小鯢科動物皮膚顯微組織切片的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種兩棲動物皮膚顯微組織切片的制備方法，具體涉及用于顯微觀察的小鯢科動物皮膚組織切片的制備方法，屬于顯微組織切片技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]皮膚是兩棲動物機(jī)體的第一道天然屏障，在適應(yīng)和進(jìn)化的過程中，擔(dān)任了呼吸、調(diào)節(jié)水平衡、離子運輸、抵抗獵食者、抗細(xì)菌、真菌等多方面的功能，這些功能體現(xiàn)了皮膚形態(tài)學(xué)特征的復(fù)雜性以及皮膚結(jié)構(gòu)潛在的生理特性，對維持兩棲動物的生存、開拓和適應(yīng)廣闊的棲息地以及多樣的生態(tài)環(huán)境中起著重要的作用。
[0003]小鯢科動物是亞洲特有的有尾類兩棲動物，也是現(xiàn)生有尾目10科中第三大科，全世界現(xiàn)已知66種，隸屬2亞科、10屬。中國現(xiàn)已知2亞科8屬30種，主要分布于東北、西南山區(qū)、華中及臺灣地區(qū)。小鯢科動物生活環(huán)境可分為水棲型和陸棲型，由于生活環(huán)境導(dǎo)致不同生活環(huán)境的小鯢科動物之間皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)特征的差異，這些形態(tài)特征的差異為小鯢科動物的適應(yīng)進(jìn)化研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；同時小鯢科動物被認(rèn)為是有尾類中最原始的類群，故皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究可為兩棲動物的進(jìn)化研究提供依據(jù)。故皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)特征在兩棲動物中，特別是小鯢科動物中的研究受到眾多學(xué)者的關(guān)注。
[0004]要研究皮膚的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，皮膚石蠟切片的制作是必不可少的一步。非專利文獻(xiàn)《小鯢科動物外部形態(tài)特征和皮膚組織的形態(tài)學(xué)研究》(張向，2014)公開了一種小鯢皮膚石蠟切片制作方法，包括:(I)取材:所采集的小鯢皮膚組織塊一般不宜過大，以(3?5mm) X (3?5mm)為宜，固定后流水沖洗24h ； (2)脫水:依次放入70%乙醇2h、80%乙醇2h、85% 乙醇 lh、90% 乙醇 lh、95% 乙醇 lh、100% 乙醇 I lOmin、100 % 乙醇 II 1min ； (3)透明:將脫水后的組織放入正丁醇I 15min，正丁醇II 15min進(jìn)行透明處理；(4)浸蠟:將皮膚組織放入石蠟I浸蠟30min，再放入純石蠟II浸蠟2h ; (5)包埋:使用75°C左右的石蠟包埋；(6)切片:用單面刀片先將蠟塊四周修整平行并切成方形或長方形，把蠟塊粘附在木塊上，調(diào)整刀片與石蠟切片約成5°角，切片厚度為4?6μπι;(7)展片、貼片、干燥:將切好的組織片用毛筆卷起，慢慢平攤于44°C的溫水中進(jìn)行展片，然后用載玻片將切片挑起，放入烘烤箱中，烘片以玻片沒有明顯水漬為準(zhǔn)；(S)HE染色:將石蠟切片組織放入二甲苯15min、100% 乙醇 10min、95% 乙醇 5min、85% 乙醇 5min、75% 乙醇 5min、蒸飽水 5min、蘇木素lOmin、流水沖洗5min、I %鹽酸酒精分色40s左右、流水沖洗藍(lán)化30min、70%乙醇2min、80%乙醇2min、伊紅乙醇5min、95%乙醇4min、100%乙醇4min，再放入二甲苯1min (共計lh58min)，然后用中性樹膠封片；(9)封固:在載玻片1/3處滴中性樹膠，用右手持細(xì)鑷輕輕地夾住蓋玻片的右側(cè)，并把它的左邊放在樹膠的左邊，然后左手持解剖針扶住蓋玻片的左邊，右手將鑷子松開逐漸下降，慢慢抽出，使樹膠在蓋玻片均勻地展開并將其中氣泡排出，干燥，用二甲苯擦干凈蓋玻片周圍多余溢出的樹膠，即得。然而，該方法存在以下不足之處:
(I)脫水不完全，造成石蠟滲透不完全，在切片時引起組織出現(xiàn)破碎或空洞，攤片時切片散開，染色時托片和著色不良等；(2)正丁醇脫水效果不佳；(3)浸蠟過程由于缺乏過渡步驟，導(dǎo)致從透明步驟攜帶的二甲苯進(jìn)入石蠟中，從而造成石蠟濃度降低，另外浸蠟時間過長造成組織塊脆硬。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種小鯢科動物皮膚顯微組織切片的制備方法，該方法可有效去除組織塊中的水分，防止石蠟滲透不全；提高透明效果，浸蠟時間相對縮短，可防止組織塊脆硬。
[0006]為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0007]小鯢科動物皮膚顯微組織切片的制備方法，包括以下步驟:
[0008](1)脫水:將經(jīng)固定處理的小鯢科動物皮膚組織依次浸入濃度梯度50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇中脫水，其中95%、100%乙醇各重復(fù)兩次，每個梯度脫水45 ?60min ；
[0009](2)透明:將經(jīng)脫水皮膚處理的組織浸入100%乙醇與二甲苯的混合液中2?3min，取出后再浸入二甲苯中10?30min ；
[0010](3)浸蠟:將經(jīng)透明處理的皮膚組織放入二甲苯與石蠟的混合液中20?30min，取出后再分兩次放入石錯中，每次45?60min ；
[0011](4)將經(jīng)浸蠟處理的皮膚組織包埋，依次經(jīng)切片、展片、貼片、烤片、染色、封固處理，即得。
[0012]步驟(1)中乙醇濃度的增加和脫水時間的增加能夠更加有效的去除組織塊中的水分，從而保證石蠟充分的滲透進(jìn)入組織細(xì)胞，否則將造成石蠟滲透不完全，在切片時引起組織出現(xiàn)破碎或空洞，攤片時切片散開，染色時托片和著色不良等。
[0013]步驟(1)中所述脫水在室溫下進(jìn)行。
[0014]步驟(2)中所述100%乙醇與二甲苯的體積比為1:1。
[0015]步驟(2)中二甲苯在小鯢科動物皮膚組織切片中的透明效果最好，能較好的溶解石蠟。
[0016]步驟(3)中采用二甲苯與石蠟的混合液的目的是在透明與浸蠟步驟之間增加一個過渡步驟，以防切片在透明步驟帶入過多的二甲苯進(jìn)入石蠟，從而導(dǎo)致石蠟濃度的降低；同時增加二甲苯與石蠟的過渡步驟后可適當(dāng)縮短浸蠟時間，以防浸蠟時間過長造成組織塊脆硬。
[0017]步驟(3)中所述二甲苯與石蠟的體積比為1:1。
[0018]步驟⑷中所述切片的厚度為4?6 μπι，切片后置于42?45°C的水中展片。
[0019]步驟(4)中所述貼片、烤片為:待切片自然伸展平后從水中取出，控干水分，置于37?45°C下干燥2?4h，或者于室溫下自然干燥一夜，亦或?qū)⑶衅糜谳d玻片上，加少量水后持載玻片在酒精燈上加溫，使切片伸展。
[0020]步驟(4)中所述染色為Η.E染色，操作步驟為:將切片依次置于二甲苯I lOmin、二甲苯 II lOmin、100 % 乙醇 I 5min、100 % 乙醇 II 5min、95 % 乙醇 5min、85 % 乙醇 5min、75%乙醇5min、水5min、蘇木精染液10?20min，流水沖洗5min，再置于HC1-乙醇分化液20?40s，流水沖洗10?30min，鏡檢，流水沖洗2min，再依次置于70%乙醇lmin、85%乙醇 lmin、伊紅染液 2min、95% 乙醇 I 2min、95% 乙醇 II 2min、100% 乙醇 I 2min、100% 乙醇Il2min、二甲苯I 5min、二甲苯II 5min。其中，1、II僅代表處理次數(shù)，如二甲苯I lOmin、二甲苯II 1min分別為二甲苯第一次處理lOmin，二甲苯第二次處理lOmin。
[0021]所述蘇木精染液為:將Ig蘇木精溶于20mL 100%乙醇中得甲液，50g鉀明礬溶于300mL蒸饋水中得乙液；將甲液、乙液混合，煮沸2?3min，再加蒸饋水定容至100mL ;最后加入0.2g碘酸鈉，即得。
[0022]所述伊紅染液為:將0.5g伊紅加入到10mL 85%乙醇中，溶解完全，即得。
[0023]所述HCl-乙醇分化液為:將ImL鹽酸加入到99mL 70%乙醇中，混勻，即得。
[0024]本發(fā)明的有益效果:
[0025]本發(fā)明中小鯢科動物皮膚顯微組織切片的制備方法包括取材、固定、沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、修整、切片與展片、貼片與烤片、H.E染色、封固等步驟，流程簡單，操作方便。同時，該方法可有效去除組織塊中的水分，防止石蠟滲透不全；提高透明效果，浸蠟時間相對縮短，可防止組織塊脆硬，獲得的切片完整，圖片結(jié)構(gòu)清晰，為研究小鯢科動物皮膚結(jié)構(gòu)提供了技術(shù)支持，適用于實驗室研究工作者對小鯢科動物皮膚組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究。
【附圖說明】
[0026]圖1為實施例1中中國小鯢(Hynobius chinesis)皮膚石錯切片顯微圖。
【具體實施方式】
[0027]下述實施例僅對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。
[0028]實施例1
[0029]染液及分化液的配制:
[0030]蘇木精染液:將Ig蘇木精溶于20mL 100%乙醇中得甲液，50g鉀明礬溶于300mL蒸饋水中得乙液；將甲液、乙液混合，煮沸2?3min，再加蒸饋水定容至100mL ;最后加入0.2g碘酸鈉，即得。
[0031]伊紅染液:將0.5g伊紅加入到10mL 85%乙醇中，溶解完全，即得。如果染不上色，可加入0.2%的冰醋酸稀釋，以促進(jìn)伊紅染色。
[0032]HCl-乙醇分化液:將ImL鹽酸加入到99mL 70%乙醇中，混勻，即得。
[0033]本實施例中小鯢科動物中國小鯢(Hyn