一種羅氏海盤車抗菌多肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及肽的制備，尤其是一種羅氏海盤車抗菌多肽的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我們知道，生物活性肽就是對生物機體的生命活動有益或是具有生理作用的肽類化合物，是一類相對分子質(zhì)量小于6000Da，是介于氨基酸與蛋白質(zhì)之間的分子聚合物，小至由兩個氨基酸組成，大至由數(shù)十個氨基酸通過肽鍵連接而成?，F(xiàn)有的研究表明，肽的生物效價和營養(yǎng)價值比游離氨基酸更高。
[0003]在生物活性肽領(lǐng)域有一種抗菌多肽，這類活性多肽多數(shù)具有強堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點，對部分真菌、原蟲、病毒及癌細胞等均具有強有力的殺傷作用。目前，所有的常規(guī)抗生素都出現(xiàn)了相應(yīng)的抗藥性致病株系，致病菌的抗藥性問題已經(jīng)日益嚴重地威脅著人們的健康?？咕囊驗榭咕钚愿?，抗菌譜廣，種類多，可供選擇的范圍廣，靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變等原因，而被認為將會在醫(yī)藥工業(yè)上有著廣闊的應(yīng)用前景。
[0004]羅氏海盤車(Asierias rollestoni)，俗稱海星、五角星，為海星綱棘皮動物，多棲息在潮間帶的沙或石礫底，其含有脂類、多糖、多肽及氨基酸、膠原蛋白、皂苷、留醇、生物堿等多種營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)，羅氏海盤車含有豐富的蛋白質(zhì)(15.46%)，蛋白質(zhì)含量比海膽黃和海參的都高，所含氨基酸種類齊全，其中必需氨基酸占氨基酸總量47.33%，因此羅氏海盤車可謂是一種優(yōu)質(zhì)蛋白源。目前，對羅氏海盤車的開發(fā)利用還十分局限，主要集中在皂苷和多糖類的研究上，還沒有發(fā)現(xiàn)從羅氏海盤車的蛋白酶解產(chǎn)物中分離具有抗菌活性多肽的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供了一種工藝先進、步驟合理、操作可行的羅氏海盤車抗菌多肽的制備方法。
[0006]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種羅氏海盤車抗菌多肽的制備方法，其特征在于:其經(jīng)過下列工藝步驟:
(1)原料預(yù)處理
選取新鮮的羅氏海盤車為原料，用水清洗，切成塊狀后送入勻漿機中，制得羅氏海盤車勻漿液；
(2)蛋白酶解產(chǎn)物的制備
將步驟(I)中得到的羅氏海盤車勻漿液加入與其等重量的超純水，攪拌均勻，再加入2?5% (以底物蛋白含量計，w/w%)海產(chǎn)品水解酶，調(diào)整pH值至7.0?8.5，控制溫度40?60°C，水解3?5h;水解后加熱至90?100°C，保持5?15min滅酶，得酶解液;將酶解液離心，得酶解上清液；
(3)濃縮、干燥
將步驟(2)中得到的酶解上清液進行真空濃縮至固形物含量為15?30%，冷凍干燥，得固體粉末；
(4)去多糖
將步驟(3)中得到的固體粉末重新溶解于去離子水中，然后加入無水乙醇至乙醇終濃度為70?90%，靜置過夜，離心去除多糖沉淀，留取去沉淀的上清液；
(5)超濾
將步驟(4)中得到的去沉淀的上清液采用分子量為5000Da的超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于5000 Da的截留液，冷凍干燥，得到羅氏海盤車蛋白酶解產(chǎn)物；
(6)生物活性肽的分離
將步驟(5)中得到的羅氏海盤車蛋白酶解產(chǎn)物用去離子水溶解為0.2g?0.5g/mL溶液，使用Sephadex LH-20凝膠色譜柱進行分離，流動相為蒸饋水，洗脫速度為0.8?1.0mL/min，220 nm測定吸光度，收集各吸收峰洗脫液，備用；
(7)抑菌活性測定、復(fù)合
將步驟(6)中得到的各吸收峰洗脫液進行抑菌活性測定;將測定具有抑菌活性的吸收峰洗脫液合并，冷凍干燥，得羅氏海盤車抗菌多肽。
[0007]所述的用水清洗是先用自來水清洗，再用去離子水清洗。
[0008]所述酶解羅氏海盤車的海產(chǎn)品水解酶為南寧東恒華道生物科技有限公司生產(chǎn)的海產(chǎn)品水解專用酶。
[0009]將酶解液離心是將酶解液送入離心機中，控制轉(zhuǎn)速4000?5000 r/min，離心15?30 mino
[0010]所述酶解上清液的真空濃縮的條件為:真空度控制為82.7?90.6KPa，溫度為45?55。。。
[0011]所述的各吸收峰洗脫液的抑菌活性測定是取10yL E.Co Ii菌液(OD6(K)nmS0.4?
0.5)涂布LB培養(yǎng)皿，設(shè)置3個重復(fù);將步驟(5)中得到的各吸收峰洗脫液各取I_3yL涂布在涂有菌液的培養(yǎng)皿上，同時設(shè)置卡那霉素(Kan+，10 mg/mL)和ms1-78(100-150ng/ml)為陽性對照組;測定具有抑菌活性的吸收峰洗脫液。
[0012]本發(fā)明以羅氏海盤車為原料，切塊勻漿后進行酶解，滅酶，離心，留取酶解上清液；將酶解上清液真空濃縮、乙醇沉淀多糖，得去沉淀的上清液;將去沉淀的上清液進行超濾，截留液采用凝膠過濾層析法進行生物活性肽的分離，收集各吸收峰洗脫液;將洗脫液進行抑菌檢測，測得具有抑菌活性的吸收峰洗脫液合并后，冷凍干燥，得羅氏海盤車抗菌多肽。本發(fā)明采用凝膠色譜法從蛋白酶解產(chǎn)物中分離檢測生物活性肽，使用了酶-膜耦聯(lián)技術(shù)對羅氏海盤車進行了深層次開發(fā);在進行活性多肽分離前，使用乙醇去除多糖，減輕后期多肽分離時的干擾。經(jīng)后期檢測，該復(fù)合多肽具有較好的體外抑菌活性。同時，作為天然的抑菌多肽，相比其他原核或真核表達產(chǎn)物，本發(fā)明所提取的抑菌多肽來源可靠，安全性高，后期研究方便。本發(fā)明提供的抗菌多肽的制備方法工藝先進、步驟合理、操作可行、產(chǎn)物安全性尚O
【附圖說明】
[0013]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0014]圖1是各吸收峰洗脫液抑菌活性試驗結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0015]實施例1
一種羅氏海盤車抗菌多肽的制備方法，其經(jīng)過下列工藝步驟:
(1)原料預(yù)處理
選取新鮮的羅氏海盤車為原料，先用自來水清洗，再用去離子水清洗，去除泥沙，切成塊狀后送入勻漿機中，制得羅氏海盤車勻漿液；
(2)蛋白酶解產(chǎn)物的制備
將步驟(I)中得到的羅氏海盤車勻漿液加入與其等重量的超純水，攪拌均勻，再加入3%(以底物蛋白含量計，w/w%)的南寧東恒華道生物科技有限公司生產(chǎn)的海產(chǎn)品水解酶，調(diào)整pH值至7.5，控制溫度50°C，水解4h;水解后加熱至95°C，保持1min滅酶，得酶解液;將酶解液送入離心機中，控制轉(zhuǎn)速4500 r/min，離心20min，得酶解上清液；
(3)濃縮、干燥
將步驟(2)中得到的酶解上清液在真空度控制為85KPa，溫度為50°C條件下，真空濃縮至固形物含量為20%，冷凍干燥，得固體粉末；
(4)去多糖
將步驟(3)中得到的固體粉末重新溶解于去離子水中，然后加入無水乙醇至乙醇終濃度為85%，靜置過夜，離心，去除多糖沉淀，留取去沉淀的上清液；
(5)超濾
將步驟(4)中得到的去沉淀的上清液采用分子量為5000Da的超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于5000 Da的截留液，冷凍干燥，得到羅氏海盤車蛋白酶解產(chǎn)物；
(6)生物活性肽的分離
將步驟(5)中得到的羅氏海盤車蛋白酶解產(chǎn)物用去離子水溶解為0.3g/mL溶液，使用Sephadex LH-20凝膠色譜柱(2.0 cmX 60 cm)進行分離，流動相為蒸饋水，洗脫速度為
0.9mL/min，220 nm測定吸光度，收集得到5個吸收峰洗脫液，備用；
(7)抑菌活性測定、復(fù)合
將步驟(6)中得到的各吸收峰洗脫液進行抑菌活性測定;其中，抑菌活性測定是取100μL E.coli菌液(OD6QOnffi為0.4?0.5)涂布LB培養(yǎng)皿，設(shè)置3個重復(fù);將步驟(5)中得到的5個吸收峰洗脫液各取2此涂布在涂有菌液的培養(yǎng)皿上，同時設(shè)置卡那霉素(Kan+，10 mg/mL)和ms1-78( 100-150ng/ml)為陽性對照組;如圖1所示，測定吸收峰洗脫液2、吸收峰洗脫液5具有較好的抑菌活性，吸收峰洗脫液1、3、4無體外抑菌活性;將測定具有抑菌活性的吸收峰洗脫液2和吸收峰洗脫液5合并，冷凍干燥，得羅氏海盤車抗菌多肽。
[0016]本實施例提供的抗菌多肽的制備方法工藝先進、步驟合理、操作可行。制備的抑菌多肽來源可靠，安全性高，后期研究方便。
[0017]實施例2
一種羅氏海盤車抗菌多肽的制備方法，其經(jīng)過下列工藝步驟:
(I)原料預(yù)處理
選取新鮮的羅氏海盤車為原料，先用自來水清洗，再用去離子水清洗，去除泥沙，切成塊狀后送入勻漿機中，制得羅氏海