專利名稱：：具有抗微生物活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法具有抗微生物活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有抗^:生物活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及用于產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明的目的是提供具有改進(jìn)的抗微生物活性的多肽。所述多肽可顯示降低的溶血活性和/或降低的細(xì)胞毒性。所述多肽還可顯示對(duì)陽(yáng)離子例如Ca2+、Mg2+、Na+降低的敏感性。所述多肽還可顯示與SEQIDNO:l相比不同的抗微生物語(yǔ)(antimicrobialspectrum)。發(fā)明概述本發(fā)明提供具有抗微生物活性的多肽，所述多肽包含氨基酸序列，優(yōu)選由氨基酸序列組成，所述氨基酸序列與以下氨基酸序列的氨基酸1至40具有至少80%同一性G-X廣G-C-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-Xii-C-H"X2-Xi3-C-X4-Xl5_Xl6_X17-X!8-Xi9-X20""G-G-X21-C-X22-X23-X24-X25-X26-X27-C-X28-C-X29;其中Xi=F、L、W或I;優(yōu)選地X!-F;X2=N、R、Q、V、G、S、A、K、L、M、D、H或Y;優(yōu)選地X^N、R、Q、V、G、S、A、K或Y;X3=G、R、A或K;優(yōu)選地X3=G;X4=P、A、L、V、K或R;J尤選;也X4二P、K或R;X5=W或R;X6=D、A、G、K、L、T、N、F、H、M、P、Q、S、C、I、R、V或Y;優(yōu)選地X^D、A、G、K、L、T、N、F、H、M、P、Q、S、V或Y;X7=E、G、A、L、C、Q或S;4尤選地X7二E、G或S;XR=D、F、G、N、V、Y、H、K、L、P、S、T、W、I、M、A、C或R;優(yōu)選地X「D、F、G、N、V、Y、H、K、L、P、X9-D或P;優(yōu)選地X9二D;X10=M、R、S、V、A、F、G、L、T、Y、WR、S、V、G、Y、L、F、T、W或K;X=Q、R、L、F、G、H、S、A、C、I、K優(yōu)選地Xn二Q、R、L、F、G、H、S、K或Y;X12=N、R、I、Y、V、K、T、Q、S、F、AXI3=H、A、F、Q、T、V或L;優(yōu)選地X13:X14=K、Q或R;優(yōu)選地X,4-K或R;X15=S、A、V、N或F;X16=I、L、M、T、W或V;優(yōu)選地乂16=1、X17=K、T或R;S、T、W、I、M或R;E或K;優(yōu)選地Xw-M、M、P、T、V、W或Y;W、E或H;H或L;H、X18=G、H、K、A、R、K或N;L或V;P、F、I、Q、R、S、T、Y或N;優(yōu)選地X,s-G、x19=Y、H、K、L、X20=K、F、H、T、X21=Y、F、R、A、X22=A、K、N、Q、M、N、Q、S、V或R;優(yōu)選地X^Y或R;C或R;優(yōu)選地X2o-K或R;H、L、M、S或W;優(yōu)選地X^Y、F、R或W;T、E、H、I、R、S、V、G或Y;優(yōu)選土也乂22=八、K、N、Q、T、S或Y;X23=K、R或T;優(yōu)選地X23二K或R;X24=G、K、Q、E、N、S、T、A或R;優(yōu)選地X^G、K、Q、A或R;X25=G、K、H、W或R;優(yōu)選地乂25=0、K或R;X26=F、A、H、I、M、V、W、R或L;優(yōu)選地X26二F或L;X27=V、L、M、I、K、Q、R或T;優(yōu)選地X2二V、L、M或T;X28=K、H、N或R;優(yōu)選地X28^K或R;X29=Y、I、YRCG或YR;優(yōu)選地X29-Y或YR;并且與SEQIDNO:l的氨基酸1至40具有少于100%同一性。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達(dá)載體和重組宿主細(xì)月包。在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明所述多肽的方法。定義抗微生物活性術(shù)語(yǔ)"抗微生物活性，，在本文中定義為能夠殺死或抑制微生物細(xì)胞生長(zhǎng)的活性。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"抗微生物"的意思指存在殺細(xì)菌的(bactericidal)和/或抑細(xì)菌的(bacteriostatic)和/或殺真菌的(fungicidal)和/或抑真菌的(fungistatic)作用和/或殺病毒的作用，其中將術(shù)語(yǔ)"殺細(xì)菌的，，理解為能夠殺死細(xì)菌細(xì)胞。將術(shù)語(yǔ)"抑細(xì)菌的，，理解為能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，即，抑制生長(zhǎng)的細(xì)菌細(xì)胞。將術(shù)語(yǔ)"殺真菌的"理解為能夠殺死真菌細(xì)胞。將術(shù)語(yǔ)"抑真菌的"理解為能夠抑制真菌生長(zhǎng)，即，抑制生長(zhǎng)的真菌細(xì)胞。將術(shù)語(yǔ)"殺病毒的"理解為能夠使病毒失活。術(shù)語(yǔ)"微生物細(xì)胞"表示細(xì)菌或真菌細(xì)胞(包括酵母)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"抑制微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)"的意思指細(xì)胞處于非生長(zhǎng)的狀態(tài)，即，它們不能增殖。t尤本發(fā)明而言,可才艮才居Lehrer&a/.,JournalofImmunologicalMethods,Vol.137(2)pp.167-174(1991)所描述的方法測(cè)定抗微生物活性。可選擇地，抗微生物活性可根據(jù)CLSI(臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute);先前稱為國(guó)家臨床和實(shí)-驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NationalcommitteeforClinicalandLaboratoryStandards》的NCCLS準(zhǔn)則測(cè)定。在具有抗微生物活性的多肽的25。/。(w/w)水溶液中，優(yōu)選在10。/。(w/w)的水溶液中，更優(yōu)選在5。/。(w/w)的水溶液中，甚至更優(yōu)選在1。/。(w/w)的水溶液中，最優(yōu)選在0.5。/。(w/w)的水溶液中，并且特別是在0.1。/。(w/w)的水溶液中，于2(TC溫育24小時(shí)之后(優(yōu)選12小時(shí)之后，更優(yōu)選8小時(shí)之后，更優(yōu)選4小時(shí)之后，更優(yōu)選2小時(shí)之后，最優(yōu)選l小時(shí)之后，并且特別是30分鐘之后)，具有抗微生物活性的多肽可能能夠?qū)⒋竽c桿菌C&c/^nWn'aco〃)(DSM1576)的活細(xì)力包lt減少至1/100。當(dāng)以1000ppm的濃度添加時(shí)，優(yōu)選當(dāng)以500ppm的濃度添加時(shí)，更優(yōu)選當(dāng)以250ppm的濃度添加時(shí)，甚至更優(yōu)選當(dāng)以100ppm的濃度添加時(shí)，最優(yōu)選當(dāng)以50ppm的濃度添加時(shí)，并且特別是當(dāng)以25ppm的濃度添加時(shí)，具有抗微生物活性的多肽可能還能夠于25。C在微生物的生長(zhǎng)底物(growthsubstrate)中將大腸桿菌(DSM1576)的生長(zhǎng)暈(outgrowth)抑制24小時(shí)。在具有抗微生物活性的多肽的25。/。(w/w)水溶液中，優(yōu)選在10。/。(w/w)的水溶液中，更優(yōu)選在5。/。(w/w)的水溶液中，甚至更優(yōu)選在1。/。(w/w)的水溶液中，最優(yōu)選在0.5。/。(w/w)的水溶液中，并且特別是在0.1。/。(w/w)的水溶液中，于2(TC溫育24小時(shí)之后(優(yōu)選12小時(shí)之后，更優(yōu)選8小時(shí)之后，更優(yōu)選4小時(shí)之后，更優(yōu)選2小時(shí)之后，最優(yōu)選l小時(shí)之后，并且特別是30分鐘之后)，具有抗微生物活性的多肽可能能夠?qū)⒖莶菅挎邨U菌C8acz7/w^6////力(ATCC6633)的活細(xì)胞數(shù)減少至1/100。當(dāng)以1000ppm的濃度添加時(shí)，優(yōu)選當(dāng)以500ppm的濃度添加時(shí)，更優(yōu)選當(dāng)以250ppm的濃度添加時(shí)，甚至更優(yōu)選當(dāng)以100ppm的濃度添加時(shí)，最優(yōu)選當(dāng)以50ppm的濃度添加時(shí)，并且特別是當(dāng)以25ppm的濃度添加時(shí)，具有抗微生物活性的多肽可能還能夠于25°C在微生物的生長(zhǎng)底物中將枯草芽孢桿菌(ATCC6633)的生長(zhǎng)暈抑制24小時(shí)。本發(fā)明的多肽具有由SEQIDNO:3至SEQIDNO:225的任一或SEQIDNO:226至SEQIDNO:251的任一或SEQIDNO:252至SEQIDNO:274的任一的氨基酸1至40所示氨基酸序列組成的多肽的抗微生物活性的至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%,更優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少80%,甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%,并且甚至最優(yōu)選至少100%。防衛(wèi)素術(shù)語(yǔ)"防衛(wèi)素"用于本文中指本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)屬于抗微生物肽的防衛(wèi)素類的多肽。為了測(cè)定多肽是否為本發(fā)明的防衛(wèi)素，優(yōu)選通過(guò)使用可自由得到的HMMER軟件包，將氨基酸序列與PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)的隱蔽馬爾科夫模型序型(hiddenmarkovmodelprofile)(HMM序型)進(jìn)行比4交(參見(jiàn)實(shí)施例7)。所述PFAM防衛(wèi)素家族包括防衛(wèi)素J或"哺乳動(dòng)物防衛(wèi)素"(登錄號(hào)PF00323)、防衛(wèi)素—2或"節(jié)肢動(dòng)物防衛(wèi)素"(登錄號(hào)PF01097)、防衛(wèi)素—卩或"卩防衛(wèi)素，，(登錄號(hào)PF0(T711)、防衛(wèi)素jropep或"防衛(wèi)素前肽，，(登錄號(hào)PF00879)和y-硫堇或'V-硫堇家族"(登錄號(hào)PF00304)。防衛(wèi)素可以屬于a-防衛(wèi)素類、(3-防衛(wèi)素類、e-防衛(wèi)素類、昆蟲(chóng)或節(jié)肢動(dòng)物防衛(wèi)素類，或植物防衛(wèi)素類。在實(shí)施方案中，本發(fā)明防衛(wèi)素的氨基酸序列包含4、5、6、7或8個(gè)半胱氨酸殘基，優(yōu)選4、5或6個(gè)半胱氨酸殘基，更優(yōu)選4或6個(gè)半胱氨酸殘基，并且最優(yōu)選6個(gè)半胱氨酸殘基。防衛(wèi)素還可以是共享任何防衛(wèi)素類的獨(dú)特特征的合成防衛(wèi)素。防衛(wèi)素的實(shí)例包括但不限于，a-防衛(wèi)素HNP-1(人嗜中性粒細(xì)胞肽)、HNP-2和HNP-3;|3-防衛(wèi)素-12、果蠅防衛(wèi)素(Drosomycin)、海利防衛(wèi)素(Heliomicin)、Yl-嘌呤硫素(purothionin)、昆蟲(chóng)防衛(wèi)素A和公開(kāi)在PCT申請(qǐng)WO99/53053,WO02/06324，WO02/085934，PCT/DK2005/000725,PCT/DK2005/000735和PCT/DK2006/000155中的防衛(wèi)素。分離的多肽術(shù)語(yǔ)"分離的多肽"用于本文中指，如通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的，其為至少20%純，優(yōu)選至少40°/。純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80。/。純，最優(yōu)選至少90%純，并且甚至最優(yōu)選至少95%純的多肽?；旧霞兊亩嚯男g(shù)語(yǔ)"基本上純的多肽"在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物按重量計(jì)含有至多10%,優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%,更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，至多3%,甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%,并且甚至最優(yōu)選至多0.5。/。的與其天然結(jié)合的(associated)其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計(jì)至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少％%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98。/。純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選所述多肽是"基本上(essentially)純的形式"，即，所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然結(jié)合的其它多肽材料。這能夠通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)，例如，通過(guò)〉知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽。在本文中，術(shù)語(yǔ)"基本上(substantially)純的多肽"與術(shù)語(yǔ)"分離的多肽"和"分離形式的多肽"同義。變體術(shù)語(yǔ)"變體"在本文定義為包含一種或多種改變的抗微生物多肽，所述改變例如在多肽中一個(gè)或多個(gè)特定位置取代、插入、缺失和/或截?cái)嘁粋€(gè)或多個(gè)特定氨基酸殘基。變體的編號(hào)方式在本發(fā)明中，采用對(duì)抗微生物多肽變體中氨基酸殘基位置的特定編號(hào)方式(numbering)。例如，通過(guò)比對(duì)已知抗微生物多肽的氨基酸序列，可以對(duì)任何抗微生物多肽中的任何氨基酸殘基指定氨基酸位置編號(hào)。使用源自SEQIDNO:l中公開(kāi)的抗微生物多肽氨基ll/^列的編號(hào)系統(tǒng)，與許多其它抗微生物多肽的氨基酸序列一起比對(duì)，可以指出結(jié)構(gòu)同源區(qū)域中的抗微生物多肽中氨基酸殘基的位置。蛋白質(zhì)序列的多重比對(duì)可以使用例如"ClustalW"(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.andGibson,T.J"1994,CLUSTALW:Improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,positions-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice,7Vwc/e/c爿",iis1_/e5earc/z22:4673-4680)進(jìn)行。DNA序列的多重比對(duì)可以使用蛋白質(zhì)比對(duì)作為模板，將氨基酸序列用DNA序列的相應(yīng)密碼子取代來(lái)進(jìn)行。通常使用的序列配對(duì)比較算法適合于檢測(cè)趨異程度未超過(guò)大約20-30%序列同一性的蛋白質(zhì)序列之間的相似性(Doolittle,1992,Pra^'"&z'.1:191-200;Brennerda/.,1998,戶roc.tV"/7.Jcfld5W.OS^95，6073-6078)。然而，具有相同折疊和相似生物學(xué)功能的真正同源的蛋白質(zhì)通常趨異至以序列為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)比較無(wú)法檢測(cè)出它們的關(guān)系的程度(LindahlandElofsson，2000,■/Mo/.295:613-615)。使用搜索程序能夠在以序列為基礎(chǔ)的搜索中獲得更好的靈敏度，所述程序使用蛋白質(zhì)家族(序型)的概率性代表(probabilisticrepresentation)來(lái)搜索數(shù)據(jù)庫(kù)。例如，PSI-BLAST程序通過(guò)重復(fù)的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索方法生成序型，并且能夠才全測(cè)關(guān)系疏遠(yuǎn)的同源物(remotehomologs)(Atschul&"/.,1997,AW;/e/c爿c/AW紅25:3389-3402)。如果感興趣的蛋白的家族或超家族在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中具有一個(gè)或多個(gè)代表，甚至能夠?qū)崿F(xiàn)更高的靈敏度。例如GenTHREADER(Jones1999,Mo/.287:797-815;McGuffinandJones,2003,所o/"/orm加b19:874-881)等程序使用來(lái)自多種來(lái)源(PSI-BLAST、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、結(jié)構(gòu)比對(duì)鐠和溶劑化勢(shì)(solvationpotential))的信息作為預(yù)測(cè)查詢序列的結(jié)構(gòu)折疊的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(neuralnetwork)的輸入。類似地，Gough2000，J.嵐腸/.313:903-919的方法能夠用來(lái)將未知結(jié)構(gòu)的序列與存在于SCOP數(shù)據(jù)庫(kù)中的超家族模型進(jìn)行比對(duì)?？蓪⑦@些比對(duì)反過(guò)來(lái)用于生成感興趣蛋白質(zhì)的同源性模型，并且使用為此目的開(kāi)發(fā)的多種工具能夠評(píng)估這些才莫型的準(zhǔn)確性。對(duì)于已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，數(shù)種工具和資源可用于恢復(fù)和生成結(jié)構(gòu)比對(duì)。例如已將蛋白質(zhì)的SCOP超家族進(jìn)行了結(jié)構(gòu)上的比對(duì)，并且這些比對(duì)是能夠獲得和下載的。這些比對(duì)能夠用于預(yù)測(cè)相同結(jié)構(gòu)超家族內(nèi)的蛋白質(zhì)中結(jié)構(gòu)上和功能上對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基。這種信息與源自同源性建模和序型搜索的信息一起，能夠用于預(yù)測(cè)在將感興趣的突變從一個(gè)蛋白質(zhì)移至親近或疏遠(yuǎn)的同源物時(shí)應(yīng)突變哪些殘基。在描述本發(fā)明的多種抗微生物多肽變體時(shí)，編寫以下所述的命名法以方便引用。在所有情況下，使用公認(rèn)的IUPAC單字母或三字母氨基酸縮寫。對(duì)于氨基酸取代，使用于下命名法原始氨基酸，位置，取代氨基酸。因此，將丙氨酸在位置226對(duì)蘇氨酸的取代表示為"T226A";將酪氨酸#—青氨酸在位置40對(duì)酪氨酸的取代(實(shí)際上是在酪氨酸之后添加精氨酸)表示為"Y40YR"。多個(gè)突變用加號(hào)("+，，)分隔，例如，"G205R+S411F，，表示在位置205和441的突變，分別是用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)和用苯丙氨酸(F)取代絲氨酸(S)。親本抗微生物多肽術(shù)語(yǔ)"親本"抗微生物多肽用于本文的意思是對(duì)其進(jìn)行修飾，例如取代、插入、缺失和/或截?cái)嘁援a(chǎn)生本發(fā)明的抗微生物多肽變體的抗微生物多肽。該術(shù)語(yǔ)也指將變體與之比較和比對(duì)的多肽。親本可以是天然存在(野生型)的多肽，或甚至可以是通過(guò)任何合適的方式制備的天然存在多肽的變體。例如，親本蛋白質(zhì)可以是在氨基酸序列中經(jīng)修飾或改變的天然存在多肽的變體。親本也可以是等位變體(allelicvariant),其是由占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式編碼的多肽。同一性參數(shù)"同一性"描述兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度通過(guò)使用包括在FASTA程序包version2.0x中的程序FASTA(參見(jiàn)W.R.PearsonandD.J.Lipman(1988),"ImprovedToolsforBiologicalSequenceAnalysis",PNAS85:2444-2448;和W.R.Pearson(1990)"RapidandSensitiveSequenceComparisonwithFASTPandFASTA",MethodsinEnzymology183:63-98)來(lái)測(cè)定。使用的計(jì)分矩陣是BLOSUM50,缺口罰分(gappenalty)是-12,并且缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)是-2。兩個(gè)核苷酸序列之間的同一性程度使用與上述相同的算法和軟件包來(lái)測(cè)定。使用的計(jì)分矩陣是同一性矩陣，缺口罰分是-16，并且缺口延伸罰分是-4?？晒┻x擇的是，兩個(gè)氨基酸序列的比對(duì)通過(guò)使用EMBOSS軟件包(http:〃emboss.org)版本2.8.0的Needle程序來(lái)測(cè)定。Needle程序執(zhí)行總體比對(duì)算法，所述算法描述于Needleman,S.B.andWimsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453中。使用的取代矩陣是BLOSUM62,缺口開(kāi)啟罰分(gapopeningpenalty)是10，并且缺口延伸罰分是0.5。將本發(fā)明的氨基酸序列(例如SEQIDNO:l的氨基酸1至40)和不同的氨基酸序列之間的同一性程度計(jì)算為兩個(gè)序列比對(duì)中精確匹配的數(shù)目除以本發(fā)明序列的長(zhǎng)度(氨基酸殘基的數(shù)目)；或者可替換地，將標(biāo)記為"最長(zhǎng)同一性(longestidentity)"的Needle的結(jié)果中用作百分比同一性并且如下計(jì)算(相同的殘基x100)/(比對(duì)的長(zhǎng)度-比對(duì)中的缺口數(shù))。結(jié)果表示為百分比同一性。多肽片段術(shù)語(yǔ)"多肽片段"在本文中定義為從SEQIDNO:2或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽，其中所述片段具有抗微生物活性。亞序列術(shù)語(yǔ)"亞序列"在本文中定義為從SEQIDNO:l或其同源序列的5'和/或3'端缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸的核苷酸序列，其中所述亞序列編碼具有抗微生物活性的多肽片段。等位變體術(shù)語(yǔ)"等位變體"在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過(guò)突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無(wú)變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽?；旧霞兊亩嗪丝嗨嵝g(shù)語(yǔ)"基本上純的多核苷酸"用于本文指無(wú)其它外來(lái)的或不期望的核苦酸的多核芬酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)產(chǎn)生體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸按重量計(jì)含有至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5°/。，更優(yōu)選至多4%,更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%,最優(yōu)選至多1%,并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核普酸可以包括天然存在的5，和3，非翻譯區(qū)，例如啟動(dòng)子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計(jì)至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98°/。純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純。本發(fā)明所述多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選在本文公開(kāi)的多核香酸是"基本上(essentially)純的形式"，即，所述多核苷酸制備物基本上(essentially)不含與其天然結(jié)合的其它多核苦酸材料。在本文中，術(shù)語(yǔ)"基本上純的多核苷酸"與術(shù)語(yǔ)"分離的多核苷酸"和"分離形式的多核苷酸"同義。所述多核苷酸可以是基因組的、cDNA、RNA、半合成的、合成的來(lái)源，或它們的任何組合。cDNA:術(shù)語(yǔ)"cDNA"在本文中定義為能夠通過(guò)反轉(zhuǎn)錄從得自真核細(xì)胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級(jí)的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過(guò)一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過(guò)稱為剪3妄的過(guò)程去除內(nèi)含子序列。源自mRNA的cDNA因而缺少任何內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建體術(shù)語(yǔ)"核酸構(gòu)建體"用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛?lái)不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的片段。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有本發(fā)明的編石馬序歹寸表達(dá)所需的42制序歹'J(controlsequence)日寸'術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體與術(shù)語(yǔ)"表達(dá)盒"同義?？刂菩蛄行g(shù)語(yǔ)"控制序列"在本文定義為包括對(duì)編碼本發(fā)明多肽的多核芬酸表達(dá)是必需的或有利的所有成分。各種控制序列對(duì)于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的。這些控制序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，控制序列包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號(hào)?？刂菩蛄锌梢院陀糜谝胩禺愋韵拗莆稽c(diǎn)的接頭一起提供，所述特異性限制位點(diǎn)促進(jìn)控制序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接。可操作地連接術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將控制序列置于相對(duì)于多核苷酸序列的編碼序列的合適位置，使得控制序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達(dá)。編碼序列當(dāng)用于本文時(shí)術(shù)語(yǔ)"編碼序列"的意思是直接指定其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開(kāi)讀框確定，所述開(kāi)讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開(kāi)始。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核苷酸序列。表達(dá)術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"包括任何涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的額外核苦酸可操作地連接。宿主細(xì)胞如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"包括任何細(xì)胞類型，所述細(xì)胞類型對(duì)于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)。修飾術(shù)語(yǔ)"修飾"在本文的意思是對(duì)由SEQIDNO:2至SEQIDNO:225的任一或SEQIDNO:226至SEQIDNO:251的任一或SEQIDNO:252至SEQIDNO:274的任一的氨基酸1至40組成的多肽的任何化學(xué)修飾，以及對(duì)編碼這種多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸以及取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸側(cè)鏈；或在氨基酸序列中使用具有相似特性的非天然氨基酸。具體而言所述修飾可以是酰胺化，例如C末端的酰胺化。發(fā)明詳述具有抗微生物活性的多肽在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供具有抗微生物活性的多肽，所述多肽包含氨基酸序列，優(yōu)選由氨基酸序列組成，所述氨基酸序列與以下氨基酸序列(I)的氨基酸1至40具有至少70。/。同一性(優(yōu)選至少80%同一性，更優(yōu)選至少85%同一性，甚至更優(yōu)選至少90%同一性，甚至更優(yōu)選至少95%同一性，最優(yōu)選97%同一性，并且特別是100%同一性)G-Xi-G-C-X2_X3_X4-X5-X6-X7-X8-X9-X0-Xj1-C-H-X2-Xi3_C_X4-Xj5-X6-Xn-X8-Xi9-X20-G-G-X2廣C-X22-X23-X24-X25陽(yáng)X26-X27-C-X28-C-X29;其中X=F、L、W或I;優(yōu)選地X「F;X2=N、R、Q、V、G、S、A、K、L、M、D、H或Y;優(yōu)選地X2二N、R、Q、V、G、S、A、K或Y;更優(yōu)選地X^N、R、S或G;X3=G、R、A或K;優(yōu)選地X3=G;X4=P、A、L、V、K或R;優(yōu)選地X4二P、K或R;X5=W或R;X6=D、A、G、K、L、T、N、F、H、M、P、Q、S、C、I、R、V或Y;優(yōu)選地X「D、A、G、K、L、T、N、F、H、M、P、Q、S、V或Y;更優(yōu)選地X^D、S、A、G或N;X7=E、G、A、L、C、Q或S;^尤選;也X7二E、G或S;X8=D、F、G、N、V、Y、H、K、L、P、S、T、W、I、M、A、C或R;優(yōu)選地X「D、F、G、N、V、Y、H、K、L、P、S、T、W、I、M或R;更優(yōu)選地X廣D、G或N;Xg二D或P;優(yōu)選地X9二D;X10=M、R、S、V、A、F、G、L、T、Y、W、E或K;優(yōu)選地X,。-M、R、S、V、G、Y、L、F、T、W或K;更優(yōu)選地X(^M、L、G或V;Xn=Q、R、L、F、G、H、S、A、C、I、K、M、P、T、V、W或Y;優(yōu)選地Xn:Q、R、L、F、G、H、S、K或Y;更優(yōu)選地Xn=Q、K、R或F;X12=N、R、I、Y、V、K、T、Q、S、F、A、W、E或H;更優(yōu)選i也X12=N、R、V或Q;X13=H、A、F、Q、T、V或L;優(yōu)選地X,3^H或L;X14=K、Q或R;優(yōu)選地X,4二K或R;X15=S、A、V、N或F;X16=I、L、M、T、W或V;優(yōu)選地乂16=1、L或V;X17=K、T或R;X18=G、H、K、A、P、F、I、Q、R、S、T、Y或N;優(yōu)選地X^G、H、R、K或N;更優(yōu)選地X,s-G或R;X19=Y、H、K、L、M、N、Q、S、V或R;伊乙選i也X19=Y或R;X20=K、F、H、T、C或R;優(yōu)選地X2Q=K或R;X21=Y、F、R、A、H、L、M、S或W;優(yōu)選地乂21=丫、F、R或W;X22=A、K、N、Q、T、E、H、I、R、S、V、G或Y;優(yōu)選地乂22=八、K、N、Q、T、S或Y;更優(yōu)選地乂22=八、S或T;X23=K、R或T;優(yōu)選地X23二K或R;X24=G、K、Q、E、N、S、T、A或R;優(yōu)選地X^G、K、Q、A或R;更優(yōu)選地X24=G或A;X25=G、K、H、W或R;優(yōu)選地乂25=0、K或R;X26=F、A、H、I、M、V、W、R或L;優(yōu)選地X26二F或L;X27=V、L、M、I、K、Q、R或T;優(yōu)選地乂27=￥、L、M或T;更優(yōu)選地X27=V或L;X28=K、H、N或R;優(yōu)選地X28-K或R;X29=Y、I、YRCG或YR;優(yōu)選地X29=Y或YR;并且與SEQIDNO:l的氨基酸1至40具有少于100%的同一性。在實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是具有抗微生物活性的多肽，其包含氨基酸序列，優(yōu)選由氨基酸序列組成，所述氨基酸序列與以下氨基酸序列(II)的氨基酸1至40具有至少70%同一性(優(yōu)選至少80%同一性，更優(yōu)選至少85%同一性，甚至更優(yōu)選至少卯。/。同一性，甚至更優(yōu)選至少95%同一性，最優(yōu)選97%同一性，并且特別是100%同一性)G-F-G-C-X1冒G-X2-X3-X4-X5-X6-D-X7-X8-C-H-X9-X10-C-Xu-S-X,2-X!3-X,4-X15_^^16—G-G-X7-G-X18-K-!X19-X20-X21-X22-G-IC-G-X23;X!=N、R、Q、V、G、S、A、K或Y;4尤選地X'^N、R、S或G;X2=P、K或R;X3=W或R;X4=D、A、G、K、L、T、N、F、H、M、P、Q、S、V或Y;優(yōu)選地X4=D、S、A、G或N;X5=E、G或S;X6=D、F、G、N、V、Y、H、K、L、P、S、T、W、I、M或R;優(yōu)選地X「D、G或N;X7=M、R、S、V、G、Y、L、F、T、W或K;伊乙選地X7=M、L、G或V;X8=Q、R、L、F、G、H、S、K或Y;伊C選i也X8:Q、K、R或F;X9=N、R、I、Y、V、K、T、S、Q或H;優(yōu)選i也X9:N、R、V或Q;X^H或L;X二K或R;X12=I、L或V;Xn二K或R;X14=G、H、R、K或N;優(yōu)選地Xw二G或R;X,5-Y或R;:K或R;X17=Y、F、R或W;X18=A、K、N、Q、T、S或Y;優(yōu)選地X,「A、S或T;X19=G、K、Q、A或R;優(yōu)選地X,「G或A;X20=G、K或R;X21^F或L;X22=V、L、M或T;伊乙選地X22^V或L;X23=Y或YR;并且與SEQIDNO:l的氨基酸1至40具有少于100%的同一性。在另外的實(shí)施方案中，氨基酸序列(I)和/或(II)與SEQIDNO:l的氨基酸序列相比具有l(wèi)、2、3、4、5、6、7或8個(gè)氨基酸的差異。優(yōu)選1、2、3、4、5或6;更優(yōu)選l、2、3、4或5;甚至更優(yōu)選l、2、3或4;甚至更優(yōu)選l、2或3;并最優(yōu)選1或2個(gè)氨基酸與SEQIDNO:l的氨基酸序列相比是不同的。在另外的實(shí)施方案中，氨基酸序列(I)和/或(II)與SEQIDNO:l的氨基酸1至40具有至少60%同一性，優(yōu)選與SEQIDNO:l的氨基酸1至40具有至少65%同一性，至少70%同一性，至少75%同一性，至少80%同一性，至少85%同一性，至少90%同一性，或至少95°/。同一性。在另外的實(shí)施方案中，如與SEQIDNO:l或SEQIDNO:3至SEQIDNO:225的任一或SEQIDNO:226至SEQIDNO:251的任一或SEQIDNO:252至SEQIDNO:274的任一相比，氨基酸序列(I)和/或(II)具有0、1、2、3、4或5個(gè)插入，優(yōu)選0、1、2或3個(gè)插入，更優(yōu)選0、l或2個(gè)插入；和0、1、2、3、4或5個(gè)缺失，優(yōu)選0、1、2或3個(gè)缺失，更優(yōu)選0、l或2個(gè)缺失。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含氨基酸序列，優(yōu)選由氨基酸序列組成，所述氨基酸序列與以下序列具有至少60%同一性(優(yōu)選70%同一性，更優(yōu)選80%同一性，甚至更優(yōu)選85。/。同一性，甚至更優(yōu)選卯％同一性，甚至更優(yōu)選95%同一性，并且最優(yōu)選100%同一性)SEQIDNO:3至SEQIDNO:225的4壬一或SEQIDNO:226至SEQIDNO:251的^f壬一或SEQIDNO:252至SEQIDNO:274的任一的氨基酸1至40;優(yōu)選SEQIDNO:3至SEQIDNO:l17的任一或SEQIDNO:226至SEQIDNO:251的任一或SEQIDNO:252至SEQIDNO:274的任一的氨基酸1至40。術(shù)語(yǔ)"SEQIDNO:3至SEQIDNO:117的i壬一"意指SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDN〇:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56、SEQIDNO:57、SEQIDNO:58、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO:69、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:74、SEQIDNO:75、SEQIDNO:76、SEQIDNO:77、SEQIDNO:78、SEQIDNO:79、SEQIDNO:80、SEQIDNO:81、SEQIDNO:82、SEQIDNO:83、SEQIDNO:84、SEQIDNO:85、SEQIDNO:86、SEQIDNO:87、SEQIDNO:88、SEQIDNO:89、SEQIDNO:90、SEQIDN〇:91、SEQIDNO:92、SEQIDNO:93、SEQIDNO:94、SEQIDNO:95、SEQIDNO:96、SEQIDNO:97、SEQIDNO:98、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:lOl、SEQIDNO:102、SEQIDNO:103、SEQIDNO:104、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:lll、SEQIDNO:112、SEQIDNO:113、SEQIDNO:114、SEQIDNO:115、SEQIDNO:116或SEQIDNO:117。術(shù)語(yǔ)"SEQIDNO:118至SEQIDNO:225的任一"意指SEQIDNO:l18、SEQIDNO:119、SEQIDNO:120、SEQIDNO:121、SEQIDNO:122、SEQIDNO:123、SEQIDNO:124、SEQIDNO:125、SEQIDNO:126、SEQIDNO:127、SEQIDNO:128、SEQIDNO:129、SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:133、SEQIDNO:134、SEQIDNO:135、SEQIDNO:136、SEQIDNO:137、SEQIDNO:138、SEQIDNO:139、SEQIDNO:140、SEQIDNO:141、SEQIDNO:142、SEQIDNO:143、SEQIDNO:144、SEQIDNO:145、SEQIDNO:146、SEQIDNO:147、SEQIDNO:148、SEQIDNO:149、SEQIDNO:150、SEQIDNO:151、SEQIDNO:152、SEQIDNO:153、SEQIDNO:154、SEQIDNO:155、SEQIDNO:156、SEQIDNO:157、SEQIDNO:158、SEQIDNO:159、SEQIDNO:160、SEQIDNO:161、SEQIDNO:162、SEQIDNO:163、SEQIDNO:164、SEQIDNO:165、SEQIDNO:166、SEQIDNO:167、SEQIDNO:168、SEQIDNO:169、SEQIDNO:170、SEQIDNO:171、SEQIDNO:172、SEQIDNO:173、SEQIDNO:174、SEQIDNO:175、SEQIDNO:176、SEQIDNO:177、SEQIDNO:178、SEQIDNO:179、SEQIDNO:180、SEQIDNO:181、SEQIDNO:182、SEQIDNO:183、SEQIDNO:184、SEQIDNO:185、SEQIDNO:186、SEQIDNO:187、SEQIDNO:188、SEQIDNO:189、SEQIDNO:190、SEQIDNO:191、SEQIDNO:192、SEQIDNO:193、SEQIDNO:194、SEQIDNO:195、SEQIDNO:196、SEQIDNO:197、SEQIDNO:198、SEQIDNO:199、SEQIDNO:200、SEQIDNO:201、SEQIDNO:202、SEQIDNO:203、SEQIDNO:204、SEQIDNO:205、SEQIDNO:206、SEQIDNO:207、SEQIDNO:208、SEQIDNO:209、SEQIDNO:210、SEQIDNO:211、SEQIDNO:212、SEQIDNO:213、SEQIDNO:214、SEQIDNO:215、SEQIDNO:216、SEQIDNO:217、SEQIDNO:218、SEQIDNO:219、SEQIDNO:220、SEQIDNO:221、SEQIDNO:222、SEQIDNO:223、SEQIDNO:224或SEQIDNO:225的任一。術(shù)語(yǔ)"SEQIDNO:226至SEQIDNO:251的任一"意指SEQIDNO:226、SEQIDNO:227、SEQIDNO:228、SEQIDNO:229、SEQIDNO:230、SEQIDNO:231、SEQIDNO:232、SEQIDNO:233、SEQIDNO:234、SEQIDNO:235、SEQIDNO:236、SEQIDNO:237、SEQIDNO:238、SEQIDNO:239、SEQIDNO:240、SEQIDNO:241、SEQIDNO:242、SEQIDNO:243、SEQIDNO:244、SEQIDNO:245、SEQIDNO:246、SEQIDNO:247、SEQIDNO:248、SEQIDNO:249、SEQIDNO:250或SEQIDNO:251的任一。術(shù)語(yǔ)"SEQIDNO:252至SEQIDNO:274的任一，，意指SEQIDNO:252、SEQIDNO:253、SEQIDNO:254、SEQIDNO:255、SEQIDNO:256、SEQIDNO:257、SEQIDNO:258、SEQIDNO:259、SEQIDNO:260、SEQIDNO:261、SEQIDNO:262、SEQIDNO:263、SEQIDNO:264、SEQIDNO:265、SEQIDNO:266、SEQIDNO:267、SEQIDNO:268、SEQIDNO:269、SEQIDNO:270、SEQIDNO:271、SEQIDNO:272、SEQIDNO:273或SEQIDNO:274的任一。術(shù)語(yǔ)"SEQIDNO:3至SEQIDNO:225的任一，，意指SEQIDNO:3至SEQIDNO:117的任一或SEQIDNO:118至SEQIDNO:225的孑壬一。術(shù)語(yǔ)"SEQIDNO:2至SEQIDNO:225的任一"意指SEQIDNO:2或SEQIDNO:3至SEQIDNO:225的任一。構(gòu)成本發(fā)明多肽的氨基酸可獨(dú)立地選自D或L型。優(yōu)選本發(fā)明的多肽是防衛(wèi)素多肽；更優(yōu)選是a防衛(wèi)素、卩防衛(wèi)素或昆蟲(chóng)(節(jié)肢動(dòng)物)防衛(wèi)素。如根據(jù)NCCLS/CLSI準(zhǔn)則，規(guī)程M7-A6，vol.20，No.2:MethodsforDilutionAntimicrobialSusceptibilityTestsforBacteriaThatGrowAerobically,S于于肉葡萄球菌(Sto/^/ococcwscw"cwm")ATCC51365、金黃色葡萄3求菌GS"to/^fococc^awew)ATCC29213或金黃色葡萄球菌ATCC25923所測(cè)定的最小抑制濃度(MinimumInhibitoryConcentration;MIC)，與SEQIDNO:l的多肽相比，本發(fā)明的多肽可顯示較高或至少相等的抗微生物活性，優(yōu)選顯示較高的抗微生物活性。在實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及人工變體，其包含保守耳又代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸的SEQIDNO:2至SEQIDNO:225的任一或SEQIDNO:226至SEQIDNO:251的任一或SEQIDNO:252至SEQIDNO:274的任一。優(yōu)選地，氨基酸改變是對(duì)性質(zhì)較不重要的(ofaminornature),即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常1至大約10個(gè)氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端曱硫氨酸殘基；至多大約20-25殘基的小接頭肽；或通過(guò)改變凈電荷或其它功能來(lái)促進(jìn)純化的小延伸，例如多組氨酉吏序歹寸(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域。保守取代的實(shí)例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和曱硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.NeurathandR丄.Hill,1979,77zePrafe/ra,AcademicPress,NewYork描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。除了20個(gè)基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-W-曱基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和a-曱基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基。"非天然氨基酸"在蛋白質(zhì)合成后已經(jīng)修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、蓬唑烷羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-曱基脯氨酸，和3，3-二曱基脯氨酸?？晒┻x擇的是，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)以使多肽的物理化學(xué)性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適pH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(CunninghamandWells,1989，5We"ce244:1081-1085)來(lái)鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個(gè)殘基，并且測(cè)試所得突變分子的生物活性(即，抗微生物活性)以鑒定對(duì)于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見(jiàn)Hilton"a/.，1996,J.Ao/.C/zew.271:4699-4708。生物相互作用也能夠通過(guò)結(jié)構(gòu)的物理分析而測(cè)定，如通過(guò)以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，連同推定的接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來(lái)測(cè)定。參見(jiàn)例如deVos"a/.,1992,255:306-312;Smithea/.,1992，J.7Wo/.224:899-904;Wlodaver&a/.,1992,F五^S丄e",309:59-64。必需氨基酸的同一性也能夠從與多肽的同一性分析推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方;去，仿寸^口刃卩些由Reidhaar-OlsonandSauer,1988,5b/ewce241:53-57;BowieandSauer,1989,/Voc.Ato/.Jcad5W.OS^86:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625公開(kāi)的那些方法來(lái)制造和測(cè)試單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。能夠4吏用的其它方法包括易錯(cuò)PCR、噬菌體展示(例如，Lowmana/.，1991,所oc/em.30:10832-10837;美國(guó)專利號(hào)5，223,409;WO92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire"fl/.，1986,G騰46:145;Ner"a/.，1988，ZWJ7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動(dòng)化的篩選方法組合以檢測(cè)由宿主細(xì)月包表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性。能夠從宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測(cè)序。這些方法允許快速測(cè)定感興趣的多肽中單獨(dú)氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。SEQIDNO:2至SEQIDNO:225的任一或SEQIDNO:226至SEQIDNO:251的任一或SEQIDNO:252至SEQIDNO:274的任一的氨基酸1至40中氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10,優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7,更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選至多5,更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選l。在另一方面，本發(fā)明提供親本抗微生物多肽的變體，該親本抗微生物多肽與SEQIDNO:l的氨基酉嬌列具有至少60%同一性，其中所述變體具有4元微生物活性并且在一個(gè)或多個(gè)位置包含取代，并且其中所述取代選自F2L、F2W或F2I;N5R、N5Q、N5V、N5G、N5S、N5A、N5K、N5L、N5M、N5D、N5H或N5Y;G6R、G6A或G6K;P7A、P7L、P7V、P7K或P7R;W8R;D9A、D9G、D9K、D9L、D9T、D9N、D9F、D9H、D9M、D9P、D9Q、D9S、D9C、D9I、D9R、D9V或D9Y;E10G、E10A、E10L、E10C、E10Q或E10S;D11F、D11G、D11N、D11V、D11Y、D11H、D11K、D11L、D11P、D11S、D11T、D11W、Dlll、D11M、D11A、D11C或D11R;D12P;M13R、M13S、M13V、M13A、M13F、M13G、M13L、M13T、M13Y、M13W、M13E或M13K;Q14R、Q14L、Q14F、Q14G、Q14H、Q14S、Q14A、Q14C、Q14I、Q14K、Q14M、Q14P、Q14T、Q14V、Q14W或Q14Y;N17R、N17I、N17Y、N17V、N17K、N17T、N17S、N17Q、N17F、N17A、N17W、N17E或N17H;H18A、H18F、H18Q、H18T、H18V或H18L;K20Q或K20R;S21A、S21V、S21N或S21F;I22L、I22M、I22T、I22W或I22V;K23R或K23T;G24H、G24K、G24A、G24P、G24F、G24I、G24Q、G24R、G24S、G24T、G24Y或G24N;Y25H、Y25K、Y25L、Y25M、Y25N、Y25Q、Y25S、Y25V或Y25R;K26F、K26H、K26T、K26C或K26R;Y29F、Y29R、Y29A、Y29H、Y29L、Y29M、Y29S或Y29W;A31K、A31N、A31Q、A31T、A31E、A31H、A3H、A31R、A31S、A31V、A31G或A31Y;K32R或K32T;G33K、G33Q、G33E、G33N、G33S、G33T、G33A或G33R;G34K、G34H、G34W或G34R;F35A、F35H、F35I、F35M、F35V、F35W、F35R或F35L;V36L、V36M、V36I、V36K、V36Q、V36R或V36T;K38H、K38N或K38R;和Y40I、Y40YRCG或Y40YR。優(yōu)選所述親本抗微生物多肽與SEQIDNO:l的氨基S交序列具有至少70%同一性，更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少90%同一性，并且最伊乙選95%同一性。特別是所述親本抗樣i生物多肽可以與SEQIDN0:1的氨基酉交序列相同。在實(shí)施方案中，親本抗微生物多肽是防衛(wèi)素多肽；更優(yōu)選a防衛(wèi)素、|3防衛(wèi)素或昆蟲(chóng)(節(jié)肢動(dòng)物)防衛(wèi)素。優(yōu)選所述親本氨基酸序列顯示抗微生物活性。在另外的實(shí)施方案中，與SEQIDN0:1的氨基酸序列相比，親本抗樣i生物多肽具有l(wèi)、2、3、4、5、6、7或8個(gè)氨基酸的差異。與SEQIDNO:l的氨基酸序列相比，優(yōu)選l、2、3、4、5或6;更優(yōu)選1、2、3、4或5;甚至更優(yōu)選l、2、3或4;甚至更優(yōu)選l、2或3;并且最優(yōu)選1或2個(gè)氨基酸是不同的。N-末端延伸本發(fā)明所述多肽的N-末端延伸可以合適地由1-50個(gè)氨基酸，優(yōu)選2-20個(gè)氨基酸，特別3-15個(gè)氨基酸組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，N-末端肽延伸不含Arg(R)。在另外的實(shí)施方案中，N-末端延伸包含將在下文進(jìn)一步定義的kex2或kex2-樣切割位點(diǎn)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，N-末端延伸是肽，其包含至少兩個(gè)Glu(E)和/或Asp(D)氨基酸殘基，例如包含以下序列之一的N-末端延伸EAE,EE,DE和DD。Kex2位點(diǎn)Kex2位點(diǎn)(參見(jiàn)例如，MethodsinEnzymologyVol185,ed.D.Goeddel,AcademicPressInc.(1990),SanDiego,CA,"GeneExpressionTechnology，，)和kex2-樣位點(diǎn)是存在于某些蛋白質(zhì)的前肽編碼區(qū)和成熟區(qū)之間的二元(di-basic)識(shí)別位點(diǎn)(即，切割位點(diǎn))。在某些情況下kex2位點(diǎn)或kex2-樣位點(diǎn)的插入顯示改進(jìn)了在前肽切割位點(diǎn)處正確的內(nèi)肽酶加工，導(dǎo)致增加的蛋白質(zhì)分泌水平。在本發(fā)明的上下文中，kex2位點(diǎn)或kex2-樣位點(diǎn)的插入導(dǎo)致在N-末端延伸的特定位置獲得切割的可能性，所述切割導(dǎo)致與SEQIDNO:2至SEQIDNO:225的任一或SEQIDNO:226至SEQIDNO:251的4壬一或SEQIDNO:252至SEQIDNO:274的任一的氨基酸1至40相比得到延伸的抗微生物多肽。融合多肽本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合在本發(fā)明所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。通過(guò)將編碼另外多肽的核苷酸序列(或其部分)融合至本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來(lái)產(chǎn)生融合多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們?cè)陂喿x框中，并使融合多肽的表達(dá)在相同啟動(dòng)子和終止子的控制下。具有抗微生物活性的多肽的來(lái)源本發(fā)明的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來(lái)源有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"獲得自"，意思是由核苷酸序列編碼的多肽由所述來(lái)源產(chǎn)生，或由其中插入了來(lái)自所述來(lái)源的核苷酸序列的菌抹產(chǎn)生。在優(yōu)選的方面，獲得自給定來(lái)源的所述多肽是胞外分泌的。本發(fā)明的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多肽例如芽孢桿菌屬(^""7/"5)多肽，例如嗜石成芽孢桿菌0Ba"7/wa汰a/6^/z//^)、解淀粉芽孑包桿菌(S(3"'〃z^awy/o/z々"ey^"'era)、短芽孑包桿菌(5o;c/〃z^6rev&)、環(huán)狀芽孑包桿菌C6fl"7/wc/rcw/aw)、凝結(jié)芽孑包桿菌C8ac/〃Mcoagw/ara)、燦爛芽孑包桿菌(5a"7/w/flw似》、遲緩芽孢桿菌CSacz7/w/e"加力、地衣芽孢桿菌C^c/〃z^fe/^m/onw、)、巨大芽孑包桿菌(Bac"/Rmegafe〃wm)、嗜熱月旨肪芽孑包桿菌(Bacz7/ussto3raz^erwo//H7M力、枯草芽孢桿菌CSflc/〃MSw6rito)或蘇云金芽孢#干菌(Bad〃wftorz'"g/era/力多肽；或鏈霉菌屬(&re;tow_yc")多肽，例如，淺青紫《連霉菌(&，tomyces1/,v油ra)或鼠灰鏈霉菌(浙Womycesm鵬."—多肽；或革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，例如，大腸桿菌或假單胞菌屬菌種(尸化w^/加"似sp.)多肽。本發(fā)明的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽例如念珠菌屬(Om^^)、克魯維酵母屬(尺/i(yvera"yce力、畢赤酵母屬(/^c/n')、酵母屬(5bcc/zaro7"yc&s1)、裂殖酵母屬0St/2/zoracc/2iaromj/cfcs)或西洋蓍霉屬(K37row/a)多肽；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽例如枝頂孢霉屬(Jc;'emom'w附)、曲霉屬(/^perg^/w)、-豆沖更霉屬(^wreo6as、隱3求菌屬(Oyptococcw力、/^7/6as^/.w/z、鐮孑包屬(Fm^n'ww)、腐質(zhì)霉屬(7/wm/co/a)、Afflg"a/wAe、毛霉屬(A/wcor)、S爻絲霉屬(Afyce/fcp/W/wra)、jVeoc"〃/附"s、月永孑包菌屬(7Vewr仍/7(9,")、擬青霉屬(尸ae"7om少ces)、青霉屬(Pem'c/〃&m)、/Vramyces、裂4習(xí)菌屬(5b/z&c^/z3/〃"m)、3果節(jié)菌屬(7^/orcw_yces)、熱子囊菌屬(T77er,"ooycw力、才炎孑包殼屬(77H'e/av/a)、!To/，oc/fl(i/Mw或木霉屬(JWc/2C^/er麵)多月太。在優(yōu)選的方面，所述多肽是具有抗微生物活性的卡爾酵母(Sacc/zarowyc"cflr&Z)^^em7'力、酉良酒酵母(Sacc/7a,-om7cescez-ev/w'ae)、4唐4匕酵母(5bcc/2orcw;Fces(iZa加/，)、道格拉氏酵母(Sacc/wramycM(iowg7咖'/)、克魯弗酵母(Sacc/w函;;cesve/力、諾地酵母(S"cc/zara，cay"orZ7e肌》或卵形酵母在另外的優(yōu)選方面，所述多肽是棘孢曲霉0^perg///1^"cw/eWw)、泡盛曲霉(/ls;erg/〃iw"W(2附on〕、》因曲霉(Apergz7/z^_/^mz'gafz)、臭曲霉(Js/erg7'〃z^ybWfi^s)、日本曲霉(/^/￡《///">57'(3/0"/<^>5")、構(gòu)巢曲霉(Jsperg7'〃ztf"/(iw/ara)、黑曲霉(y4^/erg/〃itfra'ger)、米曲霉(^^pe"g7'〃z^07加e)、4干孑包^大嫌孑包(Fusahwm6a"n'(i〖o(jì)/<ies)、禾谷錄孑包(Fwsan'wmcerea/'力、庫(kù)威嫌孑包(FwsahwmcraoAwe〃e打se)、大刀鐮孑包(Fusan.wmcw/mon/m)、禾本-牛嫌孑包(Fwsar/wmgrflw/wearw;)、禾赤鐮孑包(i^5"n'"附grow/www)、異孑包嫌孑包(Fw"r/w附/zeteras/wrwm)、合7欠木嫌孑包(Fws(3r/Mmwegwwci/)、尖嫌孑包(尸W(3n.MWax;^yporwm)、多4支鐮孑包(Fwsan.m附reft'cw/a/^附)、斗分纟工鐮孑包(F"W7'iw7ras^wm)、4妾骨木嫌孑包(jp"san'wwsamZ^c/肌w7)、月夫色嫌孑包(7^saWwm5arcoc/raw7rz)、一以分才支孑包嫌孑包(Fwan'MwsporaWc/7/o/tfey)、石克色嫌孑包(FM(3r/wmsm/;/7w^mw)、圓嫌孑包(Fz^ar/wwtorw/o^w)、擬絲孑包鐮孑包(T^kyfln'w/w/n'c/zo/Z^c/o/^fer)、!裏片鐮孢(F^yor/w附ve"e憩？wm)、特異腐質(zhì)霉(//m脂'co/(3/rao/e/w)、疏棉狀腐質(zhì)霉(T7ww/co/a/a咖gz'wO:s1(3)、米黑毛霉mz.e/ze/)、嗜熱毀絲霉(A^ce/—/z/7zora〃7emzop/n7a)、4且壽造月永孑包菌(7Vewrasporacraw")、產(chǎn)紫青霉(尸em'".〃/w附戸rpM廠。gewwm)、哈茨木審(7Hc/26(iemM/7aC朋畫)、康亍木審(Zh.c/zoaferwa/t(9w'"g7./)、長(zhǎng)枝木霉(7Hc/7C^e，a/。，'6rac/z/a/廳)、里氏木審(7h.c/2c><ier"2"reesez〕或綠色木霉(7Hc/70(iermavzWiie)多欣?？衫斫獾氖菍?duì)于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)兩種，和其它分類學(xué)的等同物(equivalent),例如無(wú)4生型(anamorph)，無(wú)論它們已知的種名。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將輕易地識(shí)別適合的等同物的同一性。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對(duì)于公眾能夠輕易地取得，所述保藏中心諸如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammiungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過(guò)將編碼另一種多肽的核普酸序列(或其部分)融合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來(lái)產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們?cè)陂喿x框中，并且融合多肽的表達(dá)在相同啟動(dòng)子和終止子的控制下。多核苷酸本發(fā)明還涉及具有編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的多核苷酸。具體而言，本發(fā)明涉及由編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列組成的多核苷酸。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，本領(lǐng)域技術(shù)人員將輕易地意識(shí)到，對(duì)于每種本發(fā)明的多肽可制備幾種編碼核苷酸序列。哪些核苷酸構(gòu)成編碼本發(fā)明多肽氨基酸的密碼子是本領(lǐng)域公知的。本發(fā)明還涉及多核苷酸，其編碼SEQIDNO:2至SEQIDNO:225的任一或SEQIDNO:226至SEQIDNO:251的4壬一或SEQIDNO:252至SEQIDNO:274的任一所示氨基酸序列的具有抗微生物活性的片段。所述多核苷酸的亞序列是其中已將一個(gè)或多個(gè)核苷酸從5'和/或3'端缺失的核苷酸序列。所述核苷酸序列可以通過(guò)遺傳工程中使用的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法來(lái)獲得，其中將核普酸序列從一個(gè)位置重置到將產(chǎn)生該核苷酸序列的不同位點(diǎn)。所述克隆方法可涉及切除(excision)和分離.包含編碼多肽的核苷酸序列的期望片，將所述片段插入載體分子，和將所述重組載體并入宿主細(xì)胞，在該細(xì)胞中核苷酸序列的多拷貝或克隆將被復(fù)制。所述核苷酸序列可以是基因組的、cDNA、RNA、半合成、合成來(lái)源的，或它們的任何組合。修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列對(duì)于多肽的合成可能是必需的，所述多肽包含的氨基酸序列與SEQIDNO:2至SEQIDNO:225的任一或SEQIDNO:226至SEQIDNO:251的任一或SEQIDNO:252至SEQIDNO:274的任一的氨基酸1至40相比具有至少一個(gè)取代、缺失和/或插入。這些人工變體性、熱穩(wěn)定性、最適pH等方面不同的變體。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，這些取代能夠在對(duì)于分子功能重要的區(qū)域之外進(jìn)行，并且仍然產(chǎn)生活性多肽。對(duì)于由本發(fā)明分離的多核苷酸編碼的多肽的活性關(guān)鍵的、并因此優(yōu)選不進(jìn)行取代的氨基酸殘基，可以根才居本領(lǐng)域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(參見(jiàn)，例如，CunninghamandWells，1989,Sc/e"ce244:1081-1085)來(lái)鑒定。在后一的技術(shù)中，將突變引入到分子中的每個(gè)正電殘基處，并且測(cè)試所得突變分子的抗微生物活性，以鑒定對(duì)于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。相互作用的位點(diǎn)也能夠通過(guò)分析三維結(jié)構(gòu)來(lái)測(cè)定，通過(guò)如核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標(biāo)記這樣的^支術(shù)來(lái)測(cè)定(參見(jiàn)，例如，deVosefa/.,1992,&/e"ce255:306-312;Smith"a/,,1992,Jbw7a/o/Afo/ecw/"r所o/ogy224:899-904;Wlodaver"a/.,1992,F五^S丄e"ers309:59-64)。此外，可通過(guò)引入核香酸取代來(lái)修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列，所述核苦酸取代不產(chǎn)生由核香酸序列編碼的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲產(chǎn)生抗微生物多肽的宿主生物體的密碼子選擇。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸與一個(gè)或多個(gè)控制序列可操作地連接，所述控制序列在合適的宿主細(xì)胞中在與該控制序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)?？梢杂迷S多方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達(dá)。依賴于表達(dá)載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對(duì)其進(jìn)行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核普酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。控制序列可以是合適的啟動(dòng)子序列，其是由用于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞識(shí)別的核苷酸序列。啟動(dòng)子序列含有介導(dǎo)多肽的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動(dòng)子可以是在所選的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截?cái)嗟暮碗s合的啟動(dòng)子，并且可以從編碼與宿主細(xì)月包同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，特別是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下述獲得的啟動(dòng)子大腸桿菌/ac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌OS^卬tomycMcoefeo/or)瓊脂糖酶基因Wa^4)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(mcS)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(flmy丄)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amj^)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(^"P)、枯草芽孢桿菌x_y"和x_y/B基因和原核[3-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroffefa/.,1978，尸raceW"g^o/f/zeiVa/7'o"a/Jcacfem少o/5We"ces75:3727-3731),以及toc啟動(dòng)子(DeBoer"a/.，1983,尸racee^"^o/Ae7Vaao"(3/爿c(3(iem少o/5Wewces80:21-25)。另夕卜的啟動(dòng)子在"UsefUlproteinsfromrecombinantbacteria"inSc/e油yc」艦r/c朋,1980,242:74-94中；和在Sambrook&a/.,1989,見(jiàn)上文中有所描述。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下列酶的基因獲得的啟動(dòng)子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(//3/加mwcorm/e/ze0天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(g/a^)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀^^分葡糖苷酶(WO00/56900)、鑲片鐮孢Daria(WO00/56900)、鑲片鐮孢Quinn(WO00/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)、里氏木霉(3-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶n、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶ni、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶iv、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶n、里氏木霉卩-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動(dòng)子(來(lái)自黑曲霉中性a-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子的雜合體)；和它們的突變的、截?cái)嗟暮碗s合的啟動(dòng)子。在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ENO-l)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAU)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氬酶(ADH1，ADH2/GAP)、S良酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬石克蛋白(CUP1)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞其它有用的啟^J子由Romanosda/.,1992,Fe^"8:423—4884苗述。控制序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，是由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3，末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基笨曱酸合酶、黑曲霉a-葡糖苦酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氬酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)月包其它有用的終止子由Romanosefa/.，1992,見(jiàn)上文描述。控制序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，其是對(duì)于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5，-末端。可以將在所選宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列用在本發(fā)明中。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ENO-l)、S良酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母a因子和釀酒酵母醇脫氬酶/甘油醛-3-磷酸脫氪酶(ADH2/GAP)?？刂菩蛄幸部梢允蔷巯佘账峄蛄?，其是與核苷酸序列的3'末端可沖喿作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時(shí)，宿主細(xì)胞將其識(shí)別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號(hào)。可以將在所選宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發(fā)明中使用。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯曱酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉a-葡糖苷酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苦酸化序列由GuoandSherman,1995,Mo/ecw/arCW/w/a廠所o/ogy15:5983-5990描述?？刂菩蛄羞€可以是信號(hào)肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基末端相聯(lián)的氨基酸序列，并且指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5，端可固有地包含信號(hào)肽編碼區(qū)，其與編碼分泌多肽的編碼區(qū)片段一起天然;也連接在翻譯閱讀框中。可供選擇的是，編碼序列5'端可含有對(duì)于所述編碼序肽編碼區(qū)時(shí)可能是必需的?；蛘?，外源信號(hào)肽編碼區(qū)可以簡(jiǎn)單地取代天然信號(hào)肽編碼區(qū)以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號(hào)肽編碼區(qū)可在本發(fā)明中使用。對(duì)于細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼區(qū)是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼區(qū)芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌P-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(，rr,，rM)和枯草芽孢桿菌p^4。另外的信號(hào)月大由SimonenandPalva,1993,jWz.cra6/o/og7'ca/ievz'evw57:109-1374苗述。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼區(qū)是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼區(qū)米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀并分酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶和疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的信號(hào)肽從釀酒酵母a因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號(hào)肽編碼區(qū)由Romanos"a/.,1992，見(jiàn)上文，描述。控制序列還可以是前肽編碼區(qū)，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無(wú)活性的并且能夠通過(guò)前肽的催化或自催化切割由前多肽轉(zhuǎn)化成成熟活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶0/^￡)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(，KO、釀酒酵母a因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(WO95/33836)的基因獲得前肽編碼區(qū)。當(dāng)信號(hào)肽和前肽區(qū)二者均出現(xiàn)在多肽的氨基末端時(shí)，將前肽區(qū)置于緊接著(nextto)多肽氨基末端，并且將信號(hào)肽區(qū)置于緊接著前肽區(qū)的氨基末端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是引起基因表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開(kāi)啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括/"。/ac和^操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAa-淀粉酶啟動(dòng)子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴(kuò)增的二氬葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調(diào)節(jié)序列可搡作地連接。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。上述的多種核酸和控制序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)方便的限制位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的核苷酸序列。可供選"t奪的是，可以通過(guò)在合適的用于表達(dá)的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構(gòu)建體來(lái)表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列。在制備表達(dá)載體的過(guò)程中，將編碼序列置于載重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達(dá)。載體的選擇將通常依賴于載體與待引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手賴二(means)?；蛘?，載體可以是一種當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單獨(dú)的載體或質(zhì)?；騼蓚€(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組的完整DNA(totalDNA),或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記，其允許簡(jiǎn)單選4奪轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性、對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是來(lái)自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的由/基因，或賦予抗生素抗性的標(biāo)記，所述抗生素抗性例如氨節(jié)青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞合適的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括但不限于fl/m/5"(乙酰胺酶)、arg」8(鳥(niǎo)氨酸氨曱?；D(zhuǎn)移酶)、Zw(草4妄膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、/^/z(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、m'aD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、/;^G(吝'U青酉吏4亥苦-5，-石粦酉交Mi羧酶)(orotidine-5'-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺香酰轉(zhuǎn)移酶)和^C(鄰氨基苯曱酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的a/wiiS*詳口pyrG基因牙口吸7K《連霉菌(iS^epto"^cas/z少gracop/ci^)的6<ar基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細(xì)胞基因組或載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組的自主復(fù)制。為了整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過(guò)同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有額外的核芬酸序列，所述核苷酸序列用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)該優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10,000堿基對(duì)，優(yōu)選400至10,000堿基對(duì)，并且最優(yōu)選800至10,000堿基對(duì)，其與相應(yīng)的目標(biāo)序列具有高度同一性以增強(qiáng)同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苦酸序列。另一方面，可以將載體通過(guò)非同源重組整合到宿主細(xì)胞基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含復(fù)制起點(diǎn)，其使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(replicator),其在細(xì)胞中發(fā)揮功能。術(shù)語(yǔ)"復(fù)制起點(diǎn)"或"質(zhì)粒復(fù)制子"在本文定義為能夠使質(zhì)粒或載體在體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYClS4的復(fù)制起點(diǎn)，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMpi的復(fù)制起點(diǎn)。用于酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是AMA1和ANSI(Gemse/"/.，1991,G潔98:61-67;Cullenda/"1987,油c/ez'd油ie廳rc/715:9163-9175;WO00/24883)。分離AMA1基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠根據(jù)公開(kāi)于WO00/24883中的方法完成?？梢詫⒍嘤谝粋€(gè)拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細(xì)胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過(guò)如下方法獲得將至少一個(gè)額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組，或包括與多核苷酸一起的可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因，其中細(xì)胞含有選擇性標(biāo)記基因的擴(kuò)增的拷貝，并且由此可通過(guò)在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)選擇多核苷酸的額外拷貝。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見(jiàn)，例如，SambrookWa/.,1989,見(jiàn)上文)。宿主細(xì)月包本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，所述重組宿主細(xì)胞包含本發(fā)明的多核苷酸，將其有利地用于多肽的重組產(chǎn)生中。將包含本發(fā)明多核苷酸的載體引入宿主細(xì)月包中，從而將該載體保留作為染色體整合體(chromosomalintegrant)或作為前述的自復(fù)制的染色體外載體。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"包含親本細(xì)胞的任何子代，其由于復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不相同。宿主細(xì)胞的選擇將很大程度依賴于編碼多肽的基因和它的來(lái)源。宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，例如，原核生物，或非單細(xì)胞微生物，例4口，真4亥生物。有用的單細(xì)胞微生物是細(xì)菌細(xì)胞，例如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，包括但不限于，芽孢桿菌屬細(xì)胞，例如，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌(Bac!7/wc/aiw》、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌；或鏈霉菌屬細(xì)胞，例如，淺青紫鏈霉菌和鼠灰鏈霉菌，或革蘭氏陰性細(xì)菌例如大腸桿菌和假單胞菌屬菌種。在優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在另外優(yōu)選的方面，芽孢桿菌屬細(xì)胞是嗜堿的芽孢桿菌屬?？赏ㄟ^(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將載體引入到細(xì)菌宿主細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)，例如，ChangandCohen,1979,M/，/arG"匿ra/G廳"cs168:111-115)，4吏用感受態(tài)纟田月包(參見(jiàn)，侈'H口，YoungandSpizizen,1961,Jow"a/o/Sacfen'o/ogy81:823-829或DubnauandDavidoff-Abelson,1971，To固fl/M。/ecwAar6z'o/ogy56:209—221),電穿孑L(參見(jiàn)，侈寸^口，ShigekawaandDower,1988,腸fec/zm々腦6:742-75l)或接合(參見(jiàn)，例如，KoehlerandThome,1987,/ow脂/c^o"m'o/ogy169:5771-5278)。宿主細(xì)力包還可以是真核生物，例如哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、才直物或真菌細(xì)月包。在優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。"真菌"用在本文包括以下門子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和4妄合菌門(Zygomycota)(^口由Hawksworthea/"/"，爿z'"swoW/2a"c/5/sZ^》Z)/cZ7.oM(a77。/7zeFw"g7'，8thedition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth"a/.,1995,見(jiàn)上，171頁(yè)中所引用)，和所有有絲分裂孑包子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworthefa/.,1995,見(jiàn)上)。在更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。"酵母"用在本文包括產(chǎn)子嚢酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)孑包霉目(Endomycetales))、產(chǎn)^旦子酵母(basidiosporogenousyeast)牙口屬于半^口菌類(FungiImperfecti)(芽孑包纟岡(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來(lái)可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如B!'o/ogyJcfz'vWeso/rea"(Skinner,F.A.，Passmore，S.M.,andDavenport,R.R.，eds,5Vc.jp/.5acfen'o/,/^ym/oy/wwiS^n'&sNo.9，1980)中所述。在更加優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是念珠菌屬、漢遜酵母屬(Z/a"w腦/a)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細(xì)胞。在最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細(xì)胞。在另外最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母(A7^ve,w^c^/acfe)細(xì)胞。在另外最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)月包是Kwtow/a/&o/_y//ca細(xì)月包。在另外更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。"絲狀真菌"包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth"a/.,1995,見(jiàn)上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過(guò)菌絲延伸進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)通過(guò)單細(xì)胞菌體的出芽生殖(budding)進(jìn)行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(掛erfc3w^ra)、Cen^on'op"'s、鬼傘屬(Cb/r/"tw)、革蓋菌屬(Con'o/w力、隱球菌屬、Fz7AayWmw、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬(A/flg"a;oW/ze)、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬(A^oca〃z'maWx)、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬(尸/7a"erac/wefe)、射脈菌屬CP/7/eWa)、瘤胃壺菌屬CP/ra"^ce力、側(cè)耳屬(尸/ewra^w)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子嚢菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬(ro/》poc/a&ww)、栓菌屬(rrawe&"或木霉屬細(xì)胞。在最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、曰本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在另外的最優(yōu)選方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫(kù)威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細(xì)胞。在另外最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是黑刺煙管菌(^/e/^a"&raC^廠^。廠/o/5"gf/vescewi1、C^廠7》or/(9/w/j1/Q""。c/"/fl、C7srz)or/o/i7'j1廣/viz/o^a、Cen>o"-opw,ssw6n^、Ce一o"-。/w7'ssw6ve環(huán)—ora、灰蓋鬼傘(Cbf/鼎sc^erew力、毛革蓋菌(CoWo/m/nhwfw力、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌(P/7a"erac/zaefec/z^^ospon'w""、輻射射月永菌(尸/z/e6/ara<i/ato)、戶/eMrafwer_ywg7'/、土生牙炎孑包霉、7>a"7efasv///aa、r/^)7m6es1ve廠s/c(9/w、口合茨木審、康于木審、長(zhǎng)斗支木審、里氏木霉或綠色木霉菌抹細(xì)胞?？梢詫⒄婢?xì)胞通過(guò)涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在EP238023和Yeltonefa/"1984，//eiV"加'owa/Jcac/em_y。/5We"c^WSL481:1470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier&a/.,1989,78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文南史描述的方法4告4tl酵母BeckerandGuarente,Abelson,J.N.andSimon,M丄,editors,GWcfetofe35tG"ewefz'"Afo/ecw/ar祝o/ow，Me/ZzotisE"2r戶o/c^，Volume194,pp182-187，AcademicPress,Inc.,NewYork;Ito,1983,Towma/。/5acfe"'o/ogy153:163;和Hinnena/.,1978,/VoceW"gsvVaf/cwa"cacfem>>o/Sc/ewcesITS/i75:1920。產(chǎn)生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式能夠產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以通過(guò)在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，和實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無(wú)機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公布的成分制備(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，其能夠從細(xì)胞裂解物(lysate)回收。可以使用本領(lǐng)域已知的對(duì)于所述多肽是特異性的方法來(lái)^^測(cè)多肽。這些檢測(cè)方法可包括特異性抗體的使用。例如，可將抗微生物活性試驗(yàn)(antimicrobialactivityassay)用于測(cè)定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過(guò)常規(guī)方法從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過(guò)濾、提:f又、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可以通過(guò)多種本領(lǐng)域已知的方法純化，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或4是耳又(參見(jiàn)，侈'H口，Prafe/w尸w折ca/7'o",J.-C.JansonandLarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，將其用編碼本發(fā)明的具有抗微生物活性的多肽的核香酸序列轉(zhuǎn)化，從而以可回收的量表達(dá)和產(chǎn)生所述多肽。多肽可從植物或植物部分回收?；蛘?，可將含有該重組多肽的植物或植物部分用于改進(jìn)食品或伺料的質(zhì)量，例如，改進(jìn)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、適口性(palatability)和流變性質(zhì)(rheologicalproperties),或用于破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉才直物的實(shí)例是草(grasses),如草J也早熟禾(meadowgrass)(藍(lán)草(bluegrass),早熟禾屬(尸oa));飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(FeWwca)、黑麥草屬(丄o"wm);寒i也型牧草(temperategrass),如Agrostis;和谷類，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實(shí)例是煙草(tobacco),豆類(legumes),如羽扇豆(lupins)，馬鈴薯，糖話計(jì)菜(sugarbeet),豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)才直物(十字花牙斗(familyBrassicaceae)),如花斗耶菜(cauliflower)，油菜籽(rapeseed)和緊密相關(guān)的模型生物體擬南芥(/^^/^>戸&Aa//am)。植物部分的實(shí)例是莖(stem)、愈傷組織(callus)、葉(leaf)、根(root)、果實(shí)(fmit)、種子(seed)和塊莖(tuber)，以及包含這些部分的獨(dú)立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyma)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的才直物細(xì)月包區(qū)室(compartments),如葉鄉(xiāng)錄體(chloroplast)、質(zhì)夕卜體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過(guò)氧化物酶體(peroxisome)和細(xì)月包質(zhì)(cytoplasm)也^^人為是才直物部分。此夕卜，<壬4可植物細(xì)胞，無(wú)論什么組織來(lái)源，都被認(rèn)為是植物部分。同樣地，植物部分，如分離以促進(jìn)本發(fā)明的應(yīng)用的具體組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)。同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的還有這些植物、植物部分和植物細(xì)胞的子代。表達(dá)本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞可以依照本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)如下方法構(gòu)建所述植物或植物細(xì)胞將編碼本發(fā)明多肽植物的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)構(gòu)建體并入植物宿主基因組，并且繁殖所得的修飾植物或植物細(xì)胞成為轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。表達(dá)載體便利地是包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達(dá)該核苷酸序列所需的適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作地連接。此外，表達(dá)構(gòu)建體可以包含對(duì)于鑒定宿主細(xì)胞有用的選擇性標(biāo)記，在所述宿主細(xì)胞中整合了表達(dá)構(gòu)建體和將該構(gòu)建體？1入到所述植物中所必需的DNA序歹'j(后者依賴于使用的DNA引入方法)。調(diào)節(jié)序列的選擇，例如啟動(dòng)子和終止子序列和任選地信號(hào)或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的選^奪，舉例來(lái)說(shuō)，基于期望何時(shí)、何處以及如何表達(dá)多肽而確定。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達(dá)可以是組成型的或誘導(dǎo)型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以靶向特定的組織或植物部分例如種子或葉。調(diào)節(jié)序列由例如Tague"a/.,1988,P/朋f86:506所述。對(duì)于組成性表達(dá)，可使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子(FranckWa/.,1980，Ce//21:285-294,Christensen"a/"1992,尸/awfS/o/.18:675-689;Zhang"a/.，1991，P/aWCW/3:1155-1165)。器官特異性啟動(dòng)子可以是例如來(lái)自貯藏庫(kù)組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊莖和果實(shí)的啟動(dòng)子(Edwards&Comzzi,1990,爿朋.iev.24:275-303)，或來(lái)自代i射庫(kù)組織(metabolicsinktissue)例^口分生纟且織的啟動(dòng)子(Itoe/1。/.，1994,尸/朋Mo/,歷o/.24:863-878),種子特異性啟動(dòng)子諸如來(lái)自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、J求蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動(dòng)子(Wu"a/.，1998,尸/aWaw/Ce〃P/^w'o/ogv39:885-889),來(lái)自豆球蛋白(Iegumin)B4和蠶豆(P7c/a/a6a)的未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動(dòng)子(Conrad"a/.，1998，/owma/尸/a"f尸/z"/o/ogy152:708-711)、來(lái)自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動(dòng)子(Chen"a/.,1998，戶/a"f朋dCe//P/z"/o/ogy39:935-941)，來(lái)自歐洲油菜06raM/ca腦pw力的貯藏蛋白napA啟動(dòng)子，或本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的任何其他種子特異性的啟動(dòng)子，例如，在WO91/14772中所描述的。此外，啟動(dòng)子可為葉特異性的啟動(dòng)子，如來(lái)自稻或番茄的rk^啟動(dòng)子(Kyozuka等，1993,iVa"fP/zjw'o/ogv102:991-1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺噤呤曱基轉(zhuǎn)移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動(dòng)子(MitraandHiggins，1994,尸/aw/1Mo/ecw/ar說(shuō)b/ogy26:85-93),或來(lái)自稻的aW尸基因啟動(dòng)子(Kagaya"a/.,1995，Mo/ecw/arawdGWera/248:668-674),或傷口誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如馬鈴薯pin2啟動(dòng)子(XuWa/"1993，P/a"/A/o/ecM/"r5/o/o^22:573-588)。同樣地，所述啟動(dòng)子可通過(guò)非生物的處理誘導(dǎo)，如溫度、干旱或鹽度變化，或通過(guò)外源施加的激活所述啟動(dòng)子的物質(zhì)謙導(dǎo)，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormone)^口乙丈希、At落酉交(abscisicacid)、赤霉酉交(gibberellicacid)牙口/或重金屬。啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件也可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明多肽在植物中的較高表達(dá)。例如，啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件可以是內(nèi)含子，其位于啟動(dòng)子和編碼本發(fā)明多肽的核苦酸序列之間。例如Xu"g/.,1993,見(jiàn)上，公開(kāi)了使用稻肌動(dòng)蛋白l基因的第一內(nèi)含子以增強(qiáng)表達(dá)。選擇性標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其它部分可以選自本領(lǐng)域內(nèi)可用的那些。將核酸構(gòu)建體根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)并入植物基因組，所述常規(guī)才支術(shù)包括土壤桿菌屬(/^ratocfen'ww)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射(microinjection).粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孑L(Gasser"a/.,1990,5We"ce244:1293;Potrykus,1990，腸/Tec/wo/柳8:535;Shimamoto"a/"1989，淑wrc338:274)。目前，沖艮癌土^裏一干菌(y4gro6ocfen't/mfwme^3c/em)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(genetransfer),是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(為了參考，見(jiàn)HooykasandSchilperoort,1992,P/aWMo/ecw/arS/o/ogy19:15-38),并且它也可以用于轉(zhuǎn)4匕因單子葉植物的優(yōu)選的方法，是用粒子(用轉(zhuǎn)化DNA涂覆的微觀的金或鴒粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中的胚(developingembryos)(Christou,1992，尸/"WJ譜，/2:275-281;Shimamoto,1994,Cwew/1C^/w/owS/o/ec/zm/ogy5:158-162;Vasil"a/.,1992,5z'o/rec/2"o/ogy10:667-674)。轉(zhuǎn)化單子葉#_物的可供選#^的方法，是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如由Omimlleh"a/.,1993，P/aWMo/ecw/ar21:415-428所描述的。轉(zhuǎn)化之后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法選擇具有并入的表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并且再生成為完整植物。通常設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化方法用于通過(guò)如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性消除選擇基因例如，使用帶有兩種獨(dú)立的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或通過(guò)特異性重組酶位點(diǎn)特異性地切除選擇基因。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)包含多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有抗微生物活性的多肽；和(b)回收所述多肽。組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物，例如藥用組合物(pharmaceuticalcomposition)。優(yōu)選地，所述組合物富含這種多肽。術(shù)語(yǔ)"富含，，表示使所述組合物的抗微生物活性增加，例如，以1.1的富集因翁:(enrichmentfactor)增力口。所述組合物可以進(jìn)一步包含其它藥用活性劑，例如另外的殺生物劑(biocidalagent)或4中生物劑(biostaticagent)，例如顯示^。上所定義的^^效生4勿活性的另外的抗微生物多肽。殺生物劑可以是抗生素，如本領(lǐng)域已知的。抗生素的種類包括青霉素，例如青霉素G、青霉素V、甲氧西林(methicillin)、苯唑西林(oxacillin)、羧千青霉素(carbenicillin)、萘夫西林(nafcillin)、氨芐青霉素(ampicillin)等；青霉素類組合p-內(nèi)酰胺酶抑制劑，頭孢菌素，例如頭孢克^各(cefaclor)、頭孑包p坐啉(cefazolin)、頭孑包口夫新(cefuroxime)、才立氧頭孑包(moxalactam)等；碳青霉烯類(carbapenems);單酰胺菌素類(monobactams);氨基糖苷類；四環(huán)素類；大環(huán)內(nèi)酯類；林可霉素類(lincomycins);多粘菌素類(polymyxins);石黃胺類(sulfonamides);奎i若酮類(quinolones);氯霉素(cloramphenical);曱硝坐(metronidazole);壯只見(jiàn)霉素(spectinomycin);甲氧千口定(trimethoprim);萬(wàn)古霉素(vancomycin)等。所述殺生物劑也可以是抗真菌劑(anti-mycoticagent)，包括多烯類，例如兩性霉素B(amphotericinB)、制霉菌素(nystatin);5-氟可新(5-flucosyn);和口坐系(azoles)，例^口。米康口坐(miconazo1)、酉同康口坐(ketoconazol)、j尹曲康口坐(itraconazol)禾口氟康p坐(fluconazol)。在實(shí)施方案中，殺生物劑是非酶促化學(xué)劑。在另外的實(shí)施方案中，殺生物劑是非多肽化學(xué)劑。組合物可包含合適的載體材料。組合物還可包含合適的遞送媒介物(deliveryvehicle),當(dāng)將所述組合物用作藥物時(shí)，該遞送々某介物能夠?qū)⒈景l(fā)明的抗微生物多肽遞送至期望的位置(locus)。所述多肽組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域已知方法制備，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒狀(granulate)或小顆粒狀(microgranulate)的形式?？蓪⒋ㄓ诮M合物中的多肽用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)穩(wěn)定。在下給出本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選用途的實(shí)例。本發(fā)明多肽組合物的劑量和使用所述組合物的其它條件可基于本領(lǐng)域已知的方法來(lái)確定。方法和用途本發(fā)明還涉及使用具有抗微生物活性的多肽的方法。所述抗微生物多肽在遭受細(xì)菌、真菌、酵母或藻類污染的任何位置通常都是有用的。通常而言，所述位置在含水系統(tǒng)中，例如冷卻水系統(tǒng)、洗衣漂洗水(laundryrinsewater);油系統(tǒng)，例如切削油、潤(rùn)滑劑、油田等，其中需要將微生物殺死或必需控制它們的生長(zhǎng)。然而，本發(fā)明也可用在已知抗微生物組合物對(duì)其是有用的所有應(yīng)用中，例如保護(hù)木材、膠乳(latex)、粘合劑、膠(glue)、紙、紙板(cardboard)、紡織品、皮革、塑料、填縫材料(caulking)和飼料。其它用途包括保存食品，飲料，化妝品例如乳液(lotion)、乳膏(cream)、湊是月交(gel)、4欠膏(ointment)、急(soap)、香〉皮(shampo0)、i周節(jié)齊寸(conditioner)、止汗劑(antiperspirant)、除臭劑(deodorant)、漱口劑(mouthwash)、隱形眼4竟產(chǎn)品，酶配制物(enzymeformulation)或食品成分。因此，本發(fā)明的抗微生物多肽可以作為消毒劑使用，例如，用于處理眼或口的感染、皮膚感染；用于止汗劑或除臭劑；用于清潔和消毒隱形眼鏡和牙齒(口腔護(hù)理)。一般而言，預(yù)期將本發(fā)明的抗微生物多肽用于清潔、消毒或抑制任何表面上的微生物生長(zhǎng)?？捎欣嘏c本發(fā)明抗微生物多肽接觸的表面的實(shí)例是處理設(shè)備的表面，所述處理設(shè)備用于例如乳制品廠、化學(xué)或制藥加工廠、水衛(wèi)生系統(tǒng)(watersanitationsystem)、煉油廠(oilprocessingplant)、紙漿力口工廠(paperpulpprocessingplant)、水處理廠和冷卻塔。本發(fā)明的抗微生物多肽應(yīng)該以有效清潔、消毒或抑制所述表面上微生物生長(zhǎng)的量來(lái)使用。本發(fā)明的抗微生物多肽另外還可用于在食品加工廠和任何制備或供應(yīng)食品的區(qū)域例如醫(yī)院、療養(yǎng)院和餐館清潔表面和烹飪用具。劑。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的抗微生物多肽或組合物作為藥物的用途。另外，述^:生物例如真菌生物體或細(xì)菌，優(yōu)選革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。本發(fā)明的組合物和抗微生物多肽也可用作抗微生物的獸用的(veterinarian)或人用治療劑或預(yù)防劑來(lái)使用。因此，本發(fā)明的組合物和抗微生物多肽可以用在處理;徵生物感染的獸用或人用治療劑或預(yù)防劑的制備中，所述微生物感染例如細(xì)菌或真菌感染，優(yōu)選革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌感染。具體而言所述微生物感染可與肺病和性傳播疾病有關(guān)，所述肺病包括但不限于結(jié)核病、肺炎和嚢性纖維化病(cysticfibrosis);所述性傳播疾病包括但不限于'淋病和衣原體。本發(fā)明的組合物包含有效量的本發(fā)明的抗微生物多肽。術(shù)語(yǔ)"有效量"在用于本文中時(shí)，意思指本發(fā)明的抗微生物多肽的量足夠抑制所述微生物的生長(zhǎng)。本發(fā)明還涉及創(chuàng)傷愈合組合物(woundhealingcomposition)或產(chǎn)品例如繃帶、醫(yī)學(xué)設(shè)備例如導(dǎo)管，并且進(jìn)一步涉及抗頭皮屑的頭發(fā)產(chǎn)品，例如香波。將本發(fā)明的抗微生物多肽的配制物施用于正遭受樣史生物感染或?qū)ξ⑸锔腥疽赘械乃拗?。施用依賴于特定的微生物可以是局部?topical)、定位的(localized)或全身的，優(yōu)選所述施用應(yīng)該是定位的。通常而言本發(fā)明的抗樣i生物多肽的劑量將是足以通過(guò)殺死至少大約50%,通常至少1對(duì)凄t(llog)，并且可以是2或2以上對(duì)數(shù)來(lái)將微生物群體減少。將本發(fā)明的化合物按減少微生物群體同時(shí)最小化任何副作用的劑量施用。預(yù)期所述組合物將在醫(yī)師的指導(dǎo)下獲得并且使用于體內(nèi)用途。將本發(fā)明的抗微生物多肽具體地用于殺死革蘭氏陰性細(xì)菌，包括銅綠^i單孢菌(hewGfomowasaerag/"raa)和沙眼衣原體(C7z/am>^'fl^ac/7o,Ma/lsO;和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，包括鏈J求菌(streptococci)例如月市炎鏈球菌(5y，tococcws戸e匿簡(jiǎn)'力、乳房鏈球菌(S.由,刮、豬腸鏈球菌(S./^oz'"fes^"a/W、酉良膿鏈球菌(51./少ogewesO和無(wú)乳鏈球菌(S.Jga/aWae);和葡萄3求菌(streptococci)例如金黃色葡萄球菌(5"to//7少/ococcws表皮葡萄5求菌(51.ep^er/77W力、模仿葡萄球菌(5*.s/ww/a"》、木糖葡萄球菌(6",w力和肉葡萄球菌(S.car"os1—?？蓪⒈景l(fā)明的抗微生物多肽的配制物施用于正遭受或易感于微生物的肺感染例如肺炎的宿主；或施用于正遭受或易感于微生物創(chuàng)傷感染例如細(xì)菌創(chuàng)傷感染的宿主。的宿主，所述皮膚感染例如痤瘡、遺傳過(guò)敏性皮炎或脂溢性皮炎；優(yōu)選所述皮膚感染是細(xì)菌皮膚感染，例如由表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、瘡皰丙酉^4干菌(iVop/om.Z)a"eWwmflc"es1)、卵一犬斗泉糸匕孑包子菌(Pz'^rosporMmova/e)或凈泉糸匕馬拉色菌(A/a/a^ez/aX"r)引起的細(xì)菌皮膚感染。本發(fā)明的抗微生物多肽還用于殺死微生物的體外配制物，具體而言用在不希望引入大量常規(guī)抗生素的情況。例如，可將本發(fā)明的抗微生物多肽添加至動(dòng)物和/或人的食品制備物中；或可將它們包括作為細(xì)胞體外培養(yǎng)的添加劑，以防止組織培養(yǎng)中微生物的過(guò)度生長(zhǎng)(overgrowth)。具體微生物對(duì)用本發(fā)明的抗微生物多肽致死的易感性可通過(guò)體外測(cè)試來(lái)測(cè)定，詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分。通常將微生物的培養(yǎng)物與不同濃度的抗微生物多肽組合一段足以使所述蛋白質(zhì)作用的時(shí)間，通常為大約一小時(shí)至一天。隨后將活樣l生物計(jì)lt,并且測(cè)定致死水平。感興趣的微生物包括但不限于，革蘭氏陰性細(xì)菌，例如檸檬酸桿菌屬菌種(CVfra6c7cfe尸w.);腸桿菌屬菌種埃希氏菌屬菌種C^c/7en.c/n."平)，例如大腸桿菌；克雷伯氏菌屬菌種(A7eZw'e〃fl平)；摩根氏菌屬菌種(Aio廠g朋e〃fl變形菌屬菌種(/Vo/ez^普羅威登斯菌屬菌種(Prav/(iewc/a^sp.);沙門氏菌屬菌種(Sa/wo朋〃a),例如傷寒沙門氏菌(51.鼠傷寒沙門氏菌(S./>'p/7/mwr/ww);沙雷氏菌屬菌種(Serra"a志賀氏菌屬菌種(幼/ge〃fl假單胞菌屬菌種CP化i^o,"o"ay^.)，例如銅綠化支單胞菌；耶爾森氏菌屬菌種(yea/"/fl平)，例如鼠疫耶爾森氏菌(K;^似)、假結(jié)核耶爾森氏菌(7戸eW(^z^e,'CM/0^)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Ke"&raco////ca);弗朗西絲氏菌屬菌種(Fra"c^ce〃a5p.);巴斯德氏菌屬菌種CPasfwre〃a弧菌屬菌種(P^Wos;.)，例如霍亂弧菌(Kc/zo/erae)、副;容血弧菌(K/ara/2emo(y"c船)；彎曲桿菌屬菌種(C"mp少/c^acter5p.)，例如空腸彎曲桿菌(C.^/wm〕；嗜血菌屬菌種(7faemop/n7wss;.)，例如流感嗜血菌(//.zVz/we"zae)、杜氏嗜血菌(//.c/wcrey!:);博德特氏菌屬菌種(5orcfete〃a例如百日咳博德特氏菌屬(及；eWz^^)、支氣管炎博德特氏菌(S.Zwwc/^e;^/ca)、副百日咳博德特氏菌(及；9flra/eWww/s);布魯氏菌屬菌種C5race〃a奈瑟氏3求菌屬菌種(A^/^en-asp.)，例如'淋病奈瑟氏J求菌(iV.go"wr/zoeae)、月t月莫炎奈瑟氏球菌(;V.mem'"g/^fe)等。其它感興趣的細(xì)菌包括軍團(tuán)菌屬菌種(丄egiowe〃a5/7.)，例如4憂月申軍團(tuán)菌(丄.p"ewwo//n7a);利其斤4爭(zhēng)氏菌屬菌種(ZiWe"'a例如單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(丄.;枝原體屬菌種(綺co//a5mas/.),例^口人型#支原、體(M/2om/w'力、月申炎才支原、體(Mp"ewmo"/ae);分斗支牙干菌屬菌種(綺cc^(3cfer/ww例如結(jié)核分枝桿菌(7W:化6ercw/os7》、麻風(fēng)分枝桿菌(M/eprae);密螺旋體屬菌種(7V印OMemfl例如徹白密螺S走體(7:pa〃/血m);疏螺旋體屬菌種CSo^rWa,例如布氏疏螺旋體(及Zwrgdor/er/);4勾端蟲(chóng)累i走體屬(丄e;tos77/rae^p.);立克)欠氏體屬菌種(i/cA:eto7'a例如立氏立克次氏體(i.n'cfeto//)、斑滲傷寒立克次氏體(兄^;/h');衣原體屬菌種(C/7/am;^'a例如石少眼衣原體(C.frac/wma&)、肺炎衣原體(C.;w^/Mow'ae)、鸚鵪熱衣原體(C./^//tocz');螺4干菌屬菌種(/^//(:0^7"￡廠例如幽門螺桿菌("/y/on')等。感興趣的非細(xì)菌病原體包括真菌和原生動(dòng)物病原體，例如瘧原蟲(chóng)屬的種類(尸/asmc^/as;.)，例^口惡'1"生癥原蟲(chóng)(/5/a/cz》aram);錐蟲(chóng)屬的種類(ro^a"aomas/7.)，侈'H口布氏,焦蟲(chóng)(7:6rwce/);shistosomes;內(nèi)阿米巴屬的種類(五"toewoeZa隱J求菌屬菌種(Q7ptoc0ccM^.);念3朱菌屬菌種(Cfl"ofe/a例如白念珠菌(C.a/6z'c"W5)等?？刹捎枚喾N施用方法。可將所述多肽配制物口服給予，或血管內(nèi)注射、皮下注射、腹膜(peritoneally)注射、通過(guò)氣溶膠、眼科(opthalmically)、膀胱內(nèi)、局部(topically)施用等。例如，通過(guò)吸入的施用方法是本領(lǐng)域熟知的。所述治療配制物的劑量將依賴于待施用的特定抗微生物多肽、疾病的性質(zhì)、施用的頻率、施用的方式、藥劑自宿主的清除率(cleamnce)等而廣泛地變化。最初的劑量可以較大，接著是較小的維持劑量(maintenancedose)。所述劑量可每周一次或兩周一次不頻繁地施用，或分成較小的劑量每日一次或每日幾次、半周一次或半周幾次地施用等，以維持有效劑量水平。在許多情況下，口服施用將比靜脈內(nèi)施用需要更高的劑量。為了口服施用時(shí)更高的穩(wěn)定性，可對(duì)酰胺鍵以及氨基端和羧基端進(jìn)行修飾。例如，可將羧基端酰胺化。劑型可將本發(fā)明的化合物并入多種用于治療施用的劑型。更具體地，可將本發(fā)明的化合物通過(guò)與合適的、可藥用的載體或稀釋劑組合配制成藥用組合物，并且可以配制成固體、半固體、液體或氣體形式的制備物，例如片劑(tablet)、月交嚢(capsule)、斗分劑(powder)、顆粒劑(granule)、軟膏(ointment)、乳膏(cream)、泡沫(foam)、；容液、才全劑(suppository)、注射劑(injection)、吸入劑(inhalant)、凝膠(gel)、微球體(microsphere)、洗劑(lotion)和氣溶膠。同樣地，可以多種方法完成所述化合物的施用，包括口服、頰、直腸、腸胃外、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)、透皮、氣管內(nèi)(intracheal)等施用。本發(fā)明的抗微生物多肽在施用之后可以是全身的，或通過(guò)使用植入物或發(fā)揮作用以在植入位點(diǎn)保持活性劑量的其它配制物，可將本發(fā)明的抗微生物多肽定位。在一個(gè)實(shí)施方案中，局部使用(topicaluse)的劑型包含降低二價(jià)陽(yáng)離子，尤其是鈣和鎂的有效濃度的螯合劑。例如，可包括試劑例如檸檬酸鹽(citrate)、EGTA或EDTA,其中檸檬酸鹽是優(yōu)選的。檸檬酸鹽的濃度將通常是大約1至10mM。本發(fā)明的化合物可單獨(dú)施用，彼此組合施用，或它們能夠與其它已知的化合物(例如，穿孔蛋白(perforin)、抗炎劑、抗生素等)組合使用。在藥物劑量形式中，所述化合物可以它們可藥用的鹽形式施用。以下方法和賦形劑4又作為示例性而絕非用于限制。對(duì)于口服制備物，所述化合物能夠單獨(dú)使用或與合適的添加劑組合使用，以制成片劑、粉劑、顆粒劑或膠囊，例如，與常規(guī)添加劑組合使用，例如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈐薯淀粉；與粘合劑組合使用，例如結(jié)晶狀纖維素(crystallinecellulose)、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；與崩散劑(disintegrator)組合使用，例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或羧曱基纖維素鈉(sodiumcarboxymethylcellulose);與潤(rùn)滑劑組合使用，例如滑石或硬脂酸4美；并且如果需要的話，與稀釋劑、緩沖劑、潤(rùn)濕劑、防腐劑和調(diào)味劑組合使用。通過(guò)將所述化合物溶解、懸浮或乳化在含水或非水的溶劑中可將所述化合物配制成用于注射的制備物，所述溶劑例如植物性或其它類似的油，合成的脂肪酸甘油酯，丙二醇或高級(jí)脂肪酸的酯類；并且如果需要的話，與常規(guī)添加劑例如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑一起?？蓪⑺龌衔镉迷谕ㄟ^(guò)吸入施用的氣溶膠劑型中?？蓪⒈景l(fā)明的化合物調(diào)配在可增壓推進(jìn)劑(pressurizedacceptablepropellant)中，例如二氯二氟曱烷、丙烷、氮等。通過(guò)與常規(guī)添加劑例如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑一起配制，可將所述化合物用作洗劑，例如防止燒傷感染的洗劑。此外，所述化合物可通過(guò)與各種基底(bases)例如乳化基底(emulsifyingbase)或水溶性基底(water-solublebase)混合制成栓劑。本發(fā)明的化合物可通過(guò)栓劑直腸施用。所述栓劑可包括在體溫熔化而在室溫固化的媒介物(vehicle)例如可可油、碳蠟和聚乙二醇?？商峁┛诜蛑蹦c施用的單位劑型(unitdosageform)例如糖漿、酏劑(elixir)和懸劑，其中每劑量單位例如一茶匙(teaspoonfUl)、一大湯匙(tablespoonftd)、片劑或栓劑含有預(yù)先確定量的組合物，該組合物中包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的化合物。類似地，用于注射或靜脈內(nèi)施用的單位劑型可在組合物中包含本發(fā)明的化合物，所述組合物作為無(wú)菌水、生理鹽水或其它可藥用載體中的溶液。持纟賣牙,方文劑型的才直入物(implantsforsustainedreleaseformulations)是本4頁(yè)體(microsphere)、板(slab)等。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成宿主良好耐受的易受侵蝕的聚合物(erodiblepolymer)。將含有本發(fā)明抗《斂生物多肽的才直增力口。術(shù)語(yǔ)"單位劑型"用于本文指適合作為人和動(dòng)物受試者單位劑量的物理上的離散單位(physicallydiscreteunit),每單位含有預(yù)定量的本發(fā)明化合物，所計(jì)算的量足以使本發(fā)明的化合物與可藥用的稀釋劑、載體或媒介物聯(lián)合以產(chǎn)生期望效果。對(duì)本發(fā)明的單位劑型的規(guī)格(specifications)依賴于所采用的具體化合物、待達(dá)到的效果，和在宿主中與所述化合物有關(guān)的藥物動(dòng)力學(xué)?？伤幱玫馁x形劑，諸如媒介物、佐劑、載體或稀釋劑，對(duì)于公眾是易于獲得的。此外，可藥用的輔助物質(zhì)(auxiliarysubstance),諸如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、張度調(diào)節(jié)劑(tonicityadjustingagent)、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑等,對(duì)于公眾是易于獲得的。對(duì)于全身施用的通常劑量范圍是每次施用從0.1皮克至100毫克每千克受試者重量。通常劑量可以是每日2至6次月l用一個(gè)片劑，或每日一次月l用一個(gè)含有較高比例活性成分含量延時(shí)釋放(time-release)膠嚢或片劑。所述延時(shí)釋放效果可以通過(guò)在不同pH值溶解的膠嚢材料、通過(guò)按照滲透壓緩慢辨，i文的膠嚢或通過(guò)任何其它已知的控制釋放的方法來(lái)獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解的是，劑量水平可作為特定化合物、癥狀的嚴(yán)重性和受試者對(duì)副作用的敏感性的函數(shù)而改變。某些特定的化合物比其它化合物更有效。對(duì)于指定化合物的優(yōu)選劑量，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)各種方法容易地決定。優(yōu)選的方法是測(cè)量指定化合物的生理效價(jià)(physiologicalpotency)。使用脂質(zhì)體作為遞送媒介物是一種感興趣的方法。脂質(zhì)體與靶位點(diǎn)的細(xì)胞融合，并且在細(xì)胞內(nèi)遞送腔室(Iumen)的內(nèi)容物。將脂質(zhì)體保持與細(xì)胞4妾觸一段足夠融合的時(shí)間，使用各種方法以保持接觸，例如分離、結(jié)合劑等。在本發(fā)明的一個(gè)方面，將脂質(zhì)體設(shè)計(jì)成氣溶膠化用于肺部施用。脂質(zhì)體可與介導(dǎo)膜融合的純化蛋白或肽，例如仙臺(tái)(Sendai)病毒或流感病毒等一起制備。月旨質(zhì)可以是形成脂質(zhì)的已知的脂質(zhì)體的任何有用的組合，包括陽(yáng)離子或兩性離子的脂質(zhì)，例如磷脂酰膽堿。剩余的脂質(zhì)通常將是中性或酸性脂質(zhì)，例如月旦固醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油等。對(duì)于制備脂質(zhì)體，可使用由Kato(1991)J.編.Oiem.266:3361描述的方法。簡(jiǎn)而言之，將包含肽的腔室組合物和脂質(zhì)在適當(dāng)?shù)暮橘|(zhì)中組合，方便地是鹽水介質(zhì)，其中總固體將在約1-10重量百分比的范圍內(nèi)。在劇烈4覺(jué)拌一段短時(shí)間之后(約5-60秒)，將試管置于溫水浴中(約25-40°C)，并且重復(fù)這個(gè)循環(huán)約5-10次。然后將組合物超聲處理一段合宜的時(shí)間(一般約1-10秒)，并可通過(guò)渦旋震蕩進(jìn)一步攪拌。接著通過(guò)加入含水介質(zhì)擴(kuò)張?bào)w積，一般增加約l-2倍體積，然后搖動(dòng)并冷卻。這種方法使得高分子量分子并入至腔室中。具有其它活性劑的配制物為了用于本發(fā)明的方法，可將本發(fā)明的抗微生物多肽與其它醫(yī)藥上的活性劑一起配制，具體而言，與其它抗微生物劑一起配制。感興趣的其它劑包括本領(lǐng)域內(nèi)已知的各種抗生素?？股氐姆N類包括青霉素，例如青霉素G、青霉素V、曱氧西林、苯唑西林、羧芐青霉素、萘夫西林、氨芐青霉素等；青霉素組合P-內(nèi)酰胺酶抑制劑、頭孢菌素，例如頭孢克洛、頭孢唑啉、頭孢唑月虧、拉氧頭孢等；碳青霉烯類；單環(huán)內(nèi)酰胺類；氨基糖苷類；四環(huán)素類；大環(huán)內(nèi)酯類；林可霉素類；多粘菌素類；磺胺類；喹諾酮類；cloramphenical;曱硝噠唑(metronidazole);壯觀霉素；曱氧芐啶(trimethoprim);萬(wàn)古霉素等?？拐婢鷦┮彩怯杏玫?，包括多烯類，例如兩性霉素B、制霉菌素；5-氟可新；和唑系，例如咪康唑、酮康唑、伊曲康唑和氟康峻?？菇Y(jié)核藥物包4舌異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素和利福平。也可將細(xì)胞因子納入本發(fā)明的抗孩i生物多肽配制物中，例如干擾素Y、腫瘤壞死因子a、白細(xì)胞介素12等。體外合成本發(fā)明的抗微生物肽可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法通過(guò)體外合成制備?？?吏用多種商業(yè)合成^殳備，例如AppliedBiosystemsInc.,Beckman的自動(dòng)合成儀等。通過(guò)使用合成儀，可將天然存在的氨基酸用非天然氨基酸取^，具體而言用D-異構(gòu)體(或D型)例如D-丙氨酸和D-異亮氨酸、非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體、具有不同長(zhǎng)度或官能度(fonctionality)的側(cè)鏈等來(lái)取代。具體的序列和制備的方式將由簡(jiǎn)便性、經(jīng)濟(jì)性、所需純度等來(lái)決定。可將化學(xué)連接提供至多種肽或蛋白質(zhì)，其包含便于鍵合的官能度，例如用于酰胺或取代胺類形成，例如還原胺化的氨基；用于碌^醚或二硫化物形成的硫醇基；用于酰胺形成的羧基等。如果需要，可在合成期間或表達(dá)期間將多種基團(tuán)引入肽中，其允許對(duì)其它分子或表面的連接。因此，半胱氨酸能夠用來(lái)制備用于連接至金屬離子復(fù)合體的硫醚、組氨酸；用于形成酰胺或酯的羧基；用于形成酰胺的氨基等。還可將多肽根據(jù)重組合成的常規(guī)方法進(jìn)行分離和純化?？芍苽浔磉_(dá)宿主的裂解物，并且使用HPLC、排阻層析、凝月吏電泳、親和層析或其它純^4支術(shù)來(lái)純化所述裂解物。在極大程度上，與涉及產(chǎn)品制備及其純化方法的污染物相比，所用組合物將包含按重量計(jì)至少20%的期望產(chǎn)品，更通常的是包含按重量計(jì)至少大約75%的期望產(chǎn)品，優(yōu)選包含按重量計(jì)至少大約95%的期望產(chǎn)品，并且對(duì)于治療目的通常的是按重量計(jì)至少大約99.5。/。的期望產(chǎn)品。通常而言，所述百分?jǐn)?shù)將以總蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)。動(dòng)物飼料本發(fā)明還涉及用于將具有抗微生物活性的多肽用于動(dòng)物飼料的方法，以及包含本發(fā)明的抗微生物多肽的伺料組合物和祠料添加劑。術(shù)語(yǔ)"動(dòng)物"包括所有動(dòng)物，包括人類。動(dòng)物的實(shí)例是非反芻動(dòng)物和反芻動(dòng)物，例如牛、羊和馬。在具體的實(shí)施方案中，動(dòng)物是非反芻類動(dòng)物。非反芻類動(dòng)物包括單胃動(dòng)物，例如豬(pig)或豬(swine)(包括但不限于小豬、成長(zhǎng)中的豬(growingpig)和母豬(sows));家禽例如火雞和雞(包括但不限于雛雞(broilerchick)、蛋雞(layer));小牛(youngcalves);和魚類(包括但不限于鮭魚)。術(shù)語(yǔ)"飼料"或"飼料組合物"的意思是適合于動(dòng)物攝入或旨在供纟會(huì)動(dòng)物攝入的任何化合物、制備物、混合物或組合物。在根據(jù)本發(fā)明的用途中，可將抗微生物多肽在飲食之前、之后或與之同時(shí)地喂給動(dòng)物。后者是優(yōu)選的。在具體的實(shí)施方案中，添加至飼料中的形式的抗微生物多肽、或包括在銅料添加物中時(shí)的抗微生物多肽是定義明確的。定義明確意味著所述抗樣吏生物多肽制備物，如通過(guò)大小排阻層析所測(cè)定的，為至少50%純的(參見(jiàn)WO01/58275的實(shí)施例12)。在另外的具體實(shí)施方案中，抗樣i生物多肽制備物，如通過(guò)此方法測(cè)定的，為至少60、70、80、85、88、90、92、94或至少95%純的。定義明確的抗微生物多肽制備物是有利的。例如，將基本上不含其它干擾或污染抗微生物多肽的抗微生物多肽正確地劑量給藥于飼料要容易得多。術(shù)語(yǔ)"正確地劑量給藥"具體而言指獲得一致的并且恒定的結(jié)果的目的，和基于期望的效果最優(yōu)化劑量的能力。然而，對(duì)于在動(dòng)物飼料中的用途，抗微生物多肽不需要那么純；例如抗微生物多肽可以包括其它酶，在這種情況下可稱其為抗微生物多肽制備物?？刮⑸锒嚯闹苽湮锬軌?a)直接添加至飼料(或直接使用在植物蛋白的處理過(guò)程中)，或(b)其能夠用于產(chǎn)生一種或多種中間體組合物，例如后續(xù)加入到伺料中(或在處理過(guò)程中4吏用的)的伺料添加劑或預(yù)混物(premix)。如上所迷的純度指原始抗微生物多肽制備物的純度，無(wú)論用于如上的(a)或(b)。這種數(shù)量級(jí)純度的抗微生物多肽制備物具體而言能夠使用重組產(chǎn)生方法來(lái)獲得，而它們不是很容易獲得的，并且當(dāng)通過(guò)傳統(tǒng)發(fā)酵方法產(chǎn)生所述抗微生物多肽時(shí)，還要經(jīng)受更嚴(yán)重的批次變化(batch-to-batchvariation)。當(dāng)然，可將這種抗微生物多肽制備物與其它酶混合。術(shù)語(yǔ)"植物蛋白"用于本文指任何化合物、組合物、制備物或混合物，其包含至少一種書t生自(derivedfrom)或起源于(originatingfrom)才直物的蛋白質(zhì)，包括修飾的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)衍生物。在具體的實(shí)施方案中，植物蛋白的蛋白質(zhì)含量是至少10、20、30、40、50或60。/。(w/w)。植物蛋白可源自植物蛋白來(lái)源，諸如豆類和谷類，例如來(lái)自豆科(Fa6aceae)(豆牙牛(jLegwm/"asae))、十字花牙牛(Owcz/enaceae)、藜牙牛(C7ze"opo&aceae)和禾本科CPoace"e)植物的才才料，諸如大豆4分、羽扇豆4分矛口油菜籽粉。在具體的實(shí)施方案中，植物蛋白來(lái)源是來(lái)自豆科的一種或多種植物的材4牛，例3口大豆、習(xí)習(xí)扇豆、5宛豆或豆。在另外的具體實(shí)施方案中，植物蛋白來(lái)源是來(lái)自藜科的一種或多種植物的材料，例如甜菜(beet)、糖甜菜(sugarbeet)、菠菜(spinach)或昆諾阿藜(quinoa)。植物蛋白來(lái)源的其它實(shí)例是油菜籽和甘藍(lán)。大豆是優(yōu)選的植物蛋白來(lái)源。植物蛋白來(lái)源的其它實(shí)例是谷類諸如大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉蜀黍(玉米)、稻和高粱。抗微生物多肽能夠以任何形式添加至祠料，其作為相對(duì)純的抗微生物多肽，或與有意添加至動(dòng)物飼料的其它成分混合，即以動(dòng)物飼料添加劑的形式，例如所謂的動(dòng)物飼料的預(yù)混物。在另外的方面，本發(fā)明涉及在動(dòng)物飼料中使用的組合物，例如動(dòng)物飼沖+和動(dòng)物飼術(shù)+添加劑，例如預(yù)混物。除了本發(fā)明的抗微生物多肽之外，本發(fā)明的動(dòng)物詞料添加劑包含至少一種脂溶性維生素，和/或至少一種水溶性維生素，和/或至少一種痕量礦物質(zhì)，和/或至少一種大量礦物質(zhì)(macromineral)。此外，任選的飼料添加劑成分是著色劑(coloringagents)、芳香化合物(aromacompounds),穩(wěn)定劑和/或至少一種其它的酶，所述酶選自肌醇六石粦酸酶EC3丄3.8或3丄3.26;木聚糖酶EC3.2.1.8;半乳聚糖酶EC3.2丄89;和/或(3-葡聚糖酶EC3.2.1.4。在具體的實(shí)施方案中，將這些其它的酶明確定義(如上對(duì)于抗微生物制備物的定義)。其它抗微生物肽(AMPs)的實(shí)例是CAP18、LeucocinA、Tritrpticin、Protegrin-l、Thanatin、卩方衛(wèi)素(Defensin)、Ovispirin侈'H口Novispirin(RobertLehrer、2000)，和它們保留抗微生物活性的片段或變體。其它抗真菌多肽(AFPs)的實(shí)例是巨大曲霉04^ct^7/mg/ga"te^)和黑曲霉肽，以及它們保留抗真菌活性的變體和片段，如wo94/01459和wo02/090384中所公開(kāi)的。通常脂溶性和水溶性維生素、以及痕量礦物質(zhì)形成有意添加至詞料的所謂的預(yù)混物部分，而通常將大量礦物質(zhì)分別添加至飼料。這些組合物類型中的任一個(gè)與本發(fā)明的抗微生物多肽一起富集(em-ich)時(shí)，都是本發(fā)明的動(dòng)物詞津+添力口劑。在具體的實(shí)施方案中，旨在將本發(fā)明的動(dòng)物詞料添加劑以0.01至10.0%;更具體而言0.05至5.0%;或0.2至1.0%(%表示g添加劑/100g飼料)的水平包括于(或規(guī)定為必需包括于)動(dòng)物飲食或飼料中。尤其對(duì)于預(yù)混物而言。以下是這些成分實(shí)例的非限定性列表脂溶性維生素的實(shí)例是維生素A、維生素D3、維生素E和維生素K,例如維生素K3。水溶性維生素的實(shí)例是維生素B12、生物素和膽》威、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、。十酸和泛酸鹽(panthothenate)，例如D-泛酸4丐(Ca-D-panthothenate)。痕量礦物質(zhì)的實(shí)例是錳、鋅、鐵、銅、碘、硒和鈷。大量礦物質(zhì)的實(shí)例是鈣、磷和鈉。對(duì)這些成分的營(yíng)養(yǎng)需求(用家禽和小豬/豬示例)列于WO01/58275的表A。營(yíng)養(yǎng)需求的意思是這些成分應(yīng)該以說(shuō)明的濃度在飲食中提供。可供選4奪的是，本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑包含至少一種WO01/58275的表A中指定的單獨(dú)成分。至少一種的意思是任一種、一種或多種、一種、或兩種、或三種、或四種等等多至所有十三種、或多至所有十五種單獨(dú)組分。更具體而言，將這樣至少一種單獨(dú)組分包括在本發(fā)明的添加劑中，所述組分的量提供其飼料中濃度(in-feed-concentration)在表A第4欄、第5欄或第6欄中說(shuō)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明還涉及動(dòng)物飼料組合物。動(dòng)物飼料組合物或飲食具有相對(duì)高的蛋白質(zhì)含量。家禽和豬飲食的特征可如WO01/58275表B的第2-3欄中所說(shuō)明。魚類飲食的特征可如此表B的第4欄中所說(shuō)明。此外，這些魚類飲食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。根據(jù)本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物具有50-800g/kg的粗蛋白含量，并且進(jìn)一步包含至少一種如本文中所要求的抗微生物多肽。此外，或可供選擇的是(對(duì)于上迷粗蛋白含量)，本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物具有10-30MJ/kg的可代謝能量(metabolisableenergy)含量；和/或0.1-200g/kg的鈣含量;和/或0.1-200g/kg的可用磷含量；和/或0.1-100g/kg的曱石克氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的曱^5克氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的賴氨酸含量。在具體的實(shí)施方案中，可代謝能量、粗蛋白、鈣、磷、曱硫氨酸、曱硫氨酸加半胱氨酸和/或賴氨酸的含量在WO01/58275(R.2-5)表B范圍2、3、4或5任一的范圍內(nèi)。將粗蛋白計(jì)算為氮(N)乘以因子6.25,即粗蛋白(g/kg)=N(g/kg)x6.25。氮含量由Kjeldahl方法(A.O.A.C.,1984,OfficialMethodsofAnalysis14thed.,AssociationofOfficialAnalyticalChemists,WashingtonDC)來(lái)測(cè)定?？?戈i射能量能句多基于theNRCpublicationNutrientrequirementsinswine,ninthrevisededition1988,subcommitteeonswinenutrition,committeeonanimalnutrition,boardofagriculture,nationalresearchcouncil來(lái)計(jì)算。NationalAcademyPress,Washington,D.C,pp.2-6,andtheEuropeanTableofEnergyValuesforPoultryFeed-stuffs,Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension,7361DABeekbergen,TheNetherlands.GrafischbedrijfPonsen&looijenbv,Wageningen.ISBN90-71463-12-5。完全動(dòng)物飲食中鈣、可用磷和氨基酸的飲食含量基于飼料表來(lái)計(jì)算，例如Veevoedertabel1997,gegevensoverchemischesamenstelling,verteerbaarheidenvoederwaardevanvoedermiddelen,CentralVeevoederbureau,Runderweg6，8219pkLelystad.ISBN90-72839-13-7。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的動(dòng)物詞料組合物包含至少一種如上所定義的植物蛋白或蛋白質(zhì)來(lái)源。在另外的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物包含0-80%玉米；和/或0-80%高粱；和/或0-70%小麥；和/或0-70%大麥；和/或0-30%燕麥；和/或0-40%大豆粉；和/或0-10%魚粉；和/或0-20%乳清。能夠?qū)?dòng)物飲食制造成例如醪液飼料(mashfeed)(非粒狀(nonpelleted))或粒狀飼料。通常而言，將研磨的詞料混合，并且根據(jù)所述物種的具體要求添加足夠量的必需維生素和礦物質(zhì)?？蓪⒚缸鳛楣腆w或液體酶配制物添加。例如，固體酶配制物通常在混合步驟之前或期間添加；液體酶配制物通常在制粒步驟之后添加。也可將酶并入飼料添加劑或預(yù)混物。飲食中的最終酶濃度在0.01-200毫克酶蛋白/千克飲食的范圍內(nèi)，例如在5-30毫克酶蛋白/千克動(dòng)物飲食的范圍內(nèi)?？蓪⒖刮⑸锒嚯陌匆韵铝?劑量范圍)的一種或多種來(lái)施用0.01-200;或0.01-100;或0.05-100;或0.05-50;或0.10-10——所有這些范圍均以毫克抗微生物多肽蛋白/千克飼料(ppm)表示。為了測(cè)定毫克抗微生物多肽蛋白/千克伺料，將抗微生物多肽從伺料組合物中純化，并且使用相關(guān)的試驗(yàn)(參見(jiàn)抗微生物活性、底物和試驗(yàn))來(lái)測(cè)定純化的抗微生物多肽的比活。飼料組合物的抗微生物活性同樣也使用相同的試驗(yàn)來(lái)測(cè)定，并且基于這兩種測(cè)定，計(jì)算出以毫克抗微生物多肽蛋白/千克伺津+表示的劑量。相同原理應(yīng)用于測(cè)定祠料添加劑中的毫克抗微生物多肽蛋白。當(dāng)然，如果用于制備飼料添加劑或飼料的抗微生物多肽的樣品可用，則從此樣品測(cè)定比活(無(wú)需從伺料組合物或添加劑中純化所述抗微生物多肽)。本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)以下實(shí)施例來(lái)描述，而不應(yīng)將其理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例用作緩沖液和底物的化學(xué)品是至少試劑級(jí)的商業(yè)產(chǎn)品。實(shí)施例1最小有效濃度的評(píng)估測(cè)試三種抗微生物多肽的抗微生物活性，所述多肽是SEQIDNO:l的變體。4安月、MethodsinMolecularBiology,vol78,AntibacterialpeptideprotocolWilliamM.Shafer,HumanPress書中描述的規(guī)程，使用三種plectasin突變體Y40YR、N17R和Y25R,針對(duì)不同微生物進(jìn)行最小有效濃度(MinimalEffectiveConcentration;MEC，表示為(ig/mL)試驗(yàn)。通過(guò)將精氨酸殘基添加至plectasin氨基酸序列的末端構(gòu)建plectasin突變體"Y40YR"。結(jié)果顯示與野生型plectasin(SEQIDNO:l)相比，全部三種抗微生物力太對(duì)于細(xì)菌枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌(Mz'cracoccw/Wew力和表皮葡萄球菌改進(jìn)的活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>表1.MEC值；全部數(shù)值均為|ig/mL。實(shí)施例2抗微生物活性的評(píng)估通過(guò)如下方法檢測(cè)一系列抗微生物活性多肽的抗微生物活性，所述多肽是SEQIDNO:l(Plectasin)的變體將它們?cè)卺劸平湍钢斜磉_(dá)，并且篩選酵母轉(zhuǎn)化體的上清對(duì)于肉葡萄球菌ATCC51365的抗微生物活性。如Sambrook,FritschandManiatis(1989),Mo/ecw/arc/om'"g，ColdSpringHarbour,LaboratoryPress,NewYork中所述制備生長(zhǎng)培養(yǎng)基和〉容液。如MethodsinMolecularBiology,vol78，Antibacterialpeptideprotocol,WilliamM.Shafer,HumanPress中所述進(jìn)行徑向擴(kuò)散試-瞼(RadialDiffusionAssay)。將200-300個(gè)酵母轉(zhuǎn)化體菌落置于14cm圓形平板上，所述平板含有25mL補(bǔ)充以1.5%半乳糖、0.5%葡萄糖和1.5%瓊脂糖的SC生長(zhǎng)培養(yǎng)基。將平板在室溫溫育3小時(shí)，用25mL相同的生長(zhǎng)培養(yǎng)基覆蓋并且使其在30。c生長(zhǎng)三天。隨后將所述平板用25mL包含1.5%瓊脂糖和指示菌抹肉葡萄球菌的105個(gè)細(xì)胞的LB生長(zhǎng)培養(yǎng)基覆蓋，并且在30。c溫育過(guò)夜以使細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)。次日，將平板用1.5mMMTT染色以輔助顯示澄清區(qū)域(clearingzone)。將產(chǎn)生澄清區(qū)域的酵母菌落轉(zhuǎn)移至微量滴定板，所述微量滴定板含有200)iL補(bǔ)充以2。/。葡萄糖和氨千青霉素(100mg/L)的SC生長(zhǎng)培養(yǎng)基。將這些指定為"主平板(masterplate)"的平板在30。c以450rpm搖動(dòng)溫育2天以使酵母生長(zhǎng)。將10來(lái)自主平板各孔的SC生長(zhǎng)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至新的微量滴定板，所述微量滴定板含有200hL具有1.5%半乳糖和0.5%葡萄糖的sc生長(zhǎng)培養(yǎng)基。將這些平板稱為子平板(daughterplate),并且在450rpm搖動(dòng)下于3(tc溫育3天以允許酵母生長(zhǎng)和肽合成。最終按照MethodsinMolecularBiology中描述的規(guī)程進(jìn)行徑向擴(kuò)散試驗(yàn)(RDA)，以分析和定量酵母上清對(duì)肉葡萄球菌的抗^:生物活性。簡(jiǎn)而言之，將30mL含有1。/o瓊脂糖和5x105cfWmL肉葡萄球菌的基本4甫墊i咅養(yǎng)基(minimalunderlaymedium)卡頁(yè)入omnitray平才反(Nunc,242811)。立即將NuncTSP平板(#445497)插在所述平板上以使96孔模式形成。一旦培養(yǎng)基凝固，將TSP平板去除并且將lOiaL酵母上清樣品施加于孔中。將平板在37。C溫育3小時(shí)，并且用15mLLB瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基覆蓋。最后，將平板在37。C溫育過(guò)夜并且用1.5mMMTT顯色以顯示澄清區(qū)域。在平板上對(duì)澄清區(qū)域進(jìn)行;險(xiǎn)查和測(cè)量。將與編碼野生型plectasin的克隆相比產(chǎn)生大小相似或增加的澄清區(qū)域的相應(yīng)酵母克隆從主平板挑取，并且轉(zhuǎn)移至包含具有2%葡萄糖和氨芐青霉素(100mg/L)的SC生長(zhǎng)培養(yǎng)基的瓊脂平板。將這些平板在30。C進(jìn)一步溫育2天以使酵母生長(zhǎng)。接著進(jìn)行集落PCR，之后進(jìn)行序列分析以鑒定plectasin序列中的氨基酸改變。突變和相應(yīng)的相對(duì)于plectasin活性的抗微生物活性示于表2。活性2對(duì)應(yīng)于Plectasin的活寸生?；钚∩?好于Plectasin，而活寸生1則比Plectasin差。<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>序列突變SEQIDNO:活性GFGCNGPWDEG,CHNHCKS工KGYKGGYCAKGGFVCKCYD11G.293GFGCNGPWDEHDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYD11H303GFGCNGPWDE畫QCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYD11K313GFGCNGPWDELDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYD11L323GFGCNGPWDEPDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYD11P333GFGCNGPWDES圃CHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYD11S343GFGCNGPWDETDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYD11T353GFGCNGPWDEVDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYD11V363GFGCNGPWDEW圃CHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYD11W373GFGCNGPWDEI,CHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYDill383GFGCNGPWDEMDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYD11M393GFGCNGPWDE麵QCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYD11N403GFGCNGPWDERDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYD11R413GFGCNGPWDEYDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYDllY423GFGCNGPWDEDDRQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYM13R433GFGCNGPWDEDDSQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYM13S443GFGCNGPWDEDDVQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYM13V453GFGCNGPWDEDDMFCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYQ14F463GFGCNGPWDEDDMGCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYQ14G473GFGCNGPWDEDDMHC臓CKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYQ14H483GFGCNGPWDEDDMSCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYQ14S493GFGCNGPWDEDDMYCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYQ14Y503GFGCNGPWDEDDMQC亂CKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCYH18L513GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSLKGYKGGYCAKGGFVCKCYI22L523GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSVKGYKGGYCAKGGFVCKCYI22V533GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKHYKGGYCAKGGFVCKCYG24H543GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKKYKGGYCAKGGFVCKCYG24K553GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKS濯YKGGYCAKGGFVCKCYG24N563GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGFCAKGGFVCKCYY29F573GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGRCAKGGFVCKCYY29R583GFGCNGPWDE醒QC酬CKSIKGYKGGWCAKGGFVCKCYY29W593GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCKKGGFVCKCYA31K603GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCNKGGFVCKCYA31N613GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCQKGGFVCKCYA31Q623GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCTKGGFVCKCYA31T633GFGCNGPWDE聽(tīng)QCHNHCKSIKGYKGGYCYKGGFVCKCYA31Y643GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKKGFVCKCYG33K653GFGCNGPTOEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKQGFVCKCYG33Q663GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKRGFVCKCYG33R673GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGKFVCKCYG34K683GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGRFVCKCYG34R693GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGLVCKCYF35L703<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>表2.來(lái)自酵母篩選試驗(yàn)的抗微生物活性數(shù)據(jù)實(shí)施例3具有改進(jìn)的抗微生物活性的抗微生物肽的鑒定在TAPS試驗(yàn)中測(cè)試一系列抗微生物多肽，所述多肽是SEQIDNO:l的變體?？蓪APS用于鑒定新的或改進(jìn)的基因，其編碼能夠殺死或抑制靶細(xì)胞生長(zhǎng)的肽(參見(jiàn)PCT申請(qǐng)WO2004/033715)。TAPS試驗(yàn)是反式作用肽系統(tǒng)(IramActing￡eptidegystem)的首字母縮寫，該試-瞼基于得到產(chǎn)生肽的壽丈感宿主之后反式(infrans)篩選其相對(duì)于指示菌抹的活性。這種系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)是基于將抗微生物肽在革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌中表達(dá)，并且其抗微生物活性能夠在不同的微生物中探測(cè)到，包括革蘭氏陰性、革蘭氏陽(yáng)性或真菌。此外，TAPS提供在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生包含二硫鍵的正確折疊的AMPs的可能性，由此保留它們的抗微生物活性。TAPS方法首先需要具有嚴(yán)密調(diào)節(jié)的在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控下的肽表達(dá)，因?yàn)樵诋a(chǎn)生肽時(shí)，宿主細(xì)胞對(duì)所述肽是敏感的。其次，產(chǎn)生的肽必須釋放至培養(yǎng)基以使其能夠與靶生物體相互作用。TAPS篩選可在固體或液體培養(yǎng)基中進(jìn)行。在固體培養(yǎng)基上，首先將質(zhì)粒文庫(kù)引入大腸桿菌宿主細(xì)胞。重要的是將轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在置于無(wú)誘導(dǎo)劑(阿拉伯糖)的LB生長(zhǎng)培養(yǎng)基上的乙酸纖維素濾器表面，以避免抗微生物多肽的表達(dá)和因此產(chǎn)生的生長(zhǎng)抑制。在接下來(lái)的步驟中，將含有菌落的濾器轉(zhuǎn)移至含有誘導(dǎo)劑(0.1%阿拉伯糖)的LB生長(zhǎng)培養(yǎng)基以允許肽合成。接著將靶菌株例如肉葡萄球菌覆蓋至平板上并且使其在37。C生長(zhǎng)12-16小時(shí)。最終，對(duì)能夠降低耙細(xì)胞增殖的宿主細(xì)胞進(jìn)行目視檢查，并且從所述宿主細(xì)胞回收編碼抗微生物肽的核苦酸序列。獲得對(duì)變體DNA序列的分析以闡明肽的性質(zhì)。如上所述，TAPS篩選也可使用液體培養(yǎng)基進(jìn)行。這種方法需要使用機(jī)器人技術(shù)(robotics)來(lái)分析大量克隆。在這種體系中，用質(zhì)粒文庫(kù)轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌origami細(xì)胞并且涂布在LB培養(yǎng)基+0.2%葡萄糖+氨千青霉素(200mg/L)上。隨后將獨(dú)立的菌落接種至包含200TB培養(yǎng)基+氨芐青霉素(200mg/L)的96或384孔板中，并且在37。C培養(yǎng)過(guò)夜。以機(jī)器人技術(shù)重復(fù)這些培養(yǎng)并且生長(zhǎng)至指數(shù)期直至添加誘導(dǎo)劑(0.1%阿拉伯糖)以觸發(fā)肽合成。下一步在于通過(guò)熱酸水解將細(xì)胞水解，從而將肽釋放至培養(yǎng)基。這種處理在于添加1M磷酸鈉緩沖液，pH2.3以獲得大約2.3的最終pH,并且將培養(yǎng)物在80°C溫育過(guò)夜。次日，將經(jīng)水解的培養(yǎng)物的25pL等分試樣用于進(jìn)行相對(duì)于期望的靶生物體的活性測(cè)試。進(jìn)行的活性測(cè)試是徑向擴(kuò)散試驗(yàn)(RDA),其中將經(jīng)水解培養(yǎng)物的等分試樣添加至已用靶菌抹肉葡萄球菌接種的瓊脂糖培養(yǎng)基。容易地鑒定從包含澄清區(qū)域的篩選平板獲得的RDA，其中澄清區(qū)域?qū)?yīng)于顯示抗微生物活性的克隆。進(jìn)行對(duì)澄清區(qū)域直徑的測(cè)量以定量肽的抗微生物活性的效價(jià)(potency)。在使用TAPS試-瞼測(cè)量時(shí)，所測(cè)試plectasin變體的抗纟斂生物活性(相對(duì)于肉葡萄球菌)示于表3?？刮⑸锘钚詫?duì)應(yīng)于澄清區(qū)域大小并且將其分類為4>3>2〉1;而4好于1，并且野生型活性對(duì)應(yīng)于l。<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>表3.來(lái)自TAPS試驗(yàn)的抗微生物活性數(shù)據(jù)實(shí)施例4抗微生物活性的評(píng)估表達(dá)并且純化Plectasin野生型(SEQIDNO:l)和五種Plectasin的變體，其中所述變體在TAPS方法中和/或在酵母體系中顯示改進(jìn)的活性。按照NCCLS準(zhǔn)則(臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)；先前稱為國(guó)家臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì))測(cè)定最小才中制;農(nóng)度(MinimalInhibitoryConcentration)(MIC,pg/mL)以測(cè)i式它們的4元微生物活性。結(jié)果顯示與野生型plectasin相比，所有plectasin變體對(duì)于金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和枯草芽孢桿菌均具有改進(jìn)的活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>表4.MIC值；全部數(shù)值均為pg/mL實(shí)施例5抗微生物活性的評(píng)估表達(dá)并純化Plectasin野生型(SEQIDNO:l)和Plectasin的幾種變體。按照CLSI(臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)；先前稱為國(guó)家臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì))的NCCLS準(zhǔn)則測(cè)定最小抑制濃度(MIC)以測(cè)試它們的抗微生物活性。將多肽相對(duì)于以下菌才朱進(jìn)行測(cè)試A:金黃色葡萄玉求菌，ATCC29213;B:金黃色葡萄球菌，ATCC25923;C:金黃色葡萄球菌，ATCC29737;D:金黃色葡萄球菌，MRSAST5(2001)，來(lái)自丹麥StatensSerumInstitut的多抗性臨床人分離菌(multi-resistantclinicalhumanisolate);E:金黃色葡萄球菌，MRSAST80(2003),來(lái)自丹麥StatensSerumInstitut的多抗性臨床人分離菌。所有MIC值均代表兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值；并且表5中所有結(jié)果均相對(duì)于野生型Plectasin來(lái)表示0:>100%的Plectasin野生型MIC;1:80-100%的Plectasin5予生型MIC;2:50-80%的Plectasin野生型MIC;3:<50%的Plectasin野生型MIC。<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>表5.相對(duì)MIC值；nd=未測(cè)定實(shí)施例6抗微生物活性的評(píng)估將大量本發(fā)明的抗微生物肽相對(duì)于下列菌抹進(jìn)行測(cè)試-組6種不同的金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌NCCLS參考菌抹;NCCLS參考菌抹；ATCC29213,MSSA,ATCC25923，MSSA,ATCC29737,MSSA;E33235,MSSA;698-01,MRSAST5，Str，Kan,Oxa;566-03,MRSAST80,Oxa,Tet，F(xiàn)us，Kan.金黃色葡萄球菌E33235、金黃色葡萄^^菌698-01和金黃色葡萄J求菌566-03可從StatensSerumInstitut,Denmark獲得。將葡萄球菌暴露在以下肽濃度中32;16;8;4;2;1;0.5;0.25;0.13;0.6;和0.03)Lig/mL。將全部肽純化、HPLC定量，并且將濃縮的肽(>160pg/mL)在肽稀釋緩沖液(0.1。/。BSA、0.01。/。乙酸)中稀釋至160fig/mL?；旧先鏝CCLS/CLSI準(zhǔn)則所述使用caMHB進(jìn)行MIC測(cè)定。在37°C溫育18-24小時(shí)之后讀取MIC并且同CFU—起記錄在下表中。相對(duì)于上述6種細(xì)菌菌抹以兩次重復(fù)評(píng)估總數(shù)95種本發(fā)明的抗微生物肽。在大部分的兩次測(cè)定(93%)中，MIC變化<2倍。將平均MIC制成下表。如果MIC在32嗎/mL以上，將使用64的值來(lái)計(jì)算平均值。<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>表6.平均MKM直實(shí)施例7使用來(lái)自PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)的HMM文件鑒定防衛(wèi)素使用隱蔽馬爾科夫模型序型(HMM序型)的序列分析可以在因特網(wǎng)上在線進(jìn)行，或使用公知的免費(fèi)獲得的軟件包HMMER在本地計(jì)算機(jī)上進(jìn)行。目前的版本是HMMER2.3.2(自2003年10月)。HMM序型可以從熟知的PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)獲得。目前的版本是PFAM16.0(自2004年11月)。可用于所有計(jì)算機(jī)平臺(tái)的HMMER和PFAM二者均可/人例^口WashingtonUniversityinSt.Louis(USA),SchoolofMedicine(http:〃pfam.wustl.edu禾口http:〃hmmer.wustl.edu)獲4尋。如果查詢的氨基酸序列或其片段屬于以下五種PFAM家族之一，所述氨基酸序列是根據(jù)本發(fā)明的防衛(wèi)素防衛(wèi)素J3或"(3防衛(wèi)素"，登錄號(hào)PF00711;防衛(wèi)素jropep或"防衛(wèi)素前肽"，登錄號(hào)PF0089;防衛(wèi)素—l或"哺乳動(dòng)物防衛(wèi)素"，登錄號(hào)PF00323;防衛(wèi)素一2或"節(jié)肢動(dòng)物防衛(wèi)素"，登錄號(hào)PF01097;Y-硫堇或""Y-硫堇家族"，登錄號(hào)PF00304。當(dāng)在線使用PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，或當(dāng)本地使用hmmpfam程序(來(lái)自HMMER軟件包)時(shí)，根據(jù)本發(fā)明，如果產(chǎn)生大于O.l的E值，和大于或等于零的得分(score)，那么氨基酸序列屬于PFAM家族。當(dāng)使用hmmpfam程序在本地進(jìn)行序列分析時(shí)，必須從PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)獲得(下載)HMM序型。對(duì)于每個(gè)家族存在兩種序型；用于全局搜索的xxxjs.hmm,和用于局部搜索的xxx—fs.hmm("xxx"是家族的名稱)。這使得對(duì)于如上所述的五個(gè)家族存在總共IO種序型。這10種序型可以單獨(dú)使用，或結(jié)合(附加)至一個(gè)單獨(dú)序型(使用文本編輯器一所述序型是ASCII文件)，可將所述單獨(dú)序型命名為例如defensin.hmm。隨后可將查詢氨基酸序列通過(guò)使用下列命令行評(píng)估hmmpfam-E0,1defensin.hmmsequence—file-其中"sequence—file，，是具有查詢氨基酸序列的文件，以任何由HMMER軟件包識(shí)別的格式。如果得分大于或等于零(O.O),并且E值大于O.l,所查詢氨基酸序列是根據(jù)本發(fā)明的防衛(wèi)素。PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)在Batemanetal.(2004)"ThePfamProteinFamiliesDatabase",NuleicAcidsResearch,Vol.32(DatabaseIssue)pp.D138-D141中有進(jìn)一步的描述。權(quán)利要求1.具有抗微生物活性的多肽，其包含與以下SEQIDNO2的氨基酸1至40具有至少80％同一性的氨基酸序列G-X1-G-C-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-C-H-X12-X13-C-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-G-G-X21-C-X22-X23-X24-X25-X26-X27-C-X28-C-X29；其中X1＝F、L、W或I；優(yōu)選地X1＝F；X2＝N、R、Q、V、G、S、A、K、L、M、D、H或Y；優(yōu)選地X2＝N、R、Q、V、G、S、A、K或Y；X3＝G、R、A或K；優(yōu)選地X3＝G；X4＝P、A、L、V、K或R；優(yōu)選地X4＝P、K或R；X5＝W或R；X6＝D、A、G、K、L、T、N、F、H、M、P、Q、S、C、I、R、V或Y；優(yōu)選地X6＝D、A、G、K、L、T、N、F、H、M、P、Q、S、V或Y；X7＝E、G、A、L、C、Q或S；優(yōu)選地X7＝E、G或S；X8＝D、F、G、N、V、Y、H、K、L、P、S、T、W、I、M、A、C或R；優(yōu)選地X8＝D、F、G、N、V、Y、H、K、L、P、S、T、W、I、M或R；X9＝D或P；優(yōu)選地X9＝D；X10＝M、R、S、V、A、F、G、L、T、Y、W、E或K；優(yōu)選地X10＝M、R、S、V、G、Y、L、F、T、W或K；X11＝Q、R、L、F、G、H、S、A、C、I、K、M、P、T、V、W或Y；優(yōu)選地X11＝Q、R、L、F、G、H、S、K或Y；X12＝N、R、I、Y、V、K、T、Q、S、A、W、E或H；X13＝H、A、F、Q、T、V或L；優(yōu)選地X13＝H或L；X14＝K、Q或R；優(yōu)選地X14＝K或R；X15＝S、A、V、N或F；X16＝I、L、M、T、W或V；優(yōu)選地X16＝I、L或V；X17＝K、T或R；X18＝G、H、K、A、P、F、I、Q、R、S、T、Y或N；優(yōu)選地X18＝G、H、R、K或N；X19＝Y(jié)、H、K、L、M、N、Q、S、V或R；優(yōu)選地X19＝Y(jié)或R；X20＝K、F、H、T、C或R；優(yōu)選地X20＝K或R；X21＝Y(jié)、F、R、A、H、L、M、S或W；優(yōu)選地X21＝Y(jié)、F、R或W；X22＝A、K、N、Q、T、E、H、I、R、S、V、G或Y；優(yōu)選地X22＝A、K、N、Q、T、S或Y；X23＝K、R或T；優(yōu)選地X23＝K或R；X24＝G、K、Q、E、N、S、T、A或R；優(yōu)選地X24＝G、K、Q、A或R；X25＝G、K、H、W或R；優(yōu)選地X25＝G、K或R；X26＝F、A、H、I、M、V、W、R或L；優(yōu)選地X26＝F或L；X27＝V、L、M、I、K、Q、R或T；優(yōu)選地X27＝V、L、M或T；X28＝K、H、N或R；優(yōu)選地X28＝K或R；X29＝Y(jié)、I、YRCG或YR；優(yōu)選地X29＝Y(jié)或YR；并且所述氨基酸序列與SEQIDNO1的氨基酸1至40具有少于100％同一性。2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸1至40具有至少85%同一性，優(yōu)選與SEQIDNO:2的氨基酸1至40具有至少卯％同一性，或至少95%同一性。3.權(quán)利要求1的多肽，其包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多肽，其包含SEQIDN0:3至SEQIDNO:225的任一或SEQIDNO:226至SEQIDNO:251的任一或SEQIDNO:252至SEQIDNO:274的任一的氨基酸序列。5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的多肽，其由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成；6.權(quán)利要求5的多肽，其由SEQIDN0:3至SEQIDNO:225的任一或SEQIDNO:226至SEQIDNO:251的任一或SEQIDNO:252至SEQIDNO:274的任一的氨基酸序列組成；或由其具有抗孩i生物活性并且包含6個(gè)半胱氨酸殘基的片段組成。7.多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求l-6任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列。8.核酸構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求7的多核苷酸，所述多—核芬酸與一個(gè)或多個(gè)在表達(dá)宿主中指導(dǎo)所述多肽產(chǎn)生的控制序列可操作地連接。9.重組表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求8的核酸構(gòu)建體。10.重組宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求8的核酸構(gòu)建體。11.用于產(chǎn)生權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求IO的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。12.轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其已經(jīng)用編碼權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的多肽的多核芬酸轉(zhuǎn)化。13.組合物，其包含權(quán)利要求l-6任一項(xiàng)所定義的抗微生物多肽。14.用于殺死或抑制微生物細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其包括將所述微生物細(xì)胞與權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所定義的抗微生物多肽接觸。15.權(quán)利要求l-6任一項(xiàng)所定義的抗微生物多肽，其用作藥物，或抗微生物的獸用或人用治療劑或預(yù)防劑。16.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所定義的抗微生物多肽在制備獸用或人用治療劑中的用途，所述治療劑用于治療微生物感染或用于預(yù)防用途。17.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所定義的至少一種抗微生物多肽在動(dòng)物飼料中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及用于產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。文檔編號(hào)C07K14/37GK101189256SQ200680020050公開(kāi)日2008年5月28日申請(qǐng)日期2006年6月2日優(yōu)先權(quán)日2005年6月6日發(fā)明者多羅蒂·R·塞古拉,奧利維爾·塔博若,杰斯珀·文德,漢斯-亨里克·K·霍根豪格,珀·H·邁金德申請(qǐng)人:諾維信公司