的4血凝單位病毒加入微量滴定孔中等體積的連續(xù)稀釋的血清，并在室溫溫育30分鐘。加入等體積的0.5％v/v火雞紅細(xì)胞并在30分鐘后通過視覺評估血細(xì)胞凝集效價(jià)。將終點(diǎn)HI效價(jià)定義為完全抑制血細(xì)胞凝集的血清的最后稀釋度。將血清轉(zhuǎn)變定義為配對的急性和恢復(fù)期樣品之間的HI效價(jià)≥4倍增加。將單個(gè)樣品的血清陽性定義為≥1∶32的HI抗體效價(jià)。
微量中和(MN)測定 通過如以前描述的MN測定法(Rowe et al.，1999)檢測對A/Canine/FL/04(H3N8)的中和血清抗體應(yīng)答，只是在測定前對犬血清進(jìn)行如上述的RDE處理。將終點(diǎn)效價(jià)定義為得到病毒的100 TCID5050％中和的血清的最高稀釋度。將血清轉(zhuǎn)變定義為配對的急性和恢復(fù)期樣品之間MN效價(jià)≥4-倍增加。將單個(gè)樣品的血清陽性定義為MN效價(jià)≥1∶80。
下面是闡明實(shí)施本發(fā)明方法的實(shí)例。不應(yīng)該將這些實(shí)施例理解為限制。除非另外指出，所有百分?jǐn)?shù)都是按重量計(jì)并且所有溶劑混合物比例都是按體積計(jì)。
實(shí)施例1 在2004年1月，在Florida賽場的2個(gè)狗舍中喂養(yǎng)的22只競賽靈

和為這些狗舍提供狗的當(dāng)?shù)剞r(nóng)場中發(fā)生了呼吸系統(tǒng)疾病的爆發(fā)。在每個(gè)狗舍建筑中有約60只狗，農(nóng)場中約300只狗。在6天內(nèi)發(fā)生了爆發(fā)，之后沒有鑒定到新的病例。22只狗的14只具有39.5到41.5℃的發(fā)熱，發(fā)咝的作嘔性咳嗽10到14天，并且最終恢復(fù)。在剩余的8只狗中，6只明顯健康的狗出乎意料地死亡，具有口和鼻出血。兩只其他狗由于快速惡化，在發(fā)生口鼻出血的24小時(shí)內(nèi)實(shí)施安樂死。這些狗都具有41℃發(fā)熱。8例死亡中4例在狗舍建筑物中發(fā)生，4例在農(nóng)場發(fā)生。50％的死亡發(fā)生在爆發(fā)的第3天。22只狗的年齡為17個(gè)月到4歲，但是73％的為17到33個(gè)月齡。
兩種臨床綜合征是明顯的較輕微的病，其特征是最初的發(fā)熱和然后咳嗽10-14天(14只狗)，隨后恢復(fù)，或者過急性死亡，伴隨著呼吸道中的出血(8只狗，死亡率為36％)。對8個(gè)死亡病例的6例進(jìn)行了尸體剖檢。所有狗都在肺、縱隔和胸膜腔中具有廣泛的出血。對呼吸道的組織學(xué)檢查揭示除了肺部出血外，所有狗都具有氣管炎、支氣管炎、細(xì)支氣管炎和化膿性支氣管肺炎(圖3)。這些組織中上皮層和氣道腔中浸潤嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。將從這些狗制備的肺勻漿物接種到多種猴、人、牛和犬細(xì)胞系用于病毒培養(yǎng)。來自一條狗的肺勻漿物在胰蛋白酶存在下在培養(yǎng)的Madin-Darby犬腎上皮細(xì)胞(MDCK)中引起細(xì)胞病變效應(yīng)，并且細(xì)胞培養(yǎng)上清液凝集了雞紅細(xì)胞。通過商業(yè)ELISA檢測甲型和乙型流感病毒的核蛋白，和通過使用對甲型流感病毒的基質(zhì)基因特異的引物進(jìn)行PCR分析，提供甲型流感病毒的初步證據(jù)。此外，通過針對馬甲型流感H3亞型的參照抗血清抑制了血細(xì)胞凝集活性，但是通過對人甲型流感亞型H1-H11和H13特異的抗血清沒有抑制血細(xì)胞凝集活性(表3)。為了表征病毒的分子性質(zhì)，我們測定了病毒基因組的8個(gè)RNA區(qū)段的核苷酸序列。與已知的流感病毒基因的序列比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明犬分離群的8種基因與來自同時(shí)代的馬甲型流感(H3N8)病毒最相似，它們與所述病毒的基因共有≥96-97％的序列同一性(圖1A，表4)。相比，來自鳥類、豬和人甲型流感分離株的代表性基因與犬分離群具有≤94％同一性(表4)。這些數(shù)據(jù)將犬分離群A/Canine/Florida/43/04(Canine/FL/04)鑒定為與馬流感病毒的同時(shí)代譜系密切相關(guān)的甲型流感H3N8病毒。因?yàn)槿蛛x群的所有基因都是馬流感病毒來源的，所以我們推斷馬流感病毒的整個(gè)基因組已經(jīng)轉(zhuǎn)移到狗。
實(shí)施例2 為了研究Canine/FL/04在靈

中的臨床和病理學(xué)觀察中的作用，我們使用抗甲型流感H3的單克隆抗體對肺組織進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色(IHC)。在支氣管和細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、支氣管腺上皮細(xì)胞和氣道腔和肺泡腔的巨噬細(xì)胞中總是檢測到病毒H3抗原(圖2A)。這些數(shù)據(jù)支持在多只狗中H3亞型流感病毒的肺部感染的診斷。
實(shí)施例3 為了確定Canine/FL/04-樣病毒參與呼吸系統(tǒng)疾病爆發(fā)的病因，我們通過血細(xì)胞凝集抑制(HI)和微量中和法(MN)分析了來自11只病狗和16只無癥狀接觸狗的急性和恢復(fù)期血清。在兩種測定法中，在11只中的8只(73％)病狗中發(fā)生了血清轉(zhuǎn)變，其定義為對Canine/FL/04的抗體效價(jià)從急性到恢復(fù)期升高≥4-倍(表1)。在HI測定中，16只中的6只(38％)無癥狀接觸狗中發(fā)生血清轉(zhuǎn)變，而在MN測定法中，16只中的8只(50％)血清轉(zhuǎn)變(表1)。血清轉(zhuǎn)變數(shù)據(jù)表明Canine/FL/04-樣病毒對狗的感染，其與多數(shù)動(dòng)物中呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)作在時(shí)間上吻合。
在與病狗一起喂養(yǎng)的額外的46只無癥狀狗的爆發(fā)后3個(gè)月，收集單個(gè)血清樣品。其中，在兩種測定法中43只(93％)為血清陽性。對于所測試的73只狗的總?cè)后w中，93％的在兩種測定中為血清陽性，包括82％(9/11)只病狗和95％(59/62)健康接觸狗。沒有呼吸系統(tǒng)疾病史的狗中的高血清陽性率表明犬科動(dòng)物流感病毒的多數(shù)感染是亞臨床的并且提示病毒在狗中的有效傳播。亞臨床感染是否促進(jìn)病毒的傳播還是未知的。
實(shí)施例4 為了更好地理解Canine/FL/04病毒感染狗的能力，用106.6半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCID50)通過氣管內(nèi)和鼻內(nèi)途徑接種四只6月齡purpose-品種的小獵兔犬的每一只。所有狗在接種后前2天(p.i.)都發(fā)生發(fā)熱(直腸溫度≥39℃)，但是在14天的觀察期內(nèi)沒有一只顯示出呼吸癥狀，如咳嗽或者鼻涕。通過用鼻或者口咽拭子定量病毒檢查病毒脫落。4只狗的僅僅兩只脫落可檢測量的病毒。一只狗在接種后1和2天脫落病毒(每個(gè)拭子1.0-2.5log10PFU)，而另一只狗在接種后連續(xù)四天脫落病毒(每個(gè)拭子1.4-4.5log10PFU)。在5p.i.對兩只狗的尸體剖檢揭示了類似于在靈

中的自發(fā)疾病中發(fā)現(xiàn)的壞死和增生性氣管炎、支氣管炎和細(xì)支氣管炎，但是沒有肺出血或者支氣管肺炎。通過IHC在支氣管、細(xì)支氣管和支氣管腺的上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中檢測到病毒H3抗原(圖2B)。從一只狗的肺組織回收感染性病毒。在接種后14天對剩下兩只狗的尸體剖檢顯示了呼吸系統(tǒng)組織中最小的組織學(xué)改變，通過IHC沒有檢測到病毒H3抗原，從肺勻漿物沒有回收病毒。到接種后第7天用MN測定法檢測到后兩只狗中的血清轉(zhuǎn)變，到第14天抗體效價(jià)進(jìn)一步增加2到3倍。這些結(jié)果確定狗對Canine/FL/04感染的易感性，如通過發(fā)熱反應(yīng)、在肺實(shí)質(zhì)中存在病毒抗原和感染性病毒、流感的典型組織學(xué)發(fā)現(xiàn)，和血清轉(zhuǎn)變所證實(shí)。在實(shí)驗(yàn)接種的小獵兔犬中不能再現(xiàn)嚴(yán)重疾病和死亡并不令人驚奇，因?yàn)榇蟛糠值奶烊桓腥镜撵`

是無癥狀的。
實(shí)施例5 為了研究在2004年1月爆發(fā)前，Canine/FL/04-樣流感病毒是否已經(jīng)在佛羅里達(dá)的靈

群體中傳播，使用HI和MN測定法對來自65只競賽靈

的存檔血清測試抗Canine/FL/04的抗體。在來自1996到1999年的33個(gè)狗樣品中沒有檢測到抗體。在2000到2003年間的32個(gè)狗樣品中，9個(gè)樣品在兩種測定法中都是血清陽性的-1個(gè)在2000年，2個(gè)在2002年，6個(gè)在2003年(表5)。血清陽性狗位于佛羅里達(dá)賽場，這些賽場與從1999到2003年未知病因的呼吸系統(tǒng)疾病爆發(fā)有關(guān)，提示Canine/FL/04-樣病毒可能是那些爆發(fā)的致病因子。為了進(jìn)一步研究該可能性，我們檢查了來自2003年3月死于出血性支氣管肺炎的靈

的存檔組織。接種到MDCK細(xì)胞和雞胚的來自一只狗的肺勻漿物產(chǎn)生了H3N8流感病毒，稱作A/Canine/Florida/242/2003(Canine/FL/03)。對Canine/FL/03的完整基因組的序列分析揭示與Canine/FL/04的＞99％同一性(表4)，表明Canine/FL/04-樣病毒在2004年前已經(jīng)感染了靈

。
實(shí)施例6 從2004年6月到8月，在佛羅里達(dá)、德克薩斯、阿拉巴馬、阿肯色、西佛吉尼亞和堪薩斯州的14個(gè)賽場的幾千只競賽靈

中發(fā)生了呼吸系統(tǒng)疾病爆發(fā)。
一些賽場的官員估計(jì)他們至少80％的狗群體患有臨床疾病。多數(shù)狗具有與2004年1月爆發(fā)中的狗類似的發(fā)熱(≥39℃)和咳嗽的臨床病征，但是許多狗也具有粘液膿性鼻涕。報(bào)導(dǎo)了多例死亡，但是不能確定準(zhǔn)確的死亡率。
我們收集了位于4佛羅里達(dá)賽場的94只狗的配對的急性和恢復(fù)期血清56％的這些狗對Canine/FL/04的抗體效價(jià)升高≥4倍，100％為血清陽性的(表6)。來自西佛吉尼亞和堪薩斯州的29只狗的恢復(fù)期血清也具有抗Canine/FL/04的抗體。我們從德克薩斯賽場的死于出血性支氣管肺炎的靈

的肺分離了甲型流感(H3N8)病毒。該分離群(稱作A/Canine/Texas/1/2004(Canine/TX/04))的完整基因組的序列分析揭示與Canine/FL/04≥99％的同一性(表4)。在13個(gè)月期間內(nèi)和從不同的地理位置從致死的犬病例分離出三種密切相關(guān)的流感病毒，以及在競賽靈

中普遍感染的實(shí)質(zhì)性血清學(xué)證據(jù)，提示Canine/FL/04-樣病毒在狗群體中的持續(xù)傳播。
Canine/FL/03、Canine/FL/04和Canine/TX/04的HA基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明它們組成單源群，具有有力的自引支持度，其與2002和2003年分離的馬病毒的同時(shí)代H3基因明顯不同(圖1B)。其他7種基因組區(qū)段的系統(tǒng)發(fā)生分析和逐對核苷酸序列比較提示犬基因隔離為與馬病毒譜系最密切相關(guān)的不同的亞譜系(數(shù)據(jù)未顯示，和表4)。在HA中存在4個(gè)標(biāo)記氨基酸改變也支持犬流感基因聚類為與馬流感分離的單源群(表2)。與來自2003和2004年的血清學(xué)結(jié)果一起，這些數(shù)據(jù)與如下相一致從馬到狗的單個(gè)病毒傳播事件和隨后該病毒在靈

群體中的水平擴(kuò)散。然而，不能正式排除來自未鑒定的儲存物種的流感病毒的該獨(dú)特譜系的重復(fù)導(dǎo)入，雖然這無論如何不太可能。
病毒HA是流感病毒的宿主物種特異性的關(guān)鍵決定子(Suzuki et al.，2000)。為了鑒定HA內(nèi)可能與對犬科動(dòng)物宿主的適應(yīng)有關(guān)的殘基，我們比較了犬HA的推導(dǎo)的氨基酸序列與同時(shí)代馬病毒的那些氨基酸序列。在馬和犬成熟HA共有氨基酸序列中有四個(gè)氨基酸不同N83S、W222L、I328T和N483T(見表2)。犬病毒當(dāng)與共有的馬序列比較時(shí)具有氨基酸缺失。因此，HA馬序列中的氨基酸位置7是HA犬序列中的位置6，HA馬序列中的氨基酸位置29是HA犬序列中的位置28，HA馬序列中的氨基酸位置82是HA犬序列中的位置82，等等。從而，四個(gè)替代的氨基酸在SEQ ID NO33和SEQ ID NO34中所示氨基酸序列的位置82、221、327和482。在共有序列位置83上絲氨酸對天冬酰胺的替代是未知功能重要性的改變，因?yàn)樵趤碜云渌锓N的H3分子中發(fā)現(xiàn)多種極性殘基。在接近H3 HA的切割位點(diǎn)的共有序列位置328上的嚴(yán)格保守的異亮氨酸已經(jīng)被蘇氨酸替代。發(fā)病機(jī)理中宿主蛋白酶對HA切割的重要作用提示該改變值得進(jìn)一步研究。在共有序列位置222上亮氨酸對色氨酸的替代是相當(dāng)值得注意的，因?yàn)樗砼c唾液酸結(jié)合口袋相鄰的非保守改變，其可以調(diào)節(jié)受體功能(Weis et al.，1988)。有趣的是，在222位的亮氨酸不是犬H3HA特有的，因?yàn)樗ǔ１话l(fā)現(xiàn)于H4、H8、H9和H12HA亞型中(Nobusawa et al.，1991；Kovacovaet al.，2002)。亮氨酸替代與對哺乳動(dòng)物宿主的病毒特異性可能更相容，因?yàn)橐呀?jīng)報(bào)導(dǎo)了亞型H4病毒對豬的感染(Karasin et al.，2000)和亞型H9病毒對人和豬的感染(Peiris et al.，1999)。在共有序列483位上天冬酰胺對蘇氨酸的替代導(dǎo)致在HA2亞基中糖基化位點(diǎn)的喪失，該位點(diǎn)在所有HA亞型中保守(Wagner et al.，2002)。盡管HA中這些氨基酸改變對于馬病毒對狗的適應(yīng)性的重要性還有待確定，但是以前已經(jīng)觀察到與物種間轉(zhuǎn)移有關(guān)的類似的氨基酸改變(Vines et al.，1998；Matrosovich et al.，2000)。在表19到25中顯示了本發(fā)明的其他流感病毒蛋白質(zhì)和馬共有序列之間的氨基酸差異。
最初感染競賽靈

的馬流感病毒的來源仍然是推測性的。在靈

競賽場的狗舍不位于附近的馬或者馬賽場，提示該靈

和脫落病毒的馬之間的接觸不能充分解釋2004年在不同州的多處爆發(fā)。接觸馬病毒的潛在來源是對靈

喂飼馬肉，所述靈

的食物被補(bǔ)充食品加工廠的生肉，食品加工廠提供可能攜帶流感的尸體，包括馬。該感染方式的先例包括H5N1鳥流感病毒向進(jìn)食受感染的雞尸體的豬和動(dòng)物園貓科動(dòng)物的種間傳播(Webster，1998；Keawcharoen et al.，2004；Kuiken et al.，2004)。盡管這是馬流感向狗的最初引入的似乎合理的途徑，但是它不能解釋最近在不同州的幾千只狗中的多次流感爆發(fā)。我們的實(shí)驗(yàn)接種研究表明在狗的鼻道和口咽中存在病毒，盡管處于適度的滴度。然而，這些結(jié)果表明脫落是可能的，并且通過大滴氣溶膠、污染物進(jìn)行的病毒的狗-狗傳播或者間接粘膜接觸可以在該疾病的動(dòng)物流行病學(xué)中起作用。
全部哺乳動(dòng)物流感病毒向不相關(guān)的哺乳動(dòng)物物種的種間轉(zhuǎn)移是罕見的事件。以前的研究已經(jīng)提供了狗與人甲型流感(H3N2)病毒的暫時(shí)感染的有限的血清學(xué)或者病毒學(xué)證據(jù)，但不是血清學(xué)和病毒學(xué)證據(jù)兩者(Nikitin etal.，1972，Kilbourne，et al.，1975；Chang et al.，1976；Houser et al.，1980)。然而，沒有犬科動(dòng)物宿主中持續(xù)傳播的證據(jù)。盡管充分記載了豬流感病毒從豬向人的直接轉(zhuǎn)移(Dacso et al.，1984；Kimura et al.，1998；Patriarca et al.，1984；Top et al.，1977)，但是沒有豬病毒在人宿主中適應(yīng)的證據(jù)。在該報(bào)導(dǎo)中，我們提供了完整馬甲型流感(H3N8)病毒向另一種哺乳動(dòng)物物種狗的種間傳播。犬病毒HA中獨(dú)特的氨基酸替代，以及美國多個(gè)州中狗感染的血清學(xué)證據(jù)，提示該病毒適應(yīng)了犬科動(dòng)物宿主。因?yàn)楣肥侨祟惖闹饕惆閯?dòng)物，所以這些發(fā)現(xiàn)具有公共健康的牽連；狗可能提供新的甲型流感病毒向人類傳播的新的來源。

a具有疾病的臨床病征的狗的數(shù)目。
b與臨床上患病狗接觸喂養(yǎng)的無癥狀狗的數(shù)目。
c使用A/Canine/Florida/43/2004病毒的血細(xì)胞凝集抑制(HI)測定法。
d使用A/Canine/Florida/43/2004病毒的微量中和(MN)測定法。
e具有配對的急性和恢復(fù)期血清中抗體效價(jià)增加至少4倍的狗的百分比。
f在恢復(fù)期血清中具有陽性抗體效價(jià)(HI效價(jià)≥32∶MN效價(jià)≥80)的狗的百分比。
g恢復(fù)期血清的幾何平均抗體效價(jià)。

＊成熟H3HA中的氨基酸殘基(單字母代碼)和位置。氨基酸代碼是A＝丙氨酸，D＝天冬氨酸，G＝甘氨酸，I＝異亮氨酸，K＝賴氨酸，L＝亮氨酸，M＝甲硫氨酸，N＝天冬酰胺，R＝精氨酸，S＝絲氨酸，T＝蘇氨酸，V＝纈氨酸，W＝色氨酸。


表示沒有從共有馬H3HA的改變。

a對來自#43狗的病毒分離群的血細(xì)胞凝集抑制效價(jià)。
b在白鼬中產(chǎn)生多克隆抗血清，而在綿羊或山羊中產(chǎn)生所有其他抗血清。


aA/Canine/Florida/43/04(H3N8)基因與來自所述物種的流感病毒分離群的多數(shù)同源基因的百分比核苷酸和氨基酸(括號內(nèi))序列同一性，接著是它們的Genbank序列數(shù)據(jù)庫檢索號。
b不可應(yīng)用在人或者豬病毒中從沒有報(bào)道N8神經(jīng)氨酸酶。

a從佛羅里達(dá)競賽靈

收集血清樣品年份。
b血清陽性狗的微量中和測定抗體效價(jià)，包括6只2003年血清陽性狗。

a使用A/canine/Florida/43/2004(H3N8)通過HI測試的臨床上患病狗的數(shù)目。
b在急性和恢復(fù)期血清之間抗體效價(jià)升高≥4倍的狗的百分比。
c在恢復(fù)期血清中具有陽性抗體效價(jià)(HI效價(jià)＞16)的狗的百分比。
d恢復(fù)期血清的幾何平均抗體效價(jià)。
實(shí)施例7-11的材料和方法 犬組織 由佛羅里達(dá)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院的解剖病理學(xué)處對6只雜種狗和一只寵物Yorkshire Terrier狗進(jìn)行尸體剖檢，所述雜種狗在2005年4月/5月流感爆發(fā)期間在佛羅里達(dá)東北部的收容所死亡，所述Yorkshire Terrier狗在2005年5月流感病毒爆發(fā)期間在佛羅里達(dá)東南部的獸醫(yī)診所中死亡。將組織用10％中性緩沖福爾馬林固定，包埋在石蠟中，并用蘇木精和伊紅染色5-μm的切片用于組織病理學(xué)診斷。在病毒學(xué)分析之前，未固定的組織在-80℃保存。
從犬組織樣品提取RNA 將來自7只狗的每一只的冷凍的肺組織解凍并在補(bǔ)充0.5％牛血清白蛋白(BSA)(Kendall，Lifeline Medical Inc.，Danbury，CT)和抗生素(慶大霉素和環(huán)丙沙星)的極限必需培養(yǎng)基(MEM)中用一次性組織研磨機(jī)勻漿。使用商業(yè)試劑盒(

Mini Kit，QIAGEN Inc.，Valencia，CA)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明提取總的RNA并用60μL最終體積的緩沖液洗脫。還從自沒有呼吸系統(tǒng)疾病的狗收集的肺組織提取總RNA。
實(shí)時(shí)RT-PCR 使用含有ROX作為被動(dòng)參考染料的

Probe RT-PCR試劑盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)，對從犬組織樣品提取的總RNA進(jìn)行一步定量實(shí)時(shí)RT-PCR。簡言之，兩個(gè)引物-探針組用于檢測每種樣品中的甲型流感序列(表7)。一個(gè)引物-探針組對于犬血凝素(H3)基因序列是選擇性的。另一個(gè)引物-探針組靶定甲型流感病毒的基質(zhì)(M)基因的高度保守區(qū)。對于每個(gè)實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)，向含有12.5μL 2X

ProbeRT-PCR Master Mix，0.25μL

RT Mix，正向和反向引物(每種0.4μM終濃度)，探針(0.1μM終濃度)和無RNA酶的水的反應(yīng)混合物中加入5μL提取的總RNA，最終體積為25μL。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明，用

Ribosomal RNA Control Reagents(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)檢測18S rRNA，其作為從犬組織樣品提取的RNA的存在的內(nèi)源性內(nèi)部對照。
在

QPCR系統(tǒng)(Stratagene，La Jolla，CA)中對反應(yīng)混合物進(jìn)行定量一步實(shí)時(shí)RT-PCR。循環(huán)條件包括50℃30分鐘的逆轉(zhuǎn)錄步驟，95℃15分鐘以激活

DNA聚合酶的最初變性步驟，和40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)包括94℃變性15秒，接著60℃下退火/延伸1分鐘。在每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)記錄FAM(發(fā)射波長518nm)和VIC(發(fā)射波長554nm)熒光信號。通過在每個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中設(shè)置閾值熒光(dR)為1000，確定閾值循環(huán)數(shù)(Ct)。用

版本2.0軟件程序(Stratagene，La Jolla，CA)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。當(dāng)H3或者M(jìn)基因的閾值循環(huán)(Ct)比來自沒有呼吸系統(tǒng)疾病的狗的肺組織的Ct小3個(gè)單位時(shí)，認(rèn)為樣品是甲型流感病毒陽性的。陽性對照由從A/canine/FL/242/03(H3N8)病毒提取的RNA的擴(kuò)增組成。
MDCK細(xì)胞中的病毒分離 解凍來自7只狗的每一只的冷凍的肺組織并在10倍體積的補(bǔ)充0.5％(BSA)和抗生素(慶大霉素和環(huán)丙沙星)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中勻漿。離心除去固體殘?jiān)⑸锨逡航臃N到在補(bǔ)充1μg/mLTPCK-處理的胰蛋白酶(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)和抗生素(慶大霉素和環(huán)丙沙星)的DMEM中培養(yǎng)的Madin-Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞上。細(xì)胞在含有5％CO2的濕潤空氣中37℃下在25cm2瓶中生長。每天觀察培養(yǎng)物的形態(tài)學(xué)改變并在接種后5天收獲。通過離心澄清收獲的培養(yǎng)物并如對于最初接種所述的將上清液接種到新鮮的MDCM細(xì)胞上；對通過血細(xì)胞凝集或者RT-PCR沒有顯示流感病毒證據(jù)的樣品進(jìn)行兩次額外的傳代。使用0.5％火雞細(xì)胞如以前描述(Burleson，F(xiàn).et al.，1992；Kendal，P.etal.，1982)的測定澄清的上清液中的血細(xì)胞凝集活性。如下述進(jìn)行RT-PCR。
含胚的雞蛋中的病毒分離 如上文關(guān)于MDCK細(xì)胞的接種所述的從冷凍的肺組織制備勻漿。將勻漿(0.2mL)接種到10天齡含胚的雞蛋的尿膜囊中。在35℃培育48小時(shí)后，在4℃過夜冷凍雞蛋，然后收獲尿囊液。使用0.5％火雞血紅細(xì)胞如以前描述的(Burleson，F(xiàn).et al.，1992；Kendal，P.et al.，1982)測定澄清的上清液中的血細(xì)胞凝集活性。如下文描述的進(jìn)行RT-PCR。對最初接種后沒有顯示出流感病毒證據(jù)的樣品用含胚的蛋進(jìn)行兩次額外傳代。
RT-PCR、核苷酸測序和系統(tǒng)進(jìn)化分析 使用

Viral RNA Mini試劑盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明從MDCK上清液或者尿囊液提取病毒RNA。使用

OneStep RT-PCR試劑盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。如以前描述的(Klimov，A.et al.，1992b)，使用通用的基因特異性引物組(根據(jù)請求可以得到引物序列)進(jìn)行cDNA中8種流感病毒基因的編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增。所得的DNA擴(kuò)增子用作

3100自動(dòng)化DNA測序儀中自動(dòng)化測序的模板，使用循環(huán)測序染料終止化學(xué)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。使用Lasergene 6

(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)分析核苷酸序列。用PHYLIP版本

軟件程序從核苷酸序列估計(jì)系統(tǒng)發(fā)生和計(jì)算自展值(Felsenstein，J.，1989)。將系統(tǒng)樹與用

程序(Kumar，S.et al.，2004)中實(shí)現(xiàn)的Tamura-Nei模型進(jìn)行的近鄰連接分析產(chǎn)生的系統(tǒng)樹相比較，并通過

4.0Beta程序(Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA)證實(shí)。
血細(xì)胞凝集抑制(HI)測定 將血清樣品與受體破壞酶(RDE，DENKA SEIKEN Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)(1份血清∶3份RDE)在37℃溫育16小時(shí)，然后在56℃熱失活30分鐘。流感A/Canine/Jacksonville/05(H3N8)病毒在37℃下5％CO2中在MDCK細(xì)胞中生長72小時(shí)。收獲病毒培養(yǎng)上清液，通過離心澄清，并在-80℃保存。HI測定中使用的所有其他病毒都生長在10天齡的含胚的雞蛋中，從其收集尿囊液并在-80℃保存。如以前描述的(Kendal，P.et al.，1982)進(jìn)行HI測定。簡言之，向96孔塑料板中等體積的連續(xù)稀釋的血清中加入25μl 4凝血單位的病毒并在室溫下溫育30分鐘。加入等體積的0.5％火雞紅細(xì)胞并在30分鐘后通過視覺估計(jì)血細(xì)胞凝集效價(jià)。將終點(diǎn)HI效價(jià)定義為完全抑制血細(xì)胞凝集的血清的最后稀釋度。
實(shí)施例7-臨床病例 在2005年4月和5月，在佛羅里達(dá)東北部的收容所中喂養(yǎng)的狗中發(fā)生了以前描述的呼吸系統(tǒng)疾病爆發(fā)(Crawford，P.C.et al.，2005)。該爆發(fā)涉及3個(gè)月至9歲年齡的至少58條狗，并且包括純種狗以及雜種狗。最常見的臨床病征是膿性鼻分泌物和咳嗽7到21天。在具有臨床疾病≥7天的43條狗中，41條對canine/FL/04(H3N8)的HI抗體效價(jià)為32到＞1024。至少10條狗發(fā)展成肺炎，其中6條被實(shí)施安樂死。這6條雜種狗包括3條雄性和3條雌性，年齡為4個(gè)月到3歲。在安樂死時(shí)臨床病征的持續(xù)時(shí)間為2到10天。在尸體剖檢時(shí)，這些狗具有肺充血和水腫。對呼吸道的組織學(xué)檢查揭示了鼻炎、氣管炎、支氣管炎、細(xì)支氣管炎和化膿性支氣管肺炎。在氣管、支氣管、細(xì)支氣管和支氣管腺中存在上皮細(xì)胞壞死和糜爛。呼吸系統(tǒng)組織被嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤。
在2005年5月，在佛羅里達(dá)東南部的一個(gè)獸醫(yī)診所中40條寵物狗中發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病爆發(fā)。最常見的臨床病征是膿性鼻分泌物和咳嗽10到30天。在40條狗中，17條對于canine/FL/04(H3N8)是血清陽性的，HI抗體效價(jià)范圍為32到＞1024。在可以得到配對的急性和恢復(fù)期血清的10條狗中發(fā)生了血清轉(zhuǎn)變。三條狗發(fā)展為肺炎。一條狗為9歲的雄性Yorkshire Terrier，在臨床病征發(fā)作后3天死亡。該狗具有氣管支氣管炎、肺水腫和充血，和嚴(yán)重的支氣管肺炎。類似于6條收容所的狗，在組織中有上皮細(xì)胞壞死和氣道糜爛和嗜中性粒細(xì)胞浸潤。
實(shí)施例8-實(shí)時(shí)RT-PCR和病毒分離 通過定量實(shí)時(shí)RT-PCR測定法分析來自7條狗的肺組織，所述測定法檢測甲型流感的M基因和犬H3N8甲型流感病毒的H3基因。來自所有7條狗的肺對于甲型流感M基因和犬流感H3基因都是陽性的(表8)。在MDCK細(xì)胞中傳代3次后，從在肺炎3天后死亡的收容所狗的肺分離亞型H3N8病毒。該病毒稱作A/canine/Jacksonville/05(H3N8)(canine/Jax/05)。在含胚的雞蛋中傳代2次后，從肺炎3天后也死亡的寵物狗的肺回收甲型流感亞型H3N8病毒。將該病毒稱作A/canine/Miami//05(H3N8)(canine/Miami/05)。
實(shí)施例9-犬甲型流感H3N8分離群的遺傳學(xué)分析 canine/Jax/05和canine/Miami/05的序列分析揭示它們的血凝素(HA)基因與從2004和2005年賽場的流感爆發(fā)期間死于肺炎的競賽靈

的肺回收的canine/FL/04、canine/TX/04和canine/Iowa/05分離群具有98％同一性(Crawford，P.C.et al.，2005；Yoon K-Y.et al.，2005)。此外，canine/Jax/05和canine/Miami/05的HA基因與2000年后分離的同時(shí)代馬流感病毒有98％同一性。HA基因的系統(tǒng)發(fā)生比較表明canine/Jax/05和canine/Miami/05病毒與canine/FL/04、canine/TX/04和canine/Iowa/05靈

分離群和同時(shí)代的馬分離群聚類，形成與20世紀(jì)90年代早期分離的較早的馬病毒不同的組(圖4)。此外，canine/Jax/05、canine/Miami/05和canine/Iowa/05分離群與canine/Tx/04比對canine/FL/04或canine/FL/03更接近。2005年分離群形成了一個(gè)亞組，其似乎與較早的2003和2004犬病毒分叉，在約10個(gè)簡約信息位點(diǎn)具有差異。這些差異支持如下假說，即犬流感病毒在狗與狗之間水平傳播，而不是從外部來源定期地再次輸入。從2003到2005年的突變積累表明病毒被傳播到新的宿主后必須經(jīng)歷的正在進(jìn)行的適應(yīng)過程，如對犬流感病毒預(yù)期已經(jīng)發(fā)生。
實(shí)施例10-犬甲型流感病毒H3N8分離群的氨基酸分析 在所有6種犬分離群中都有保守氨基酸替代，其使得它們與同時(shí)代的馬流感病毒不同(表9)。這些保守替代是I15M、N83S、W222L、I328T和N483T。成熟HA蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)生比較表明canine/Jax/05、canine/Miami/05和canine/Iowa/05病毒與canine/TX/04分離群形成一個(gè)亞組(圖4)。有3個(gè)氨基酸改變(L118V、K261N和G479E)使得該亞組與其他犬病毒不同(表9)。有兩個(gè)氨基酸改變(F79L和G218E)，其使得2005分離群與它們的canine/TX/04根不同。此外，來自非靈

狗的2005分離群canine/Jax/05和canine/Miami/05與canine/Iowa/05靈

分離群有一個(gè)氨基酸改變R492K而不同。最后，canine/Jax/05與canine/Miami/05的差別是一個(gè)氨基酸S107P。在所有其他H3N8馬和犬病毒中，S在107位保守，但是A/Equine/Jilin/1/89除外，其具有T(Guo Y.et al.，1992)。
實(shí)施例11-犬甲型流感H3N8分離群的抗原分析 使用較早的和同時(shí)代的馬流感病毒和犬流感病毒的血清組，和在2005年從感染流感病毒的馬和狗收集的血清進(jìn)行血細(xì)胞凝集抑制(HI)試驗(yàn)(表10)。在該分析中還包括來自對canine/FL/04免疫的白鼬的血清。當(dāng)用同時(shí)代的馬病毒測試時(shí)，馬血清中HI抗體效價(jià)比以前的分離群高8到16倍，但是當(dāng)用犬病毒測試時(shí)降低至少4倍。犬血清不與較早的馬病毒反應(yīng)，但是當(dāng)用同時(shí)代的馬分離群和犬分離群測試時(shí)，抗體效價(jià)增加4倍。該結(jié)果也在來自對犬流感病毒免疫的白鼬的血清中觀察到。這些血清反應(yīng)性模式表明犬流感病毒和同時(shí)代的馬流感病毒之間的抗原相似性，并且與系統(tǒng)發(fā)生分析相一致。抗canine/Miami/05分離群的馬、犬和白鼬血清中的抗體效價(jià)與2003和2004白鼬分離群的那些相似。然而，canine/Jax/05分離群的效價(jià)低2到4倍。這提示canine/Jax/05在抗原上與其他犬分離群不同，這可能與成熟HA中107位的單個(gè)氨基酸改變部分有關(guān)。

a加下劃線的字母r代表核苷酸a或者g，加下劃線的字母k代表核苷酸g或者t。
b大寫字母代表鎖定核酸殘基。



a在用抗原欄中所列出的馬、犬或者白鼬血清和病毒進(jìn)行的血細(xì)胞凝集抑制測定中測定的抗體效價(jià)。
b來自用canine/FL/04病毒免疫的血清。
實(shí)施例12-15的材料和方法 犬流感病毒接種物 通過用代表以前描述的(Crawford et al.，2005)最初分離群的第3代的A/canine/FL/43/04(H3N8)原種接種Madin-Darby犬腎(MDCK)上皮細(xì)胞，制備病毒接種物。在補(bǔ)充1μg/mL TPCK-處理的胰蛋白酶(Sigma-AldrichCorp.，St.Louis，MO)和抗生素(慶大霉素和環(huán)丙沙星)的Dulbecco極限必需培養(yǎng)基(DMEM)中接種的MDCK細(xì)胞在含有5％CO2的濕潤空氣中37℃下生長在250cm2培養(yǎng)瓶中。每天觀察培養(yǎng)物的形態(tài)改變并在接種后5天收獲。通過離心澄清收獲的培養(yǎng)物并在接種狗之前將上清液在-80℃保存。用上清液的等分試樣通過Reed和Muench方法測定病毒效價(jià)。效價(jià)為107半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCID50)的A/canine/Florida/43/2004(canine/FL/04)/mL。
實(shí)驗(yàn)接種 8條4個(gè)月齡的colony品種的雜種狗(Marshall BioResources，NorthRose，NY)(4條雄性和4條雌性)用于佛羅里達(dá)大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)接種研究。狗的體重為13到17kg。在接種前，根據(jù)體檢、基線血試驗(yàn)和記錄體溫兩周，發(fā)現(xiàn)狗是健康的。根據(jù)對在到達(dá)實(shí)驗(yàn)室之時(shí)和2周后收集的配對血清樣品進(jìn)行的血清學(xué)試驗(yàn)，所有狗以前都沒有接觸犬流感病毒。通過靜脈內(nèi)注射異丙酚(

Zeneca Pharmaceuticals，0.4mg/kg體重以生效)麻醉狗以用氣管內(nèi)管插管。6條狗(3條雄性和3條雌性)每條接種5mL無菌鹽水中的107TCID50 canine/FL/04病毒，通過插入到氣管內(nèi)插管的小直徑橡膠導(dǎo)管將所述病毒施用于氣管遠(yuǎn)端。兩條狗(1條雄性和1條雌性)用等體積的無菌鹽水假接種。假接種的對照狗與接種病毒的狗關(guān)在不同的房間內(nèi)并且由不同的工作人員照料。每天進(jìn)行兩次體檢和直腸溫度記錄，直到接種后6天(p.i.)。
咽和直腸拭子采集 為了監(jiān)視病毒脫落，在接種后0到6天，使用聚酯拭子(Fisher ScientificInternational Inc.，Pittsburgh，PA)從每條狗每天兩次收集口咽樣品。將拭子置于含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的1mL無菌磷酸緩沖鹽水(PBS)中。從第0到6天每天從每條狗收集直腸拭子。通過離心澄清拭子運(yùn)送培養(yǎng)液，制備拭子提取物。使用DirectigenTM商業(yè)免疫測定試劑盒(BD，F(xiàn)ranklinLakes，NJ)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明，對拭子提取物的等分試樣立即測試甲型流感病毒核蛋白。剩余的提取物在-80℃保存?zhèn)溆糜谄渌牟《緦W(xué)測定。
尸體剖檢 在接種后第1天，通過靜脈內(nèi)接種Beuthanasia-

溶液(1mL/5kg體重；Schering-Plough Animal Health Corp)，對一條假接種的狗和一條病毒接種的狗實(shí)施安樂死。從接種后第2到第5天，每天對一條病毒接種的狗類似地實(shí)施安樂死。在接種后第6天，對剩下的假接種的和病毒接種的狗實(shí)施安樂死。由研究人員(WLC)之一進(jìn)行完全的尸體剖檢。將組織用10％中性緩沖的福爾馬林固定，石蠟包埋，并對5-μm切片用蘇木精和伊紅染色用于組織病理學(xué)診斷或者處理用于如下文所述的免疫組織化學(xué)。將未固定的肺組織送到佛羅里達(dá)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院的診斷臨床微生物學(xué)/寄生蟲學(xué)/血清學(xué)處(Diagnostic Clinical Microbiology/Parasitology/Serology Service)用于細(xì)菌分離和鑒定。在非選擇性培養(yǎng)基以及選擇博德特氏菌(Bordetella)種(Regan-Lowe；Remel，Lenexa，KS)和支原體(Mycoplasma)種(Remel)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)樣品。在報(bào)告無生長前，所有培養(yǎng)物都保持了21天。在病毒學(xué)分析之前，未固定的組織也在-80℃保存。
免疫組織化學(xué) 將脫石蠟并再水化的5-μm氣管和肺組織切片封固在Bond-RiteTM載玻片(Richard-Allan Scientific，Kalamazoo，MI)上并隨后用蛋白酶K(DAKOCytomation Inc.，Carpenteria，CA)處理，接著用過氧化物酶封閉試劑(

EnVisionTM Peroxidase Kit，DAKO Corp.，Carpenteria，CA)處理。將切片用抗甲型流感H3的單克隆抗體(Chemicon International，Inc.，Ternecula，CA)的1∶500稀釋液在室溫下溫育2小時(shí)。對照包括用小鼠IgG(1mg/mL，Serotec，Inc.Raleigh，NC)溫育相同的切片，和使用正常的犬肺切片與單克隆抗體溫育。用一級抗體處理后，將切片與二級免疫過氧化物酶和過氧化物酶底物試劑(

EnVisionTM Peroxidase Kit，Dako Corp.)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明處理。將切片用蘇木精復(fù)染，用Clarifier#2和Bluing試劑(Richard-Allan Scientific，Kalamazoo，MI)處理，脫水，并用Permount(ProSciTech，Queensland，Australia)蓋片。
來自拭子和組織的RNA提取物 將來自每條狗的肺和氣管組織解凍并在補(bǔ)充0.5％牛血清白蛋白(BSA)和抗生素(慶大霉素和環(huán)丙沙星)的極限必需培養(yǎng)基(MEM)中，使用一次性組織研磨機(jī)(Kendall，Lifeline Medical Inc.，Danbury，CT)勻漿。使用商業(yè)試劑盒(

Mini Kit，QIAGEN Inc.，Valencia，CA)，根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明從組織勻漿以及咽和直腸拭子提取物提取總RNA并用最終體積60μL的緩沖液洗脫。
實(shí)時(shí)RT-PCR 使用

Probe RT-PCR試劑盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)和引物-探針組對總的RNA進(jìn)行一步定量實(shí)時(shí)RT-PCR，該試劑盒含有作為被動(dòng)參照染料的ROX，所述引物-探針組靶定甲型流感病毒的基質(zhì)(M)基因的高度保守區(qū)(Payungporn S.et al.，2006a；Payungporn S.et al.，2006b)。對于每次實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)，向含有12.5μL 2X

Probe RT-PCR Master Mix，0.25μL

RT Mix，正向和反向引物(每種終濃度0.4μM)，探針(0.1μM終濃度)和無RNA酶的水的反應(yīng)混合物中加入5μL提取的總RNA，終體積為25μL。使用

GAPDHControl Reagents(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明檢測GAPDH，其作為從拭子和組織樣品提取的RNA存在的內(nèi)源性內(nèi)部對照和作為歸一化對照。
對

QPCR系統(tǒng)(Stratagene，La Jolla，CA)中的反應(yīng)混合物進(jìn)行定量一步實(shí)時(shí)RT-PCR。循環(huán)條件包括50℃30分鐘的反轉(zhuǎn)錄步驟，95℃15分鐘以活化

DNA聚合酶的最初變性步驟，和40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)包括94℃變性15秒，接著60℃下退火/延伸1分鐘。在每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)記錄FAM(發(fā)射波長518nm)和VIC(發(fā)射波長554nm)熒光信號。通過在每個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中設(shè)置閾值熒光(dR)為1000，確定閾值循環(huán)數(shù)(Ct)。用

版本2.0軟件程序(Stratagene，La Jolla，CA)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。陽性對照由從A/canine/FL/242/03(H3N8)病毒提取的RNA的擴(kuò)增組成。對于每個(gè)樣品，通過將M Ct值除以對應(yīng)的GAPDH Ct值對結(jié)果歸一化。
從組織再次分離病毒 解凍來自接種病毒的狗的冷凍的肺和氣管組織并在10倍體積的補(bǔ)充0.5％(BSA)和抗生素的DMEM中勻漿。離心除去固體殘?jiān)⑸锨逡航臃N到在補(bǔ)充1μg/mL TPCK-處理的胰蛋白酶(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)和如上述抗生素的DMEM中培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞上。細(xì)胞在含有5％CO2的濕潤空氣中37℃下在25cm2瓶中生長。每天觀察培養(yǎng)物的形態(tài)學(xué)改變并在接種后5天收獲。通過離心澄清收獲的培養(yǎng)物并如對于最初接種所述的將上清液接種到新鮮的MDCM細(xì)胞上；對通過血細(xì)胞凝集或者RT-PCR沒有顯示流感病毒證據(jù)的樣品進(jìn)行兩次額外的傳代。使用0.5％火雞細(xì)胞如以前描述(Crawford et al.，2005)的測定經(jīng)澄清的上清液中的血細(xì)胞凝集活性。如下述進(jìn)行RT-PCR。
RT-PCR、核苷酸測序和系統(tǒng)進(jìn)化分析 使用

Viral RNA Mini試劑盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明從MDCK上清液提取病毒RNA。使用

OneStep RT-PCR試劑盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。如以前描述的(Crawford et al.，2005)，使用通用的基因特異性引物組(根據(jù)請求可以得到引物序列)進(jìn)行cDNA中8種流感病毒基因的編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增。所得的DNA擴(kuò)增子用作ABI

3100自動(dòng)化DNA測序儀中自動(dòng)化測序的模板，使用循環(huán)測序染料終止化學(xué)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。使用Lasergene 6

(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)分析核苷酸序列。將從受感染的狗回收的病毒的核苷酸序列與接種物中病毒的序列比較以確定在呼吸道中復(fù)制期間是否已經(jīng)發(fā)生了改變。
實(shí)施例12-臨床疾病 所有6條接種病毒的狗在接種后前2天都產(chǎn)生了暫時(shí)發(fā)熱(直腸溫度≥39℃)，但是沒有一只在6天的觀察期內(nèi)顯示出呼吸系統(tǒng)病征如咳嗽或者鼻涕。假接種的狗保持臨床上健康。
實(shí)施例13-病毒脫落 對接種后24小時(shí)從一條接種病毒的狗收集的口咽拭子檢測甲型流感核蛋白。通過定量實(shí)時(shí)RT-PCR，在接種后72、84和120小時(shí)從一條狗和接種后108、120和132小時(shí)從另一條狗收集的口咽拭子是病毒陽性的(表11)。每μL拭子提取物中流感M基因拷貝的絕對數(shù)目從接種后第3天到第6天隨時(shí)間增加。在直腸拭子中沒有檢測到病毒。
實(shí)施例14-尸體剖檢 與以前使用特定無病原體的小獵兔犬的實(shí)驗(yàn)感染(Crawford et al.，2005)相比，接種病毒的雜種狗患有肺炎，如通過來自接種后1到6天的肺的總體的和組織學(xué)分析所證明。除了肺炎外，狗還患有類似于自然感染的狗中所描述的鼻炎、氣管炎、支氣管炎和細(xì)支氣管炎(Crawford et al.，2005)。在呼吸道和支氣管腺層中存在上皮壞死和糜爛，在粘膜下層組織中有嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(圖5，上圖)。免疫組織化學(xué)在支氣管、細(xì)支氣管和支氣管腺的上皮細(xì)胞中檢測到病毒H3抗原(圖5，下圖)。不存在細(xì)菌超感染。來自2條假接種的狗的呼吸系統(tǒng)組織是正常的。
實(shí)施例15-氣管和肺中的病毒復(fù)制 通過定量實(shí)時(shí)RT-PCR，從接種后第1天到第6天，所有狗中的氣管和肺都是病毒陽性的(表12)。每μL氣管勻漿的流感M基因拷貝的絕對數(shù)目從接種后第1天到第5天增加，然后在第6天下降。每μL肺勻漿的M基因拷貝的絕對數(shù)目從接種后第1天到第6天下降。通常，在接種后6天的每天，氣管含有比肺多≥1log10的病毒。

a用A/canine/FL/43/04(H3N8)病毒接種后從狗收集口咽拭子的時(shí)間。
b通過將M(Ct)除以每個(gè)拭子提取物的GAPDH(Ct)計(jì)算歸一化比。
c每μL拭子提取物的基質(zhì)基因拷貝的絕對數(shù)目。


a用A/canine/FL/43/04(H3N8)病毒接種后從狗收集組織的時(shí)間。
b通過將M(Ct)除以每個(gè)組織勻漿的GAPDH(Ct)計(jì)算歸一化比。
c每μL組織勻漿的基質(zhì)基因拷貝的絕對數(shù)目。
實(shí)施例16的材料和實(shí)施例方法 病毒毒株 在含胚的卵或者M(jìn)DCK細(xì)胞中增殖犬流感病毒毒株以及鳥、馬和人來源的那些流感病毒毒株(表15中所列)，并通過雞胚中的終點(diǎn)稀釋或者噬斑測定法滴定它們的感染力。使用火雞血紅細(xì)胞通過血細(xì)胞凝集測定法進(jìn)行快速病毒定量。
診斷樣品 對2005年期間病毒呼吸系統(tǒng)疾病的疑似病例收集的共60條犬的肺組織測試犬流感病毒的存在。
從犬組織樣品提取RNA 將重量為20到30mg的肺組織塊在一次性組織研磨機(jī)(Kendal)中勻漿。按照生產(chǎn)商的推薦，使用商業(yè)試劑盒(RNeasy Mini Kit，Qiagen，Valencia，CA)提取總RNA并用終體積60μL稀釋。
引物和探針設(shè)計(jì) 使用CLUSTAL X程序(版本1.8)進(jìn)行來自多種亞型和來自多種物種的H3和M基因的多序列比對。從對應(yīng)于甲型流感病毒的不同亞型的已知序列的保守區(qū)選擇基質(zhì)(M)引物和探針，而選擇H3血凝素基因特異引物和探針組以特別匹配馬和犬甲型流感病毒基因和錯(cuò)配同源的鳥和人基因(表13)。用引物設(shè)計(jì)軟件(OLIGOS版本9.1)和EXIQON(http://lnatools.com)提供的基于網(wǎng)絡(luò)的分析工具進(jìn)行Tm計(jì)算和預(yù)測二級結(jié)構(gòu)以及自身雜交。18S rRNA基因的保守區(qū)用作從犬組織樣品的提取的RNA的存在的內(nèi)源性內(nèi)部對照。Pre-Developed

Assay Reagents for Eukaryotic 18SrRNA(VIC/TAMRA)(Applied Biosystems)用于實(shí)時(shí)檢測組織樣品中的18S rRNA。
實(shí)時(shí)RT-PCR條件 通過使用含有作為被動(dòng)參照染料的ROX的Quantitect Probe RT-PCR試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)進(jìn)行一步實(shí)時(shí)RT-PCR。在每次實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)中，5μL RNA樣品用作模板與反應(yīng)混合物組合，所述反應(yīng)混合物含有10μL 2X QuantiTech Probe RT-PCR Master Mix，0.2μLQuantiTech RT Mix，引物(0.4μM終濃度的H3基因或者0.6μM終濃度的M基因)，探針(0.1μM終濃度的H3基因或者0.2μM終濃度的M基因)和無RNA酶的水，最終體積為20μL。在Mx3005P Real-Time QPCR系統(tǒng)(Stratagene)中進(jìn)行一步實(shí)時(shí)RT-PCR。循環(huán)條件包括50℃30分鐘的反轉(zhuǎn)錄步驟。95℃15分鐘以便活化HotStarTaq DNA聚合酶的初步變性步驟后，在40個(gè)循環(huán)中進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)包括變性(94℃15秒)和退火/延伸(60℃30秒)。在每個(gè)循環(huán)延伸步驟結(jié)束時(shí)得到FAM(發(fā)射波長516nm，用于H3和M檢測)和VIC(發(fā)射波長555nm，用于18S rRNA檢測)熒光信號一次。使用Mx3005P軟件版本2.02(Stratagene)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR測定的數(shù)據(jù)采集和分析。
H3引物/探針組對于犬流感(H3N8)的特異性和M引物/探針組對于甲型流感病毒的通用性 為了測試每種引物/探針組的特異性，從甲型流感病毒的幾種已知的亞型提取的RNA用作實(shí)時(shí)RT-PCR測定中的模板(表15)。
用于確定實(shí)時(shí)RT-PCR性能的RNA標(biāo)準(zhǔn) 通過使用與T7啟動(dòng)子連接的引物，用犬甲型流感病毒(A/canine/Florida/242/2003(H3N8))的基因產(chǎn)生H3(nt 1-487)和M(nt1-276)的PCR擴(kuò)增子(表13)。然后通過使用Riboprobe體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)-T7(Promega)，按照生產(chǎn)商的推薦，將H3和M基因的純化的PCR擴(kuò)增子用作體外轉(zhuǎn)錄的模板。通過測量260nm的吸光度計(jì)算所轉(zhuǎn)錄的RNA的濃度。然后將RNA連續(xù)稀釋10倍，從108到10個(gè)拷貝/μL以進(jìn)行靈敏度測試。此外，通過將最初的RNA模板濃度(拷貝/μL)的對數(shù)對為每次稀釋得到的閾值循環(huán)數(shù)(Ct)作圖產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，以便確定實(shí)時(shí)RT-PCR的總體性能。
實(shí)時(shí)RT-PCR和Directigen Flu A測試試劑盒之間的比較靈敏度測試 將包括106.67EID50/mL(HA＝64)的A/Wyoming/3/2003(H3N2)和107.17EID50/mL(HA＝16)的A/canine/Florida/242/2003(H3N8)的兩種病毒毒株的原種病毒用于檢測閾值測定法。按照生產(chǎn)商的使用說明，在快速甲型流感病毒抗原檢測試劑盒Directigen Flu A，(Becton，Dickinson and Company)中使用磷酸緩沖鹽水(PBS)(125μL)中樣品的對數(shù)稀釋度。每個(gè)DirectigenFlu A測試裝置在膜中央具有一個(gè)H1N1流感抗原點(diǎn)，其顯影為紫色點(diǎn)并且指出該測試的完整性，該測試是基于抗核蛋白(NP)的單克隆抗體。在所述點(diǎn)周圍紫色三角形的顯影表明在測試的樣品中存在流感NP。將來自三角形的紫色信號的強(qiáng)度打分為+(三角形輪廓)，++(淺色三角形)，+++(深紫色三角形)和++++(極深紫色三角形)。使用QIAamp Viral RNA Mini試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)從每種病毒稀釋液的125μL等分試樣提取病毒RNA并以最終體積50μL稀釋。通過實(shí)時(shí)RT-PCR測試5uL體積提取的病毒RNA用于與Directigen Flu A試劑盒的比較靈敏度測試。
實(shí)施例16 犬流感病毒的實(shí)時(shí)RT-PCR測定依賴于來自三種分子探針的信息，所述探針靶定來自宿主細(xì)胞的18S rRNA以及來自甲型流感病毒基因組的M和H3(表14)。宿主基因的擴(kuò)增報(bào)告樣品質(zhì)量和完整性。預(yù)期含有犬流感(H3N8)病毒的臨床的、尸體剖檢或?qū)嶒?yàn)室樣品用三種探針產(chǎn)生擴(kuò)增信號。用M和18S rRNA探針產(chǎn)生擴(kuò)增信號但是對于H3陰性的樣品將表明來自人、豬或者鳥來源的流感病毒亞型H3或者來自非H3亞型的流感病毒。這些罕見的情況可以通過RT-PCR解決，其使用HA通用引物以產(chǎn)生擴(kuò)增子cDNA，可以通過測序分析所述cDNA。適當(dāng)收集和處理的缺少甲型流感病毒的樣品僅僅產(chǎn)生18S rRNA擴(kuò)增信號。僅僅18S rRNA探針和H3探針產(chǎn)生擴(kuò)增信號的情況表明有缺點(diǎn)的技術(shù)，除非證明相反；需要闡明使用M探針的假陰性或者對于H3的假陽性。最后，用這三種探針不能產(chǎn)生擴(kuò)增信號的樣品表明有缺陷的樣品收集、降解、錯(cuò)誤的RNA提取或者存在PCR中使用的聚合酶的抑制劑。
為了測試犬甲型流感病毒(H3N8)的H3引物/探針組的特異性和甲型流感的M引物/探針組的通用性，通過實(shí)時(shí)RT-PCR測試甲型流感病毒的幾種亞型。結(jié)果表明H3引物/探針組僅僅用犬流感(H3N8)產(chǎn)生陽性擴(kuò)增信號。在其他亞型或者人H3毒株中沒有觀察到顯著的假陽性或者非特異性擴(kuò)增信號。M引物/探針組對測試的所有毒株產(chǎn)生了陽性擴(kuò)增信號(表15)。這些結(jié)果表明H3引物/探針特異檢測犬甲型流感病毒(H3N8)，而M引物/探針檢測甲型流感病毒的多種亞型。
通過M和H3體外轉(zhuǎn)錄的RNA的終點(diǎn)稀釋評估實(shí)時(shí)RT-PCR測定法的性能。如所預(yù)期的，閾值循環(huán)數(shù)(Ct)與RNA標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度以正相關(guān)增加?？梢栽贛和H3的分別低至103和102個(gè)拷貝/μL的RNA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度下檢測到熒光信號(圖6A和6B)。通過將起始RNA濃度的對數(shù)對從每個(gè)稀釋度得到的閾值循環(huán)數(shù)(Ct)作圖，構(gòu)建M和H3基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6C和6D)。用標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率確定PCR反應(yīng)效率，其在理論上是指數(shù)的；100％擴(kuò)增效率將意味著每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增子濃度的加倍。具有約-3.1到-3.6之間斜率的標(biāo)準(zhǔn)曲線通常適于多數(shù)需要準(zhǔn)確定量的應(yīng)用(90-110％反應(yīng)效率)。Rsq值是所有數(shù)據(jù)對標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的擬合。如果所有數(shù)據(jù)都精確地位于曲線上，那么Rsq將為1.00。隨著數(shù)據(jù)從該曲線進(jìn)一步下降，Rsq降低。Rsq≥0.985是多數(shù)測定法可接受的。M標(biāo)準(zhǔn)曲線揭示了-3.576的斜率(效率＝90.4％)和Rsq＝1.00，而H3標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生了-3.423的斜率(效率＝95.9％)和Rsq＝0.999。這些值表明實(shí)時(shí)RT-PCR測定法的滿意的擴(kuò)增效率和總體性能。我們將M引物/探針組與H3引物/探針組相比較低的效率和靈敏度規(guī)因于M引物序列的N倍簡并性，需要該簡并性來確保M基因序列變異性在多種亞型、宿主和譜系的病毒之間的寬覆蓋度。
還將實(shí)時(shí)RT-PCR測定法的靈敏度與商業(yè)的快速抗原檢測測定法(Directigen Flu A)相比較。用Directigen Flu A和通過實(shí)時(shí)RT-PCR分析了A/Wyoming/3/2003(H3N2)和A/canine/Florida/242/2003(H3N8)的對數(shù)稀釋度。Directigen Flu A的結(jié)果表明對兩種病毒毒株的靈敏度為用于這些實(shí)驗(yàn)的原種病毒的約100倍稀釋度(圖7)。犬病毒(A/canine/Florida/242/2003106.x PFU/ml)樣品產(chǎn)生的信號(紫色)比在人病毒(A/Wyoming/3/2003107.x PFU/ml)中發(fā)現(xiàn)的弱得多，與這些樣品中較低的病毒濃度相一致。備選地，犬流感的較低信號可以規(guī)因于單克隆抗體對NP的分子特異性；即在犬甲型流感病毒的NP表位中氨基酸的保守性很差。
A/canine/Florida/242/2003和A/Wyoming/3/2003的每次反應(yīng)分別使用病毒10和30PFU當(dāng)量，M基因的實(shí)時(shí)RT-PCR產(chǎn)生了高于閾值的Ct值(表16)。兩種病毒毒株的靈敏度值的差異是因?yàn)樽畛醯牟《拘r(jià)的不同。沒有進(jìn)行犬和人流感病毒之間的H3基因檢測比較，是因?yàn)槲覀兊膶?shí)時(shí)RT-PCR測定中的H3引物/探針唯一地?cái)U(kuò)增犬甲型流感病毒。RT-PCR比快速抗原檢測試劑盒靈敏105倍。
為了評估RT-PCR測試在來自患有急性呼吸系統(tǒng)疾病的狗的尸體剖檢樣品中的性能，通過實(shí)時(shí)RT-PCR測試了在2005年送交的60個(gè)犬肺組織樣品中犬甲型流感病毒的存在。60個(gè)樣品中總共12個(gè)(20％)對于M和H3基因是陽性的，而剩下的48個(gè)樣品對于M和H3基因都產(chǎn)生了陰性結(jié)果。通過蛋和MDCK細(xì)胞接種進(jìn)行病毒分離嘗試，以評估實(shí)時(shí)測定法的特異性；根據(jù)RT-PCR，12個(gè)樣品中對犬流感陽性的兩個(gè)樣品產(chǎn)生了犬流感病毒(數(shù)據(jù)未顯示，手稿準(zhǔn)備中)。盡管所有組織都從具有嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病史的狗中收集，但是通過實(shí)時(shí)PCR或者常規(guī)分離，多數(shù)樣品都沒有產(chǎn)生犬流感病毒，提示其他呼吸系統(tǒng)病原體如支氣管博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)、犬瘟熱或者副流感病毒的高發(fā)生率。本文的一步實(shí)時(shí)RT-PCR測定法提供了犬甲型流感病毒(H3N8)檢測的快速、靈敏和劃算的方法。該疾病的早期中，犬甲型流感病毒(H3N8)感染的快速實(shí)驗(yàn)室診斷可以得到與臨床患者和設(shè)施管理相關(guān)的信息。




＊注意通過核苷酸測序證實(shí)臨床樣品的亞型。






＊基于1963和1998年間分離的病毒的可利用的基因。



＊基于1963和1998年間分離的病毒的可利用的基因。

＊基于1963和1998年間分離的病毒的可利用的基因。
實(shí)施例17-犬科動(dòng)物流感攻擊模型開發(fā) 觀察到從Florida的流感爆發(fā)分離的犬科動(dòng)物流感(犬科動(dòng)物流感)病毒是H3N8型流感病毒，并且與馬流感病毒毒株A/equine/Ohio/03非常接近(Crawford et al.，SCIENCE Vol.309，2005年9月，將其完整引入本專利作為參考)。在本研究中研究了使用馬流感病毒毒株A/equine/Ohio/03在狗中誘導(dǎo)流感樣疾病的潛力。
步驟 從供應(yīng)商得到13周齡的混合性別的小獵犬，并圈在BSL-2設(shè)施中的各個(gè)籠子中。將狗隨機(jī)分配成兩組，每組5只狗。如表26所示，將一組進(jìn)行氣管內(nèi)攻擊，另一組進(jìn)行口鼻攻擊。在14周齡時(shí)對狗進(jìn)行攻擊。

將細(xì)胞培養(yǎng)生長的馬流感病毒A/equine/Ohio/03用作攻擊病毒。對于氣管內(nèi)攻擊，通過遞送試管施用攻擊病毒，該試管由具有膠管管頭的氣管導(dǎo)管(大小4.0/4.5，Sheridan，USA)和飼管(大小5Fr，1.7mm，/16英寸長，Kendall，USA)組成，體積為0.5到1.0ml。對于口鼻攻擊，使用霧化器(DeVilbiss Ultra-

99超聲霧化器，Sunrise Medical，USA)以2到3ml的體積以噴霧施用攻擊病毒(每只狗10x7.0到10x8.0TCID50)。
攻擊后觀察狗的流感相關(guān)臨床病征14天。在第0天(攻擊前)、和攻擊后第7天和14天從每只狗收集血清樣品用于用H3N8馬流感病毒以標(biāo)準(zhǔn)方案(SAM 124，CVB，USDA，Ames，IA)測定HI效價(jià)。將所有狗實(shí)施人道的安樂死并用10％緩沖的福爾馬林收集肺組織用于組織病理學(xué)評估。
結(jié)果 該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在表27中總結(jié)。攻擊后在幾只狗中觀察到流感相關(guān)的臨床病征。這些病征包括發(fā)熱(＞103°F；＞39.4℃)和咳嗽。在組1中5只狗中的2只(即40％)發(fā)熱(＞103°F；＞39.4℃)，相比組2中為5只狗中的1只(即，20％)。來自口鼻攻擊組的一只狗打噴嚏，另一種在攻擊后咳嗽。為組1觀察到HI效價(jià)為10到80，幾何平均效價(jià)(GMT)為20。為組2觀察到效價(jià)范圍為40到160，GMT為86。每組的一只狗具有與流感相容或其特有的組織病理損傷。

實(shí)施例18-馬流感病毒疫苗對狗的功效 觀察到從Florida的流感爆發(fā)分離的犬科動(dòng)物流感是H3N8型流感病毒，并且基于序列相似性與馬流感病毒A/equine/Ohio/03非常接近。進(jìn)行下面的研究以確定實(shí)驗(yàn)滅活的馬流感病毒疫苗的功效。
步驟 從供應(yīng)商得到9只7周齡的混合性別的小獵犬，并圈在BSL-2設(shè)施的各個(gè)籠子中。將這些狗隨機(jī)分成兩組，如表28概述
第一組由5只狗組成，在8和12周齡時(shí)用皮下(SQ)途徑對它們用滅活的CARBIGENTM佐劑化的馬流感病毒A/equine/Ohio/03疫苗接種。使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過二元氮丙啶(″BEI″)滅活A(yù)/equine/Ohio/03。每劑疫苗含有按重量計(jì)5％的CARBIGENTM、4096HA單位滅活病毒、足夠的PBS以使得劑量的總體積為1ml，并用足夠的NaOH調(diào)節(jié)pH到7.2和7.4之間。在第一次和第二次接種當(dāng)天和第一次和第二次接種后7和14天和在攻擊前從所有狗收集血清樣品，用于測定HI效價(jià)，該測定使用H3N8馬流感病毒和標(biāo)準(zhǔn)方案(SAM 124，CVB，USDA，Ames，IA)。在第二次接種后3周時(shí)，用細(xì)胞培養(yǎng)生長的馬流感病毒A/equine/Ohio/03(每只狗107.0到108.0TCID50)以每劑1-2ml體積經(jīng)口鼻攻擊5只接種的狗和由4只年齡匹配的狗組成的第二組(即，對照組)。將攻擊病毒用霧化器(DeVilbissUltra-

99超聲霧化器，Sunrise Medical，USA)以噴霧施用于狗。在攻擊后14天觀察狗的流感相關(guān)的臨床病征。將攻擊后7天的5只狗(3只接種，2只對照)和攻擊后14天的4只狗(2只對照和2只接種)實(shí)施人道的安樂死用于用10％緩沖的福爾馬林收集肺組織用于組織病理學(xué)評估。
結(jié)果 該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在表29和30中概述。所有接種的狗在接種后發(fā)生血清轉(zhuǎn)變。在用馬流感病毒A/equine/Ohio/03進(jìn)行的接種后期間內(nèi)觀察到HI效價(jià)范圍為40到640，GMT為129。使用犬科動(dòng)物流感隔離群A/canine/Florida/242/03觀察到HI效價(jià)為160到320，幾何平均效價(jià)為211。6只接種狗的兩只在1天內(nèi)具有＞103°F(＞39.4℃)的發(fā)熱，在攻擊后的任何狗中沒有觀察到其他臨床病征。
結(jié)論 所有接種的狗都應(yīng)答滅活的CARBIGENTM佐劑化的馬流感疫苗。使用犬科動(dòng)物流感病毒隔離群的HI效價(jià)提示滅活的馬流感疫苗誘導(dǎo)了對犬科動(dòng)物流感病毒的可檢測水平的交叉反應(yīng)抗體。盡管基于犬科動(dòng)物流感病毒隔離群的HI效價(jià)，用于該實(shí)驗(yàn)的攻擊病毒在小獵犬狗中沒有誘導(dǎo)任何可注意到的臨床疾病，但是斷定滅活的馬疫苗可以用于在狗中誘導(dǎo)交叉反應(yīng)抗體，其可以潛在保護(hù)狗抵抗H3N8型犬科動(dòng)物流感病毒引起的“犬科動(dòng)物流感”病。


＊用馬流感隔離群Ohio 03攻擊動(dòng)物 ＊＊CARBIGENTM佐劑化的馬流感病毒Ohio 03疫苗用于接種 實(shí)施例19-馬流感病毒疫苗對狗的功效 從Florida流感爆發(fā)分離的犬科動(dòng)物流感病毒經(jīng)表征與許多H3N8型馬流感病毒隔離群密切相關(guān)。通過DNA和氨基酸相似性分析，表明該犬科動(dòng)物流感病毒與馬流感病毒A/equine/Ohio/03非常相似。在狗中進(jìn)行下面的研究以確定通過商業(yè)途徑可獲得的馬流感疫苗在狗中的功效。
步驟 在該研究中使用約16月齡的混合性別的20只雜種狗和20只小獵犬。將狗隨機(jī)分成6組(表31)，每組6-7只狗。組1和4中的狗在16和17月齡時(shí)通過皮下(SQ)途徑用可商購的滅活的佐劑化馬流感疫苗(EQUICINE IITM，Intervet Inc.，Millsboro，DE)接種。組2和5中的狗通過鼻內(nèi)途徑(單鼻孔)用1ml體積的修飾的活的equine/Kentucky/91流感疫苗接種。在接種當(dāng)天、第一次接種后(組1、2、4和5)和第二次接種后(組1和4)7和14天收集血樣，用于用H3N8馬流感病毒和犬科動(dòng)物流感病毒，按照標(biāo)準(zhǔn)方案(SAM 124，CVB，USDA，Ames，IA)測定HI效價(jià)。
用細(xì)胞培養(yǎng)生長的馬流感病毒毒株A/equine/Ohio/03(每只狗10x7.0到10x8.0TCID50)以1-2ml體積經(jīng)口鼻攻擊接種的狗(最后接種后72天)和對照。將攻擊病毒用霧化器(DeVilbiss Ultra-

99超聲波霧化器，Sunrise Medical，USA)作為噴霧施用于狗。攻擊后觀察狗的流感相關(guān)的臨床病征12天。從攻擊后-1到12天每天用含有抗生素(新霉素和多粘菌素B)的Earl’s MEM培養(yǎng)基收集鼻和口咽拭子用于病毒分離。拭子中病毒的存在表明動(dòng)物在鼻/口分泌物中分泌病毒。在攻擊后12天對所有狗實(shí)施人道安樂死并用10％緩沖的福爾馬林收集肺組織用于組織病理學(xué)評估。

＊不適用 ＊＊EQUICINE IITM由Intervet Inc.作為液體疫苗上市。EQUICINE IITM含有滅活的A/Pennsylvania/63流感(或″A/Pa/63″)病毒和A/equine/Kentucky/93流感(或″A/KY/93″)病毒與卡波姆(即，

(Intervet Inc.))。更具體地，一劑EQUICINE IITM含有106.0EID50的滅活的A/Pa/63，106.7EID50滅活的A/KY/93，0.25％體積的卡波姆，和足夠的PBS以產(chǎn)生總體積1ml。
＊＊＊A/KY/91是凍干的疫苗，其用水重構(gòu)。這種重構(gòu)用足夠使疫苗劑量達(dá)到1ml總體積的疫苗級水進(jìn)行。該疫苗含有equine/Kentucky/91流感(或″A/KY/91″)病毒，并且在例如美國專利號6,436,408；6,398,774；和6,177,082中討論，將其完整引入本專利作為參考。當(dāng)重構(gòu)時(shí)，一劑疫苗含有每ml107.2TCID50的A/KY/91，每ml 0.015克N-Z AMINE ASTM，每ml 0.0025克明膠，和每ml 0.04克D乳糖。N-Z AMINE ASTM是通過酪蛋白的酶促水解產(chǎn)生的氨基酸和肽的精煉來源。N-Z AMINE ASTM由KerryBio-Science(Norwich，NY，USA)上市。
結(jié)果 所有接種的狗在接種后都發(fā)生血清轉(zhuǎn)變，并且使用馬流感病毒(H3N8型)，HI效價(jià)對于EQUICINE IITM疫苗組的狗為10到80，對于A/KY/91疫苗組，為10到40。
將接種后(對于EQUICINE IITM疫苗，在第二次接種后)2周收集的樣品用犬科動(dòng)物流感和馬流感病毒(H3N8型)測定HI效價(jià)。HI結(jié)果在表32中顯示。臨床病征包括攻擊后觀察到的發(fā)熱(＞103°F；＞39.4℃)，偶爾咳嗽，和輕微的鼻涕。

＊不適用 在小獵犬中，EQUICINE IITM疫苗組(組1)中6只狗的2只、A/KY/91疫苗組(組2)中7只狗的1只和對照組(組3)中6只狗的2只具有發(fā)熱。組3(對照組)中6只狗的一只在使用0.25％雞紅細(xì)胞(CRBC)進(jìn)行的血凝測定中對鼻拭子材料的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的病毒是陽性的。對照組(組3)中6只狗的1只和A/KY/91疫苗組(組2)中7只狗的1只在攻擊后觀察期具有輕微的流涕。對于小獵犬狗，在對照和疫苗組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P＞0.05)。
在雜種狗中，EQUICINE IITM疫苗組(組4)中7只狗的5只，A/KY/91疫苗組(組5)中7只狗的1只，和對照組(組6)中6只狗的5只具有發(fā)熱。來自組4和6各有1只狗具有輕微流涕，并且來自組5的一只狗具有偶爾的咳嗽。EQUICINE IITM疫苗組(組4)中7只狗的兩只和對照組(組6)中6只狗的3只在HA測定法中對于鼻拭子中流感病毒是陽性的。A/KY/91組(組5)中沒有狗對于鼻拭子材料中的流感病毒是陽性的。
結(jié)論 通過血清學(xué)，闡明用通過商業(yè)途徑可獲得的馬流感疫苗接種狗刺激中等水平的流感抗體應(yīng)答。在用H3N8型流感病毒攻擊后，在狗中流感相關(guān)的臨床病征的發(fā)展中可以存在一定的品種差異?；畹臏p毒馬流感疫苗(A/KY/91)提供了雜種狗中對臨床疾病發(fā)展(直腸溫度)的顯著(P＜0.05)保護(hù)。而且，活的減毒的病毒疫苗防止鼻分泌物中流感病毒脫落。
實(shí)施例20-犬科動(dòng)物流感攻擊模型開發(fā) 考慮到為了研究目的在犬科動(dòng)物中誘導(dǎo)疾病還沒有被證明是成功的，在下面的研究中使用犬科動(dòng)物流感病毒H3N8開發(fā)狗中的犬科動(dòng)物流感攻擊模型的潛力。
步驟 從供應(yīng)商得到10只混合性別的雜種狗，并圈在BSL-2設(shè)施的籠子中。將狗隨機(jī)分成兩組，每組5只狗。如表33所示，一組進(jìn)行氣管內(nèi)/鼻內(nèi)攻擊，另一組進(jìn)行口鼻攻擊。

在約12周齡時(shí)攻擊狗。含胚的雞蛋生長的犬科動(dòng)物流感病毒(A/canine/Florida/242/03)用作攻擊病毒。每只狗接受2ml(用于口鼻途徑)或4ml(氣管內(nèi)/鼻內(nèi)途徑)體積的總共約107.2TCID50病毒。
對于氣管內(nèi)/鼻內(nèi)攻擊，首先將3ml攻擊病毒施用于氣管，然后使用遞送試管施用5ml PBS，該試管由具有膠管管頭的氣管導(dǎo)管(大小4.0/4.5，Sheridan，USA)和飼管(大小5Fr，1.7mm；16英寸(41cm)長，Kendall，USA)組成，并施用1ml攻擊病毒，接著用注射器將3ml空氣施用到鼻孔中。
對于口鼻攻擊，使用霧化器(NebulairTM，DVM Pharmaceuticals，Inc.，Miami，F(xiàn)L)以大約2ml的體積以噴霧施用攻擊病毒。在攻擊后14天觀察狗的流感相關(guān)的臨床病征。在攻擊后14天對狗實(shí)施安樂死，并用10％緩沖的福爾馬林收集組織(肺和氣管)樣品用于組織病理學(xué)檢查。
結(jié)果 組1和2中的所有狗在24到48小時(shí)內(nèi)都發(fā)生了犬科動(dòng)物流感臨床病征。每只狗具有兩種或多種下面的臨床病征發(fā)熱(＞103.0°F；＞39.4℃)、咳嗽、嚴(yán)重的或者粘液膿性的眼分泌物、漿液性或粘液膿性的鼻分泌物、嘔吐、腹瀉、抑郁、體重減輕、作嘔、咯血，和聽得見的啰音。來自組1的5只狗的5只和來自組2的5只狗中的4只的肺組織具有組織病理學(xué)損害，其包括下面的一種或多種彌散化膿性支氣管肺炎、支氣管炎/毛細(xì)支氣管炎，在腔中具有嗜中性粒細(xì)胞滲出物栓，和粘膜和細(xì)支氣管周組織中顯著的單核細(xì)胞聚集、肺泡內(nèi)混合的滲出物，具有大量泡沫狀巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞以及粒細(xì)胞滲入，和肺泡隔的增厚，具有II型肺細(xì)胞增殖，其與流感病毒感染相容或是流感病毒感染特有的。氣管組織樣品是正常的。
結(jié)論 H3N8犬科動(dòng)物流感隔離群如在該研究中使用的隔離群可以用于使用本研究中描述的方法之一或者類似方法在狗中誘導(dǎo)犬科動(dòng)物流感疾病。
實(shí)施例21-犬科動(dòng)物流感攻擊模型開發(fā) 在下面的研究中進(jìn)一步研究使用犬科動(dòng)物流感病毒H3N8開發(fā)狗中的犬科動(dòng)物流感攻擊模型的可能性。
步驟 從供應(yīng)商得到15只17到18周齡雜種狗和15只15周齡小獵犬，并圈在BSL-2設(shè)施的籠子中。將雜種狗隨機(jī)分成3組(組1到3)，每組5只狗。將所有小獵犬分成一組(組4)，如表34所示
將狗用毒性犬科動(dòng)物流感病毒A/Canine/Florida/242/2003(從患有犬科動(dòng)物流感疾病的靈

的肺分離(University of Florida的Cynda Crawford博士提供))經(jīng)口鼻攻擊。使用霧化器(NebulairTM)以約2ml體積作為噴霧施用攻擊病毒。在攻擊后觀察狗的流感相關(guān)的臨床病征14天。
結(jié)果 組1和4中80％(5只中的4只)狗、組2和3中的100％的狗在48小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生犬科動(dòng)物流感臨床病征。每只狗具有一種或多種下面的臨床病征發(fā)熱(＞103.0°F；＞39.4℃)、咳嗽、漿液性或粘液膿性眼分泌物、漿液性或粘液膿性鼻分泌物、嘔吐、腹瀉、抑郁、體重減輕、作嘔、和啰音。在小獵犬中觀察到的臨床病征與雜種狗相比通常更輕并且是短程的。
結(jié)論 H3N8犬科動(dòng)物流感隔離群，如該研究中使用的隔離群可以用于使用該研究中描述的方法或者類似的方法以104.8到106.8 TCID50的攻擊劑量范圍在狗中誘導(dǎo)犬科動(dòng)物流感樣或者狗窩咳嗽樣疾病。在雜種狗和小獵犬中觀察到的臨床病征有一定的不同。通常，小獵犬與雜種狗相比具有更輕微的流感相關(guān)的臨床病征。
實(shí)施例22-犬科動(dòng)物流感疫苗功效研究 進(jìn)行下面的研究以評估H3N8馬流感疫苗在狗中抗犬科動(dòng)物流感病毒的功效。
步驟 從供應(yīng)商得到17只14周齡雜種狗和10只8周齡小獵犬。將狗隨機(jī)分成5組，如表35所示，并圈在研究設(shè)施中。

該研究中使用的疫苗是

-佐劑化的、失活的馬流感病毒(A/equine/KY/02)疫苗。為了制備該疫苗，使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過二元氮丙啶(BEI)滅活病毒。每個(gè)疫苗劑量含有

(10％v/v)、6144HA單位的滅活病毒、0.1％(v/v)的10％硫柳汞、0.1％(v/v)酚紅，足夠的NaOH以調(diào)節(jié)pH為6.8至7.2，和足夠的PBS用于使總劑量體積達(dá)到1ml。
將組1和4中的狗用2劑疫苗接種。在第一次劑量后4周施用第二次劑量(即，加強(qiáng)劑量)。在18周齡時(shí)用1劑接種組2中的狗。收集血樣以用標(biāo)準(zhǔn)方案評估HI效價(jià)，使用在第0天(接種前)、第一次和第二次接種后7和14天的H3N8犬科動(dòng)物流感隔離群。攻擊前約5天，將狗轉(zhuǎn)移到BSL-2設(shè)施并圈在單獨(dú)的籠子中。
在組1和4的第二次接種后和組2第一次接種后2周用毒性犬科動(dòng)物流感病毒(每只狗107.7TCID50A/Canine/Florida/242/2003)經(jīng)口鼻攻擊所有接種的和年齡匹配的對照狗。使用霧化器(NebulairTM)以每只狗2ml作為噴霧施用攻擊病毒。攻擊后觀察狗的流感相關(guān)的病征17天。從-1天(即攻擊前一天)到攻擊后17天用含有2ml病毒轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的試管收集鼻和口咽拭子用于病毒分離。在攻擊后17天對所有狗實(shí)施安樂死并用10％緩沖的福爾馬林收集肺和氣管樣品用于組織病理學(xué)分析。在攻擊后7和14天收集血樣用于HI效價(jià)測定。用于攻擊后觀察的臨床病征得分評估在表36中顯示。
結(jié)果 2劑量接種組(組1和4)中的所有狗都發(fā)生了對犬科動(dòng)物流感病毒分離物的HI抗體效價(jià)應(yīng)答(表37)。攻擊后，在所有組中攻擊后14天時(shí)效價(jià)增加約4倍間接表明所有狗都暴露于攻擊病毒。所有狗顯示出一種或多種下面的犬科動(dòng)物流感病征發(fā)熱(＞103.0°F；＞39.4℃)、咳嗽、漿液性或粘液膿性眼分泌物、漿液性或粘液膿性的鼻分泌物、嘔吐、腹瀉、抑郁、體重減輕和呼吸困難。與年齡匹配的對照相比，接種具有較不嚴(yán)重的臨床病征(表38)。由于8周齡(P＝0.040)和14周齡(P＝0.003)狗中的2-劑量接種，臨床病征存在顯著減輕(分別為組4和組1)。在該實(shí)驗(yàn)中，一次劑量接種沒有提供臨床病征(組2)的顯著減輕(P＝0.294)。
病毒分離結(jié)果在表39中顯示。在14周齡狗中，從收集自2次劑量疫苗組(組1)的7只狗中的2只(29％)、1次劑量疫苗組(組2)的5只狗的3只(60％)，和對照組(組3)的5只狗的5只(100％)的拭子樣品分離到犬科動(dòng)物流感病毒。在8周齡狗中，從2次劑量疫苗組(組4)的5只狗的1只(20％)、對照組(組5)的5只狗的4只(80％)分離到病毒。與未接種的對照(組3和5)相比，由于2次劑量接種(組1和4)，在拭子樣品中對于犬科動(dòng)物流感病毒陽性的狗的數(shù)目顯著減少(P＝0.003)。盡管在1次劑量疫苗組(組2)和對照組(組3)之間拭子樣品中對犬科動(dòng)物流感病毒陽性的狗的數(shù)目減少(60％對100％)，但是該差異不是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(P＝0.222)。
進(jìn)行肺和氣管組織樣品的損傷的組織病理學(xué)評估以鑒定與犬科動(dòng)物流感疾病相容或其特有的損傷。這包括例如，測定是否存在下面的一種或多種具有化膿性支氣管肺炎的區(qū)域；具有單核細(xì)胞聚集(淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞)的支氣管周圍炎/細(xì)支氣管周圍炎；在腔中存在粒細(xì)胞細(xì)胞碎片栓；呼吸上皮增生；肺泡中混合的滲出物，具有大量粒細(xì)胞和細(xì)胞碎片；(泡沫狀)巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞聚集；和肺泡隔增厚，具有II型肺細(xì)胞增生。
表40提供了該實(shí)驗(yàn)中狗的損傷程度概述。在14周齡狗中，在2次劑量接種組(組2)中7只狗的5只和1次劑量接種組(組1)中5只狗的4只中肺損傷的范圍和嚴(yán)重性較低。所有對照狗(組3)都具有嚴(yán)重和廣泛的損傷，提示沒有受到保護(hù)。在14周齡狗中，1或2次劑量接種引起的氣管損傷沒有差異。在8周齡狗中，在2次劑量接種和對照狗之間肺損傷沒有差異。沒有狗具有氣管損傷。
結(jié)論 該研究的結(jié)果表明(1)滅活的H3N8馬流感病毒可以在接種的狗中誘導(dǎo)犬科動(dòng)物流感病毒交叉反應(yīng)性HI抗體應(yīng)答，(2)使用H3N8馬流感病毒疫苗可以減輕狗中犬科動(dòng)物流感病毒疾病的嚴(yán)重性，和(3)使用H3N8犬科動(dòng)物流感病毒疫苗可以減少鼻和/或口分泌物中的病毒排泄。











“+”與流感感染一致或其特有的嚴(yán)重?fù)p傷 “+/-“輕微損傷(不確定) “-“正常的 實(shí)施例23-犬科動(dòng)物流感疫苗功效研究 進(jìn)行下面的研究以確定在狗中多價(jià)H3N8馬流感疫苗對犬科動(dòng)物流感病毒的功效。
步驟 從供應(yīng)商得到17只15周齡的小獵犬。將狗隨機(jī)分成3組，如表41中所示，并圈在研究設(shè)施中。

在該研究中使用的疫苗是

佐劑化的滅活的馬流感(A/equine/KY/02、A/equine/KY/93，和A/equine/NM/2/93)疫苗。為了制備該疫苗，使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過二元氮丙啶(BEI)滅活病毒。每個(gè)疫苗劑量含有

(10％v/v)，2048HA單位每種滅活的病毒，0.1％(v/v)10％硫柳汞，0.1％(v/v)酚紅，足夠的NaOH以調(diào)節(jié)pH到6.8至7.2，和足夠的PBS用于使總劑量體積達(dá)到1ml。
將組1中的狗用2劑疫苗接種。在第一次劑量后4周施用第二次劑量(即，加強(qiáng)劑量)。在19周齡時(shí)用1劑疫苗接種組2中的狗。收集血樣以用標(biāo)準(zhǔn)方案評估HI效價(jià)，使用在第0天(接種前)、第一次和第二次接種后7和14天的H3N8犬科動(dòng)物流感分離物。攻擊前7天，將狗轉(zhuǎn)移到BSL-2設(shè)施并圈在單獨(dú)的籠子中。
在組1第二次接種后和組2第一次接種后2周用毒性犬科動(dòng)物流感病毒(每只狗107.7 TCID50 A/Canine/Florida/242/2003)經(jīng)口鼻攻擊所有接種的狗和年齡匹配的對照狗。使用霧化器(NebulairTM)以每只狗2ml作為噴霧施用攻擊病毒。攻擊后觀察狗的流感相關(guān)的臨床病征14天。在攻擊后14天對所有狗實(shí)施安樂死并用10％緩沖的福爾馬林收集肺和氣管樣品用于組織病理學(xué)分析。在攻擊后7和14天收集血樣用于HI效價(jià)測定。用于攻擊后觀察的臨床病征得分分配在表42中顯示。
結(jié)果 所有接種的狗都發(fā)生了對犬科動(dòng)物流感病毒分離物的HI抗體效價(jià)應(yīng)答(表43)。攻擊后，在所有組中攻擊后14天時(shí)HI效價(jià)與攻擊前HI效價(jià)相比增加約4倍間接表明所有狗都暴露于攻擊病毒。所有狗顯示出犬科動(dòng)物流感疾病病征，每只狗顯示出一種或多種下面的臨床病征發(fā)熱(＞103.0°F；＞39.4℃)、咳嗽、漿液性或粘液膿性眼分泌物、漿液性或粘液膿性的鼻分泌物、嘔吐、腹瀉、抑郁、體重減輕和呼吸困難。與年齡匹配的對照相比，接種具有較不嚴(yán)重的臨床病征(表44)。由于狗(組1)中的2-劑量接種，臨床病征存在顯著減輕(P＝0.028)。一劑量接種沒有提供臨床病征(組2)的顯著減輕(P＝0.068)。
如在實(shí)施例22中，進(jìn)行肺和氣管組織樣品損傷的病理組織學(xué)評估以鑒定與犬科動(dòng)物流感疾病相容或者其特有的損傷。表45提供了該實(shí)驗(yàn)中狗的損傷程度概述。在15周齡的狗中，使用1劑或2劑接種狗在所有狗中預(yù)防了肺損傷。5只對照狗中的4只(80％)具有與流感疾病一致的嚴(yán)重的化膿性支氣管肺炎。來自2劑疫苗組(組1)的7只狗的1只和來自對照組(組3)的5只狗的1只具有輕微的氣管損傷，提示為氣管炎，其可以規(guī)因于流感疾病。
結(jié)論 來自該研究的結(jié)果表明1)滅活的H3N8馬流感病毒可以在接種的狗中誘導(dǎo)犬科動(dòng)物流感病毒交叉反應(yīng)性HI抗體應(yīng)答，和2)使用H3N8馬流感病毒疫苗可以降低狗中犬科動(dòng)物流感病毒疾病的嚴(yán)重性。





＊第一次接種-組1 ＊＊第二次接種-組1；第一次接種-組2 ＊＊＊攻擊日

“+”與流感感染一致或其特有的嚴(yán)重?fù)p害 “+/-“輕微損傷(不確定) “-“正常的 實(shí)施例24-犬科動(dòng)物流感疫苗功效研究 進(jìn)行下面的研究以確定(1)在狗中單價(jià)對多價(jià)H3N8馬流感疫苗對犬科動(dòng)物流感病毒的功效，和(2)施用途徑對疫苗功效的影響。
步驟 從供應(yīng)商得到30只10周齡雜種狗。將狗隨機(jī)分成6組，如表46所示，并圈在研究設(shè)施中。

使用三種類型的疫苗(VAX-1、VAX-2，和VAX-3)。VAX-1為

-佐劑化的滅活馬流感病毒(A/equine/KY/02)單價(jià)疫苗，每劑含有

(10％v/v)、6144HA單位的滅活病毒、0.1％(v/v)的10％硫柳汞、0.1％(v/v)酚紅，足夠的NaOH以調(diào)節(jié)pH到6.8至7.2，和足夠的PBS用于使總劑量體積達(dá)到1ml。VAX-2是

-佐劑化的滅活馬流感病毒(A/equine/KY/02)單價(jià)疫苗，每劑疫苗含有

(10％v/v)、4096HA單位的滅活病毒、0.1％(v/v)的10％硫柳汞、0.1％(v/v)酚紅，足夠的NaOH以調(diào)節(jié)pH到6.8至7.2，和足夠的PBS用于使總劑量體積達(dá)到1ml。VAX-3是

-佐劑化的滅活馬流感(A/equine/KY/02、A/equine/KY/93和A/equine/NM/2/93)多劑疫苗，并且含有

(10％v/v)，每種毒株2048HA單位滅活的病毒，0.1％(v/v)的10％硫柳汞、0.1％(v/v)酚紅，足夠的NaOH以調(diào)節(jié)pH到6.8至7.2，和足夠的PBS用于使總劑量體積達(dá)到1ml。通過二元氮丙啶(BEI)使用標(biāo)準(zhǔn)方法滅活用于疫苗制劑的所有流感病毒。
每組的疫苗和施用途徑在表46描述。通過鼻內(nèi)(IN)或皮下(SQ)途徑接種接種組中的所有狗，并且每只狗接受2劑。第二劑(即，加強(qiáng)劑量)在第一劑后4周施用。收集血樣以用標(biāo)準(zhǔn)方案用H3N8犬科動(dòng)物流感分離物在第0天(接種前)、第一次和第二次接種后7和14天評估HI效價(jià)。攻擊前7天，將狗轉(zhuǎn)移到BSL-2設(shè)施中并圈在單獨(dú)的籠子中。
在第二次接種后2周用毒性犬科動(dòng)物流感病毒(每只狗107.4TCID50A/Canine/Florida/242/2003)經(jīng)口鼻攻擊所有接種的狗和年齡匹配的對照狗。使用霧化器(NebulairTM)以每天2ml體積作為噴霧施用攻擊病毒。攻擊后觀察狗的流感相關(guān)的臨床病征14天。攻擊后7和14天收集血樣用于HI效價(jià)測定。在攻擊后14天對所有狗實(shí)施安樂死并用10％緩沖的福爾馬林收集肺和氣管樣品用于組織病理學(xué)分析。用于攻擊后觀察的臨床病征得分評估在表47中顯示。
結(jié)果 不管疫苗的類型如何，所有通過SQ途徑接種的狗都應(yīng)答犬科動(dòng)物流感病毒隔離群產(chǎn)生HI抗體效價(jià)(表48)。在接種后期間，無論疫苗類型，來自IN接種組(即組1、3和5)的狗都沒有應(yīng)答犬科動(dòng)物流感病毒隔離群而產(chǎn)生HI抗體效價(jià)。然而，在所有狗中攻擊后14天，效價(jià)升高4倍，間接表明所有狗都暴露于攻擊病毒(表47)。
所有狗顯示出一種或多種下面的犬科動(dòng)物流感臨床病征發(fā)熱(＞103.0°F；＞39.4℃)、咳嗽、漿液性或粘液膿性眼分泌物、漿液性或粘液膿性的鼻分泌物、嘔吐、腹瀉、抑郁、體重減輕和呼吸困難。與年齡匹配的對照相比，接種具有較不嚴(yán)重的臨床病征(表49)。在通過SQ途徑用VAX-3接種的狗中臨床病征顯著減輕(組4)。在該實(shí)驗(yàn)中，IN施用VAX-1、VAX-2或VAX-3沒有提供犬科動(dòng)物流感病毒臨床病征的顯著減輕。
如實(shí)施例22和23中，進(jìn)行肺和氣管組織樣品的損傷的組織病理學(xué)評估以鑒定與犬科動(dòng)物流感疾病相容或其特有的損傷。表50提供了該實(shí)驗(yàn)中對于狗的損傷程度概述。5只對照狗(組6)中的5只具有與流感感染一致的肺損傷。通過SC途徑用VAX-2接種(組2)的5只狗的2只和通過SC途徑用VAX-3接種(組4)的5只狗的3只沒有任何流感相關(guān)的肺損傷。不管疫苗類型如何，通過鼻內(nèi)途徑接受疫苗的所有狗都具有與流感感染相一致的嚴(yán)重肺損傷。在該研究中觀察到的氣管損傷非常輕微。
結(jié)論 來自該研究的結(jié)果表明(1)滅活的H3N8馬流感病毒可以在通過SQ途徑接種的狗中誘導(dǎo)犬科動(dòng)物流感病毒交叉反應(yīng)性HI抗體應(yīng)答，(2)鼻內(nèi)施用單價(jià)(VAX-1和VAX-2)或多價(jià)疫苗(VAX-3)在狗中不是有效的，和(3)皮下施用多價(jià)疫苗(VAX-3)提供了狗中犬科動(dòng)物流感病毒疾病嚴(yán)重性的顯著(P＝0.016)減輕。








“+”與流感感染一致或其特有的嚴(yán)重?fù)p傷 “+/-“輕微損傷(不確定) “-“正常的 實(shí)施例25-犬科動(dòng)物流感疫苗功效研究 犬科動(dòng)物流感疾病由H3N8流感病毒(CIV)引起。CIV非常接近馬H3N8病毒(Crawford et al.，2005)并且感染所有接觸的狗。約80％的被接觸的狗發(fā)生臨床病征。在下面的研究中，確定滅活的H3N8馬流感病毒疫苗和犬科動(dòng)物流感病毒疫苗的功效。
步驟 在該研究中使用35只小獵犬和5只雜種狗。將小獵犬隨機(jī)分成3組(表51)。將所有雜種狗都分配到對照組(組3)。對所有狗都飼以標(biāo)準(zhǔn)生長飲食并且無限制地獲取水。

對組1和2中的狗用VAX-1或VAX-2接種(表51)。VAX-1是

佐劑化的滅活的馬流感病毒(A/equine/KY/02)疫苗。為了疫苗制備，使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過二元氮丙啶(BEI)滅活疫苗病毒。每劑疫苗含有

(10％v/v)、6144HA單位的滅活病毒、0.1％(v/v)10％的硫柳汞、0.1％(v/v)的酚紅和足夠使總劑量體積達(dá)到1ml的PBS和用于調(diào)節(jié)pH到6.8到7.2的NaOH。
VAX-2是滅活的CARBIGENTM佐劑化的犬科動(dòng)物流感抗原疫苗(A/canine/Fl/43/2004)。使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過二元氮丙啶(″BEI″)滅活A(yù)/canine/Fl/43/2004。每劑量疫苗含有按質(zhì)量計(jì)5％的CARBIGENTM，約1280HA單位滅活病毒，足夠使劑量總體積達(dá)到1ml的PBS，和足夠調(diào)節(jié)pH到7.2至7.4的NaOH。在第一次和第二次接種當(dāng)天、第一次和第二次接種后7和14天，和攻擊前從所有狗收集血清樣品以使用H3N8馬流感病毒標(biāo)準(zhǔn)方案(SAM 124，CVB，USDA，Ames，IA)測定HI效價(jià)。攻擊前7天，將狗轉(zhuǎn)移到ABSL-2設(shè)施并圈在單獨(dú)的籠子中。
將所有接種的狗和年齡匹配的對照狗在第二次接種后2周用毒性犬科動(dòng)物流感病毒(每只狗107.2 TCID50 A/Canine/Florida/242/2003)經(jīng)口鼻攻擊。使用霧化器(NebulairTM)以噴霧(2ml/狗)施用攻擊病毒。攻擊后觀察狗的流感相關(guān)的臨床病征14天。從-1天(即攻擊前1天)到攻擊后14天每天用含有2ml用于病毒分離的病毒轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的試管收集鼻和口咽拭子。在攻擊后第7和14天收集血樣用于HI效價(jià)測定。在表52中顯示了用于攻擊后觀察的臨床病征分?jǐn)?shù)賦值。
結(jié)果 所有接種的狗(組1和2)都應(yīng)答犬科動(dòng)物流感病毒隔離群而產(chǎn)生了HI抗體效價(jià)(表53)。所有的狗顯示出一種或多種下面的犬科動(dòng)物流感病征發(fā)熱(＞103.0°F；＞39.4℃)、咳嗽、漿液性或粘液膿性眼分泌物、漿液性或粘液膿性的鼻分泌物、嘔吐、腹瀉、抑郁、和厭食。與年齡匹配的對照相比，接種具有較不嚴(yán)重的臨床病征(表54)。用VAX-1(組1)或VAX-2(組2)接種的狗中臨床病征有顯著(P＜0.001)減輕。
病毒分離結(jié)果在表55和56中顯示。毒性犬科動(dòng)物流感病毒攻擊后，從組1(VAX-1)的15只狗的5只(33％)、組2(VAX-2)的5只狗的0只(0％)和對照(組3)的20只的17只(85％)中分離到犬科動(dòng)物流感病毒。滅活的馬流感疫苗(VAX-1)和犬科動(dòng)物流感病毒(VAX-2)接種都證明引起鼻或口分泌物或兩者中的病毒脫落與對照相比顯著(P＝0.004)減少(表55)。
結(jié)論 來自該研究的結(jié)果表明(1)滅活的H3N8馬流感病毒和犬科動(dòng)物流感病毒疫苗可以在接種的狗中誘導(dǎo)犬科動(dòng)物流感病毒反應(yīng)性HI抗體應(yīng)答，(2)使用H3N8馬流感病毒或犬科動(dòng)物流感病毒疫苗可以降低狗中犬科動(dòng)物流感病毒疾病的嚴(yán)重性，和(3)使用H3N8馬流感病毒或犬科動(dòng)物流感病毒疫苗可以在鼻和/或口分泌物中減少病毒分泌。







＊使用

版本9.1的NPARIWAY程序分析(使用GLM程序比較疫苗組)
＊使用

(版本9.1)的FREQ程序分析和與Fisher精確檢驗(yàn)相關(guān)的P值




在本專利(包括權(quán)利要求)中的單詞“包含”、“含有”和“包括”將被解釋為包括在內(nèi)而不是排他性的。該解釋意在與這些單詞在美國專利法中給出的解釋相同。
上面對優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述僅僅意在使本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉本發(fā)明、它的原理和它的實(shí)際應(yīng)用，從而本領(lǐng)域技術(shù)人員可以改編和以多種形式應(yīng)用本發(fā)明，使得它們可以最適于具體應(yīng)用的需要。因此，本發(fā)明不限于上面的實(shí)施方案并且可以以多種形式修飾。
應(yīng)該理解本文描述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅用于闡明目的，并且參照其的多種修飾或更改將是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到的，并且包括在本申請的精神和范圍內(nèi)。
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<400>1
atg gag aga ata gaa gaa ctg aga gat ctg atg tta caa tcc cgc acc48
Met Glu Arg Ile Glu Glu Leu Arg Asp Leu Met Leu Gln Ser Arg Thr
1 5 10 15
cgc gag ata cta aca aaa act act gtg gac cac atg gcc ata atc aag96
Arg Glu Ile Leu Thr Lys Thr Thr Val Asp His Met Ala Ile Ile Lys
20 25 30
aaa tac aca tca gaa aga caa gag aag aac cct gca ctt agg atg aaa144
Lys Tyr Thr Ser Glu Arg Gln Glu Lys Asn Pro Ala Leu Arg Met Lys
35 40 45
tgg atg atg gca atg aaa tac cca att aca gca gat aag agg ata atg192
Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Ile Thr Ala Asp Lys Arg Ile Met
50 55 60
gag atg att cct gag aga aat gaa cag ggt caa acc ctt tgg agc aaa240
Glu Met Ile Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys
65 70 75 80
acg aac gat gct ggc tca gac cgc gta atg gta tca cct ctg gca gtg288
Thr Asn Asp Ala Gly Ser Asp Arg Val Met Val Ser Pro Leu Ala Val
85 90 95
aca tgg tgg aat agg aat gga cca aca acg agc aca att cat tat cca336
Thr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro Thr Thr Ser Thr Ile His Tyr Pro
100 105 110
aaa gtc tac aaa act tat ttt gaa aag gtt gaa aga ttg aaa cac gga384
Lys Val Tyr Lys Thr Tyr Phe Glu Lys Val Glu Arg Leu Lys His Gly
115 120 125
act ttt ggc ccc gtt cat ttt agg aat caa gtc aag ata aga cga aga432
Thr Phe Gly Pro Val His Phe Arg Asn Gln Val Lys Ile Arg Arg Arg
130 135 140
gtt gat gta aac cct ggt cac gcg gac ctc agt gcc aaa gaa gca caa480
Val Asp Val Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Lys Glu Ala Gln
145 150 155 160
gat gtg atc atg gaa gtt gtt ttc cca aat gaa gtg gga gcc ata att528
Asp Val Ile Met Glu Val Val Phe Pro Asn Glu Val Gly Ala Ile Ile
165 170 175
cta aca tcg gaa tca caa cta aca ata acc aaa gag aaa aag gaa gaa576
Leu Thr Ser Glu Ser Gln Leu Thr Ile Thr Lys Glu Lys Lys Glu Glu
180 185 190
ctt cag gac tgc aaa att gct ccc ttg atg gta gca tac atg cta gaa624
Leu Gln Asp Cys Lys Ile Ala Pro Leu Met Val Ala Tyr Met Leu Glu
195 200 205
aga gag ttg gtc cga aaa aca agg ttc ctc cca gta gca ggc gga aca672
Arg Glu Leu Val Arg Lys Thr Arg Phe Leu Pro Val Ala Gly Gly Thr
210 215 220
agc agt gta tac att gaa gtg ttg cat ctg act cag gga aca tgc tgg720
Ser Ser Val Tyr Ile Glu Val Leu His Leu Thr Gln Gly Thr Cys Trp
225 230 235 240
gag caa atg tac acc cca gga gga gaa gtt aga aac gat gat att gat768
Glu Gln Met Tyr Thr Pro Gly Gly Glu Val Arg Asn Asp Asp Ile Asp
245 250 255
caa agt tta att att gca gcc cgg aac ata gtg aga aga gcg aca gta816
Gln Ser Leu Ile Ile Ala Ala Arg Asn Ile Val Arg Arg Ala Thr Val
260 265 270
tca gca gat cca cta gca tcc cta ctg gaa atg tgc cac agt aca cag864
Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met Cys His Ser Thr Gln
275 280 285
att ggt gga ata agg atg gta gac atc ctt aag cag aat cca aca gag912
Ile Gly Gly Ile Arg Met Val Asp Ile Leu Lys Gln Asn Pro Thr Glu
290 295 300
gaa caa gct gtg gat ata tgc aaa gca gca atg gga ttg aga att agc960
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tca tca ttc agc ttt ggt gga ttc acc ttc aaa aga aca agt gga tca1008
Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser
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tca gtc aag aga gaa gaa gaa atg ctt acg ggc aac ctt caa aca ttg1056
Ser Val Lys Arg Glu Glu Glu Met Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu
340 345 350
aaa ata aga gtg cat gag ggc tat gaa gaa ttc aca atg gtc gga aga1104
Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Arg
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aga gca aca gcc att atc aaa aag gca acc aga aga ttg att caa ttg1152
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gcc atg gtg ttt tcg caa gaa gat tgc atg ata aaa gca gtt cga ggc1248
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cct gac atg acc cca agc acc gag atg tca ttg aga gga gtg aga gtc1440
Pro Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu Met Ser Leu Arg Gly Val Arg Val
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agc aaa atg gga gtg gat gag tac tcc agc act gag aga gtg gtg gtg1488
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Ser Ile Asp Arg Phe Leu Arg Val Arg Asp Gln Arg Gly Asn Ile Leu
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gcg gaa aag gca atg aaa gaa tat gga gag aac ccg aaa atc gaa aca96
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aac aaa ttt gca gca ata tgc act cac ttg gaa gtc tgc ttc atg tac144
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tcg gat ttt cac ttt att aat gaa ctg ggt gag tca gtg gtc ata gag192
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Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile
85 90 95
Tyr Arg Arg Lys Asp Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu His Asp
100 105 110
Lys Glu Glu Ile Met Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp
115 120 125
Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn
130 135 140
Asp Thr Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp
145 150 155 160
Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser
165 170 175
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu
180 185 190
Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg
195 200 205
Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn
210 215 220
Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp
225 230 235 240
Gln Val Arg Glu Gly Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu
245 250 255
Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His
260 265 270
Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Ala Ile Thr Ser Gly
275 280 285
Tyr Asp Phe Glu Lys Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe
290 295 300
Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Ile Phe Ser Leu Ile Arg Pro Lys Glu
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Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala
325 330 335
Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Leu Asn Phe Ile Arg Gly Thr Lys Val
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Ile Pro Arg Gly Gln Leu Thr Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn
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420 425 430
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Glu Asn Ala Lys Ser Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe
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Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp
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Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Ala Ile Gly Phe Ala Ser Leu Gly
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ata tta atc att aat gtc att ctc cat gta gtc agc att ata gta aca96
Ile Leu Ile Ile Asn Val Ile Leu His Val Val Ser Ile Ile Val Thr
20 25 30
gta ctg gtc ctc aat aac aat aga aca gat ctg aac tgc aaa ggg acg144
Val Leu Val Leu Asn Asn Asn Arg Thr Asp Leu Asn Cys Lys Gly Thr
35 40 45
atc ata aga aag tac aat gaa aca gta aga gta gaa aaa att act caa192
Ile Ile Arg Lys Tyr Asn Glu Thr Val Arg Val Glu Lys Ile Thr Gln
50 55 60
tgg tat aat acc agt aca att aag tac ata gag aga cct tca aat gaa240
Trp Tyr Asn Thr Ser Thr Ile Lys Tyr Ile Glu Arg Pro Ser Asn Glu
65 70 75 80
tac tac atg aac aac act gaa cca ctt tgt gag gcc caa ggc ttt gca288
Tyr Tyr Met Asn Asn Thr Glu Pro Leu Cys Glu Ala Gln Gly Phe Ala
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cca ttt tcc aaa gat aat gga ata cga att ggg tcg aga ggc cat gtt336
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100 105 110
ttt gtg ata aga gaa cct ttt gta tca tgt tcg ccc tca gaa tgt aga384
Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Val Ser Cys Ser Pro Ser Glu Cys Arg
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ata ggg caa tca cct aat gta tat caa gct aga ttt gaa tcg gta gca528
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165 170 175
tgg tca gca aca gca tgc cat gat gga aaa aaa tgg atg aca gtt gga576
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gtt ccg gtt gat att att aat tca tgg gca ggg gat att tta aga acc672
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aaa gat gga aga gta att gga cag act gat ata agt ttc aat ggg gga816
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cac ata gag gag tgt tct tgt tac ccc aat gaa ggg aag gtg gaa tgc864
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act gac act cct agg gga gag gat agt caa ttc aca ggc tca tgt aca1008
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325 330 335
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Ser Pro Leu Gly Asn Lys Gly Tyr Gly Val Lys Gly Phe Gly Phe Arg
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Ser Gly Phe Glu Ile Ile Lys Ile Arg Asn Gly Trp Thr Gln Asn Ser
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Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr Lys Ser Gly Ser Ser Tyr
165 170 175
Pro Thr Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Lys Asn Phe Asp Lys Leu
180 185 190
Tyr Ile Trp Gly Ile His His Pro Ser Ser Asn Gln Glu Gln Thr Lys
195 200 205
Leu Tyr Ile Gln Glu Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser
210 215 220
Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Leu Val Arg Gly
225 230 235 240
Gln Ser Gly Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp
245 250 255
Ile Leu Met Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Val Ala Pro Arg Gly Tyr
260 265 270
Phe Lys Leu Lys Thr Gly Lys Ser Ser Val Met Arg Ser Asp Ala Pro
275 280 285
Ile Asp Ile Cys Val Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Ser
290 295 300
Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Val Thr Tyr Gly Lys Cys
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Pro Lys Tyr Ile Arg Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg
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Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly
340 345 350
Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe
355 360 365
Arg Tyr Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser
370 375 380
Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val Ile
385 390 395 400
Glu Arg Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu
405 410 415
Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys
420 425 430
Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn
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450 455 460
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Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp
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aaa tac aca tca gga aga caa gag aag aac cct gca ctt agg atg aaa144
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aaa gtc tac aaa act tat ttt gaa aag gtt gaa aga ttg aaa cac gga384
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gtt gat gta aac cct ggt cac gcg gac ctc agt gcc aaa gaa gca caa480
Val Asp Val Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Lys Glu Ala Gln
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gat gtg atc atg gaa gtt gtt ttc cca aat gaa gtg gga gcc aga att528
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210 215 220
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tgc aat cca ttg aat cct ttc gtt agt cac aaa gaa att gaa tca gtc1920
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aac agt gca gta gta atg cct gcg cat ggc cct gcc aaa agc atg gag1968
Asn Ser Ala Val Val Met Pro Ala His Gly Pro Ala Lys Ser Met Glu
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tat gat gct gtt gca aca aca cat tct tgg atc ccc aag agg aac cgg2016
Tyr Asp Ala Val Ala Thr Thr His Ser Trp Ile Pro Lys Arg Asn Arg
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tcc ata ttg aac aca agc caa agg gga ata ctc gaa gat gag cag atg2064
Ser Ile Leu Asn Thr Ser Gln Arg Gly Ile Leu Glu Asp Glu Gln Met
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tat cag aaa tgc tgc aac ctg ttt gaa aaa ttc ttc ccc agc agc tca2112
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tac aga aga cca gtc gga att tct agt atg gtt gag gcc atg gtg tcc2160
Tyr Arg Arg Pro Val Gly Ile Ser Ser Met Val Glu Ala Met Val Ser
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aag gat gag ttc gct gag atc atg aag atc tgt tcc acc att gaa gag2256
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Val Thr Gln Asn Gly Arg Ser Gly Ala Cys Lys Arg Gly Ser Ala Asp
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agt ttc ttt agc cga ctg aat tgg cta aca aaa tct gga agc tct tac528
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ata gaa cca ttt tca aag aca aca ccc cga cca ctc aaa atg cca ggt816
Ile Glu Pro Phe Ser Lys Thr Thr Pro Arg Pro Leu Lys Met Pro Gly
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Gly Pro Pro Cys His Gln Arg Ser Lys Phe Leu Leu Met Asp Ala Leu
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aaa ctg agc att gag gac cca agt cac gag gga gag ggg ata cca cta912
Lys Leu Ser Ile Glu Asp Pro Ser His Glu Gly Glu Gly Ile Pro Leu
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tat gat gca atc aaa tgc atg aaa act ttc ttt gga tgg aaa gag ccc960
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agg acc ccc aag acc aag aat atg aaa aaa aca agc caa ttg aaa tgg1104
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gca cta ggt gaa aat atg gca cca gag aaa gtg gat ttt gag gat tgt1152
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ctg aca gat tca agc tgg ata gag ctc gat gaa att ggg gag gat gtc1296
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Arg Glu Ile Leu Thr Lys Thr Thr Val Asp His Met Ala Ile Ile Lys
20 25 30
aaa tac aca tca gga aga caa gag aag aac cct gca ctt agg atg aaa144
Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys Asn Pro Ala Leu Arg Met Lys
35 40 45
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50 55 60
gag atg att cct gag aga aat gaa cag gga caa acc ctt tgg agc aaa240
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85 90 95
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115 120 125
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Thr Leu Ala Arg Arg Ile Cys Glu Lys Leu Glu Gln Ser Gly Leu Pro
260 265 270
Val Gly Gly Asn Glu Lys Lys Ala Lys Leu Ala Asn Val Val Arg Lys
275 280 285
Met Met Thr Asn Ser Gln Asp Thr Glu Leu Ser Phe Thr Ile Thr Gly
290 295 300
Asp Asn Thr Lys Trp Asn Glu Asn Gln Asn Pro Arg Ile Phe Leu Ala
305 310 315 320
Met Ile Thr Tyr Ile Thr Arg Asp Gln Pro Glu Trp Phe Arg Asn Val
325 330 335
Leu Ser Ile Ala Pro Ile Met Phe Ser Asn Lys Met Ala Arg Leu Gly
340 345 350
Lys Gly Tyr Met Phe Glu Ser Lys Ser Met Lys Leu Arg Thr Gln Ile
355 360 365
Pro Ala Glu Met Leu Ala Ser Ile Asp Leu Lys Tyr Phe Asn Asp Ser
370 375 380
Thr Lys Lys Lys Ile Glu Lys Ile Arg Pro Leu Leu Val Asp Gly Thr
385 390 395 400
Ala Ser Leu Ser Pro Gly Met Met Met Gly Met Phe Asn Met Leu Ser
405 410 415
Thr Val Leu Gly Val Ser Ile Leu Asn Leu Gly Gln Arg Lys Tyr Thr
420 425 430
Lys Thr Thr Tyr Trp Trp Asp Gly Leu Gln Ser Ser Asp Asp Phe Ala
435 440 445
Leu Ile Val Asn Ala Pro Asn His Glu Gly Ile Gln Ala Gly Val Asp
450 455 460
Arg Phe Tyr Arg Thr Cys Lys Leu Val Gly Ile Asn Met Ser Lys Lys
465 470 475 480
Lys Ser Tyr Ile Asn Arg Thr Gly Thr Phe Glu Phe Thr Ser Phe Phe
485 490 495
Tyr Arg Tyr Gly Phe Val Ala Asn Phe Ser Met Glu Leu Pro Ser Phe
500 505 510
Gly Val Ser Gly Ile Asn Glu Ser Ala Asp Met Ser Ile Gly Val Thr
515 520 525
Val Ile Lys Asn Asn Met Ile Asn Asn Asp Leu Gly Pro Ala Thr Ala
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545 550 555 560
Cys His Arg Gly Asp Thr Gln Ile Gln Thr Arg Arg Ser Phe Glu Leu
565 570 575
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580 585 590
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Cys Asn Pro Leu Asn Pro Phe Val Ser His Lys Glu Ile Glu Ser Val
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Asn Ser Ala Val Val Met Pro Ala His Gly Pro Ala Lys Ser Met Glu
645 650 655
Tyr Asp Ala Val Ala Thr Thr His Ser Trp Ile Pro Lys Arg Asn Arg
660 665 670
Ser Ile Leu Asn Thr Ser Gln Arg Gly Ile Leu Glu Asp Glu Gln Met
675 680 685
Tyr Gln Lys Cys Cys Asn Leu Phe Glu Lys Phe Phe Pro Ser Ser Ser
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Tyr Arg Arg Pro Val Gly Ile Ser Ser Met Val Glu Ala Met Val Ser
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gcg gaa aag gca atg aaa gaa tat gga gag aac ccg aaa atc gaa aca 96
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aac aaa ttt gca gca ata tgc act cac ttg gaa gtc tgc ttc atg tac144
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tcg gat ttc cac ttt ata aat gaa ctg ggt gag tca gtg gtc ata gag192
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tct ggt gac cca aat gct ctt ttg aaa cac aga ttt gaa atc att gag240
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ggg aga gat cga aca atg gca tgg aca gta gta aac agc atc tgc aac288
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aaa gag aac aga ttt gtt gaa att ggt gtg aca agg aga gaa gtt cac384
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115 120 125
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tat act ctt gat gaa gag agt aga gcc agg atc aag acc aga cta ttc528
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gat cca aga ttt gag cca cac aaa tgg gaa aaa tac tgc gtt cta gaa1632
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cga tat caa aac tct gaa gga aca ggg caa gct gca gat cta aag agc1152
Arg Tyr Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser
370 375 380
act caa gca gcc atc gac cag att aat gga aag tta aac aga gtg att1200
Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val Ile
385 390 395 400
gaa aga acc aat gag aaa ttc cat caa ata gag aag gaa ttc tca gaa1248
Glu Arg Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu
405 410 415
gta gaa gga aga att cag gac ttg gag aaa tat gta gaa gac acc aaa1296
Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys
420 425 430
ata gac cta tgg tcc tac aat gca gaa ttg ctg gtg gct cta gaa aat1344
Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn
435 440 445
caa cat aca att gac tta aca gat gca gaa atg aat aaa tta ttt gag1392
Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ala Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu
450 455 460
aag act aga cgc cag tta aga gaa aac gca gaa gac atg gga ggt gga1440
Lys Thr Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Gly Gly
465 470 475 480
tgt ttc aag att tac cac aaa tgt gat aat gca tgc att gaa tca ata1488
Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Glu Ser Ile
485 490 495
aga act ggg aca tat gac cat tac ata tac aaa gat gaa gca tta aac1536
Arg Thr Gly Thr Tyr Asp His Tyr Ile Tyr Lys Asp Glu Ala Leu Asn
500 505 510
aat cga ttt cag atc aaa ggt gta gag ttg aaa tca ggc tac aaa gat1584
Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp
515 520 525
tgg ata ctg tgg att tca ttc gcc ata tca tgc ttc tta att tgc gtt1632
Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Ile Cys Val
530 535 540
gtt cta ttg ggt ttc att atg tgg gct tgc caa aaa ggc aac atc aga1680
Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg
545 550 555 560
tgc aac att tgc att tga1698
Cys Asn Ile Cys Ile
565
<210>78
<211>565
<212>PRT
<213>流感病毒
<400>78
Met Lys Thr Thr Ile Ile Leu Ile Leu Leu Thr His Trp Ala Tyr Ser
1 5 10 15
Gln Asn Pro Ile Ser Gly Asn Asn Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His
20 25 30
His Ala Val Ala Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Met Ser Asp Asp Gln
35 40 45
Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ile Ser Met Gly
50 55 60
Lys Ile Cys Asn Lys Ser Tyr Arg Ile Leu Asp Gly Arg Asn Cys Thr
65 70 75 80
Leu Ile Asp Ala Met Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Ala Phe Gln Tyr
85 90 95
Glu Ser Trp Asp Leu Phe Ile Glu Arg Ser Ser Ala Phe Ser Asn Cys
100 105 110
Tyr Pro Tyr Asp Ile Pro Asp Tyr Ala Pro Leu Arg Ser Ile Val Ala
115 120 125
Ser Ser Gly Thr Val Glu Phe Thr Ala Glu Gly Phe Thr Trp Thr Gly
130 135 140
Val Thr Gln Asn Gly Arg Ser Gly Ala Cys Lys Arg Gly Ser Ala Asp
145 150 155 160
Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr Lys Ser Gly Ser Ser Tyr
165 170 175
Pro Thr Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Lys Asn Phe Asp Lys Leu
180 185 190
Tyr Ile Trp Gly Ile His His Pro Ser Ser Asn Gln Glu Gln Thr Lys
195 200 205
Leu Tyr Ile Gln Glu Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser
210 215 220
Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Leu Val Arg Gly
225 230 235 240
Gln Ser Gly Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp
245 250 255
Ile Leu Met Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Val Ala Pro Arg Gly Tyr
260 265 270
Phe Lys Leu Asn Thr Gly Lys Ser Ser Val Met Arg Ser Asp Val Pro
275 280 285
Ile Asp Ile Cys Val Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Ser
290 295 300
Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Val Thr Tyr Gly Lys Cys
305 310 315 320
Pro Lys Tyr Ile Arg Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg
325 330 335
Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly
340 345 350
Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe
355 360 365
Arg Tyr Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser
370 375 380
Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val Ile
385 390 395 400
Glu Arg Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu
405 410 415
Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys
420 425 430
Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn
435 440 445
Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ala Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu
450 455 460
Lys Thr Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Gly Gly
465 470 475 480
Cys Phe LysIle Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Glu Ser Ile
485 490 495
Arg Thr Gly Thr Tyr Asp His Tyr Ile Tyr Lys Asp Glu Ala Leu Asn
500 505 510
Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp
515 520 525
Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Ile Cys Val
530 535 540
Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg
545 550 555 560
Cys Asn Ile Cys Ile
565
<210>79
<211>20
<212>DNA
<213>流感病毒
<400>79
tatgcatcgc tccgatccat 20
<210>80
<211>21
<212>DNA
<213>流感病毒
<400>80
gctccacttc ttccgttttg a 21
<210>81
<211>30
<212>DNA
<213>流感病毒
<400>81
aattcacagc agagggattc acatggacag30
<210>82
<211>24
<212>DNA
<213>流感病毒
<220>
<221>變異
<222>(7)..(7)
<223>r＝a或g
<400>82
catggartgg ctaaagacaa gacc24
<210>83
<211>24
<212>DNA
<213>流感病毒
<220>
<221>變異
<222>(18)..(18)
<223>k＝g或t
<400>83
agggcatttt ggacaaakcg tcta24
<210>84
<211>18
<212>DNA
<213>流感病毒
<400>84
acgctcaccg tgcccagt 18
<210>85
<211>28
<212>DNA
<213>流感病毒
<400>85
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<210>86
<211>42
<212>DNA
<213>流感病毒
<400>86
tgtaatacga ctcactatag ggctccactt cttccgtttt ga 42
<210>87
<211>30
<212>DNA
<213>流感病毒
<400>87
gatcgctctt cagggagcaa aagcaggtag 30
<210>88
<211>40
<212>DNA
<213>流感病毒
<400>88
tgtaatacga ctcactatag ggcattttgg acaaagcgtc40
權(quán)利要求
1.分離的流感病毒，其能夠感染犬科動(dòng)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的流感病毒，其中所述流感病毒具有H3的HA血清型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的流感病毒，其中所述流感病毒具有血清型H3N8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的流感病毒，其中所述流感病毒包含編碼具有SEQID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一個(gè)中所示的氨基酸序列的多肽或者其功能和/或免疫原性片段的多核苷酸，或者所述多核苷酸編碼與SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一個(gè)中所示的氨基酸序列有99％或者更大的序列同一性的多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的流感病毒，其中所述流感病毒包含具有SEQ IDNO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一個(gè)中所示的核苷酸序列的多核苷酸，或者所述多核苷酸與SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一個(gè)中所示的核苷酸序列有98％或者更大的序列同一性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的流感病毒，其中所述流感病毒是稱作A/canine/Florida/43/2004的病毒隔離群或者稱作A/canine/Florida/242/2003的病毒隔離群。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的流感病毒，其中所述流感病毒是稱作canine/Jax/05的病毒隔離群或稱作canine/Miami/05的病毒隔離群。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的流感病毒，其中所述流感病毒被滅活或減毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的流感病毒，其中所述流感病毒在可藥用載體或稀釋劑中提供。
10.分離的多核苷酸，其包含權(quán)利要求1的流感病毒的基因組區(qū)段或基因的全部或部分。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含選自神經(jīng)氨酸酶基因、核蛋白基因、基質(zhì)蛋白基因、聚合酶堿性蛋白基因、聚合酶酸性蛋白基因、非結(jié)構(gòu)蛋白基因、和血凝素基因的流感基因的全部或者部分。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的多核苷酸，其中所述流感病毒包含編碼具有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一個(gè)中所示的氨基酸序列的多肽或者其功能和/或免疫原性片段的多核苷酸，或者所述多核苷酸編碼與SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一個(gè)中所示的氨基酸序列有99％或者更大的序列同一性的多肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的多核苷酸，其中所述流感病毒包含具有SEQID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一個(gè)中所示的核苷酸序列的多核苷酸，或者所述多核苷酸與SEQ IDNO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75或77的任一個(gè)中所示的核苷酸序列有98％或者更大的序列同一性。
14.根據(jù)權(quán)利要求10的多核苷酸，其中用可藥用載體或稀釋劑配制所述多核苷酸。
15.多核苷酸表達(dá)構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求10的多核苷酸。
16.寡核苷酸，其可以與權(quán)利要求10的多核苷酸的編碼或者非編碼序列雜交。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在高嚴(yán)格條件下與所述序列雜交。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸長為10到500個(gè)核苷酸、10到20個(gè)核苷酸、21到30個(gè)核苷酸、31到40個(gè)核苷酸、41到50個(gè)核苷酸、51到60個(gè)核苷酸、61到70個(gè)核苷酸、71到80個(gè)核苷酸、81到90個(gè)核苷酸或91到100個(gè)核苷酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含可檢測的標(biāo)記或者報(bào)告分子。
20.根據(jù)權(quán)利要求16的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與包含權(quán)利要求1的流感病毒的基因組區(qū)段或基因的全部或部分的多核苷酸有約90％到100％的核苷酸序列同一性。
21.根據(jù)權(quán)利要求16的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含SEQ IDNO35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、79、80、81、82、83、84、85、86、87或88任一個(gè)中所示的核苷酸序列。
22.權(quán)利要求10的多核苷酸編碼的經(jīng)分離的多肽。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的多肽，其中所述多肽選自血凝素蛋白、神經(jīng)氨酸酶蛋白、核蛋白、基質(zhì)蛋白、聚合酶堿性蛋白、聚合酶酸性蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一個(gè)中顯示的氨基酸序列，或其功能性和/或免疫原性片段。
25.根據(jù)權(quán)利要求22的多肽，其中用可藥用載體或稀釋劑配制所述多肽。
26.包含權(quán)利要求1的流感病毒的免疫原的組合物，其中所述免疫原能夠誘導(dǎo)針對流感病毒的免疫應(yīng)答，所述流感病毒能夠感染犬科動(dòng)物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的組合物，其中所述免疫原包含無細(xì)胞的完整病毒，或者其部分；病毒多核苷酸；病毒蛋白；病毒多肽或者肽；病毒感染的細(xì)胞；基于重組病毒載體的構(gòu)建體；重排列病毒；或者所述病毒的裸核酸。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的組合物，其中所述病毒蛋白質(zhì)、多肽或者肽包含SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一個(gè)中所示的氨基酸序列或者其功能和/或免疫原性片段，或者所述多核苷酸編碼與SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78的任一個(gè)中所示的氨基酸序列有99％或者更大的序列同一性的多肽。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的組合物，其中所述病毒多核苷酸編碼包含SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一個(gè)中所示的氨基酸序列的多肽，或者其功能和/或免疫原性片段。
30.根據(jù)權(quán)利要求26的組合物，其中用可藥用載體或稀釋劑配制所述組合物。
31.在動(dòng)物中誘導(dǎo)針對能夠感染犬科動(dòng)物的流感病毒的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括對所述動(dòng)物施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求26的組合物。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述組合物包含病毒蛋白質(zhì)、多肽或者肽，或者其功能和/或免疫原性片段，所述病毒蛋白質(zhì)、多肽或者肽包含SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、34、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78任一個(gè)中所示的氨基酸序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述組合物包含能夠感染犬科動(dòng)物的流感病毒或所述病毒的部分。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述流感病毒選自稱作A/canine/Florida/43/2004的病毒隔離群、稱作A/canine/Florida/242/2003的病毒隔離群、稱作canine/Jax/05的病毒隔離群或稱作canine/Miami/05的病毒隔離群，或所述病毒隔離群的任一種的部分。
35.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述免疫應(yīng)答是保護(hù)性免疫應(yīng)答，其預(yù)防或者阻止流感病毒對所述動(dòng)物的感染。
36.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述流感病毒具有選自H3的HA血清型。
37.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述流感病毒具有血清型H3N8。
38.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述組合物還包含佐劑。
39.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述動(dòng)物是犬科動(dòng)物。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述犬科動(dòng)物是馴養(yǎng)的狗。
41.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中腸胃外施用所述組合物。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中皮下、腹膜內(nèi)或者肌內(nèi)施用所述組合物。
43.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中經(jīng)鼻或者經(jīng)口施用所述組合物。
44.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述流感病毒是被滅活的或減毒的。
45.分離的抗體，其特異結(jié)合權(quán)利要求22的多肽的表位。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
47.根據(jù)權(quán)利要求45的抗體，其中所述抗體結(jié)合血凝素蛋白。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的抗體，其中所述血凝素蛋白是H3血凝素蛋白。
49.根據(jù)權(quán)利要求47的抗體，其中所述血凝素蛋白包含SEQ ID NO16、SEQ ID NO32、SEQ ID NO62或SEQ ID NO78中所示的氨基酸序列。
50.細(xì)胞，其包含
a)能夠感染犬科動(dòng)物的流感病毒；或
b)多核苷酸，其包含權(quán)利要求1的流感病毒的基因組區(qū)段或基因的全部或部分。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是犬科動(dòng)物細(xì)胞。
52.檢測能夠感染犬科動(dòng)物的流感病毒的方法，所述方法包括從動(dòng)物得到生物樣品，并對所述樣品篩選結(jié)合權(quán)利要求1的流感病毒的蛋白質(zhì)、多肽或者肽的抗體或者配體的存在。
53.檢測能夠感染犬科動(dòng)物的流感病毒的方法，所述方法包括從動(dòng)物得到核酸樣品，并將所述核酸樣品與根據(jù)權(quán)利要求16的寡核苷酸接觸，并確定所述寡核苷酸在嚴(yán)格條件下是否與所述核酸雜交。
54.篩選對能夠感染犬科動(dòng)物的流感病毒具有抗病毒活性的化合物的方法，所述方法包括將用權(quán)利要求1的病毒感染或者包含所述病毒的細(xì)胞與受試化合物接觸，并確定所述受試化合物是否抑制所述病毒在所述細(xì)胞中的活性。
55.重排列病毒，其包含權(quán)利要求1的流感病毒的至少一種基因、基因組區(qū)段或者多核苷酸。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的重排列病毒，其中用可藥用載體或稀釋劑配制所述重排列病毒。
57.分離的病毒，其包含一種或多種多核苷酸，其中所述一種或多種多核苷酸編碼選自HA、NA、NP、MA、PB1、PB2、PA和NS的犬科動(dòng)物流感病毒蛋白質(zhì)，或者其功能或者免疫原性片段。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的病毒，其中所述一種或多種多核苷酸包含選自SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75和77的核苷酸序列。
59.根據(jù)權(quán)利要求57的病毒，其中所述HA蛋白質(zhì)具有選自SEQ IDNO16、32、62和78的氨基酸序列。
60.根據(jù)權(quán)利要求57的病毒，其中所述NA蛋白質(zhì)具有選自SEQ IDNO12、28、58和74的氨基酸序列。
61.根據(jù)權(quán)利要求57的病毒，其中所述NP蛋白質(zhì)具有選自SEQ IDNO10、26、56和72的氨基酸序列。
62.根據(jù)權(quán)利要求57的病毒，其中所述MA蛋白質(zhì)具有選自SEQ IDNO14、30、60和76的氨基酸序列。
63.根據(jù)權(quán)利要求57的病毒，其中所述PB1蛋白質(zhì)具有選自SEQ IDNO4、20、50和66的氨基酸序列。
64.根據(jù)權(quán)利要求57的病毒，其中所述PB2蛋白質(zhì)具有選自SEQ IDNO2、18、48和64的氨基酸序列。
65.根據(jù)權(quán)利要求57的病毒，其中所述PA蛋白質(zhì)具有選自SEQ IDNO6、22、52和68的氨基酸序列。
66.根據(jù)權(quán)利要求57的病毒，其中所述NS蛋白質(zhì)具有選自SEQ IDNO8、24、54和70的氨基酸序列。
67.根據(jù)權(quán)利要求57的病毒，其中在可藥用載體或稀釋劑中提供所述病毒。
68.檢測能夠感染犬科動(dòng)物的流感病毒的方法，所述方法包括從動(dòng)物得到含有核酸的樣品，并將所述核酸樣品與特異結(jié)合所述病毒的多核苷酸或者基因序列的正向和反向寡核苷酸引物在一定條件下接觸，如果所述核酸含有所述引物結(jié)合的序列，那么所述條件足以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物；并檢測所述擴(kuò)增產(chǎn)物。
69.根據(jù)權(quán)利要求68的方法，其中所述寡核苷酸引物是與多核苷酸的編碼或非編碼序列雜交的寡核苷酸，所述多核苷酸包含能夠感染犬科動(dòng)物的流感病毒的基因組區(qū)段或基因的全部或部分。
70.保護(hù)犬科動(dòng)物免于流感病毒感染的方法，其中所述方法包括對所述犬科動(dòng)物施用治療有效量的疫苗，該疫苗包含
至少一種馬流感病毒抗原，和
至少一種可藥用賦形劑。
71.根據(jù)權(quán)利要求70的方法，其中所述馬流感病毒抗原包含滅活的病毒。
72.根據(jù)權(quán)利要求70的方法，其中所述馬流感病毒抗原包含活的減毒病毒。
73.根據(jù)權(quán)利要求70的方法，其中所述疫苗包含來自一種以上病毒隔離群的馬流感病毒抗原。
74.根據(jù)權(quán)利要求70的方法，其中所述疫苗包含來自H7流感病毒的至少一種抗原。
75.根據(jù)權(quán)利要求70的方法，其中皮下施用所述疫苗。
76.根據(jù)權(quán)利要求70的方法，其中鼻內(nèi)施用所述疫苗。
77.根據(jù)權(quán)利要求70的方法，其中所述疫苗與選自博德特氏菌疫苗、腺病毒疫苗和副流感病毒疫苗的至少一種疫苗組合施用。
78.保護(hù)犬科動(dòng)物免于H3流感病毒感染的方法，其中該方法包括對所述犬科動(dòng)物施用治療有效量的疫苗，該疫苗包含
至少一種H3流感病毒抗原和/或至少一種H7流感病毒抗原，和
至少一種可藥用賦形劑。
79.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中所述疫苗包含來自一種或多種下列犬科動(dòng)物流感病毒隔離群的一種或多種抗原A/canine/Florida/43/2004、A/canine/Florida/242/2003、canine/Jax/05和canine/Miami/05。
80.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中所述疫苗包含來自H7流感病毒的至少一種抗原。
81.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中所述H3流感病毒抗原包含滅活的病毒。
82.根據(jù)權(quán)利要求81的方法，其中所述疫苗包含來自一種或多種下列犬科動(dòng)物流感病毒隔離群的一種或多種抗原A/canine/Florida/43/2004、A/canine/Florida/242/2003、canine/Jax/05和canine/Miami/05。
83.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中所述H3流感病毒抗原包含活的減毒病毒。
84.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中所述疫苗包含從受感染的犬科動(dòng)物分離的病毒隔離群的至少一種抗原。
85.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中所述疫苗包含來自一種以上病毒隔離群的抗原。
86.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中皮下施用所述疫苗。
87.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中鼻內(nèi)施用所述疫苗。
88.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中將所述疫苗施用于犬科動(dòng)物一次。
89.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中將所述疫苗施用于犬科動(dòng)物至少兩次。
90.根據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中在第一次劑量后約2到約8周將所述疫苗的第二次劑量施用于所述犬科動(dòng)物。
91.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中所述疫苗與選自博德特氏菌疫苗、腺病毒疫苗和副流感病毒疫苗的至少一種疫苗組合施用。
92.保護(hù)犬科動(dòng)物免于犬科動(dòng)物流感病毒引起的呼吸系統(tǒng)損傷的方法，其中該方法包括對所述犬科動(dòng)物施用治療有效量的疫苗，該疫苗包含
至少一種馬流感病毒抗原，和
至少一種可藥用賦形劑。
93.根據(jù)權(quán)利要求92的方法，其中在所述犬科動(dòng)物被感染犬科動(dòng)物流感病毒之前對該犬科動(dòng)物施用所述疫苗。
94.保護(hù)犬科動(dòng)物免于犬科動(dòng)物流感病毒引起的呼吸系統(tǒng)損傷的方法，其中該方法包括對所述犬科動(dòng)物施用治療有效量的疫苗，該疫苗包含
至少一種H3流感病毒抗原和/或至少一種H7流感病毒抗原，和
至少一種可藥用賦形劑。
95.根據(jù)權(quán)利要求94的方法，其中在所述犬科動(dòng)物被感染犬科動(dòng)物流感病毒之前對該犬科動(dòng)物施用所述疫苗。
96.保護(hù)犬科動(dòng)物免于犬科動(dòng)物流感病毒感染引起的鼻或口分泌物中具有犬科動(dòng)物流感病毒的方法，其中該方法包括對該犬科動(dòng)物施用治療有效量的疫苗，該疫苗包含
至少一種馬流感病毒抗原，和
至少一種可藥用賦形劑。
97.根據(jù)權(quán)利要求96的方法，其中在所述犬科動(dòng)物被犬科動(dòng)物流感病毒感染之前對該犬科動(dòng)物施用所述疫苗。
98.保護(hù)犬科動(dòng)物免于犬科動(dòng)物流感病毒感染引起的鼻或口分泌物中具有犬科動(dòng)物流感病毒的方法，其中該方法包括對該犬科動(dòng)物施用治療有效量的疫苗，該疫苗包含
至少一種H3流感病毒抗原和/或至少一種H7流感病毒抗原，和
至少一種可藥用賦形劑。
99.根據(jù)權(quán)利要求98的方法，其中在所述犬科動(dòng)物被犬科動(dòng)物流感病毒感染之前對該犬科動(dòng)物施用所述疫苗。
100.犬科動(dòng)物流感疫苗，其中該疫苗包含
治療有效量的至少一種H3流感病毒抗原和/或至少一種H7流感病毒抗原，和
至少一種可藥用賦形劑。
101.根據(jù)權(quán)利要求100的疫苗，其中所述疫苗包含來自一種或多種下列犬科動(dòng)物流感病毒隔離群的一種或多種抗原A/canine/Florida/43/2004、A/canine/Florida/242/2003、canine/Jax/05和canine/Miami/05。
102.根據(jù)權(quán)利要求100的疫苗，其中所述病毒抗原包含滅活的病毒。
103.根據(jù)權(quán)利要求102的疫苗，其中所述疫苗包含來自一種或多種下列犬科動(dòng)物流感病毒隔離群的一種或多種抗原A/canine/Florida/43/2004、A/canine/Florida/242/2003、canine/Jax/05和canine/Miami/05。
104.根據(jù)權(quán)利要求100的疫苗，其中所述病毒抗原包含活的減毒病毒。
105.犬科動(dòng)物流感疫苗，其中該疫苗包含
治療有效量的馬流感病毒抗原，和
至少一種可藥用賦形劑。
106.根據(jù)權(quán)利要求105的疫苗，其中所述馬流感病毒抗原包含滅活的病毒。
107.根據(jù)權(quán)利要求105的疫苗，其中所述病毒抗原包含活的減毒病毒。
108.用于保護(hù)犬科動(dòng)物免于流感病毒感染的藥盒，其中該藥盒包含
治療有效量的疫苗，該疫苗包含至少一種馬流感病毒抗原，和
選自下列的至少一種組分
用于將疫苗施用于所述犬科動(dòng)物的裝置，
幫助將疫苗施用于所述犬科動(dòng)物的可藥用賦形劑，
增強(qiáng)犬科動(dòng)物對該疫苗的免疫應(yīng)答的可藥用賦形劑，
與疫苗一起同時(shí)被犬科動(dòng)物消費(fèi)的食物，和
與疫苗一起同時(shí)被犬科動(dòng)物消費(fèi)的膳食(treat)。
109.根據(jù)權(quán)利要求108的藥盒，其中該藥盒包含用于將疫苗皮下施用于所述犬科動(dòng)物的裝置。
110.根據(jù)權(quán)利要求108的藥盒，其中該藥盒包含用于將疫苗鼻內(nèi)施用于所述犬科動(dòng)物的裝置。
111.用于保護(hù)犬科動(dòng)物免于H3流感病毒感染的藥盒，其中該藥盒包含
治療有效量的疫苗，該疫苗包含至少一種H3流感病毒抗原和/或至少一種H7流感病毒抗原，和
選自下列的至少一種組分
用于將疫苗施用于所述犬科動(dòng)物的裝置，
幫助將疫苗施用于所述犬科動(dòng)物的可藥用賦形劑，
增強(qiáng)犬科動(dòng)物對該疫苗的免疫應(yīng)答的可藥用賦形劑，
與疫苗一起同時(shí)被犬科動(dòng)物消費(fèi)的食物，和
與疫苗一起同時(shí)被犬科動(dòng)物消費(fèi)的膳食(treat)。
112.根據(jù)權(quán)利要求111的藥盒，其中
該藥盒包含所述疫苗的兩次劑量；和
該兩次劑量一起包含所述疫苗的治療有效量。
113.根據(jù)權(quán)利要求111的藥盒，其中該藥盒包含用于將疫苗皮下施用于所述犬科動(dòng)物的裝置。
114.根據(jù)權(quán)利要求111的藥盒，其中該藥盒包含用于將疫苗鼻內(nèi)施用于所述犬科動(dòng)物的裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的流感病毒，其能夠感染犬科動(dòng)物和在犬科動(dòng)物中引起呼吸系統(tǒng)疾病。本發(fā)明還涉及用于誘導(dǎo)針對本發(fā)明的流感病毒的免疫應(yīng)答的組合物和方法。本發(fā)明還涉及用于鑒定本發(fā)明的病毒和診斷本發(fā)明病毒對動(dòng)物的感染的組合物和方法。
文檔編號C07K14/11GK101563361SQ200680041958
公開日2009年10月21日 申請日期2006年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月19日
發(fā)明者P·C·克勞福德, P·J·吉布斯, E·J·杜博維, R·O·多尼斯, J·卡茨, A·I·克利莫夫, N·P·拉克什曼, M·A·盧姆, D·G·E·古瓦爾特斯, M·W·梅倫坎普, N·J·考克斯, W·L·卡斯?fàn)柭?申請人:佛羅里達(dá)大學(xué)研究基金公司, 疾病控制和預(yù)防中心健康公共事業(yè)部部長所代表的美國政府, 康乃爾研究基金會(huì)有限公司, 因特韋特國際有限公司