專利名稱：顯微光學(xué)葡萄糖檢測器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型熒光化合物，尤其涉及適用于檢測糖
(saccharide)或糖類(sugar)如葡萄糖的新型熒光化合物，涉及使用這類熒 光化合物進(jìn)行糖檢測的新方法，和涉及新型的完全集成的熒光檢測微 系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
已經(jīng)開發(fā)了許多種測定方法來檢測和定量測定生物樣品中包含的 被分析物。目前所用的大部分測定方法依賴于被分析物和測定試劑之 間的特異性結(jié)合反應(yīng)。被分析物可以是大的復(fù)雜分子，如蛋白質(zhì)、病 毒、病毒抗原、細(xì)菌細(xì)胞、細(xì)胞表面受體、酶、激素、多糖、糖蛋白、 脂蛋白、或小的半抗原分子(haptenic molecule)如肽、某些激素、治療 藥物和被濫用的藥物，這些僅僅是例子。
結(jié)合測定可基于它們的形式分為兩大類均相和非均相測定。均 相測定是基于被分析物和測定試劑間的單相反應(yīng)。非均相測定典型地 涉及液體樣品中包含的被分析物和測定試劑的結(jié)合，所述測定試劑連 接于固體載體。已使用多種材料作為載體表面，包括玻璃棒、玻璃珠、 經(jīng)硅石浸漬的條、玻璃纖維和微粒。
通常，染料，尤其是熒光染料，常常被用于均相和非均相的結(jié)合 測定，以提供可檢測信號。然而，由結(jié)合有標(biāo)記的被分析物產(chǎn)生的熒 光信號的精確檢測常常被高的和多變的背景所干擾，這是由于生物樣 品本身的熒光。
液體流動細(xì)胞計(jì)量術(shù)幫助解決了這個(gè)問題。在流動細(xì)胞計(jì)量術(shù)中，將具有結(jié)合的被分析物的己標(biāo)記粒子通過激光束。發(fā)射的粒子熒光信 號被測定，并與被分析物的存在和量相關(guān)聯(lián)。本方法的主要優(yōu)點(diǎn)為， 在該樣品的其它未結(jié)合成分的存在下，能精確地檢測和測量與被結(jié)合 的被分析物相關(guān)的熒光信號。
糖代表重要的一類生物化學(xué)分析物。用于確定樣品中它們濃度的 現(xiàn)有方法典型地依靠酶測定。盡管酶測定已經(jīng)證明是可靠的，但是它 們必須利用相當(dāng)不穩(wěn)定的酶，其可在它們基底存在的情況下耗盡。另 外，常規(guī)的酶測定方法不能以方便的流動細(xì)胞計(jì)量術(shù)的形式利用?；?于粒子的測定如在流動細(xì)胞計(jì)量術(shù)中使用的測定，要求限制于粒子的 信號變化。普通的酶分析方法使用違反該要求的可自由擴(kuò)散的中間體。
在臨床設(shè)置中，糖的測定是特別重要的。治療糖尿病和低血糖要 求頻繁地測量組織的葡萄糖濃度。這通常是通過每天抽取幾次少量的 血液樣品(如通過手指穿刺)來完成?；颊叩湫偷厥褂檬中g(shù)刀來抽取血 滴，并將該血滴應(yīng)用于試劑條，該試劑條用小的儀器讀數(shù)。該方法是 疼痛的、侵入性的和耗時(shí)的。
最近的方法涉及植入傳感器粒子，所述粒子能產(chǎn)生可檢測的被分 析物信號，該信號響應(yīng)于體內(nèi)的被分析物濃度。所建議的方法比常規(guī)
的用于測定血液D-葡萄糖的手指穿刺技術(shù)具有較少的侵入性。它僅要 求定期的更換皮膚中的傳感器粒子。
傳感器粒子典型地包括熒光傳感器，所述傳感器或者連接于粒子 表面，或者結(jié)合到粒子的本體內(nèi)。傳感器對于目標(biāo)分析物是特定的。 傳感器和分析物的結(jié)合產(chǎn)生了可檢測信號，所述信號響應(yīng)于被分析物 的濃度。當(dāng)被分析物為葡萄糖時(shí)，與熒光團(tuán)共軛的硼酸或二硼酸已經(jīng)
被使用。典型的例子顯示于圖式1中非熒光 熒光 圖式1
苯基硼酸(PBA)已被固定在用于糖傳感器中的轉(zhuǎn)換器的表面上。 例如，碳和金屬電極已被含PBA的聚合物如聚(丙烯酸酯)、聚(苯胺) 和聚(吡咯)改性。自組裝的PBA單層也已被用于開發(fā)敏感性和選擇性 的電化學(xué)和光學(xué)糖傳感器，但是直到現(xiàn)在它們?nèi)晕从糜诖笠?guī)模的熒光 檢測單元或熒光檢測微系統(tǒng)中。由于獲得精確的葡萄糖讀數(shù)對于糖尿 病患者健康的重要性，因此高度期望有一種用于葡萄糖測試的精確方 法，該方法使用PET-型熒光化合物和熒光檢測系統(tǒng)。另外，高度期望 有一種小型化熒光檢測系統(tǒng)，其允許糖尿病患者監(jiān)控他或她自己的葡 萄糖水平。
發(fā)明簡述
本發(fā)明提供了式I的化合物，所述化合物在金表面上形成自組裝 的單層，并在糖的存在下發(fā)熒光
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其中F表示熒光團(tuán)，R為低級脂族或芳族基團(tuán)，n和m各自為0、 l或2， n+m為整數(shù)2或3， p為1 約30的整數(shù)，[CH2CH2]P部分與連接到硼原子的苯環(huán)為取代的或未取代的。
本發(fā)明還提供一種用于檢測被分析物的集成的微流體熒光檢測系 統(tǒng)，該系統(tǒng)包括光源；涂覆于金表面上的自組裝單層，其中該自組
裝單層包括在被分析物存在下發(fā)熒光的熒光團(tuán)；光處理器；和檢測器。 在一個(gè)實(shí)施方案中，式I的化合物在金表面上形成自組裝單層。
本發(fā)明還提供了一種使用微流體熒光檢測系統(tǒng)來檢測生物樣品中 糖的存在或量的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖尿病患者可使用本發(fā)明 的微流體熒光檢測系統(tǒng)監(jiān)控他或她自己的葡萄糖水平。
附圖簡述


圖1和圖2為制備式II化合物的合成圖。
圖3為本發(fā)明的經(jīng)微加工的熒光糖檢測器的示意圖。
圖4為本發(fā)明的經(jīng)微加工的熒光糖檢測器示意圖，其顯示了單層
表面下方的微/小型流體通道。
圖5為微放電光源的示意圖。
圖6為配備有閃耀光柵的光處理器的示意圖。
圖7說明了傳輸閃耀光柵，包括用于計(jì)算通過光柵的衍射光的方
向所需的參數(shù)。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供一種新型的感測和結(jié)合糖的化合物，其在金表面上形 成自組裝的單層。這樣形成的感測糖的金結(jié)構(gòu)可通過小手術(shù)植入到患 者體內(nèi)或應(yīng)用于熒光檢測系統(tǒng)用于檢測糖。本發(fā)明還提供了一種完全 集成的微流體系統(tǒng)用于熒光檢測。
定義
除非另有說明，使用下列定義-
如本文中所使用的，術(shù)語"自組裝單層"(SAM)是指通過分子的自發(fā)組織在固體表面上形成單向的層。 一個(gè)例子為在金上硫羥化合物 的組織。
如本文中所使用的，術(shù)語"熒光團(tuán)"是指當(dāng)暴露于光源或被光源 激發(fā)時(shí)，發(fā)出熒光的化合物或基團(tuán)，所述光源為例如可見光或紅外光。
如本文中所使用的，在此使用的術(shù)語"患者"是指任意動物，包 括哺乳動物，優(yōu)選小鼠、大鼠、其它嚙齒類動物、兔子、狗、貓、豬、 牛、羊、馬或靈長類動物，最優(yōu)選人類，所述物在其血液或尿中目前 具有或可能具有可檢測的葡萄糖。該術(shù)語可指明雄性或雌性或者兩者 都有，或排除雄性或雌性。
本發(fā)明的新型感測和結(jié)合糖的化合物具有下式L-
其中F代表熒光團(tuán)，R為低級脂族基或芳族基，n和m各自為0、 1或2， n+m為整數(shù)2或3， p為1~約30的整數(shù)。優(yōu)選地，p至少為 12，并且更優(yōu)選p至少為15?；鶊F(tuán)[CH2CH2]p可為未取代的，或被不對 熒光性產(chǎn)生不利影響的取代基取代。式I的化合物在糖的存在下通過光 誘導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移(PET)機(jī)理發(fā)出熒光。傳感器的熒光強(qiáng)度的變化響應(yīng)于 胺基和熒光團(tuán)之間光誘導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)換，其通過將糖羥基與硼酸結(jié)合來 調(diào)控。在缺少糖結(jié)合時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光被氮原子的未共享電子 對熄滅。例如當(dāng)葡萄糖被結(jié)合時(shí)，未共享電子對以鍵的形式被利用， 不參與熄滅熒光。硼酸和葡萄糖之間的硼酸酯的形成增加了硼酸的路易斯(Lewis)酸度，降低了PET，并重新引起傳感器的內(nèi)在熒光。
在上式I中，熒光團(tuán)(F)包括大量的含有7t-電子系統(tǒng)的原子或基團(tuán)。 優(yōu)選的熒光團(tuán)包括萘基(naphtyl)、蒽基、芘基和菲基。最優(yōu)選的熒光 團(tuán)為蒽基。形成熒光團(tuán)的原子或基團(tuán)任選地被取代，只要取代基不會 對熒光產(chǎn)生不利的影響。
在式I中，連接在氮原子上的R基團(tuán)表示低級脂族或芳族官能團(tuán)。 優(yōu)選地，R為具有1 4個(gè)碳原子的垸基，即甲基、乙基、丙基或丁基， 或苯基。
在式I中，m為0、 l或2。因此，本發(fā)明化合物中的氮原子被置 于硼酸部分附近，通過亞甲基或亞乙基連接該氮原子，或者該氮原子 直接連接到苯基硼酸的鄰位上。優(yōu)選m為1，因此氮通過亞甲基連接 到苯環(huán)上。在式I中，n還為0、 l或2， n+m為整數(shù)2或3。因此氮原 子和硼酸位于緊鄰熒光團(tuán)的位置。優(yōu)選n為l。
連接到苯基硼酸的硼原子的苯環(huán)可被合適的取代基取代，只要這 種取代不會對熒光產(chǎn)生不利的影響。合適的取代基例子包括甲基、 乙基、丙基、丁基、苯基、甲氧基、乙氧基、丁氧基和苯氧基。
如式I表示的本發(fā)明化合物包括在其分子結(jié)構(gòu)內(nèi)的熒光團(tuán)，但是 在缺少糖時(shí)不發(fā)射熒光。應(yīng)當(dāng)理解，這是因?yàn)闊晒鈭F(tuán)的熒光被氮原子 的未共享電子對熄滅；氮的電子占據(jù)了熒光團(tuán)的最低激發(fā)單重能態(tài)以 致于抑制了熒光。然而，本發(fā)明的化合物在結(jié)合糖后發(fā)射高強(qiáng)度的熒 光。該現(xiàn)象可按如下解釋糖的存在產(chǎn)生了在氮原子(N)和硼原子(B) 之間的鍵，以形成糖與本發(fā)明的苯基硼酸化合物的強(qiáng)的絡(luò)合物，其中 缺乏電子的硼原子已與富電子的氮相結(jié)合。因此，氮原子的未共享電 子對已被用于與硼原子結(jié)合，將不會有助于熒光熄滅光電分子 (electrogen)轉(zhuǎn)移過程，從而顯示了化合物的內(nèi)在熒光。落入本發(fā)明式I內(nèi)的優(yōu)選化合物為具有式II的化合物，其中F(熒 光團(tuán))為蒽基，R為甲基，n和m各自為l, p為12 約30的整數(shù)，最 優(yōu)選地，p為15 約30的整數(shù)。
(II)
式II的化合物在單糖如D-葡萄糖和D-果糖的存在下展示出高度 增加的強(qiáng)度的熒光。因此，該化合物通常適用于檢測單糖，或尤其適 用于特定的單糖。在檢測可含有多種單糖的樣品中的特定單糖時(shí)，樣 品通常要經(jīng)受預(yù)處理(例如色譜法)以分離多糖，然后使用本發(fā)明的熒光 化合物檢測。另外，樣品中單糖分析物的量可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法 由熒光強(qiáng)度來確定。
本發(fā)明的化合物在金表面上形成自組裝的單層?；衔锏牧蛄u基 易于吸附于金表面，從而形成含有游離的苯基硼酸部分的單層，所述 苯基硼酸部分充當(dāng)糖結(jié)合部位。硫羥從其低濃度溶液中被吸附，所述 濃度優(yōu)選為0.5 2.5mM，最優(yōu)選l 2mM。合適的溶劑包括甲醇、乙 醇和四氫呋喃(THF)。 SAM的質(zhì)量取決于吸附時(shí)間。合適的吸附時(shí)間范 圍為約12小時(shí) 2天或3天。優(yōu)選更長的吸附時(shí)間以生成最高質(zhì)量的 SAM。
金表面合適地作為薄膜而形成在基底上。合適的基底材料為那些 能良好地傳輸紅外光、可見光和/或紫外線的材料。優(yōu)選的材料包括玻 璃、硅、碳納米管或聚合物基底如聚二甲基硅氧垸(PDMS)。還可使用 單晶基底。用于制備本發(fā)明的具有硫羥的SAM的優(yōu)選晶面為(lll)取向?；卓蔀槠降?、凹的或凸的。優(yōu)選平的基底?；壮叽缈梢宰兓? 這取決于最終結(jié)構(gòu)如何被用于(例如作為外科手術(shù)植入物)大規(guī)模熒光 檢測單元中或用于熒光檢測微系統(tǒng)中。合適的小且平的玻璃基底包括
顯微鏡玻璃蓋玻片，如那些以商標(biāo)GoldSea產(chǎn)或Superslip⑧銷售的基底。
由于PET機(jī)理，在缺少糖時(shí)，金表面將不發(fā)熒光；在存在糖時(shí)， 金表面將發(fā)熒光。本發(fā)明化合物的PET性能可發(fā)生變化，這取決于連 接到硫羥基的亞垸基鏈的長度。
金結(jié)構(gòu)可通過外科手術(shù)植入到患者體內(nèi)以連續(xù)監(jiān)控葡萄糖水平。 然后通過光學(xué)裝置測量在葡萄糖存在下產(chǎn)生的熒光信號。如果在活體 外樣品(即從患者活體中取出的樣品)中檢測葡萄糖，可以使用大規(guī) 模熒光檢測單元或使用熒光檢測微系統(tǒng)來檢測熒光，這也構(gòu)成本發(fā)明 的一部分。
圖3和圖4為本發(fā)明微系統(tǒng)例子的示意圖。本發(fā)明的熒光檢測微 系統(tǒng)為集成的微流體系統(tǒng)，其包括被組裝成便攜裝置的四種主要部件
(l)用于熒光激發(fā)的光源2(LS); (2)涂覆于金表面1的用于糖結(jié)合 和熒光檢測的自組裝單層，如上所述；(3)光處理器3(LP)，用于從激發(fā) 光中分離激發(fā)的熒光和在空間上將熒光擴(kuò)展成光譜；和(4)用于光強(qiáng)測 量的檢測器4(DET)。使用微制造技術(shù)單獨(dú)制造部件(1) (3)。這四個(gè)部 件可按多種不同的幾何形狀排列。因此，例如，圖3顯示了光源2的 位置與光處理器3相鄰，而圖4顯示了光源2位于光處理器3的下方。
在操作中，包含或潛在包含葡萄糖的生物流體通過位于單層表面 下方的微/小型通道7輸送至單層表面，如圖4所示。該單層-微/小型通 道組合件裝配有注射口 6，其連接到微/小型通道，并允許注射液體樣 品至微/小型通道中。注射口 6可位于單層上任何方便的位置。泵送裝 置用于推動生物流體通過微/小型通道。合適的泵送裝置包括附加于單 層的外部泵或驅(qū)動電極。驅(qū)動電極可位于單層上所有適宜的位置以在生物流體內(nèi)產(chǎn)生驅(qū)動力。在圖4中顯示了裝配有驅(qū)動電極5的單層-微/ 小型通道組合件的例子。為了便于該系統(tǒng)中單層及其基底的布置或更 換，單層小片優(yōu)選被設(shè)計(jì)成被插入或拔出該系統(tǒng)。
用于產(chǎn)生強(qiáng)熒光激發(fā)光的合適光源包括激光器、白熾光或微放電。 激光器的例子包括二極管激光器和垂直腔表面發(fā)射激光器(VSCEL)。然
而，激光器是昂貴的，相對難于小型化和集成到微系統(tǒng)中。白熾光源 也難于小型化。因此，優(yōu)選的光源是微放電，其展示在圖5中。光源 可以是單個(gè)源或陣列。為了便于布置或更換該系統(tǒng)中的光源，該光源 優(yōu)選被設(shè)計(jì)成小片以插入或拔出該系統(tǒng)。
當(dāng)分子從紫外光譜或可見光譜中(波長通常為200 900nm范圍內(nèi)) 吸收光子時(shí)，熒光產(chǎn)生了，然后快速發(fā)射光子，典型地在納秒內(nèi)或更 短的時(shí)間內(nèi)發(fā)射光子。發(fā)射波長總是長于激發(fā)波長，這是因?yàn)榉肿觾?nèi) 有一些能量損失以加熱或振動。熒光染料通常在寬的激發(fā)范圍內(nèi)具有 可檢測的發(fā)射強(qiáng)度。熒光染料的正規(guī)化熒光發(fā)射光譜通常獨(dú)立于激發(fā) 波長，這使得微放電光源適于熒光激發(fā)，只要微放電在寬的激發(fā)范圍 內(nèi)提供光子。對于每種染料，最大的熒光發(fā)射通常在唯一的發(fā)射波長 處發(fā)生，與激發(fā)強(qiáng)度波長無關(guān)。然而，在給定的激發(fā)強(qiáng)度下，不同的 激發(fā)波長產(chǎn)生不同的最大發(fā)射強(qiáng)度。對于每種染料，有最佳的激發(fā)波 長范圍。因此，為了最好的效率或靈敏度，優(yōu)選設(shè)計(jì)/選擇如下光源， 其主要在最佳激發(fā)波長范圍周圍提供光子。例如，有可能設(shè)計(jì)用于最 佳激發(fā)波長范圍的微放電光源，通過在某些壓力下用某些氣體/蒸氣填 充放電區(qū)域來實(shí)現(xiàn)。其它例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
圖5為微放電光源的示意圖。在緊密電極8和9之間施加高電壓 如10 300 V,由此產(chǎn)生放電IO和通過光孔12的強(qiáng)光11。微制造微 放電光源的陣列以對應(yīng)于SAM下面的微/小型通道，將該陣列置于微/ 小型通道的下方。放電電極對可相互垂直地面對，如圖5所示，或可 位于同一表面上，并且緊密地隔開。除圖5所示的微放電構(gòu)造以外的許多微放電構(gòu)造是可能的，它們利用緊密電極的原理在高強(qiáng)電場下產(chǎn) 生微放電。取決于噪聲要求，可使用過濾器來濾出熒光波長范圍內(nèi)的 放電光。
微放電光源的一個(gè)缺點(diǎn)是其光強(qiáng)和光譜不是恒定的。然而，這不 是本發(fā)明系統(tǒng)的問題，其中只有熒光強(qiáng)度可能不是恒定的，該正規(guī)化 的熒光光譜通常不受光源強(qiáng)度變化的影響。被激發(fā)熒光的波長獨(dú)立于 激發(fā)光，只要源光的光子能足夠大以用于激發(fā)。
光源的主要基底優(yōu)選為硅。這兩個(gè)電極(陰極和陽極)由包括金屬或 摻雜多晶硅的材料形成。通過控制兩個(gè)電極間的距離在幾個(gè)微米以內(nèi)， 可顯著地降低放電電壓。使用犧牲層如二氧化硅或某些金屬的層可容 易地實(shí)現(xiàn)這個(gè)距離。
來自受照單層的所得反射光為來自源和熒光的光的反射的組合。 配備有光柵的光處理器被用于將源光與熒光分離，并將熒光擴(kuò)展成空 間光譜。光柵優(yōu)選閃耀光柵。光柵將入射光的主要部分衍射成為其第
非零(non-zero-th)衍射級中的一個(gè)，該衍射光被擴(kuò)展成空間光譜。
對應(yīng)使用光柵的操作原理和方程對本領(lǐng)域是已知的。衍射光的方 向由方程(l)控制
mX=d(sin0-sin9o) (1) 其中6o為入射角，e為衍射角，X為波長，m為衍射級，d為光柵 表面上的光柵周期(例如對于圖7的閃耀光柵，d為相鄰槽間的間隔)。 專用于閃耀光柵的另外詳細(xì)的方程也是本領(lǐng)域所已知的。參見例如， 教材Diffraction Gratings(衍射光柵),M. C. Hutley， Academic Press, 1982，其內(nèi)容在此通過引用的方式包括到本文中。
方程(l)中使用的參數(shù)表示在圖7中。入射光束描繪為箭頭17。衍 射光束描繪為箭頭19。槽的法線表示為點(diǎn)線18。光柵法線表示為點(diǎn)線20。
使用光柵將熒光光譜從源光譜中有效地分離出來。圖6為裝配有 閃耀光柵的光處理器的示意圖。將熒光從入射光14中分離出來，該入 射光14為熒光和源光的組合，并通過閃耀光柵13將其擴(kuò)展成熒光光 譜15。然后通過光檢測器陣列16(PDA)檢測熒光。
利用圖6中所示的處理器，穿過非光柵區(qū)域的生成光的強(qiáng)度也可 被測量。測得的強(qiáng)度可用作參比強(qiáng)度。閃耀光柵結(jié)構(gòu)通過精密微加工 或通過玻璃或聚合物的蝕刻而制成。如果使用蝕刻，則需要特定的光 致抗蝕劑輪廓(profile)和因此的特定掩模。特定的掩模包括傳送調(diào)節(jié)掩 模。暴露的光以漸變強(qiáng)度分布(profile)在光柵線位置穿過掩模到達(dá)光致 抗蝕劑。合適的檢測器包括小型光傳感器陣列、充電耦合裝置(CCD)、 或光電倍增管傳感器陣列，這取決于靈敏度和分辨率要求。
由于在這個(gè)光學(xué)系統(tǒng)中沒有使用透鏡和鏡，因此在該系統(tǒng)的組裝 中不需要嚴(yán)格的對準(zhǔn)和間隔。然而，當(dāng)使用光源組合時(shí)，在微/小型通 道小片和光源之間的對準(zhǔn)可能是必要的。當(dāng)光源為小片時(shí)，例如可通 過對準(zhǔn)的硅-玻璃陽極結(jié)合或硅-聚合物-玻璃結(jié)合來實(shí)現(xiàn)對準(zhǔn)。
相比于常規(guī)的光學(xué)檢測系統(tǒng)，本發(fā)明微系統(tǒng)提供許多優(yōu)點(diǎn)。常規(guī) 的光學(xué)檢測臺傾向于是大體積的和昂貴的。相比而言，該小型化系統(tǒng) 花費(fèi)較少、緊湊、需要的樣品量更少，并且易于使用。這些優(yōu)點(diǎn)對于 糖尿病患者自我監(jiān)控葡萄糖是尤其有用和重要的。
現(xiàn)在將通過下面的非限制性例子來說明本發(fā)明。
實(shí)施例1
按照圖1和圖2中所示的合成路線來制備式II的熒光化合物(其 中n和m各自為l， p為2):首先，式1的苯基硼酸酐按如下制備鄰溴甲苯與鎂(l.l當(dāng)量)在二乙醚中于25。C下反應(yīng)。于-78。C向三甲基硼 酸酯(IO當(dāng)量)的二乙醚溶液中滴加格氏(Grignard)試劑。將混合物攪拌 另外的2小時(shí)，然后讓其暖熱至室溫，并攪拌另外的2小時(shí)。在減壓 條件下除去二乙醚，固體從水中重結(jié)晶。將產(chǎn)物苯基硼酸在真空烘箱 中干燥過夜，以制得苯基硼酸酐。
將苯基硼酸酐與NBS(N-溴代丁二酰亞胺)(l.l當(dāng)量)和催化的 AIBN(偶氮異丁腈)在作為溶劑的四氯化碳中混合。該混合物在200瓦 燈的輻射下回流2小時(shí)。在溶液是熱的時(shí)候，過濾該溶液，并除去溶 劑以得到期望的式2的溴甲基硼酸酐。
將溴甲基硼酸酐在氯仿中與9-甲基氨基甲基-10-羥乙基蒽(3)(2.1 當(dāng)量)混合，回流2小時(shí)。當(dāng)混合物冷卻時(shí)，進(jìn)行過濾，并除去溶劑。 然后用二乙醚洗滌固體，并從乙酸乙酯中重結(jié)晶，以得到式4的產(chǎn)物。
用25%過量的含水(48%)氫溴酸以及硫酸處理化合物4。將混合物 回流幾小時(shí)。該水不溶性層被分離；連續(xù)地用水、冷的濃硫酸和碳酸 鈉溶液洗滌；分離；用氯化鈣干燥；和蒸餾以得到相應(yīng)的式5的溴化 物。
將95%乙醇和硫脲混合物在蒸汽浴上被加熱至回流溫度。關(guān)閉蒸 汽， 一次性加入化合物5。接著在5分鐘內(nèi)發(fā)生劇烈反應(yīng)，異硫脲鎗溴 化物鹽5從溶液中分離。放熱反應(yīng)在沒有另外應(yīng)用熱的情況下繼續(xù)至 完成。該異硫脲鑰溴化物鹽通過過濾來收集，并干燥。將異硫脲錄溴 化物鹽和85%氫氧化鉀水溶液的混合物沸騰回流5小時(shí)。然后給燒瓶 裝上分液漏斗、進(jìn)氣管和冷凝器，用于蒸汽蒸餾。通過進(jìn)氣管導(dǎo)入氮 氣，滴加冷的硫酸水溶液。連續(xù)添加，直至反應(yīng)混合物用剛果紅試紙 檢測呈酸性，然后添加20%過量的酸。在添加酸的最后，停止氮?dú)馔?入，通過進(jìn)氣管導(dǎo)入蒸汽。將油與餾出物中的水分離，并且用氯化f丐 干燥。將粗產(chǎn)物在氮?dú)鈿夥罩?、減壓下通過10英寸Vigreux柱分餾，以制得式II的化合物。
實(shí)施例2
通過將微圖案化的金小片浸入到式II化合物的溶液中15小時(shí)，從 而制備式II化合物的自組裝單層。溶液濃度為1.0mM，溶劑為9:1的 THF:甲醇。固定方法通過SPR光譜學(xué)來監(jiān)控。在SAM形成以后，用 甲醇漂洗該小片，然后在氮?dú)庀赂稍铩?br> 5叩^5^@顯微鏡玻璃蓋玻片用作金小片的基底。蓋玻片用Piranha 溶液(30%11202:濃H2S04 l:3)清洗15秒，用Milli-(/級的水小心漂洗。 該蓋玻片然后在氮?dú)饬髦懈稍?，并置于真空蒸發(fā)器中。使用Polaron E5000濺涂系統(tǒng)，在蓋玻片上沉積金膜(約500 nm厚)。將濺涂系統(tǒng)在 如下條件下保持180秒:2.0xl(r2 mbar和20mA。
參考文獻(xiàn)
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所有在此引用的或提及的專利和公開物顯示了本發(fā)明涉及的本領(lǐng) 域技術(shù)人員的技術(shù)水平，每個(gè)此類引用的專利或公開物通過引用的方 式結(jié)合到的程度如同其被單獨(dú)地整體包括或在此完整地提出。申請人 保留物理上將來自于任何此類引用的專利或公開物的任何和所有的材 料和信息包括在本說明書中的權(quán)力。在此描述的具體的方法和組合物代表的是優(yōu)選的實(shí)施方案和示例 性的，不企圖限定本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮本說明書后， 會產(chǎn)生其它的目的、方面和實(shí)施方案，它們被包括在由權(quán)利要求書范 圍所確定的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員，對公開的本發(fā)明 作出各種替代和修改而不違背本發(fā)明的范圍和本質(zhì)時(shí)是顯而易見的。
在此示例性描述的本發(fā)明可適合于在缺少任一元件或限制的條件 下實(shí)施，所述元件和條件在此沒有作為必需的條件而明確地公開。在 此示例性描述的方法和工藝可適合于以不同的步驟次序來操作，它們 沒有必要嚴(yán)格限制于在此或在權(quán)利要求中指示的步驟次序。如同在此
和在所附的權(quán)利要求書中所使用的，單數(shù)形式("a" 、 "an"和"the") 包括其復(fù)數(shù)對象，除非上下文另有明確表示。因此，例如引用的"一 種檢測器"或"患者"包括多個(gè)此類的檢測器或患者等等。決不可把 本專利解釋成為限制于具體的實(shí)施例或?qū)嵤┓桨富蛟诖司唧w公開的方 法。決不可將本專利解釋成為限制于專利商標(biāo)局的任何審查員或任何 其它官員或雇員的聲明，除非這類聲明是具體地和在沒有條件或限制 的情況下明確地用于申請人的答復(fù)意見中。
已被使用的術(shù)語和措詞被用作描述性而不是限制性的術(shù)語，不打 算在使用這類術(shù)語和措詞時(shí)排除所示和描述的特征的任何等價(jià)物或其 部分，但是應(yīng)認(rèn)識到，在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)的各種修改是可行 的。因此，應(yīng)理解，盡管本發(fā)明已經(jīng)通過優(yōu)選的實(shí)施方案和任選的特 征做了詳細(xì)的公開，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將對在此公開的概念進(jìn)行修 改和變化，這類修改和變化被認(rèn)為是在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍以內(nèi)。
本發(fā)明在此已經(jīng)做了廣泛地和一般性地描述。落入所屬的公開內(nèi) 容內(nèi)的每個(gè)更窄的種和亞屬群也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這包括本發(fā)明 的一般性描述，其條件或否定限制為屬中去除任何主題，不管刪去的 材料是否在此做具體的詳述。
權(quán)利要求
1.一種式I的化合物其中F表示熒光團(tuán)，R為低級脂族或芳族基團(tuán)，n和m各自為0、1或2，n+m為整數(shù)2或3，p為1～約30的整數(shù)，[CH2CH2]p部分與連接到硼原子的苯環(huán)為取代的或未取代的。
2. 如權(quán)利要求1所述的化合物，其中R為具有1 4個(gè)碳原子的院基o
3. 如權(quán)利要求1所述的化合物，其中F為取代的或未取代的萘基、 蒽基、芘基或菲基。
4. 如權(quán)利要求3所述的化合物，其中F為取代的或未取代的蒽基。
5. 如權(quán)利要求l所述的化合物，其中m和n各自為l。
6. 式l的化合物，其中連接到硼原子的苯環(huán)被一個(gè)或多個(gè)以下基 團(tuán)取代甲基、乙基、丙基、丁基、苯基、甲氧基、乙氧基、丁氧基 或苯氧基。
7. 如權(quán)利要求l所述的化合物，具有式II:其中p為12 約30的整數(shù)。
8. 如權(quán)利要求7所述的化合物，其中p為15 約30的整數(shù)。
9. 一種用于檢測被分析物的集成的微流體熒光檢測系統(tǒng)，其包括光源；涂覆在金表面上的自組裝單層，其中該自組裝單層包括熒光團(tuán)， 該熒光團(tuán)在被分析物的存在下發(fā)熒光； 光處理器；和 檢測器。
10. 如權(quán)利要求9所述的系統(tǒng)，其中部件被組裝成便攜裝置。
11. 如權(quán)利要求9所述的系統(tǒng)，其中光源為激光、白熾光或微放電。
12. 如權(quán)利要求9所述的系統(tǒng)，其中光源為單個(gè)源或陣列。
13. 如權(quán)利要求ll所述的系統(tǒng)，其中光源為微放電。
14. 如權(quán)利要求9所述的系統(tǒng)，其中光處理器配備有光柵。
15. 如權(quán)利要求14所述的系統(tǒng)，其中光柵為閃耀光柵。
16. 如權(quán)利要求9所述的系統(tǒng)，其中單層小片被設(shè)計(jì)成插入到系 統(tǒng)中或從系統(tǒng)中拔出。
17. 如權(quán)利要求9所述的系統(tǒng)，其中光源被設(shè)計(jì)成插入到系統(tǒng)中 或從系統(tǒng)中拔出。
18. 如權(quán)利要求9所述的系統(tǒng)，其中檢測器選自小型光傳感器 陣列、充電耦合裝置和光電倍增管傳感器陣列。
19. 如權(quán)利要求9所述的系統(tǒng)，其中金表面涂覆有式I化合物的自 組裝單層其中F表示熒光團(tuán)，R為低級脂族或芳族基團(tuán)，n和m各自為0、 l或2， n+m為整數(shù)2或3， p為1 約30的整數(shù)，[CH2CH2]P部分與連 接到硼原子的苯環(huán)為取代的或未取代的。
20. 如權(quán)利要求19所述的系統(tǒng)，其中p為12 約30的整數(shù)。
21. 如權(quán)利要求19所述的系統(tǒng)，其中p為15 約30的整數(shù)。
22. —種檢測生物樣品中糖的方法，該方法包括以下步驟(a)使用集成的微流體熒光檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測，所述系統(tǒng)包括 光源；涂覆在金表面上的自組裝單層；其中該自組裝單層包括熒光團(tuán)， 該熒光團(tuán)在被分析物的存在下發(fā)熒光； 光處理器；和 檢測器，其中利用式I化合物在金表面上形成自組裝單層其中F表示熒光團(tuán)，R為低級脂族或芳族基團(tuán)，n和m各自為0、 l或 2， n+m為整數(shù)2或3， p為1 約30的整數(shù)，[CH2CH2]p部分與連接到 硼原子的苯環(huán)為取代的或未取代的，和其中包含或潛在包含糖的生物流體通過位于單層表面下方的微通道或 小型通道傳輸至單層表面；和(b)用所述檢測器檢測熒光，其中熒光為生物樣品中糖的存在或其 量的指示。
23. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中糖為D-葡萄糖或D-果糖。
24. 如權(quán)利要求23所述的方法，其中糖為D-葡萄糖。
25. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中p為12 約30的整數(shù)。
26. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中p為15 約30的整數(shù)。
27. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中檢測是通過糖尿病患者來實(shí) 施的，以監(jiān)控他或她自己的葡萄糖水平。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在糖的存在下發(fā)熒光的化合物，所述化合物具有下式，其中F表示熒光團(tuán)，R為低級脂族或芳族基團(tuán)，n和m各自為0、1或2，n+m為整數(shù)2或3，p為1～約30的整數(shù)，[CH₂CH₂]_p部分與連接到硼原子的苯環(huán)為取代的或未取代的。本發(fā)明還提供一種完全集成的微流體系統(tǒng)用于檢測熒光，所述系統(tǒng)包括光源；涂覆在金表面上的具有上式化合物的自組裝單層，其可在糖存在下發(fā)熒光；光處理器；和檢測器。
文檔編號C07F5/02GK101305012SQ200680029822
公開日2008年11月12日 申請日期2006年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月15日
發(fā)明者古元東, 張春波 申請人:霍尼韋爾國際公司