新型抗hiv感染多肽及其利用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及用于抑制Hiv感染的多肽及其在制備抗HIV感染 或預(yù)防或治療艾滋病的藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 人免疫缺陷病毒（HIV)是艾滋病的病原體，目前全球有超過3000萬感染者，每年 導(dǎo)致約200萬人死亡，并且每年還新增約200萬感染者，嚴(yán)重威脅人類的健康。目前世界范 圍內(nèi)HIV感染主要以1型（HIV-I)為主。
[0003] HIV-I通過其包膜糖蛋白（Env)介導(dǎo)的病毒-細(xì)胞膜融合感染宿主細(xì)胞。Env包 含表面亞基gpl20和跨膜亞基gp41，三個Env形成非共價復(fù)合體鑲嵌在病毒表面。表面亞 基gpl20在病毒感染細(xì)胞過程中可以特異識別并結(jié)合于靶細(xì)胞表面的受體和輔助受體，同 時起著穩(wěn)定跨膜亞基gp41功能,并在適當(dāng)時機(jī)釋放出gp41以啟動融合；跨膜亞基gp41是 導(dǎo)致病毒-細(xì)胞膜融合的直接功能分子。
[0004] 在病毒細(xì)胞融合過程中，gp41的N-端螺旋區(qū)（NHR)和C-端螺旋區(qū)（CHR)通過折 疊形成了一個發(fā)夾狀的六螺旋結(jié)構(gòu)；該結(jié)構(gòu)的形成為病毒-細(xì)胞膜融合提供了能量，對病 毒-細(xì)胞融合至關(guān)重要。晶體結(jié)構(gòu)顯示，在六螺旋中，三個由NHR形成的螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成內(nèi)核， 形成三個溝槽，三個CHR反平行結(jié)合在溝槽中。能夠阻止HIV-I六螺旋形成的藥物則可以 有效地抑制艾滋病毒-細(xì)胞膜融合從而阻止病毒感染和體內(nèi)傳播，用于艾滋病治療，稱為 融合抑制劑。
[0005] 最初NHR衍生多肽作為融合抑制劑的發(fā)現(xiàn)是1992年WiId等發(fā)現(xiàn)的DP107 (aa553-590)，其抑制病毒感染的活性在0. 2-liiM左右。另外，蛋白水解酶切產(chǎn)物N36 (aa546-581)也作為NHR衍生多肽設(shè)計的模板，原始序列的活性約為IiiM。直接衍生于NHR 的多肽（也稱為N肽）抗融合活性比衍生于CHR的多肽要差很多，主要原因可能是單分子 的N肽在溶液中容易自身聚集，降低了其與靶點的結(jié)合幾率；另外由于NHR序列比較保守， 改造空間相對較小。外源NHR衍生多肽可直接與病毒gp41亞穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)中的內(nèi)源CHR結(jié)合， 形成無活性的六螺旋結(jié)構(gòu)；或與內(nèi)源NHR競爭性的結(jié)合形成復(fù)合螺旋（coiled-coil)內(nèi)核 結(jié)構(gòu)，阻礙其形成有正常功能的六螺旋。
[0006] 在NHR的螺旋結(jié)構(gòu)中，每兩圈螺旋所包含的七個殘基可以依次標(biāo)記為a-g位。在六 螺旋中，NHR通過其（a,d)位疏水殘基自聚形成三聚體復(fù)合螺旋，并通過其（e，g)位殘基與 外圍的CHR結(jié)合。一般認(rèn)為，在單獨(dú)存在的溶液狀態(tài)下，NHR的（a，d)位殘基可以使其發(fā)生 寡聚形成卷曲復(fù)合螺旋，而（e，g)位點殘基則主要使寡聚后的復(fù)合螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生沉聚。單 獨(dú)的N肽活性均比較低，其抑制病毒-細(xì)胞融合的IC50值約為I-IOiiM。根據(jù)文獻(xiàn)報道，這 可能與其在溶液中容易發(fā)生自身折疊從而使得靶結(jié)合活性位點不易暴露有關(guān)。
[0007] 在克服NHR多肽自聚方面，一般通過在NHR的N或C末端引入有穩(wěn)定三聚體卷曲 螺旋結(jié)構(gòu)的模型肽，得到嵌合蛋白，使其在溶液狀態(tài)下呈現(xiàn)穩(wěn)定的三聚體結(jié)構(gòu)，可大大改善 N肽的活性。但是這些嵌合蛋白分子量大，合成難度較高，作為藥物開發(fā)仍存在一定距離。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在保留原始N肽長 度的基礎(chǔ)上，通過在N肽的（a，d)位點引入疏水性氨基酸，并在N肽的（e，g)位點引入螺旋 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定因素-鹽橋，可以得到單體具有〇.IUM以下IC50值的有高融合抑制活性的N肽 融合抑制劑，這類多肽融合抑制劑的氨基酸殘基均為天然氨基酸，具有明顯的合成優(yōu)勢。由 此提供了下述發(fā)明：
[0009] 本發(fā)明的第一方面涉及一種多肽、其衍生物、或其可藥用鹽，其中，所述多肽包含 選自SEQIDNO: 1~SEQIDNO: 10所示的氨基酸序列：
[0010] QffKNLLEAIKAQQELLKLTVEGIKQLQERIKAVERYLK(SEQIDNO：1)；
[0011] QINNLLRAIEALQHLLQLLVffGIKQLQARILAVERYLK(SEQIDNO：2)；
[0012] QffNNLLEAIKALQELLKLLVEGIKQLQERIKAVERYLK(SEQIDNO：3)；
[0013] QffKNLLEAIKALQELLKLLVEGIKQLQERIKAVERYLK(SEQIDNO：4)；
[0014] WKNLLEAIKALQELLKLLVEGIKQLQERIKAVERYL(SEQIDNO：5)；
[0015] LLSGIVQQINNLLRAIEALQHLLQLIVWGIKQLQARIL(SEQIDNO：6)；
[0016] LLKGIVEQIKKLLEAIKALQELLKKIVEGIKWLQERIL(SEQIDNO：7)；
[0017] LLKGIVEQIKNLLEAIKALQELLKLIVEGIKWLQERIK(SEQIDNO：8)；
[0018] LWEQIRKLLSGIVQQINNLLRAIEALQHLLQKIVEGIK(SEQIDNO：9)；
[0019] LWKQIRELLKGIVEQIKNLLEAIKALQELLKLIVEGIK(SEQIDNO:10)。
[0020] 其中氨基酸縮寫具有本領(lǐng)域公知的含義，例如：W為色氨酸、N為天冬酰胺、A為丙 氨酸、S為絲氨酸、K為賴氨酸、L為亮氨酸、E為谷氨酸、Q為谷氨酰胺、I為異亮氨酸、H為 組氨酸、M為甲硫氨酸、T為蘇氨酸、D為天冬氨酸、R為精氨酸、Y為酪氨酸、F為苯丙氨酸。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項所述的多肽、其衍生物、或其可藥用鹽，其中，所述多 肽的N末端連接乙?；?、寡肽序列、或親脂性基團(tuán)，和/或C末端連接酰胺基、寡肽序列、親 脂性基團(tuán)、或膽固醇等；
[0022] 優(yōu)選地，所述寡肽序列為1-10個氨基酸殘基組成的寡肽序列(例如EEE、KKK、 GQAV、GEEE等）；
[0023] 優(yōu)選地，所述親脂性基團(tuán)為含有3到20個碳原子的脂肪酸鏈，更優(yōu)選含8-16個碳 原子的脂肪酸鏈。
[0024] 在本發(fā)明的實施方案中，所述多肽的N末端連接乙?；–H3CO-),和/或C末端連 接酰胺基（-CONH2 )。
[0025] 本發(fā)明第二方面涉及核酸分子，其編碼本發(fā)明第一方面任一項所述的多肽。
[0026] 本發(fā)明第三方面涉及重組載體，其含有本發(fā)明第二方面所述的核酸分子。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明第三方面任一項的重組載體，其中所述載體為克隆載體或表達(dá)載體， 所述表達(dá)載體例如為原核表達(dá)載體或真核表達(dá)載體。
[0028] 本發(fā)明第四方面涉及重組細(xì)胞，其含有本發(fā)明第三方面所述的重組載體。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明第四方面任一項的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為原核細(xì)胞(例如大腸桿 菌）或真核細(xì)胞(例如酵母細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞)。
[0030] 本發(fā)明的另一方面涉及一種藥物組合物，其包含本發(fā)明第一方面任一項的多肽、 其衍生物、或其可藥用鹽、或者本發(fā)明第二方面任一項的核酸分子、或者本發(fā)明第三方面任 一項的重組載體、或者本發(fā)明第四方面任一項的重組細(xì)胞；任選地，還包含藥學(xué)上可接受的 載體或輔料。優(yōu)選地，所述藥物組合物為注射劑。
[0031] 通常本發(fā)明藥物組合物含有0. 1 - 90重量％的本發(fā)明第一方面任一項的多肽、其 衍生物、或其可藥用鹽、或者本發(fā)明第二方面任一項的核酸分子、或者本發(fā)明第三方面任一 項的重組載體、或者本發(fā)明第四方面任一項的重組細(xì)胞。藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域已知的 方法制備。用于此目的時，如果需要，可將本發(fā)明第一方面任一項的多肽、其衍生物、或其可 藥用鹽、或者本發(fā)明第二方面任一項的核酸分子、或者本發(fā)明第三方面任一項的重組載體、 或者本發(fā)明第四方面任一項的重組細(xì)胞與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑 結(jié)合，制成可作為人用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?br>[0032] 本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明第一方面任一項的多肽、其衍生物、或其可藥用鹽、 或者本發(fā)明第二方面任一項的核酸分子、或者本發(fā)明第三方面任一項的重組載體、或者本 發(fā)明第四方面任一項的重組細(xì)胞在制備治療和/或預(yù)防和/或輔助治療包膜類病毒感染所 致疾病的藥物中的用途。
[0033] 在本發(fā)明的實施方案中，所述包膜類病毒為人免疫缺陷病毒（HIV)，例如為 HIV-I。
[0034] 在本發(fā)明的實施方案中，所述包膜類病毒感染所致的疾病為艾滋病，例如為I型 艾滋病。
[0035] 本發(fā)明的再一方面涉及一種治療和/或預(yù)防和/或輔助治療包膜類病毒感染所致 疾病的方法，包括給予有需要的受試者有效量的本發(fā)明第一方面任一項的多肽、其衍生物、 或其可藥用鹽、或者本發(fā)明第二方面任一項的核酸分子、或者本發(fā)明第三方面任一項的重 組載體、或者本發(fā)明第四方面任一項的重組細(xì)胞的步驟。
[0036] 在本發(fā)明的實施方案中，所述包膜類病毒為人免疫缺陷病毒（HIV)，例如為 HIV-I。
[0037] 在本發(fā)明的實施方案中，所述包膜類病毒感染所致的疾病為艾滋病，例如為I型 艾滋病。
[0038] 本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明第一方面任一項的多肽、其衍生物、或其可藥用鹽、 或者本發(fā)明第二方面任一項的核酸分子、或者本發(fā)明第三方面任一項的重組載體、或者本 發(fā)明第四方面任一項的重組細(xì)胞在制備作為HIV融合抑制劑或者抗HIV藥物中的用途。
[0039] 本發(fā)明的再一方面涉及一種在體內(nèi)或體外抑制HIV的方法，包括使用有效量的本 發(fā)明第一方面任一項的多肽、其衍生物、或其可藥用鹽、或者本發(fā)明第二方面任一項的核酸 分子、或者本發(fā)明第三方面任一項的重組載體、或者本發(fā)明第四方面任一項的重組細(xì)胞的 步驟。
[0040] 本發(fā)明的再一方面涉及一種在體內(nèi)或體外抑制HIV-IEnv介導(dǎo)的細(xì)胞融合的方 法，包括使用有效量的本發(fā)明第一方面任一項的多肽、其衍生物、或其可藥用鹽、或者本發(fā) 明第二方面任一項的核酸分子、或者本發(fā)明第三方面任一項的重組載體、或者本發(fā)明第四 方面任一項的重組細(xì)胞的步驟。
[0041] 發(fā)明的有益效果
[0042] 本發(fā)明涉及的多肽長度為36-38個天然氨基酸殘基，其活性較原始序列大大提 高，其中最佳活性序列較原始序列在活性上提高了近100倍，達(dá)到了 39nM。這些多肽作為直 接衍生于NHR的單體融合抑制劑，具有很好的應(yīng)用價值，且其合成成本大大降低，具有非常 好的開發(fā)前景。同時，這些多肽水溶性好，在溶液狀態(tài)下可形成穩(wěn)定的螺旋結(jié)構(gòu)，對于改善 藥物水溶性和研究此類藥物作用的機(jī)制非常有利。
【附圖說明】
[0043] 圖1多肽1單獨(dú)溶液及其與CHR混合溶液的⑶譜
[0044] 圖2多肽2單獨(dú)溶液及其與CHR混合溶液的⑶譜
[0045] 圖3多肽3單獨(dú)溶液及其與CHR混合溶液的⑶譜
[0046] 圖4多肽4單獨(dú)溶液及其與CHR混合溶液的⑶譜
[0047] 圖5多肽5單獨(dú)溶液及其與CHR混合溶液的⑶譜
[0048] 圖6多肽6單獨(dú)溶液及其與CHR混合溶液的⑶譜
[0049] 圖7多肽7單獨(dú)溶液及其與CHR混合溶液的⑶譜
[0050] 圖1-7中，橫坐標(biāo)為波長（nm)，縱坐標(biāo)為0(deg?cm2 ?dmor1);其中的1-7分別 為多肽的編號。
[0051] 圖8多肽1的⑶變溫掃描曲線
[0052] 圖9多肽2的⑶變溫掃描曲線
[0053] 圖10多肽3的⑶變溫掃描曲線
[0054] 圖11多肽4的⑶變溫掃描曲線
[0055] 圖12多肽5的⑶變溫掃描曲線
[0056] 圖13多肽6的⑶變溫掃描曲線
[005