專利名稱：固定化的探針和檢測構(gòu)象改變的朊病毒蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及錯折疊的蛋白，例如與疾病狀況相關(guān)的那些蛋白的檢測領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明涉及用于檢測樣品中構(gòu)象改變的蛋白和朊病毒的方法、探針和試劑盒。在一個實(shí)施方案中，構(gòu)象改變的蛋白和朊病毒與淀粉樣變性疾病相關(guān)。
背景技術(shù)：
正?？扇艿鞍踪|(zhì)轉(zhuǎn)化成構(gòu)象改變的不溶蛋白被認(rèn)為是各種疾病中的致病性過程。在這些疾病中，結(jié)構(gòu)上的構(gòu)象變化一般是正常的可溶性和功能性蛋白轉(zhuǎn)化成定義的不溶狀態(tài)所需的。這種不溶蛋白的實(shí)例包括阿爾茨海默氏病(AD)和大腦淀粉樣血管病(CAA)的淀粉樣斑塊中的Aβ肽；帕金森氏病的Lewy體中沉積的α-突觸核蛋白、額顳性癡呆(frontal temporaldementia)和皮克(Pick′s)病中神經(jīng)原纖維纏結(jié)中的tau；肌萎縮性側(cè)索硬化中的過氧化物歧化酶；亨廷頓病中的亨廷頓蛋白；和Creutzfeldt-Jakob病(CJD)中的朊病毒。對于綜述，參見Glenner et al.，J.Neurol.Sci.941-28，1989；Haan et al.，Clin.Neurol.Neurosurg.92(4)305-310，1990。
通常，這些高度不溶的蛋白形成由具有共同特征β折疊片層構(gòu)象的非分支纖絲組成的聚集物。在CNS中，淀粉樣可以存在于大腦的血管和腦膜血管中(腦血管的沉積)以及腦實(shí)質(zhì)中(斑塊)。在人類和動物模型中的神經(jīng)病理研究表明，鄰近淀粉樣沉淀的細(xì)胞在它們的正常功能方面受到影響。(Mandybur，Acta Neuropathol.78329-331，1989；Kawai et al.，Brain Res.623142-146，1993；Martin et al.，Am.J.Pathol.1451348-1381，1994；Kalaria etal.，Neuroreport 6477-80，1995；Masliah et al.，J.Neurosci.165795-5811，1996)。其他研究還表明，淀粉樣纖絲可以實(shí)際上啟動神經(jīng)變性。(Lendon etal.，J.Am.Med.Assoc.277825-831，1997；Yankner，Nat.Med.2850-852，1996；Selkoe，J.Biol.Chem.27118295-18298，1996；Hardy，Trends Neurosci.20154-159，1997)。
在AD和CAA中，主要的淀粉樣成分是淀粉樣beta蛋白(Aβ)。通過兩種推定的分泌酶的作用從淀粉樣beta前體蛋白(APP)產(chǎn)生的Aβ肽，在正常的CNS和血液中以低水平存在。兩種主要的變體，Aβ1-40和Aβ1-42是由APP的選擇性羧基末端截短產(chǎn)生的(Selkoe et al.，PNAS USA 857341-7345，1988；Selkoe，Trends Neurosci.16403-409，1993)。Aβ1-42是AD和CAA的淀粉樣沉淀物中的兩種肽中更容易產(chǎn)生纖維(fibrillogenic)且更為豐富的。除了上述AD病例中的淀粉樣沉淀物之外，大多數(shù)AD病例也與血管壁中的淀粉樣沉淀有關(guān)(Hardy，1997，supra；Haan et al.，1990，supra；Terry et al.，supra；Vinters H.V.，Cerebral amyloid angiopathy，Stroke Mar-Apr；18(2)311-324，1987；Itoh Y，et al.Subpial beta/A4 peptide deposits are closely associated withamyloid angiopathy in the elderly，Neurosci.Lett.155(2)144-147，Jun.11，1993；Yamada M.，et al.，Subarachnoid haemorrhage in the elderlyanecropsy studyof the association with cerebral amyloid angiopathy，J Neurol.Neurosurg.Psychiatry 56(5)543-547，May，1993；Greenberg S.M.，et al.，The clinicalspectrum of cerebral amyloid angiopathypresentations without lobarhemorrhage，Neurology 43(10)2073-2079，Octobe 1993)。這些血管的病變是CAA的標(biāo)志，其可以在沒有AD時存在。
人類transthyretin(TTR)是由四個相同的、主要是β片層結(jié)構(gòu)的單元組成的正常血漿蛋白，它充當(dāng)了激素甲狀腺素的轉(zhuǎn)運(yùn)子。TTR異常自組裝成淀粉樣纖絲引起兩種形式的人類疾病，即老年系統(tǒng)性淀粉樣變性(SSA)和家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病(FAP)(Kelly，Curr.Opin.Struct.Biol.6(1)11-17，1996)。FAP中淀粉樣形成的原因是TTR中的點(diǎn)突變；SSA的原因是未知的。通過在活檢材料中原位檢測淀粉樣沉淀物，在組織學(xué)上確立了臨床診斷。
迄今為止，關(guān)于TTR體內(nèi)轉(zhuǎn)化成淀粉樣的機(jī)制所知很少。然而，幾個實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證明了通過正常人TTR的部分變性可以在體外模擬淀粉樣轉(zhuǎn)化(McCutchen et al.，Biochemistry 32(45)12119-12127，1993；McCutchen andKelly，Biochem.Biophys.Res.Comm.197(2)415-421，1993)。構(gòu)象轉(zhuǎn)變的機(jī)制涉及單體的構(gòu)象中間體，其聚合成線性的β片層結(jié)構(gòu)狀淀粉樣纖絲(Lai et al.，Biochemistry 35(20)6470-6482，1996)。通過與穩(wěn)化分子，例如甲狀腺素或triiodophenol結(jié)合，可以緩和(mitigate)這種過程(Miroy et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(26)15051-15056，1996.)神經(jīng)炎性斑塊形成的確切機(jī)制和斑塊形成與疾病相關(guān)性神經(jīng)變性過程的關(guān)系沒有很好地確定。公知阿爾茨海默病和朊病毒疾病患者的腦中淀粉樣纖絲引起某些細(xì)胞的炎性活化。例如，通過纖絲的β-淀粉樣和朊病毒肽刺激原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物和THP-1單核細(xì)胞系來活化相同的酪氨酸激酶依賴性炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)。由β淀粉樣和朊病毒纖絲引發(fā)的信號反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)毒性產(chǎn)物的產(chǎn)生，其對于神經(jīng)變性負(fù)有部分責(zé)任(Combs et al.，J.Neurosci.19928-939，1999)。
朊病毒是在人類和動物中引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)海綿狀腦病的感染性病原體。朊病毒不同于細(xì)菌、病毒和類病毒。潛在的朊病毒前體是稱為PrP27-30的蛋白，一種在感染的腦中作為斑塊發(fā)現(xiàn)的、多聚化(聚集)成棒樣細(xì)絲的28千道爾頓疏水性糖蛋白。正常的蛋白同源物不同于朊病毒之處在于它是可容易地降解的，而朊病毒對蛋白酶有高度的抗性。已經(jīng)表明朊病毒可能含有極其少量的高感染性核酸，通過常規(guī)的分析方法不可檢測出(BenjaminLewin，″Genes IV″，Oxford Univ.Press，New York，1990，at page 1080.)。目前的優(yōu)勢性假說是無核酸成分是朊病毒蛋白的感染性所需的。
完整的朊病毒蛋白編碼基因已經(jīng)被克隆、測序并在轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)。正常的細(xì)胞朊病毒蛋白PrPC是由單拷貝的宿主基因編碼的，并在神經(jīng)元的外表面正常地存在。在翻譯后加工期間，稱為PrPSc的蛋白從正常的細(xì)胞PrP同種型(PrPC)形成，產(chǎn)生朊病毒疾病。PrPSc是動物和人類的可傳播神經(jīng)變性疾病的傳播和發(fā)病所必需的。
正常的朊病毒蛋白(PrPC)是細(xì)胞表面的金屬-糖蛋白，如此處的圖8所示，主要具有α螺旋和卷曲-環(huán)結(jié)構(gòu)，通常在中樞神經(jīng)和淋巴系統(tǒng)中表達(dá)。相信它充當(dāng)了抗氧化劑，并被認(rèn)為與細(xì)胞的自動調(diào)節(jié)相關(guān)。然而，PrP的異常形式，即PrPSc，如此處圖9所示，是一種對蛋白酶有抗性并具有主要含有β片層的二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象體。相信二級結(jié)構(gòu)中的這種構(gòu)象變化引起了朊病毒疾病過程中的聚集和最后的神經(jīng)毒性斑塊沉積。
朊病毒相關(guān)疾病包括綿羊和山羊的癢病、鹿和麋鹿的慢性消耗性疾病，和牛的牛海綿狀腦病(BSE)(Wilesmith and Wells，Microbiol.Immunol.17221-38，1991)。已經(jīng)鑒定了四種人類朊病毒疾病(1)庫魯病，(2)Creutzfeldt-Jakob病(CJD)，(3)Gerstmann-Strassler-Scheinker病(GSS)和(4)致死性家族性不眠癥(FFI)(Gajdusek，D.C.，Science 197943-969，1977；Medori et al.N.Engl.J. Med 326444-449，1992)。
朊病毒疾病是傳染性和隱伏的。例如，與朊病毒疾病相關(guān)的長潛伏(incubation)時間將不能充分體現(xiàn)在世界范圍內(nèi)數(shù)十年來在用尸源性人生長激素(HGH)治療的數(shù)千人中醫(yī)原性CJD的程度。由于牛朊病毒已經(jīng)傳播到患新的變體型Creutzfeldt-Jakob病(nvCJD)的人，檢測生物制品中朊病毒的重要性被提高(Chazot et al.，Lancet 3471181，1996；Will et al.，Lancet347921-925，1996)。
由朊病毒引起的疾病很難診斷。疾病可以是潛伏的或亞臨床的(異常的朊病毒是可檢測的，但癥狀不是)。此外，朊病毒相關(guān)蛋白的正常同源物存在于未受感染的有機(jī)體的腦中，進(jìn)一步使檢測復(fù)雜化(Ivan Roitt et al.，″Immunology″，Mosby-Year Book Europe Limited，1993，at page 15.1)。
用于檢測朊病毒相關(guān)感染的存在的當(dāng)前技術(shù)依靠腦中的宏觀形態(tài)變化，并依靠一般僅在癥狀被顯現(xiàn)之后應(yīng)用的免疫化學(xué)技術(shù)。許多當(dāng)前的檢測方法是基于抗體的分析，或依靠親和層析。它們使用來自死亡動物的腦組織，或在某些情況下，使用血液樣品的毛細(xì)管免疫電泳。
基于腦組織的分析可能導(dǎo)致到晚期才檢測出并需要屠宰將要測試的動物。Prionic-Check也需要屠宰動物來獲得液化的腦組織樣品，其通過用Western印跡施加到抗體。雖然可在六到七個小時內(nèi)獲得結(jié)果，測試不能夠解決腦中PrPSc積累和臨床癥狀發(fā)作之間的六個月的延遲時間。扁桃體活檢采樣、以及血液和腦脊髓采樣，雖然是精確的，需要外科手術(shù)和花費(fèi)數(shù)周時間來獲得結(jié)果。電噴電離質(zhì)譜(ESI-MS)、核磁共振(NMR)、循環(huán)二色性(circular dichroism)(CD)和其他非放大的結(jié)構(gòu)性技術(shù)需要大量的樣品和一般距離離樣品源相當(dāng)遠(yuǎn)的昂貴設(shè)備。
與上述疾病，例如AD和CAA相關(guān)的構(gòu)象改變的蛋白的檢測方法也是不適當(dāng)?shù)?，因?yàn)?，像早先提及的朊病毒檢測技術(shù)一樣，它們常常需要死后的組織采樣。
因而，需要可靠的和可負(fù)擔(dān)的用于構(gòu)象改變的蛋白和朊病毒的檢測方法。這些方法應(yīng)當(dāng)可在患病受試者的生活期間應(yīng)用，以獲得快速診斷和便于預(yù)防或補(bǔ)救治療。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了可靠的、可負(fù)擔(dān)的和安全的方法，用于與各種疾病相關(guān)的構(gòu)象改變型蛋白和朊病毒的檢測。本發(fā)明的方法可以用來獲得快速診斷和便于預(yù)防或補(bǔ)救治療。有意義的是，本發(fā)明的方法使用少量的樣品，因而與當(dāng)前已知的診斷技術(shù)相比侵入性較低，并更容易應(yīng)用。進(jìn)一步的，本發(fā)明的方法可以用來分析來自活受試者的樣品，并且不限于死后獲得的樣品。此外，它們可以以確保感染性材料不在測試期間增殖的方式來使用。
本發(fā)明通過使用催化增殖(catalytic propagation)來開發(fā)構(gòu)象改變型蛋白或朊病毒中的構(gòu)象變化，克服了與先有技術(shù)的診斷技術(shù)相關(guān)的許多難題，所述蛋白或朊病毒與特定的疾病過程相關(guān)，諸如傳染性海綿狀腦病(TSE)。催化增殖可用于擴(kuò)增樣品中存在的構(gòu)象改變的蛋白片段或朊病毒的數(shù)目，并引起可檢測聚集物的如下形成當(dāng)含有構(gòu)象改變的蛋白或朊病毒的樣品與以下定義的構(gòu)象探針相互作用時，所述探針經(jīng)歷構(gòu)象變化，采取了構(gòu)象改變的蛋白(其可能是可溶的或不溶的)或朊病毒的構(gòu)象，并與所述蛋白或朊病毒聚集。顯示為β片層形式的所產(chǎn)生聚集物，可使用標(biāo)準(zhǔn)的分析技術(shù)容易地檢測。結(jié)果，本發(fā)明促成了小樣品量的快速和有成本效益的分析，并廣泛地適用于來自各種來源的組織和體液，包括但不限于腦和血液。
本發(fā)明還允許檢測小量的疾病相關(guān)性構(gòu)象改變型蛋白，例如低密度脂蛋白受體、囊性纖維化穿膜調(diào)節(jié)物、亨廷頓蛋白、Aβ肽、朊病毒、胰島素相關(guān)淀粉樣蛋白、血紅蛋白、α-突觸核蛋白、視紫紅質(zhì)、晶狀體蛋白和p53。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法使用在此另外描述的回文探針，例如，含有PrPSc蛋白的氨基酸序列126-104和109-126的回文33-mer探針，來檢測樣品中的朊病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述探針在每個末端與一些部分結(jié)合，所述部分在探針向β-片層結(jié)構(gòu)構(gòu)象轉(zhuǎn)變時其光學(xué)性質(zhì)是獨(dú)特且可檢測的。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測樣品中構(gòu)象改變型蛋白或朊病毒的方法，包括(a)使所述樣品與一種或多種α-螺旋或隨機(jī)卷曲型構(gòu)象探針反應(yīng)，所述探針與所述樣品中的β-片層構(gòu)象型不溶蛋白或朊病毒相互作用，并因而(i)經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)變，成為以β-片層為主的構(gòu)象，和(ii)與樣品中的β-片層構(gòu)象型不溶蛋白或朊病毒形成可檢測的聚集物；和(b)檢測可檢測聚集物的水平，其中可檢測聚集物的水平與樣品中β-片層構(gòu)象型不溶蛋白或朊病毒的水平相關(guān)，并因而與所述樣品的感染性相關(guān)。在實(shí)施方案中，探針被固定在固相支持物上，例如聚苯乙烯平板、膜、瓊脂糖或聚苯乙烯珠。
本發(fā)明還提供了使用這些方法的試劑盒，以及診斷受試者是否患有或易感染與構(gòu)象改變的蛋白或朊病毒相關(guān)的疾病的方法。本發(fā)明的試劑盒可以包括一種或多種α-螺旋或隨機(jī)卷曲型構(gòu)象探針，所述探針與樣品中β-片層構(gòu)象型不溶蛋白或朊病毒相互作用并因而(i)經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)變，成為以β-片層為主的構(gòu)象，和(ii)與樣品中β-片層構(gòu)象型不溶蛋白或朊病毒形成可檢測的聚集物。所述試劑盒也可以包括固定化的探針，所述探針具有特定的構(gòu)象，例如β-片層構(gòu)象，其可以與朊病毒疾病蛋白特異性地相互作用。所述試劑盒可以進(jìn)一步包括一些部分，所述部分結(jié)合于或?qū)⒔Y(jié)合探針的末端，并且在所述探針向主要為β-片層構(gòu)象的構(gòu)象轉(zhuǎn)變時其在光學(xué)上是可檢測的，并且所述試劑盒包括使用所述試劑盒的說明書，和用于懸浮或固定樣品的溶液。
診斷受試者是否患有或易患與構(gòu)象改變型蛋白或朊病毒相關(guān)的疾病的方法，包括(a)從所述受試者獲得樣品；(b)使所述樣品與一種或多種α-螺旋或隨機(jī)卷曲型構(gòu)象探針反應(yīng)，所述探針與所述樣品中的β-片層構(gòu)象型不溶蛋白或朊病毒相互作用，并因而(i)經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)變，成為以β-片層為主的構(gòu)象，和(ii)與樣品中的β-片層構(gòu)象型不溶蛋白或朊病毒形成可檢測的聚集物；和(c)檢測可檢測聚集物的水平，其中可檢測聚集物的水平與樣品中β-片層構(gòu)象型不溶蛋白或朊病毒的數(shù)量和樣品的感染性水平相關(guān)，并指示所述受試者是否患有或易患與β-片層構(gòu)象型不溶蛋白或朊病毒相關(guān)的疾病。
本發(fā)明還提供了從樣品中降低或消除PrPSc的方法。所述方法包括提供包含主要為β-片層構(gòu)象的固定化的探針，用所述固定化的探針與含有或懷疑含有PrPSc的樣品在一定條件下接觸并持續(xù)足夠長的時間，使所述固定化的探針結(jié)合樣品中的至少一些PrPSc，并從余下的樣品分離所述探針/PrPSc復(fù)合物。在實(shí)施方案中，所述樣品是生物樣品，例如血液或血漿。
在以下的詳細(xì)說明中進(jìn)一步描述了本發(fā)明的這些和其他方面。
附圖簡述附圖合并到本說明書中并作為本說明書的一部分，與實(shí)施方案的文字說明一起，說明了本發(fā)明的實(shí)施方案，用來解釋本發(fā)明的原理。


圖1例示了TSE構(gòu)象體的α-螺旋單體和β片層二聚體，以及本發(fā)明的探針的各種實(shí)施方案。朊病毒蛋白(PrPC)的正常的野生型(wt)形式傾向于單體狀態(tài)，而異常的、引起疾病的形式(PrPSc)傾向于多聚的(二聚或更高)狀態(tài)。
圖2例示了對含有由β-片層組成的TSE蛋白的樣品的診斷分析。上部的反應(yīng)表示在樣品中存在錯折疊的蛋白的情況下的過程，而底部的反應(yīng)表示在樣品中不存在錯折疊的蛋白的情況下的過程。
圖3例示了診斷分析的循環(huán)二色性(CD)的圖，所述診斷分析是根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的并且使用聚L-賴氨酸(20微摩爾(μM)，52,000分子量(MW))作為肽模型。
圖4例示了診斷分析的吸光度圖，所述診斷分析是使用聚L-賴氨酸(70μM，52,000MW)作為肽模型進(jìn)行的。
圖5例示了圖3的結(jié)果，其使用聚L-賴氨酸(70μM，52,000MW)作為肽模型，并說明了pH值和溫度對構(gòu)象變化的影響。
圖6例示了光譜分析，其使用芘作為熒光探針，在經(jīng)歷構(gòu)象變化的α螺旋束狀結(jié)構(gòu)中的近端和末端位置中進(jìn)行。
圖7例示了在蛋白性物質(zhì)或朊病毒中與構(gòu)象變化相關(guān)的能量變化。
圖8例示了PrPC的α螺旋和環(huán)結(jié)構(gòu)。
圖9例示了PrPSc的以β-片層為主的二級結(jié)構(gòu)。
圖10例示了可用于本發(fā)明的方法中的回文33-mer探針，由它的序列表示，并以在每個末端附著有芘標(biāo)記的圖形形式表示。
圖10A圖示了33-mer探針的線性序列和它包含的19-mer和14-mer，回文序列是加下劃線的。在這個附圖中，描繪了特異于人類朊病毒蛋白或倉鼠朊病毒蛋白的探針。鼠序列的探針是相同的，只是在鼠序列中人類甲硫氨酸殘基被纈氨酸和亮氨酸殘基替代(參見SEQ ID NO29、10和3)。
圖10B圖示了折疊的序列，顯示了可以從所述序列形成的平行回文結(jié)構(gòu)，以及在肽的兩端存在的芘分子如何能形成激發(fā)二聚體(excimer)結(jié)構(gòu)。
圖11例示了蛋白和肽可以采取的三種不同的常見構(gòu)象形式的循環(huán)二色性圖(來源Woody，R.W.，In Circular Dichroism and the ConformationalAnalysis of Biomolecules，F(xiàn)asman，G.D.，Ed.，Plenum Press，New York，l996，pages 25-69)。
圖12例示了診斷分析的循環(huán)二色性圖，所述診斷分析是根據(jù)本發(fā)明在水性條件下進(jìn)行的，并且使用了回文33-mer探針和構(gòu)成它的14-mer和19-mer氨基酸序列(這三個序列在圖10中說明)。
圖13例示了圖6的光譜分析的變體，其中診斷分析的光譜熒光數(shù)據(jù)是使用具有兩端附著有芘(pyrene)的回文33-mer探針(SEQ ID NO1，參見圖10)進(jìn)行的。在單體(開發(fā))構(gòu)象中的光譜掃描產(chǎn)生了最大發(fā)射在370nm到385nm之間的醒目熒光光譜，而芘標(biāo)記的肽的被激發(fā)的二聚物或激發(fā)二聚體狀態(tài)的發(fā)射最大值在475nm到510nm之間。
圖14例示了其中使用芘作為熒光團(tuán)的光譜分析，激發(fā)波長約350nm，觀測到的波長約365nm到600nm。將激發(fā)之后的單體芘的正常發(fā)射(單體熒光)記錄為在約370nm和385nm之間檢測的最大波長。
圖15例示了在診斷分析中在不同的探針濃度下激發(fā)二聚體形式(IE)與單體形式(IM)的比例，所述診斷分析使用圖10描述的回文33-mer探針。當(dāng)條件接近蛋白的等電點(diǎn)時預(yù)期看到蛋白的最小溶解性，這是在條件(2)接近33-mer肽的等電點(diǎn)時所觀察到的由于與(1)相比在這些條件下它具有顯著降低的溶解性，它與自身聚集。在這個實(shí)施例中，在肽的等電點(diǎn)處靜電相互作用(pl＝10)在肽的濃度極低(10μM)的條件下觸發(fā)了自我締合。以下圖例適用于圖151.pH6-8，鹽濃度范圍100-500mM KCl2.pH10-11，鹽濃度范圍100-500mM KCl圖16例示了診斷分析中構(gòu)象變化的締合曲線，所述診斷分析在各種條件下使用回文33-mer探針(SEQ ID NO1)、19-mer(SEQ ID NO2)和14-mer(SEQ ID NO3)(參見圖10)來測定與從隨機(jī)卷曲到β-片層的轉(zhuǎn)化相關(guān)的最佳參數(shù)。
圖17顯示了來自實(shí)施例6中描述的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中測量朊病毒蛋白與33-mer探針的復(fù)合物的熒光作為時間的函數(shù)。復(fù)合物基本上隨著時間(1小時-24小時)離解。
圖18(A)-(C)例示了在TRIS∶TFE(1∶1)溶劑中存在感染的腦組織勻漿(1)、健康腦組織勻漿(2)和單獨(dú)的肽(3)的情況下目標(biāo)肽(520mM)的熒光光譜。從來自倉鼠(“A”；270pg/ml)、綿羊(“B”；60pg/ml)和麋鹿(“C”；6pg/ml)的0.01％腦組織勻漿獲得數(shù)據(jù)。
圖19例示了根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的熒光診斷分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線。連接實(shí)心圓圈的線代表使用本發(fā)明的探針和系統(tǒng)獲得的檢測曲線?；疑珔^(qū)中的區(qū)域(約1到約11pM)和灰色區(qū)右側(cè)的區(qū)域代表當(dāng)前可得的商業(yè)檢測試劑盒的敏感性。在這個附圖中顯示的數(shù)據(jù)證明了，與當(dāng)今使用的經(jīng)證實(shí)的測試相比，在沒有任何優(yōu)化的情況下本發(fā)明的敏感度高兩個數(shù)量級。朊病毒感染性1IU-3fM＝200,000PrP。使用Dr.Schmerr的毛細(xì)管免疫電泳法測定朊病毒蛋白濃度(Schmerr et al.，J Chromatogr.A.，853(1-2)207-214，Aug.20，1999)。數(shù)據(jù)來自圖18。
圖20圖示了根據(jù)本發(fā)明的兩個探針的熒光光譜，其已被獨(dú)立地固定到聚苯乙烯平板上。在不同的pH獨(dú)立地固定兩種探針標(biāo)記“α-螺旋”的探針在pH7.4固定，而標(biāo)記“β-折疊”的探針在pH5.0固定。附圖顯示了在pH7.0獲得的光譜，表明以給定構(gòu)象固定肽將肽鎖定在該構(gòu)象中。
圖21圖示了固定化的目標(biāo)肽保持了結(jié)合PrPSc或PrPC的能力。
圖21A圖示了本發(fā)明的固定化的β-片層構(gòu)象探針與PrPC或PrPSc的復(fù)合物的吸光度，表明所述固定化的探針優(yōu)選以劑量依賴性方式結(jié)合PrPSc。
圖21B是柱形圖，其顯示了固定化的目標(biāo)肽區(qū)分PrPSc和PrPC。
圖22圖示利用結(jié)合型錯折疊的朊病毒蛋白探針以及正常朊病毒蛋白或錯折疊的朊病毒蛋白進(jìn)行的競爭實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說明現(xiàn)在將詳細(xì)地參考本發(fā)明的各種的示范性實(shí)施方案，其中一些的實(shí)施例在附圖中說明。
如在此使用的，以下術(shù)語具有以下相應(yīng)的意思。
“致淀粉樣變疾病(amyloidogenic disease)”是在身體中形成淀粉樣斑塊或淀粉樣沉淀的疾病。淀粉樣形成在許多疾病中發(fā)現(xiàn)，例如糖尿病、AD、癢病、GSS、BSE、CJD、慢性消耗性疾病(CWD)和相關(guān)的傳染性海綿樣腦病(TSE)。
TSE是致死的神經(jīng)變性疾病，其包括人類疾病諸如CJD、庫魯病、FFI和GSS。TSE的動物形式包括綿羊中的癢病、鹿和麋鹿中的CWD，和牛中的BSE。這些疾病的特征在于在腦中正常的蛋白酶敏感性的、宿主編碼的朊病毒蛋白(PrP-sen)的異常蛋白酶K抗性同種型(PrP-res)的形成和積累。PrP-res從PrP-sen通過涉及構(gòu)象變化的翻譯后加工而形成，所述構(gòu)象變化將PrP-sen轉(zhuǎn)變成具有更高β-片層含量的PrP-res分子聚集物。PrP-res的這些高分子聚集物的形成與TSE介導(dǎo)的腦部病理緊密地相關(guān)，其中在腦中形成PrP-res的淀粉樣沉淀，其最終變成“海綿狀”(充滿孔洞)。
TSE疾病可通過暴露于不尋常的病原體來傳播，例如，通過在新幾內(nèi)亞島的森林人中的祭典食人，或BSE中給牛飼喂動物成分。通過施用來自尸體垂體的人生長激素、移植的硬膜物質(zhì)和角膜移植，和通過在神經(jīng)病學(xué)處理期間將外科醫(yī)師暴露于受感染組織，也已經(jīng)引起了醫(yī)源性CJD。
已經(jīng)顯示了天然的朊病毒蛋白(PrP)的存在對于TSE的發(fā)病是必需的。細(xì)胞蛋白PrP-sen是由在人類中位于染色體20上的基因編碼的唾液酸糖蛋白。PrP基因在神經(jīng)和非神經(jīng)組織中表達(dá)，它的mRNA的最高濃度在神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)。PrP基因的翻譯產(chǎn)物包括人類中的253個氨基酸、倉鼠和小鼠中的254個氨基酸、牛中的264個氨基酸和綿羊中的256個氨基酸(所有這些序列在美國專利No.5,565,186中公開，其描述了產(chǎn)生表達(dá)物種特異性PrP的轉(zhuǎn)基因小鼠的方法)。在朊病毒蛋白相關(guān)腦病中，細(xì)胞的PrP-sen被轉(zhuǎn)變?yōu)楦淖兊腜rP-res。PrP-res與PrP-sen的區(qū)別在于PrP-res聚集體(Caughey andChesebro，Trends Cell Biol.756-62，1997)；對蛋白酶K消化有至少部分的抗性(在PrP-sen被完全降解的情況下僅約N-末端67個氨基酸被蛋白酶K消化除去)(Prusiner et al.，Sem.Virol.7159-173，1996)；并且與PrP-sen相比具有更少的α-螺旋結(jié)構(gòu)和更多的β-片層結(jié)構(gòu)(Pan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9010962-10966，1993)。
如果PrP-sen在癢病感染的神經(jīng)移植體的動物接受者的腦組織中不表達(dá)，沒有病變在移植體外部發(fā)生，證明PrP-res和PrP-sen都是病變所需的(Brander et al.，Nature 379339-343，1996)。在感染和疾病表現(xiàn)之間的長潛伏期(數(shù)月到數(shù)十年，取決于物種)促使了無細(xì)胞的體外測試的開發(fā)，其中PrP-res誘導(dǎo)PrP-sen轉(zhuǎn)變成PrP-res(Kockisko et al.，Nature 370471-474，1994；還參見Prusiner et al.，WO 97/16728，1997年5月9日公開)。這些體內(nèi)和體外的觀測表明，PrP-res和PrP-sen之間的直接相互作用形成了PrP-res并促使TSE發(fā)病。
早先已經(jīng)顯示含有某些PrP序列的小的合成肽與患有TSE的腦中的不溶沉淀中所見的高度β-片層二級結(jié)構(gòu)類型自然地聚集形成纖絲(Gasset etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910940-10944，1992；Come et al.，Proc.NatlAcad.Sci.USA 905959-5963，1993；Forloni et al.，Nature 362543-546，1993；Hope et al.，Neurodegeneration 51-11，1996)。此外，其他的合成PrP肽已經(jīng)顯示了與PrP-sen分子相互作用形成具有提高的蛋白酶抗性的聚集復(fù)合物(Kaneko et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9211160-11164，1995；Kaneko et al.，J.Mol.Biol.270574-586，1997)。
“構(gòu)象改變的蛋白”包括任何蛋白，其具有與疾病相關(guān)的三維構(gòu)象，并且不同于假定它不與疾病相關(guān)時的三維構(gòu)象。構(gòu)象改變的蛋白可能引起疾病，或可能是疾病的癥狀中的因素，或可能作為其他因素的結(jié)果在樣品中或體內(nèi)出現(xiàn)。根據(jù)該定義，構(gòu)象改變的蛋白可能具有產(chǎn)生至少兩種構(gòu)象的單個氨基酸序列，一種構(gòu)象與疾病相關(guān)，另一種不相關(guān)。構(gòu)象改變的蛋白一般處于展現(xiàn)了β-片層形式的不溶蛋白形式，并且在本發(fā)明中得以分析。
以下是與構(gòu)象改變的蛋白相關(guān)的疾病的非限制性列表，同時列出的是相關(guān)的構(gòu)象改變型蛋白阿爾茨海默氏病(APP、Aβ肽、α1-抗凝乳蛋白酶、tau、非Aβ成分、早老蛋白(presenilin)1、早老蛋白2、apoE)；朊病毒疾病、CJD、癢病和BSE(PrPSc)；ALS(SOD和神經(jīng)絲)；皮克病(皮克體(Pickbody))；帕金森氏病(Lewy體中的α-突觸核蛋白(synuclein))；額顳性癡呆(frontotemporal dementia)(纖絲中的tau)；II型糖尿病(支鏈淀粉)；多發(fā)性骨髓瘤-漿細(xì)胞惡性增生(IgGL-鏈)；家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病(familialamyloidotic polyneuropathy)(運(yùn)甲狀腺素蛋白(transthyretin))；甲狀腺髓樣癌(促降鈣素(procalcitonin))；慢性腎衰竭(β2-微球蛋白)；充血性心力衰竭(心房利鈉因子)；老年心臟和系統(tǒng)性淀粉樣變性(senile cardiac and systemicamyloidosis)(transthyretin)；慢性炎癥(血清淀粉樣蛋白A)；動脈粥樣硬化(ApoA1)；家族性淀粉樣變性(familia amyloidosis)(凝溶膠蛋白(gelsolin))；亨廷頓病(Huntington’s disease)(亨廷頓蛋白(Huntingtin))。
“不溶蛋白”包括與淀粉樣變性疾病相關(guān)的任何蛋白，包括但不限于在前述段落中確定的任何蛋白。不溶蛋白在聚集物中一般顯示β-片層形成。
“PrP蛋白”、“PrP”等等在此可互換地使用，都是指已知在人類和動物中引起疾病(海綿狀腦病)的感染性顆粒型，和PrPSc在合適的條件下轉(zhuǎn)變成感染性PrPSc形式的非感染性形式PrPC。
術(shù)語“朊病毒”、“朊病毒蛋白”、“PrPSc蛋白”等等在此可互換地使用，是指PrP蛋白的感染性PrPSc形式?！半貌《尽笔切g(shù)語“蛋白”和“感染”的縮寫。顆粒主要(如果不僅僅是)包含由PrP基因編碼的PrPSc分子。朊病毒不同于細(xì)菌、病毒和類病毒。已知的朊病毒感染動物并引起綿羊和山羊的癢病、神經(jīng)系統(tǒng)的傳染性變性疾病，以及BSE(或瘋牛病)和貓的貓科海綿狀腦病。已知影響人類的四種朊病毒疾病是(1)庫魯病(kuru)，(2)CJD，(3)GSS，和(4)FFI。如在此使用的，“朊病毒”包括在使用的任何動物、特別是在人類和馴養(yǎng)的家畜中引起所有或任何這些疾病和其它疾病的所有形式的朊病毒。
在此使用術(shù)語“PrP基因”來描述表達(dá)包括已知的多態(tài)性和病原性突變的蛋白的遺傳物質(zhì)。術(shù)語“PrP基因”一般指編碼任何形式的朊病毒蛋白的任何物種的任何基因。PrP基因可以來自任何動物，并包括它的所有多態(tài)性和突變，公認(rèn)的是該術(shù)語包括有待發(fā)現(xiàn)的其他這樣的PrP基因。由這種基因表達(dá)的蛋白可以采取PrPC(非疾病)或PrPSc(疾病)形式。
“肽模擬物”是模擬另一種生物學(xué)活性肽分子的活性的模擬物。
“蛋白”是指經(jīng)由肽鍵連接的兩個或多個單獨(dú)氨基酸(不管是否為天然存在的)的任何聚合物，當(dāng)結(jié)合到一個氨基酸(或氨基酸殘基)的α碳的羧酸基團(tuán)的羧基碳原子變?yōu)榕c結(jié)合到鄰近氨基酸的α碳的氨基的氨基氮原子共價結(jié)合時，產(chǎn)生了這種聚合。這些肽鍵，和構(gòu)成它們的原子(即，α碳原子、羧基碳原子和它們的取代基氧原子，和氨基氮原子和它們的取代基氫原子)形成蛋白的“多肽主鏈”。簡而言之，多肽主鏈應(yīng)理解為是指蛋白的氨基氮原子、α碳原子和羧基碳原子，雖然兩個或多個這些原子(有或沒有它們的取代基原子)也可能作為偽原子存在。實(shí)際上，可用于在此描述的功能性位點(diǎn)描述詞的多肽主鏈的任何表達(dá)形式將理解為包括在術(shù)語“多肽主鏈”的含義內(nèi)。
術(shù)語“蛋白”被理解為在其含義內(nèi)包括術(shù)語“多肽”和“肽”(有時，在此這些可以可互換地地使用)。此外，包含多個多肽亞基(例如，DNA聚合酶III、 RNA聚合酶II)或其他組分(例如，如端粒酶中存在的RNA分子)的蛋白也理解為包括在在此使用的“蛋白”的含義內(nèi)。類似地，蛋白和多肽的片段也處于本發(fā)明的范圍內(nèi)，在此可以稱為“蛋白”。
“構(gòu)象”或“構(gòu)象約束物(conformational constraint)”是指特定蛋白構(gòu)象的存在，例如，α-螺旋、平行和反平行β-鏈、亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)、鋅指，等等。此外，構(gòu)象約束可以包括沒有其他結(jié)構(gòu)信息的氨基酸序列信息。舉例來說，“-C-X-X-C-”(SEQ ID NO)是指示兩個半胱氨酸殘基必須由兩個其他氨基酸殘基分隔的構(gòu)象約束，在這個特定約束的內(nèi)容中它們每一個的身份(identity)是不相關(guān)的?！皹?gòu)象變化”是一種構(gòu)象變化到另一種。
蛋白的序列編碼適當(dāng)?shù)恼郫B的確切機(jī)制是未知的。為了實(shí)現(xiàn)由折疊編碼的天然狀態(tài)，蛋白質(zhì)分子必需轉(zhuǎn)變成從許多可選構(gòu)象中選出的獨(dú)特構(gòu)象。功能蛋白一般是可溶的，可以采用包括卷曲和有序元件的各種結(jié)構(gòu)。有序元件包括在例如肌紅蛋白和血紅蛋白的蛋白中占優(yōu)勢的α螺旋。在人類的老化過程中，在某些蛋白中，可溶結(jié)構(gòu)(例如，α螺旋區(qū))的構(gòu)象改變成β片層結(jié)構(gòu)，其經(jīng)歷了與功能喪失相關(guān)聯(lián)的聚集作用。
至少有二十種蛋白當(dāng)它們采取構(gòu)象改變的狀態(tài)時與人類疾病相關(guān)，早先已經(jīng)描述了其中的一些。圖1說明了TSE構(gòu)象體的α-螺旋單體和β-片層二聚體形式。朊病毒蛋白(PrPC)的正常的野生型(wt)形式傾向于單體狀態(tài)，而異常的、引起疾病的形式(PrPSc)更容易采用多聚的狀態(tài)。
通過各種實(shí)驗(yàn)或計算方法可以確定蛋白結(jié)構(gòu)，其中一些如下所述?？梢酝ㄟ^能夠產(chǎn)生至少低分辨率結(jié)構(gòu)的任何方法來實(shí)驗(yàn)性評估蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。這種方法目前包括X-射線晶體衍射和核磁共振(NMR)光譜。X-射線晶體衍射是用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)評估的一種方法，基于晶體中圍繞原子核的電子云對特征性波長的X射線輻射的衍射作用。X-射線晶體衍射使用純化的生物分子的晶體(但這些通常包括溶劑成分、輔因子、基質(zhì)或其他配體)來確定構(gòu)成特定生物分子的原子的近原子級分辨率。晶體生長的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，生物分子之間一般是不同的。自動化的晶體生長技術(shù)也是已知的。
核磁共振(NMR)目前使得確定生物分子的溶液構(gòu)象(而不是晶體結(jié)構(gòu))成為可能。一般地，僅可對小分子，例如低于約100-150個氨基酸的蛋白采用這種技術(shù)。然而，使用如同位素標(biāo)記的技術(shù)，新近的發(fā)展已經(jīng)產(chǎn)生了對大蛋白質(zhì)的溶液結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)性說明。NMR光譜相對于X-射線晶體衍射的益處是，結(jié)構(gòu)在溶液中測定而不是在晶體格構(gòu)中，在其中格構(gòu)鄰近相互作用可能改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。NMR光譜的缺點(diǎn)是NMR結(jié)構(gòu)不像晶體結(jié)構(gòu)那樣詳細(xì)和精確。一般地，與由晶體學(xué)測定的相比，由NMR光譜測定的生物分子結(jié)構(gòu)具有中度的分辨率。
研究生物分子結(jié)構(gòu)中有用的其他技術(shù)包括循環(huán)二色性(CD)、熒光和紫外可見吸光度光譜。這些技術(shù)的說明參見，例如，Physical BiochemistryApplications to Biochemistry and Molecular Biology，2nded.，W.H.Freeman&Co.，New York，N.Y，1982。
“等價物”是指具有與要分析的蛋白的氨基酸序列類似的氨基酸序列的蛋白，但氨基酸序列中具有至少一個，但少于5個(例如，3個或更少)的差異，例如通過替換、添加或刪除的方式。因此，在基本上不改變蛋白質(zhì)的基本功能的給定序列和它在環(huán)境中用途的特定殘基位置中的一個或多個氨基酸的替換，對于描述本發(fā)明的目的而言是等價的。
“同源性”、“同源于”、“同源的”、“同一性”或“相似性”是指兩個多肽之間的序列相似性，同一性是更嚴(yán)格的比較。同源性和同一性各自可以通過比較每個序列中的位置來確定，所述序列為了比較的目的而被對準(zhǔn)。當(dāng)被比較序列中的位置被相同氨基酸占據(jù)時，則分子在該位置是同一的。氨基酸序列的同一性的程度是氨基酸序列共有的位置上相同的氨基酸數(shù)量的函數(shù)。氨基酸序列的同源性或相似性的程度是在氨基酸序列共有的位置處結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸數(shù)量的函數(shù)。“不相關(guān)的”或“非同源的”序列與本發(fā)明中使用的序列之一享有40％或更低的同一性，而優(yōu)選低于25％的同一性。相關(guān)的序列享有超過40％的同一性，優(yōu)選至少約50％的同一性，更優(yōu)選至少約70％的同一性，更優(yōu)選至少約90％的同一性，更優(yōu)選至少約99％的同一性。
術(shù)語“同一性百分比”是指兩個氨基酸序列之間的序列同一性。同一性可以通過比較每個序列中的位置來確定，所述序列為了比較的目的而被對準(zhǔn)。當(dāng)一個被比較序列中的等效位置被另一個中在相同位置的相同氨基酸占據(jù)時，則分子在該位置是同一的；但等效晶位由相同或相似的氨基酸殘基(例如，在脂性和/或電子性質(zhì)上相似)占據(jù)時，則分子可以稱為在該位置是同源的(相似的)。同源性、相似性或同一性百分比的表述，是指在被比較序列共有的位置處相同或相似的氨基酸數(shù)量的函數(shù)?？梢允褂酶鞣N比對算法和/或程序，包括FASTA、BLAST或ENTREZ。FASTA和BLAST作為GCG序列分析程序包(University of Wisconsin，Madison，Wis.)的部分是可用的，可以用例如默認(rèn)設(shè)置來使用。ENTREZ可以通過National Center forBiotechnology Information，National Library of Medicine，NIH，Bethesda，Md.)獲得。在一個實(shí)施方案中，可以通過GCG程序用1的缺口加權(quán)來確定兩個序列的同一性百分比，例如，每個氨基酸缺口被加權(quán)方式就像它是兩個序列之間的單個氨基酸錯配一樣。確定序列同一性的其他技術(shù)是公知的，并在現(xiàn)有技術(shù)中描述了。
如在此使用的術(shù)語“相互作用”意思是包括分子之間可檢測的相互作用(例如，生物化學(xué)的相互作用)，例如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-核酸、核酸-核酸、蛋白質(zhì)-小分子、或核酸-小分子相互作用。
術(shù)語“不溶蛋白的同源物”包括由不溶蛋白基因的同源物編碼的所有氨基酸序列，和與這種序列等價或同源的所有氨基酸序列。因此，“不溶蛋白的同源物”包括在Pfam族中計分為命中(hit)的蛋白。為了鑒定蛋白序列中“不溶蛋白”結(jié)構(gòu)域的存在，并進(jìn)行確定目標(biāo)多肽或蛋白具有特定的輪廓，可以使用各種默認(rèn)參數(shù)對幾個數(shù)據(jù)庫(例如，SwissProt，PIR)之一檢索該蛋白的氨基酸序列(http://www.sangetr.ac.uk？Software/Pfam？HMM_search)。例如，作為搜索程序的HM_MER程序包的部分可用的hmmsf程序是用于MILPAT0063的家族特異性默認(rèn)程序，15的分值是確定命中的默認(rèn)閾分值。做為選擇，可以降低用于確定命中的閾分值(例如，到8bits)。Pfam數(shù)據(jù)庫的說明可以在Sonham et al.，Proteins28(3)405-420，1997中找到，HMMs的詳細(xì)說明可以在例如Gribskov et al.，Meth.Enzymol.183146-159，1990；Gribskov et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA84435 5-4358，1987；Krogh et al.，J.Mol.Biol.2341501-1531，1994和Stultz etal.，Protein Sci.2305-314，1993中找到，通過引用將它們的內(nèi)容合并在此。
“測試樣本”是要測試的材料樣品，在意思上等價于并因而與“樣品”可互換地使用?？梢酝ㄟ^在玻璃勻漿器中勻漿從組織(例如，碎肉的一部分、通過活組織檢查步驟獲得的一定量組織，血液或血液的級分，例如血漿)制備樣品。樣品的數(shù)量可以是適合于使用本申請的應(yīng)用的任何數(shù)量。例如，如果使用血液或血液級分，可以是約1μl、約100μl、約1ml、約10ml、約100ml、約一升(或一品脫)，或更多。在本發(fā)明的某些應(yīng)用中，可以使用大體積的血液或血液制品作為樣品，包括大于一升(或一品脫)的數(shù)量。當(dāng)固體組織是樣品的來源時，樣品應(yīng)在約1mg到1gm之間，優(yōu)選的10mg到250mg之間，理想地20到100mg之間。要采樣的材料可以懸浮在適合的溶劑中，優(yōu)選的pH值7.0和7.8之間的磷酸鹽緩沖鹽水。溶劑可以含有洗滌劑，例如Triton X-100、SDS或肌氨酰。在一定數(shù)量的勻漿器移動(excursion)下進(jìn)行勻漿，優(yōu)選的10到25次沖擊(stroke)之間、理想地15到20次沖擊之間。懸浮的樣品優(yōu)選的在100到1,000g之間離心5-10分鐘，采樣上清材料用于分析。在某些樣品中，優(yōu)選根據(jù)由Safar et al.，Nature Medicine41157-1165，1998描述的和由Wadsworth et al.，Lancet 358171-180，2001修改的步驟，用其他試劑例如磷鎢酸處理上清材料。
要測試的樣品的數(shù)量是根據(jù)對上清溶液的蛋白質(zhì)含量的測定，這由Bradford描述的步驟來測量。優(yōu)選的，這相應(yīng)于0.5到2mg之間的蛋白質(zhì)。
對于組織材料除了如上所述的步驟之外，可以從血清、可能含有動物來源的產(chǎn)品的藥物制劑、脊液、唾液、尿或其他體液獲得受試樣品?？梢灾苯訙y試液體樣品，或可以用如上所述的試劑例如磷鎢酸的處理。
“構(gòu)象探針”優(yōu)選的是具有氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列相似于、更優(yōu)選相同于靶蛋白中的一些氨基酸序列，并且所述肽也有可能在與靶蛋白(不溶蛋白)復(fù)合時經(jīng)歷構(gòu)象變化以產(chǎn)生β-片層形式。這種改變一般產(chǎn)生正常情況下所述探針不證明的β-片層結(jié)構(gòu)。理想地，探針具有回文結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有來自靶蛋白的兩個氨基酸序列。在本發(fā)明中優(yōu)選使用α-螺旋或隨機(jī)卷曲型構(gòu)象探針(即，在溶液中顯示α-螺旋或隨機(jī)卷曲構(gòu)象的探針)，包括以下序列回文33-mer(SwissProt P04156；Pfam ID Prion Pf00377&03991)，其包含與PrPSc蛋白的氨基酸122-104和109-122(SEQ ID NO13和14)等同的氨基酸序列(SEQ ID NO29)VVAGAAAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAAAAGAVV(鼠)(SEQ ID NO1)VVAGAAAAGAMHKMNTKPKMKHMAGAAAAGAVV；(人類)回文33-mer(SwissProt P04156；Pfam ID Prion Pf00377&03991)，其包含與PrPSc蛋白的氨基酸122-104和109-122(SEQ ID NO13和14)等同的氨基酸序列(SEQ ID NO29)VVAGAAAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAAAAGAVV(鼠)(SEQ ID NO1)VVAGAAAAGAMHKMNTKPKMKHMAGAAAAGAVV；(人類)回文33-mer(SwissProt P04156；Pfam ID Prion Pf00377&03991)，其包含與PrPSc蛋白的氨基酸122-104和109-122(SEQ ID NO13和14)具有約70％到約90％同一性的氨基酸序列(SEQ ID NO29)VVAGAAAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAAAAGAVV(鼠)(SEQ ID NO1)VVAGAAAAGAMHKMNTKPKMKHMAGAAAAGAVV；(人類)探針，其包含與Aβ肽(Nref00111747；人類)的氨基酸1-40(SEQ IDNO4)DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV相同的氨基酸序列；探針，其包含與Aβ肽(Nref00111747；人類)的氨基酸1-40(SEQ IDNO4)DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV等同的氨基酸序列；探針，其包含與Aβ肽(Nref00111747；人類)的氨基酸1-40(SEQ IDNO4)DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV具有約70％到約90％同一性的氨基酸序列；探針，其包含與Aβ肽(Nref00111747；人類)的氨基酸11-34EVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL(SEQ ID NO5)相同的氨基酸序列；探針，其包含與Aβ肽(Nref00111747；人類)的氨基酸11-34相同、但殘基H13被R替代來降低金屬離子相互作用并提高肽的溶解度的氨基酸序列EVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL；(SEQ ID NO6)；探針，其包含與Aβ肽(Nref0011747；人類)的氨基酸25-35GSNKGAIIGLM(SEQ ID NO7)相同的氨基酸序列；探針，其具有聚賴氨酸中發(fā)現(xiàn)的螺旋-環(huán)-螺旋構(gòu)象，并且具有長度至少10個氨基酸殘基并與KKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKK等同或同源的氨基酸序列(27-mer)(SEQ ID NO8)；探針，其具有聚谷氨酰胺中發(fā)現(xiàn)的構(gòu)象并具有與QQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQ等同或同源的氨基酸序列；(23-mer)(SEQ ID NO9)探針，其包含與野生型(wt)TSE(人類Nref00130350)的氨基酸104-122KPKTNLKHVAGAAAAGAVV(SEQ ID NO10)同源的氨基酸序列；探針，其包含與野生型(wt)TSE(人類Nref00130350)的氨基酸104-122KPKTNLKHVAGAAAAGAVV(SEQ ID NO10)等同的氨基酸序列；探針，其包含與野生型(wt)TSE(人類Nref00130350)的氨基酸序列104-122KPKTNLKHVAGAAAAGAVV(SEQ ID NO10)具有約70％到約90％相同性的氨基酸序列；包含下述氨基酸序列的探針，所述氨基酸序列(a)是選擇性突變的TSE序列；(b)是去穩(wěn)定化且非感染性的；和(c)具有與野生型(wt)TSE(人類Nref00130350)的氨基酸序列104-122 KPKTNLKHVAGAAAAGAVV(SEQID NO10)同源的氨基酸序列；包含下述氨基酸序列的探針，所述氨基酸序列(a)是選擇性突變的TSE序列；(b)是去穩(wěn)定化且非感染性的；和(c)具有與野生型(wt)TSE(人類Nref00130350)的氨基酸序列104-122KPKTNLKHVAGAAAAGAVV(SEQID NO10)等同的氨基酸序列；包含下述氨基酸序列的探針，所述氨基酸序列(a)是選擇性突變的TSE序列；(b)是去穩(wěn)定化且非感染性的；和(c)具有與野生型(wt)TSE(人類Nref00130350)的氨基酸序列104-122KPKTNLKHVAGAAAAGAVV(SEQ IDNO10)具有約70％到約90％相同性的氨基酸序列；包含下述氨基酸序列的探針，所述氨基酸序列與人類糖尿病相關(guān)性胰島淀粉樣多肽前體(支鏈淀粉)蛋白(Accession#_NP_000406；人類)的氨基酸1-38(SEQID NO 11)MGILKLQVFLIVLSVALNHLKATPIESHQVEKRKCNTA相同；包含下述氨基酸序列的探針，所述氨基酸序列與人類糖尿病相關(guān)性人類胰島淀粉樣多肽前體(支鏈淀粉)蛋白(Accession#_NP_000406；人類)的氨基酸 1-38(SEQ IDNO11)MGILKLQVFLIVLSVALNHLKATPIESHQVEKRKCNTA的序列內(nèi)的至少10個連續(xù)氨基酸殘基相同；包含下述氨基酸序列的探針，所述氨基酸序列與人類嬰兒SIDS相關(guān)性人類肺表面活性蛋白(NCBI Accession#_AAH32785；人類)的氨基酸1-25MAESHLLQWLLLLLPTLCGPGTAAW(SEQ ID NO12)相同；包含下述氨基酸序列的探針，所述氨基酸序列包括人類PrPSc的氨基酸104-122或鼠PrPSc蛋白的氨基酸103-121(SEQ ID NO13和14)(SwissProtP04156；Pfam IDpron PF00377&03991)的至少10個連續(xù)氨基酸殘基人類朊病毒蛋白(Accession PO4156)MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG(SEQ ID NO13)；鼠朊病毒蛋白(Accession PO4925)MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGTWGQPHGGGWGQPHGGSWGQPHGGSWGQPHGGGWGQGGGTHNQWNKPSKPKTNLKHVAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPMIHFGNDWEDRYYRENMYRYPNQVYYRPVDQYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCVTQYQKESQAYYDGRRSSSTVLFSSPPVILLISFLIFLIVG(SEQ ID NO14)；包含下述氨基酸序列的探針，其包括以下人類血漿gelsolin(P06396；Muary et al.，F(xiàn)EBS Lett.260(1)85-87，1990)的氨基酸235-269(以下通過雙下劃線強(qiáng)調(diào))的至少10個連續(xù)氨基酸殘基MAPHRPAPALLCALSLALCALSLPVRAATASRGASQAGAPQGRVPEARPNSMVVEHPEFLKAGKEPGLQIWRVEKFDLVPVPTNLYGDFFTGDAYVILKTVQLRNGNLQYDLHYWLGNECSQDESGAAAIFTVQLDDYLNGRAVQHREVQGFESATFLGYFKSGLKYKKGGVASGFKHVVPNEVVVQRLFQVKGRRVVRATEVPVSWESFNNGDCFILDLGNNIHQWCGSNSNR MLQVLGPKPALPAGTEDTFAKEDAANRKLAKLYKVSNGAGTMSVSLVADENPFAQGALKSEDCFILDHGKDGKIFVWKGKQANTEERKAALKTASDFITKMDYPKQTQVSVLPEGGETPLFKQFFKNWRDPDQTDGLGLSYLSSHIANVERVPFDAATLHTSTAMAAQHGMDDDGTGQKQIWRIEGSNKVPVDPATYGQFYGGDSYIILYNYRHGGRQGQIIYNWQGAQSTQDEVAASAILTAQLDEELGGTPVQSRVVQGKEPAHLMSLFGGKPMIIYKGGTSREGGQTAPASTRLFQVRANSAGATRAVEVLPKAGALNSNDAFVLKTPSAAYLWVGTGASEAEKTGAQELLRVLRAQPVQVAEGSEPDGFWEALGGKAAYRTSPRLKDKKMDAHPPRLFACSNKIGRFVIEEVPGELMQEDLATDDVMLLDTWDQVFVWVGKDSQEEEKTEALTSAKRYIETDPANRDRRTPITVVKQGFEPPSFVGWFLGWDDDYWSVDPLDRAMAELAAYERLKATQVSKGIRDNERSGRARVHVSEEGTEPEAM(SEQ ID NO16)；包含氨基酸序列的探針，所述氨基酸序列包括下文所述和由Levy et al.，J.Exp.Med.169(5)1771-1778，1989(P01034)報道的半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)C蛋白序列的淀粉樣蛋白形成區(qū)(氨基酸26-147；以下由雙下劃線強(qiáng)調(diào))的至少10個連續(xù)氨基酸殘基。合適的探針是至少10個氨基酸的其任何部分?？梢韵鄳?yīng)地定位許多探針。
MAGPLRAPLLLLAILAVALAVSPAAG ID NO17)；取自上述序列的氨基酸39-47的cystatin C蛋白的回文探針，其具有四單元脯氨酸接頭EEEVSADMPPPPMDASVEEE(SEQ ID NO18)包含下述氨基酸序列的探針，所述氨基酸序列包括亨廷頓蛋白蛋白(Huntington’s病蛋白)的殘基18-40(以下通過雙下劃線強(qiáng)調(diào))的低聚或多聚谷氨酰胺的10到23個、包括10和23個連續(xù)的谷氨酰胺殘基，蛋白序列如下所示MATLEKLMKAFESLKSFPPPPP PPPPPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPPPPPPPPPPGPAVAEEPLHRPKKELSATKKDRVNHCLTICENIVAQSVRNSPEFQKLLGIMELFLLCSDDAESDVRMVADECLNKVIKALMDSNLPRLQLELYKEIKKNGAPRSLRAALWRFAELAHLVRPQKCRPYLVNLLPCLTRTSKRPEESVQETLAAAVPKIMASFGNFANDNEIKVLLKAFIANLKSSSPTIRRTAAGSAVSICQHSRRTQYFYSWLLNVLLGLLVPVEDEHSTLLILG(SEQ ID NO19；P42858；gi1170192)；示例性的探針QQQQQQQQQQQQQQQQQ(SEQ ID NO20)；包含下述氨基酸序列的探針，所述氨基酸序列包括參與原纖維形成的人類胰島淀粉樣多肽的氨基酸殘基45-50和48-53(以下強(qiáng)調(diào)的)的至少6個連續(xù)氨基酸殘基，其序列在下文描述(SEQ ID NO21)NP_000406[gi4557655]Scrocchi et al.，J Struct.Biol.141(3)218-227，2003。MGILKLQVFLIVLSVALNHLKATPIESHQVEKRKCNTATCATQR NNFGAILSSTNVGSNTYGKRNAVEVLKREPLNYLPL(SEQ IDNO21).
示例性的探針含有以下序列，其是上述SEQ ID NO21的肽序列的序列45-53內(nèi)的最小序列，其可以不經(jīng)修飾使用或可以用來形成本發(fā)明的回文探針LANFV(SEQ D NO22)；VFNALPPPPLAKFV(回文探針)(SEQ ID NO23)；FLVHSS(SEQ ID NO24)；SSHVLFPPPPFLVHSS(回文探針)(SEQ ID NO25)；包含下述氨基酸序列的探針，所述氨基酸序列包括transthyretin(AAH20791[gi18089145]；MacPhee and Dobson，J.Mol.Biol.，279(5)1203-1215，2000)的肽片段的氨基酸殘基11-19(以下通過雙下劃線強(qiáng)調(diào))的至少5個連續(xù)氨基酸殘基MASHRLLLLC AGPTGTGESKCPLMVKVLDAVRGSPAINVAVHVFRKAADDTWEPFASGKTSESGELHGLTTEEEFVEGIYKVEIDTKSYWKALGISPFHEHAEVVFTANDSGPRRYTIAALLSPYSYSTTAVVTNPKE(SEQID NO26)；回文探針，其基于上述引用的SEQ ID NO26的強(qiáng)調(diào)的序列(氨基酸殘基11-19)ESVFVLGALPPPPLAGLVFVSE.(SEQ ID NO27)使用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和肽相關(guān)的化學(xué)合成可以容易地產(chǎn)生許多其他探針而不需過度的實(shí)驗(yàn)。
通過一種或多種光譜方法測定探針的天然構(gòu)象，例如CD、傅里葉變換紅外線、紫外線、NMR或熒光，等等。在如下所述的溶劑中這種構(gòu)象應(yīng)當(dāng)相應(yīng)于α-螺旋或隨機(jī)卷曲的構(gòu)象(例如，在CD中，光譜的性質(zhì)表現(xiàn)出所述構(gòu)象)。
修飾探針使其含有通過光學(xué)裝置可檢測的取代基。這種取代基可以包括色氨酸(氨基酸)、芘或相似的熒光基團(tuán)，都附著在或接近所述肽探針的末端位置。這種熒光基團(tuán)的附著根據(jù)常規(guī)的化學(xué)方法來進(jìn)行，其是本領(lǐng)域中公知的。優(yōu)選的，但不是必需地，附著是通過熒光團(tuán)對所述探針的共價附著。理想地，取代基具有以產(chǎn)生稱為激發(fā)二聚體的物質(zhì)的方式相互作用的能力。激發(fā)二聚體體現(xiàn)了兩個熒光基團(tuán)的相互作用，其在用特定波長的光激發(fā)時，發(fā)射不同波長的光線，其在量級上也與由單獨(dú)作用的熒光團(tuán)發(fā)射的不相同。因而，容許這種激發(fā)二聚體形成的構(gòu)象探針的結(jié)構(gòu)變化可以通過光學(xué)性質(zhì)方面的變化來檢測。取決于附著到探針的熒光團(tuán)，這種變化可以通過已知的熒光技術(shù)來測量，包括UV、IR、CD、NMR或熒光，和許多其它技術(shù)。這些變化的量級與探針經(jīng)歷構(gòu)象改變的程度相關(guān)。
在另一個實(shí)施方案中，探針可以用放射性物質(zhì)取代。理想地，這應(yīng)當(dāng)是具有足以通過當(dāng)前為此目的采用的機(jī)制檢出的能量的正電子發(fā)射。這樣的實(shí)體將優(yōu)選的含有氧-15(通過正電子發(fā)射衰變的氧的同位素)或其他放射性核素。在這個實(shí)施方案中，放射性標(biāo)記的探針可以注射到患者中，在外部監(jiān)視探針與蛋白目標(biāo)的結(jié)合。
探針可以包含在溶液中顯示隨機(jī)卷曲或α-螺旋構(gòu)象的至少五種、優(yōu)選的約十種或更多氨基酸殘基的肽或肽模擬物。肽或肽模擬物探針溶劑可以是水性的并具有約4和約10之間的pH ，優(yōu)選pH在約5和約8之間，并且可能具有約0.05和約0.5之間的離子強(qiáng)度(當(dāng)一般地用氯鹽，例如氯化鈉或氯化鉀制備時)。所述溶劑也可能含有一定百分比的水混溶性有機(jī)材料，例如三氟乙醇，量按體積計為約30％到約70％，優(yōu)選約45％到約60％?？梢杂眠m合的緩沖系統(tǒng)，例如醋酸鹽/乙酸、Tris或磷酸鹽來制備所述溶劑。
探針氨基酸探針序列通過要分析的靶蛋白的性質(zhì)來確定，通常包括已知經(jīng)歷從α-螺旋或卷曲到β-片層的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的靶區(qū)域。β-片層的結(jié)構(gòu)與靶蛋白的病原性形式相關(guān)。構(gòu)象探針序列理想地含有感興趣的靶序列的兩個重復(fù)，優(yōu)選的長度在約10到25個氨基酸，更優(yōu)選的長度在約14到20個氨基酸。優(yōu)選地在探針中布置這些來形成圖10中所示的回文結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的方法和試劑盒中使用的優(yōu)選探針具有相應(yīng)于要分析的蛋白的β-片層區(qū)域的氨基酸序列。這些探針優(yōu)選的長度至少5個氨基酸單位，可以是長度約300-400個氨基酸單位(-mer)或更長，然而，優(yōu)選的這些是長度約10個氨基酸到約50個氨基酸。在本發(fā)明的某些方面，相應(yīng)于β-片層區(qū)域的優(yōu)選探針長度約15個氨基酸到約100個氨基酸。在其他中，優(yōu)選的探針可以長度約20個氨基酸到約40個氨基酸。給定探針的優(yōu)選的長度將是探針與靶蛋白復(fù)合并產(chǎn)生β-片層形成的能力的函數(shù)。
用于本發(fā)明的探針從序列數(shù)據(jù)庫中存在的信息可容易地確定，或做為選擇，可以通過實(shí)驗(yàn)容易地確定。因此，探針一般將相應(yīng)于最小數(shù)量的氨基酸，優(yōu)選至少10個、更優(yōu)選約10到25個氨基酸，其相應(yīng)于靶蛋白的肽序列的至少一部分，所述靶蛋白可以經(jīng)歷從α-螺旋或隨機(jī)卷曲到不溶蛋白中的β-片層形成的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。
注意到，在指導(dǎo)合適探針的表達(dá)與合成的實(shí)驗(yàn)信息內(nèi)，存在著在使用本發(fā)明中可以指導(dǎo)實(shí)踐者的某些約束。從主要是轉(zhuǎn)化的構(gòu)象狀態(tài)中(在復(fù)合物中)的群體α分離最初的構(gòu)象狀態(tài)中的群體，僅有幾千卡的差異。如圖7所示，從一種構(gòu)象狀態(tài)轉(zhuǎn)化到另一種是由驅(qū)動力提供的，所述驅(qū)動力是由于探針分子和它天然締合物來形成β-片層復(fù)合物之間的締合Kd，或分子之間靜電相互作用中的變化(例如，由降低溶液的離子強(qiáng)度引起的變化)。如果涉及金屬離子例如Al或另一個配體的結(jié)合，其他的靜電或硬脂類的影響可以有貢獻(xiàn)。探針肽的大小可以變化，但應(yīng)當(dāng)足夠長以在檢測條件下具有“合理地”確定的二級結(jié)構(gòu)，以及具有對于選擇的靶例如朊病毒蛋白的足夠的識別特異性。探針肽也應(yīng)當(dāng)適應(yīng)單位點(diǎn)突變以一般性地適合突變的蛋白或株系，認(rèn)識到這些變化和/或異質(zhì)性影響分子的熱力學(xué)穩(wěn)定性。此外，探針對于患者群體必需是非傳染性的，無論所述群體是人類患者群體、馴養(yǎng)的動物群體，還是其他哺乳動物群體。
一旦確定了探針的肽序列(其相應(yīng)于對如上所述β-片層形成負(fù)責(zé)的靶蛋白的至少一部分)，可以用便于所述肽或探針的分析的部分或化學(xué)實(shí)體來末端封閉所述肽序列(在肽的一個、優(yōu)選的兩個末端)。優(yōu)選的，這個部分是熒光團(tuán)、例如芘，但根據(jù)分析所使用的分析技術(shù)可以廣泛地變化。所述部分或化學(xué)實(shí)體可以復(fù)合或共價結(jié)合在或接近所述肽的氨基或羧基末端，其優(yōu)選用短的、疏水性肽序列來末端封閉。在本發(fā)明的優(yōu)選的方面，探針肽的氨基和羧基末端都用大小從約1到約5個氨基酸的小疏水性肽來末端封閉。這些可以是天然的或合成的，但優(yōu)選的是中性的(即，來自靶蛋白的β-片層形成區(qū))。熒光基團(tuán)優(yōu)選附著在或接近探針的氨基和/或羧基末端(優(yōu)選的兩端)，并且可以是，例如，芘、色氨酸、熒光素、羅丹明，和許多其他的，優(yōu)選的是芘。優(yōu)選的是，當(dāng)處在正確的幾何取向中時，所述熒光基團(tuán)形成激發(fā)二聚體。
根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)象探針優(yōu)選是回文性質(zhì)的。術(shù)語回文是指給定構(gòu)象探針的序列排布使得它將含有相應(yīng)于對于β-片層形成負(fù)責(zé)的靶蛋白的一部分的第一和第二肽序列，但所述肽序列以回文方式存在，即，在第一肽序列中從羧基末端到氨基末端(或氨基末端到羧基末端)，和在第二肽序列中從氨基末端到羧基末端(或羧基末端到氨基末端)。在回文構(gòu)象探針中的第一和第二肽序列不必是長度上相同的，雖然這在某些實(shí)施方案中是優(yōu)選的，但應(yīng)當(dāng)至少大致相等(兩個肽序列(探針的“臂”)長度上應(yīng)不超過15、優(yōu)選的不超過10、再更優(yōu)選的不超過5個氨基酸)。優(yōu)選的，回文探針序列內(nèi)的第一和第二肽序列由接頭分隔，所述接頭包含1到5個氨基酸、優(yōu)選1到3個氨基酸，其優(yōu)選的含有至少一個脯氨酸氨基酸，更優(yōu)選的主要包含脯氨酸氨基酸。圖10呈現(xiàn)了本發(fā)明中有用的示例性的回文33-mer構(gòu)象探針。
優(yōu)選的，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)象探針含有疏水性氨基酸序列，其優(yōu)選的來自靶蛋白質(zhì)的相關(guān)肽序列(即，對β-片層形成負(fù)責(zé)的肽序列)，并且在長度上可以從1個氨基酸到20個或更多氨基酸中變化，優(yōu)選的長度約2-10個氨基酸，并出現(xiàn)在或接近所述構(gòu)象探針的兩個末端之一。對于回文構(gòu)象探針來說，這些疏水性氨基酸序列出現(xiàn)在探針的兩個肽臂的末端。任選的，探針也可以含有合成的疏水性氨基酸序列(即，對于與β-片層形成負(fù)責(zé)的靶蛋白的肽序列是非天然的)，其在所述探針的至少一個末端，或?qū)τ诨匚奶结榿碚f，在或接近探針的每個末端，其在長度上可以從少至一個氨基酸到20個或更多氨基酸的范圍中變化，優(yōu)選長度為約3-10個氨基酸。
舉例來說并且不限制地，如果靶蛋白中期望的肽序列含有從氨基末端到羧基末端的序列QRSTVVARLKAAAV(SEQ ID NO15)(其中AAAV(SEQID NO30)是疏水性氨基酸序列)，則回文結(jié)構(gòu)將含有第一肽序列VAAAKLRAVVTSRQ(SEQ ID NO31)和第二肽序列QRSTVVARLKAAAV(SEQ ID NO15)(或?qū)υ撔蛄械挠H密變異)，兩個序列由包含1到5個氨基酸的接頭分隔，這些氨基酸中的至少一個，如果不是所有的，優(yōu)選的大多數(shù)這些氨基酸是脯氨酸。因而探針將是VAAAKLRAVVTSRQPPPPQRSTVVARLKAAAV(SEQ ID NO28)(假想的的回文探針)。
優(yōu)選，回文探針將含有從靶蛋白的相關(guān)序列獲得的疏水性氨基酸序列?？梢匀菀椎孬@得根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)象探針。
以下規(guī)則可以用來指導(dǎo)根據(jù)本發(fā)明合適的優(yōu)選構(gòu)象探針的形成。這些規(guī)則一般性地應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)象探針而不是作為限制，但更具體地在上下文中使用來產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的回文構(gòu)象探針。
以下規(guī)則可以應(yīng)用于本發(fā)明來產(chǎn)生優(yōu)選的構(gòu)象肽探針1.肽回文結(jié)構(gòu)的每個“臂”應(yīng)具有最少五個、優(yōu)選的至少10-12個氨基酸，理想地，不超過約25個氨基酸。
2.從更大的蛋白的區(qū)域選出的氨基酸序列，已知所述蛋白經(jīng)歷從α-螺旋或隨機(jī)卷曲到β-片層的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。
3.一種或多種以下的其他指標(biāo)a)高比例的疏水性氨基酸--一般不低于約75％(基于氨基酸的數(shù)目)，理想地80％或更高，b)至少20個和優(yōu)選25個氨基酸的重復(fù)(例如存在于亨廷頓蛋白中)，c)相反信號的簇集電荷(clustered charges of opposite sign)(如Zhang，S.，Altman，M.and Rich，A.in Conformational Disease，A Compendium，Solomon，Taraboulos and Katchalski-Katzir，eds.The Center for the Study of EmergingDiseases，2001中描述的，d)每個肽臂之間的接頭序列，其具有1個或更多氨基酸、優(yōu)選低于五個并含有一個或多個脯氨酸殘基。
肽探針的測試標(biāo)準(zhǔn)1.回文結(jié)構(gòu)肽探針的構(gòu)象應(yīng)當(dāng)是α-螺旋或隨機(jī)卷曲而不是β-片層的。
2.肽構(gòu)象的測定理想地通過可以鑒定溶液構(gòu)象的CD測量來實(shí)現(xiàn)。在可以包括水性緩沖液和/或有機(jī)試劑，例如三氟乙醇的一種或多種溶劑中使用CD光譜計進(jìn)行這些--參見圖11。
應(yīng)用以上獲得的一般規(guī)則并使用本領(lǐng)域容易獲得的方法，普通技術(shù)人員可以產(chǎn)生具有在本發(fā)明中有用的有利特征的大量構(gòu)象肽探針。
當(dāng)旋光活性物質(zhì)稍微不同地吸收L和R手性圓偏振光時觀察到“循環(huán)二色性”(“CD”)，通過CD分光偏振計來測量。差異是非常小的，并呈現(xiàn)橢圓率中的冪的分式。圖11描繪了相關(guān)的CD曲線，表示蛋白和肽可以采取的三種不同的常見構(gòu)象形式。肽和蛋白中存在的不同種類的二級結(jié)構(gòu)的CD色譜是不同的。測量和比較復(fù)合的和未復(fù)合的蛋白的CD曲線是實(shí)踐本發(fā)明的精確的測量手段。
出人意料地，我們確定盡管如圖12中所示與14-mer結(jié)構(gòu)相似的兩個疏水鏈的接近性。在接近生理?xiàng)l件下，共價地連接兩個肽--對于人類回文探針來說為圖10中描繪的序列，而對于鼠探針來說為14-mer(SEQ ID NO3)和19-mer(SEQ ID NO2)--的回文結(jié)構(gòu)33-mer(SEQ ID NO1或29)，顯示大量隨機(jī)卷曲或α-螺旋構(gòu)象。在回文33-mer肽的每個末端添加芘容許構(gòu)象變化的光譜觀測，如圖13中所示的。對附著于單體(開放)構(gòu)象的33-mer的末端芘的光譜掃描產(chǎn)生了顯著不同的熒光光譜，其具有370nm和385nm之間的最大發(fā)射，而芘-標(biāo)記的肽的受激二聚物或激發(fā)二聚體(excimer)狀態(tài)具有的發(fā)射最大值在475nm和510nm之間。
雖然有可能通過幾種如上所述的光學(xué)方法跟蹤構(gòu)象變化，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案利用熒光光譜，因?yàn)樵摷夹g(shù)提供了操作的敏感性、快速性和簡單性。探針通過在兩個末端附著具有特定光學(xué)性質(zhì)的熒光團(tuán)來修飾。優(yōu)選的是，這些包括在用特定波長的光照射時發(fā)熒光的能力(由熒光團(tuán)本身的吸收和發(fā)射光譜來定義)。因此，優(yōu)選設(shè)計探針，使得用接近最大吸收波長的光線照射引起探針以足夠更高的波長發(fā)射光線從而與激發(fā)波長區(qū)分。測量這種照射和發(fā)射，以及這樣做的技術(shù)對本領(lǐng)域熟練人員是公知的。這些熒光基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于，芘、色氨酸、熒光素和羅丹明。還優(yōu)選的是，附著的熒光基團(tuán)當(dāng)處于正確的幾何取向中時具有形成激發(fā)二聚體的能力。
“激發(fā)二聚體”是一種加合物，其不一定是共價的并且是在以經(jīng)被光子激發(fā)的分子實(shí)體和相同的未激發(fā)分子實(shí)體之間形成的。所述加合物是性質(zhì)上短暫的，存在直到它通過光子的發(fā)射來發(fā)熒光。有可能通過在長于普通發(fā)射光譜的波長處新熒光條帶的產(chǎn)生來識別激發(fā)二聚體(或激發(fā)二聚體的形成)。激發(fā)二聚體不同于熒光共振能量傳遞，因?yàn)榧ぐl(fā)光譜與單體的是相同的。
激發(fā)二聚體的形成取決于熒光基團(tuán)的幾何對準(zhǔn)，并且受到它們之間距離的重大影響。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，熒光基團(tuán)存在于每個探針末端，只要總體探針構(gòu)象是α-螺旋或隨機(jī)卷曲，熒光基團(tuán)之間的激發(fā)二聚體形成即是可以忽略的。這可以通過在不存在要測量的靶蛋白的情況下在用于分析的溶劑中測量探針的熒光特性(behavior)來容易地確定。
在與被分析物目標(biāo)相互作用之后的優(yōu)選的構(gòu)象轉(zhuǎn)變通過在可以分析激發(fā)二聚體形成的條件下測量熒光光譜來實(shí)現(xiàn)。一般地，使用芘作為示例性的熒光團(tuán)，激發(fā)波長是約350納米，觀測波長365-600nm。將激發(fā)之后的單體芘的正常發(fā)射(單體熒光)記錄為在約370-385mm之間的最大波長。代表性數(shù)據(jù)在圖14中示出。
如圖14所示，在475-510nm的最大值處記錄激發(fā)二聚體或受激二聚物狀態(tài)。受激二聚物狀態(tài)的形成也可以通過添加高鹽和通過在接近肽的pI的pH下進(jìn)行測量來促進(jìn)(例如，在說明的實(shí)例中，約10的pH值)。
因此，在本發(fā)明的優(yōu)選的方法中，探針與要分析的特定蛋白的相互作用引起探針中的構(gòu)象變化從而出現(xiàn)激發(fā)二聚體形成。這可通過在此描述的步驟容易地測量。探針結(jié)構(gòu)從不存在被分析物時所顯示的情況(α-螺旋或隨機(jī)卷曲)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?片層結(jié)構(gòu)，使得附著于探針的熒光基團(tuán)形成可以容易地鑒定的激發(fā)二聚體。進(jìn)一步的，激發(fā)二聚體形成的數(shù)量與蛋白被分析物存在的數(shù)量直接相關(guān)。
可以在聚集的形式中、或存在其他細(xì)胞組分例如脂其他蛋白或碳水化物的情況下檢測蛋白質(zhì)或朊病毒。用于分析的樣品制備物優(yōu)選被均質(zhì)化或經(jīng)過相似的組織或聚集結(jié)構(gòu)破壞，優(yōu)選的通過離心除去細(xì)胞碎屑。理想地在存在緩沖鹽溶液的情況下進(jìn)行這種處理，并可以利用幾種洗滌劑諸如SDS、Triton X-100或肌氨酰之一。樣品的進(jìn)一步濃縮可以通過用幾種試劑的任一種處理來實(shí)現(xiàn)；一個優(yōu)選的試劑是磷鎢酸鹽，其根據(jù)Safar ct al.，Nature Medicine 41157-1165，1998的方法來使用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇肽探針用于向未知的或受試樣品添加。肽探針優(yōu)選的是具有主要的α-螺旋或隨機(jī)卷曲的二級結(jié)構(gòu)的蛋白或肽序列，但優(yōu)選而不是必須的是，其來自負(fù)責(zé)β-片層形成的靶肽的一部分。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，肽探針是由聚賴氨酸中發(fā)現(xiàn)的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)組成的肽片段。在另一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，肽探針由選自野生型TSE、期望的物種特異性TSE肽序列、或甚至已經(jīng)被突變而使其不穩(wěn)定且非感染性的選擇性突變型TSE序列。另外，外在的熒光團(tuán)，例如芘，可以被添加或設(shè)計到肽探針中，以容許使用普通的熒光檢測技術(shù)檢測預(yù)期的構(gòu)象變化。
一旦選擇了肽，將它添加到受試樣品。然而，在添加肽探針之前，優(yōu)選的是使樣品經(jīng)歷本領(lǐng)域公知的解聚集技術(shù)，例如超聲處理。解聚集步驟容許任何可能聚集的樣品材料分裂開，從而這些解聚集的樣品材料可自由地與新近引入的肽探針結(jié)合，由此便于預(yù)期的催化增殖。
在容許受試樣品或解聚集的受試樣品與肽探針相互作用之后，產(chǎn)生的混合物隨后經(jīng)歷本領(lǐng)域一般已知的分析方法用于聚集物的檢測，如果是使用熒光肽探針的情況則進(jìn)行熒光測量。含有任何異常折疊的或引發(fā)疾病的蛋白的特征性優(yōu)勢型β-片層形成的未知或受試樣品，導(dǎo)致在含有受試樣品和肽探針的最終混合物中的β-片層形成的增加和因此的聚集物形成。反之，缺乏任何優(yōu)勢型β-片層二級結(jié)構(gòu)的未知或受試樣品將既不能催化向β-片層結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化，也不能促進(jìn)聚集物的形成。
可以以許多方式觸發(fā)受試樣品中的初始構(gòu)象變化。不希望受任何理論的限制，金屬配體的結(jié)合可以指導(dǎo)蛋白構(gòu)象中的變化并有利于聚集。不同肽序列的表達(dá)或裂解可以促進(jìn)引起纖絲和斑塊形成的進(jìn)一步聚集。基因點(diǎn)突變也可以改變兩種不同構(gòu)象所需的相對能量水平，引起結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變中的中點(diǎn)偏移。此外，濃度水平的增加對于促成構(gòu)象轉(zhuǎn)變是足夠的。但是不管起初的觸發(fā)機(jī)制如何，許多異常蛋白構(gòu)象中的疾病過程(例如在朊病毒相關(guān)疾病中)，涉及異常構(gòu)象的催化增殖，引起早先正常的蛋白的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。
本發(fā)明中有用的光學(xué)檢測技術(shù)包括，但不限于，光散射、使用外在熒光染料例如1-苯胺基-8-萘磺酸鹽(ANS)或剛果紅染色的疏水性檢測，熒光共振能量傳遞(FRET)、通過單體的構(gòu)象變化或α-β雜二聚物中界面處的結(jié)合的內(nèi)在色氨酸熒光的淬滅、平衡超速離心、和大小排阻層折。
出人意料地確定的是，將本發(fā)明的肽探針固定在固相支持物例如聚苯乙烯平板上，可以將探針“鎖定”在特定的構(gòu)象(即，使探針維持優(yōu)勢型α-螺旋形式或優(yōu)勢型β-片層形式)。雖然將各種肽固定到各種固相支持物是本領(lǐng)域已知的，一般地，人們不能以合理的確信程度預(yù)測任何特定肽可以以滿意的效力固定。此外，人們不能以合理的確信程度預(yù)測肽一旦被固定化將具有期望的活性(例如，維持了它在溶液中顯示的活性)。實(shí)際上，本領(lǐng)域公知的是，肽的固定可以引起肽的變性，并因而引起其大部分(如果不是所有的)二級結(jié)構(gòu)的破壞。因此，公知的是僅能通過小心的條件選擇，且常常通過嘗試-錯誤的實(shí)驗(yàn)，人們可以鑒定用于固定特定肽的適當(dāng)條件，但預(yù)測將成功地固定給定的肽并保持肽的二級結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性的條件一般是不可能的。本發(fā)明公開了出乎意料的結(jié)果，根據(jù)本發(fā)明的探針，如以上討論的其享有共同的結(jié)構(gòu)特征，不僅能以足夠的效力固定在固相支持物上，一但被固定化了還可以保持它們的活性。此外，本發(fā)明公開了以特定構(gòu)象(例如，β-片層或α-螺旋)固定的探針可以保持與該構(gòu)象相關(guān)的活性，即使所述探針暴露于在溶液中時將改變它們的構(gòu)象的條件下也如此。因此，本發(fā)明針對并解決了現(xiàn)有技術(shù)面臨的難題如何提供特異性結(jié)合感興趣的朊病毒蛋白的固定化探針或探針組。
本發(fā)明的探針可以通過固定被“鎖定”到特定構(gòu)象、并且該構(gòu)象在結(jié)合朊病毒蛋白方面是有活性的，這種發(fā)現(xiàn)允許人們實(shí)踐本發(fā)明從而在許多應(yīng)用中使用本發(fā)明的探針。例如，人們可以使用固定化到珠子上的探針來快速和有效地檢測樣品中朊病毒蛋白的存在(例如，通過使用固定的α-螺旋探針)，或來優(yōu)選檢測樣品中的感染性朊病毒蛋白(例如，通過使用固定的β-片層探針)。人們也可以使用固定的探針來結(jié)合樣品中出現(xiàn)的某些、基本上所有的、或所有的朊病毒蛋白，并從樣品的其余部分分離朊病毒蛋白，來提供具有較少朊病毒蛋白、基本上沒有朊病毒、或完全沒有朊病毒的純凈的樣品。這些技術(shù)對于保健領(lǐng)域、特別是涉及血液制品的生產(chǎn)和使用的那些方面具有意義。例如，可以使用這個發(fā)明不僅來檢測血液或血液制品樣品中朊病毒的存在，還來降低血液或血液制品樣品中朊病毒的數(shù)量，或完全地消除朊病毒。
因此，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，提供了固定本發(fā)明的探針的方法。所述方法一般包括提供本發(fā)明的探針，其可以包括產(chǎn)生包含處在期望構(gòu)象中的探針的組合物；提供固相支持物，使所述探針暴露于所述固相支持物足夠長的時間以允許探針固定到所述固相支持物，并除去組合物中存在的未結(jié)合的探針和其他物質(zhì)。所述方法可以進(jìn)一步包括將探針與固相支持物交聯(lián)，洗滌所述結(jié)合的探針來除去未結(jié)合的探針或其他物質(zhì)，干燥所述固相支持物和探針，或已知用于產(chǎn)生蛋白-固相支持物組合的其他步驟。當(dāng)然，在使探針結(jié)合于固相支持物之前，探針可暴露于錯折疊的蛋白，諸如錯折疊的朊病毒蛋白(PrPSc)足夠量的時間以使得探針成為以β片層為主的構(gòu)象并結(jié)合于錯折疊的蛋白。探針-錯折疊的蛋白復(fù)合物與固相支持物的結(jié)合隨后可照常繼續(xù)。在所述情況下，探針-錯折疊的蛋白復(fù)合物可通過以下方式結(jié)合于固相支持物直接結(jié)合、經(jīng)由探針結(jié)合，或經(jīng)由錯折疊的蛋白與可結(jié)合于固相支持物的另一探針(本發(fā)明的探針或其它探針，諸如本領(lǐng)域已知的)的結(jié)合而間接地結(jié)合。
在產(chǎn)生包含處在期望構(gòu)象中的探針的組合物中，人們可以使用不同的pH或鹽組合來影響本發(fā)明的探針的構(gòu)象。如以上討論的，本發(fā)明的探針的構(gòu)象可以通過調(diào)節(jié)探針?biāo)幦芤旱柠}濃度、pH值、或兩者來改變。一般地，接近每個探針的pI的條件使得探針采取以β-片層為主的構(gòu)象。同樣地，酸性(例如，低于約5.0的pH值)或堿性(例如，超過約9.0的pH值)的條件使得探針采取以β-片層為主的構(gòu)象。相比之下，中性的(例如，約5.0和約9.0之間的pH值)條件使得探針采取主要α-螺旋結(jié)構(gòu)。一般地，低鹽濃度(例如，低于100mM鹽)使得探針采取α-螺旋構(gòu)象，而高鹽濃度(例如，500mM)鹽使得探針采取β-片層構(gòu)象。技術(shù)人員可以選擇合適的pH值和鹽濃度組合來獲得期望構(gòu)象的探針而不需過度的實(shí)驗(yàn)。
固相支持物可以是適合于結(jié)合肽以及與生物材料使用的任何已知的固體物質(zhì)。許多這種固相支持物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。作為固相支持物有用的材料的實(shí)例包括，但不限于，塑料，包括聚苯乙烯，玻璃，多聚糖，金屬和各種聚合物，包括膠乳、丙烯酸類和尼龍。固相支持物的形式的實(shí)例包括但不限于，平板、珠子和膜。對固相支持物的許多種修飾是已知的，其可增強(qiáng)肽與它們的結(jié)合，所有這些修飾和修飾的固相支持物包括在本發(fā)明中。
探針暴露于固相支持物的時間將取決于使用的固相支持物種類、提供的探針數(shù)量和人們可以選擇的其他變量而變化。一般地，時間長度將是一般地用于將肽結(jié)合到固相支持物的長度，并且一般地基于所述固相支持物和由固相支持物生產(chǎn)廠家提供的建議。因此，時間的長度可以短至一分鐘，或長至一周。一般地，暴露將包括約一小時到約72小時，例如約2小時、約3小時、約14小時、約16小時、約24小時或約48小時?？梢栽跍y試運(yùn)行中監(jiān)視結(jié)合效力，來鑒定最佳結(jié)合時間和條件。
除去組合物中存在的未結(jié)合的探針和其他物質(zhì)可以通過任何已知的合適技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。一般地，這包括從結(jié)合組合物除去結(jié)合固相支持物的肽組合物，或從固相支持物-肽組合物除去結(jié)合組合物。因而，可以通過將組合物從容器中倒出來實(shí)現(xiàn)去除，在所述容器中組合物與固相支持物相互暴露。同樣地可以通過吸取、吸出、虹吸、排水等等來實(shí)現(xiàn)。在具體實(shí)施方案中，通過允許組合物蒸發(fā)來實(shí)現(xiàn)去除。
所述方法可以進(jìn)一步包括已知在產(chǎn)生固相支持物結(jié)合的肽組合物中有用的其他步驟。如本領(lǐng)域已知的，對于肽的結(jié)合可用的許多固相支持物具有設(shè)計成可通過探針與固相支持物的表面上反應(yīng)基團(tuán)的交聯(lián)來共價結(jié)合肽的表面。這種交聯(lián)可以以許多方式實(shí)現(xiàn)，包括用紫外光照射、用熱度或化學(xué)物質(zhì)處理，或干燥。任何適合的固相支持物和技術(shù)包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
其他額外的步驟可以包括洗滌結(jié)合的探針來除去組合物中存在的未結(jié)合的探針或其他物質(zhì)，干燥所述固相支持物和探針，或已知用于產(chǎn)生蛋白-固相支持物組合的其他步驟。人們可以在各種額外的處理和處理組合之中選擇來適應(yīng)特定的需求。
所述固定化的探針具有許多用途。一般地，固定化的探針被用來結(jié)合樣品中的朊病毒蛋白。結(jié)合可以用于許多目的，例如檢測樣品中朊病毒蛋白的存在，或結(jié)合樣品中的朊病毒蛋白并除去它們。檢測樣品中的朊病毒蛋白可以用于篩選產(chǎn)品例如食物產(chǎn)品或醫(yī)藥產(chǎn)品(例如血液制品)的朊病毒蛋白污染的方法中，包括感染性朊病毒蛋白例如PrPSc。從樣品中除去朊病毒蛋白可以用于從產(chǎn)品，例如食物產(chǎn)品或醫(yī)藥產(chǎn)品(例如，血液制品)降低或消除朊病毒蛋白的方法，其可以改善產(chǎn)品對于人類或動物使用的安全性。
一般地，使用固定化的探針篩選的方法包括提供固定化的探針，提供含有或懷疑含有朊病毒蛋白的樣品，在一定條件下使所述樣品暴露于所述固定化的探針持續(xù)足夠長的時間使得所述固定化的探針結(jié)合樣品中的朊病毒蛋白(如果存在的話)，并檢測與所述固定化的探針結(jié)合的朊病毒蛋白的存在。檢測可以通過任何已知技術(shù)，諸如上文討論和詳述的那些來進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，檢測包括分析來自標(biāo)記的光線發(fā)射，例如通過熒光或發(fā)光。在其他實(shí)施方案中，檢測是通過凝膠中存在的蛋白質(zhì)的PAGE和染色。在其他的實(shí)施方案中，檢測是通過與特異于感興趣的朊病毒蛋白的抗體反應(yīng)來進(jìn)行的。以上給出了檢測技術(shù)的其他非限制性實(shí)施例。
將樣品暴露于固定化的探針進(jìn)行足夠長度的時間，并在允許朊病蛋白(如果在樣品中存在)與固定化的探針結(jié)合的條件下。蛋白與其他蛋白結(jié)合的適合條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可以使用任何適合的條件。在以下的實(shí)施例中詳述了示例性的條件。一般地，適合的條件包括水性環(huán)境、中性pH(例如，從約6.0到約8.0的pH)、適量的鹽(例如，從約100mM到約400mM鹽)、和很少或沒有洗滌劑、乳化劑或其他可能抑制蛋白-蛋白相互作用的輔助物質(zhì)。使用的固定化的探針和樣品的數(shù)量將取決于可用的樣品數(shù)量、懷疑在樣品中存在的朊病毒蛋白的數(shù)量、使用者希望將樣品暴露于固定化的探針的時間長度，和其他考慮。固定化的探針和樣品的數(shù)量一般地將與當(dāng)使用非固定化探針時使用的量相同，如上所述。在一些實(shí)施方案中，樣品含有或懷疑含有感染性的或引起疾病的朊病毒蛋白，例如PrPSc。
一般地，降低樣品中朊病毒蛋白的方法包括提供固定化的探針、提供含有或懷疑含有朊病毒蛋白的樣品、在一定條件下使所述樣品暴露于所述固定化的探針持續(xù)足夠長的時間使得所述固定化的探針結(jié)合樣品中的至少一些朊病毒蛋白(如果存在的話)，并從所述樣品分離固定化的探針和固定化的探針-朊病毒蛋白復(fù)合物。在實(shí)施方案中，所述方法降低樣品中朊病毒蛋白質(zhì)的數(shù)量達(dá)到可檢測的量。在實(shí)施方案中，所述方法降低樣品中朊病毒蛋白的數(shù)量達(dá)到低于檢測限度的量。在實(shí)施方案中，所述方法完全地從樣品中消除朊病毒蛋白。在實(shí)施方案中，樣品含有或懷疑含有感染性的或引起疾病的朊病毒蛋白，例如PrPSc。
在降低樣品中朊病毒蛋白的方法中，固定化的探針和樣品可以與檢測朊病毒蛋白的方法中討論的那些相同，可以以與以上所討論的相同的數(shù)量和形式來提供。從樣品分離固定化的探針和固定化的探針-朊病毒蛋白復(fù)合物可以通過任何適合的技術(shù)，例如通過倒出樣品，通過從樣品物理除去固定化的探針和復(fù)合物來進(jìn)行。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解從水性溶液除去珠子、膜和其他固相支持物的許多方法，那些方法的任一種可以用于從樣品分離固定化的探針和固定化的復(fù)合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，固定化的探針是與膜結(jié)合的探針，所述膜對于血液或血液制品例如血漿是可透過的，所述樣品是血液或血液產(chǎn)品例如血漿，所述血液或血液產(chǎn)品通過濾過所述結(jié)合探針的膜來消除在所述血液或血液產(chǎn)品中的一些或全部朊病毒蛋白。使樣品的最后部分(the last ofthe sample)通過膜引起與探針結(jié)合的膜與樣品的分離。在已經(jīng)過濾了血液或血液產(chǎn)品之后，可以分析與探針結(jié)合的膜來確定朊病毒蛋白質(zhì)的存在。
根據(jù)上述公開明顯的是，在實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括檢測與固定化的探針結(jié)合的朊病毒蛋白的存在。檢測可以通過任何已知技術(shù)，如上文討論和詳述的那些。同樣地，各種額外的步驟可以包括到方法中，只要那些步驟不會使得所述方法不能除去樣品中存在的一些或所有朊病毒蛋白即可。
在本發(fā)明的任何方法中，可以利用對照物(陽性、陰性、或兩者)來驗(yàn)證分析。陽性對照一般包括用已知包含至少一種朊病毒蛋白(一般是具體的、已知的類型)的樣品進(jìn)行所述方法，并可以用來確認(rèn)所述方法能夠檢測該蛋白和/或?qū)υ撎囟ǖ牡鞍滋禺?。一般地，陽性對照包括其中一般以已知的?shù)量有意地添加了已知的朊病毒蛋白的樣品(在該方法的任何階段)。陰性對照一般包括用已知不含任何朊病毒蛋白的樣品進(jìn)行所述方法，并可以用于確認(rèn)所述方法不提供系統(tǒng)性的假陽性結(jié)果?？梢栽谒龇椒ㄖ械囊粋€或多個特定階段運(yùn)行其他對照來證實(shí)那些階段如所期待的那樣起作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員很好地知道適合的對照物，并可以設(shè)計和利用它們而不需過度的實(shí)驗(yàn)。
如在以下實(shí)施例中詳細(xì)討論的，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其構(gòu)象以β-片層為主的固定化的本發(fā)明探針對于朊病毒蛋白的引起疾病的形式是特異的(例如，PrPSc)。因此，探針的固定可用于設(shè)計和實(shí)現(xiàn)特異性檢測引起疾病的朊病毒蛋白的方法，和降低或消除引起疾病的朊病毒蛋白的方法。這與其他可用的方法相比是有益的，因?yàn)樗试S特異性檢測朊病毒蛋白的子集合而不需要昂貴的和耗時的抗體應(yīng)用。
因此，在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從樣品降低或消除PrPSc的方法。所述方法包括提供包含構(gòu)象以β-片層為主的固定化的探針、在一定條件下用含有或懷疑含有PrPSc的樣品接觸所述固定化的探針并持續(xù)足夠長的時間，使所述固定化的探針與樣品中至少一些PrPSc結(jié)合，并從樣品分離探針/PrPSc復(fù)合物。在實(shí)施方案中，所述樣品是生物樣品，例如血液或血漿。
考慮到以上討論的方法，顯然的是，本發(fā)明提供試劑盒，所述試劑盒以包裝的組合形式包含具有特定構(gòu)象的至少一種固定化的探針。更具體地，因?yàn)楣潭梢援a(chǎn)生包含處于特定構(gòu)象的探針的固相支持物，所述探針在隨后暴露于各種環(huán)境條件期間保持了該構(gòu)象，本發(fā)明可以提供含有這種固定化的探針的試劑盒。如在此討論的，固定化的探針可用于特異性結(jié)合所選的朊病毒蛋白，并因而可用于檢測樣品中的具體朊病毒蛋白，或可用于從樣品除去具體的朊病毒蛋白?！鞍b的組合(packaged combination)”是指所述試劑盒提供單獨(dú)的包裝，其含有一種或多種成分，例如固定化的探針、緩沖液、說明書等待的組合。雖然含有單個容器的試劑盒一般不被認(rèn)為具有多種元件的組合，對于本發(fā)明來說，這種結(jié)果也包括在“包裝的組合”的定義之內(nèi)。
一般地，本發(fā)明的這個方面的試劑盒包括一些或全部固定化的探針和實(shí)踐本發(fā)明的方法必需的其他供應(yīng)品和試劑。因此，它們一般包括在至少一個容器中的至少一種固定化的探針。在某些實(shí)施方案中，單個探針(包括相同探針的多個拷貝)被固定在單獨(dú)的固相支持物上并在單獨(dú)的容器中提供。在其他實(shí)施方案中，在單個容器中提供兩種或多種探針，各自特異于不同的朊病毒蛋白或不同形式的單個朊病毒蛋白。在實(shí)施方案中，在多個不同的容器中提供相同的固定化的探針(例如，以單用途形式)，或在多個不同容器中提供多種固定化的探針。在實(shí)施方案中，探針被固定在多種不同類型的固相支持物上。固定化的探針和容器的任何組合是本發(fā)明涉及的，實(shí)踐者可自由地在這些組合中選擇以得到對于期望的用途適合的試劑盒。
試劑盒的容器可以是適合于包裝和/或包含本發(fā)明的固定化的探針的任何容器。適合的材料包括，但不限于，玻璃、塑料、紙板或其他紙制品，和金屬。容器可以完全地包住固定化的探針，或可以簡單地覆蓋所述探針，從而最小化由塵屑、油等的污染。試劑盒可以包括單個容器或多個容器，其中存在多個容器時，每個容器可以與所有其他容器相同、或不同于其他的、或不同于某些但不是所有的其他容器。
試劑盒本身可以由任何適合的材料制成。試劑盒材料的非限制性實(shí)例包括，但不限于紙板或其他紙制品、塑料、玻璃和金屬。紙板試劑盒是優(yōu)選的。
試劑盒可以包含固定一種或多種探針到固相支持物所需的一些或所有試劑和供應(yīng)品，或結(jié)合固定化的探針到樣品中的朊病毒蛋白所需的一些或所有試劑和供應(yīng)品。
當(dāng)然，本發(fā)明的試劑盒可以包含一種或多種非固定化的探針和一種或多種含有或不含有固定化的探針的固相支持物。這種試劑盒優(yōu)選的包含固定一種或多種探針到固相支持物所需的一些或所有試劑和供應(yīng)品，或結(jié)合固定化的探針到樣品中的朊病毒蛋白所需的一些或所有試劑和供應(yīng)品。
本發(fā)明使用增殖的(propagated)構(gòu)象變化來將異常蛋白質(zhì)或朊病毒的水平直接與感染性水平相關(guān)。為此，優(yōu)選的是以一定方式使用本發(fā)明的方法，其中作為增殖的結(jié)果感染性的產(chǎn)物沒有增加。這可以通過在異常形式的感染、傳播和增殖之間的鏈接中放置“間斷(break)”來實(shí)現(xiàn)。這種間斷必需在聚集物的二聚體和多聚體形成之間的轉(zhuǎn)變階段發(fā)生。多聚體形式的物理形成可以簡單地通過阻止導(dǎo)致它形成的步驟來阻斷。這可以通過使用其中感興趣的序列被附著到非相關(guān)肽的探針或通過中性的“阻斷劑”片段來實(shí)現(xiàn)，應(yīng)理解的是接頭或“系繩(tether)”上的探針很可能相互遭遇(encounter)并因而引起所述信號的擴(kuò)增。
實(shí)施例通過以下實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，其是為了純粹地示范本發(fā)明，無論如何不應(yīng)被看作是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1材料和方法如下通過使用本發(fā)明可以獲得用于測試和診斷的樣品。樣品可以通過在玻璃勻漿器中勻漿或在存在液氮的情況下通過研缽和研棒來從組織(例如，碎肉的一部分、或通過活組織檢查過程獲得的一定量組織)獲得。材料的數(shù)量應(yīng)在約1mg到1gm之間，優(yōu)選的10mg到250mg之間，例如20mg到100mg之間。要采樣的材料可以懸浮在適合的溶劑中，優(yōu)選的pH值7.0和7.8之間的磷酸鹽緩沖鹽水。添加RNase抑制物是可選擇的和優(yōu)選的。溶劑可以含有洗滌劑(Triton X-100、SDS或肌氨酰)。在一定數(shù)量的勻漿器移動(excursion)下進(jìn)行勻漿，優(yōu)選的10到25次沖擊之間、例如15到20次沖擊之間。懸浮的樣品優(yōu)選的在100到1,000×g之間離心5-10分鐘，采樣上清材料用于分析。在某些樣品中，根據(jù)由Safar et al.，Nature Medicine41157-1165，1998說明的和由Wadsworth，The Lancet 358171-180，2001修改的步驟，優(yōu)選的用其他試劑處理上清材料，例如磷鎢酸。
要測試的樣品的數(shù)量是根據(jù)對上清溶液的蛋白質(zhì)含量的測定，這由Bradford(Anal.Biochem.72248-254，1976)描述的步驟來測量。用于測定微克量的蛋白的快速和敏感的方法利用了蛋白-染料結(jié)合的原理。優(yōu)選的，要測試的樣品中蛋白的數(shù)量在約0.5mg和2mg蛋白之間。
對于組織材料除了如上所述的步驟之外，可以從血清、可能含有動物來源的產(chǎn)品的藥物制劑、脊液、唾液、尿或其他體液獲得受試樣品?？梢灾苯訙y試液體樣品，或可以通過如上所述的試劑例如磷鎢酸的處理。
含有TSE的樣品可以根據(jù)本發(fā)明如下分析。參考附圖2，示意圖的頂部行說明了表示為含有β-片層的TSE蛋白的未知樣品。通過超聲處理使得β-片層解聚集。添加標(biāo)記的肽探針，并容許與樣品結(jié)合。樣品中的β-片層構(gòu)象誘導(dǎo)肽探針形成β-片層構(gòu)象。在肽探針中的β-片層增殖形成了聚集物。作為結(jié)果的向以β片層為主的形式的變換以及擴(kuò)增的聚集物的形成通過例如光散射和CD的技術(shù)來檢測。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，肽探針是熒光標(biāo)記的，并且使用熒光檢測。
附圖2的底端行顯示了選擇性的實(shí)施例，其中TSE蛋白的未知樣品以它的正常α-螺旋形式存在。為了一致，樣品經(jīng)歷如上所述相同的解聚集過程。在添加標(biāo)記的肽探針時，既不發(fā)生向β-片層形式的轉(zhuǎn)化也不與未知樣品的結(jié)合。結(jié)果，在標(biāo)記的肽探針的情況下沒有聚集物熒光信號，并且通過其他分析工具沒有檢測到聚集物形成。根據(jù)這個示意圖，可以測試未知樣品的這種異常蛋白構(gòu)象或序列的存在或缺乏。
實(shí)施例2聚賴氨酸被用作模型肽。使用模型系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來說明在從以α-螺旋為主轉(zhuǎn)化成富含β-片層的形式中涉及的構(gòu)象變化。選擇的模型系統(tǒng)使用非神經(jīng)毒性聚氨基酸聚賴氨酸。由于利用率和安全性而選擇聚氨基酸。它在5到9之間的pH值通常表現(xiàn)為隨機(jī)卷曲構(gòu)象。
附圖3描繪了其中聚L-賴氨酸(20μM；52,000MW)被用作肽模型的實(shí)驗(yàn)的CD圖。
在附圖3中也說明了維持在pH7和25℃的樣品24顯示約204nm的最小值，指示隨機(jī)卷曲結(jié)構(gòu)。維持在pH11(接近等電點(diǎn))和50℃的樣品26，顯示大約216nm的最小值，指示β-片層結(jié)構(gòu)(對于蛋白構(gòu)象的示范性的CD色譜參見附圖11)。樣品28是維持在pH7和25℃和維持在pH11和50℃的樣品的1∶1組合物，其顯示大約216nm的最小值，指示β-片層結(jié)構(gòu)。樣品30是維持在pH7和50℃和維持在pH11和50℃的樣品的1∶1組合物，顯示大約216 nm的最小值，指示β-片層結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例3附圖4說明了進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的一般CD結(jié)果(1)使用聚L-賴氨酸；和(2)在變化的溫度和pH值，來觀察在變化的環(huán)境條件下隨機(jī)卷曲到β-片層的構(gòu)象改變的影響。結(jié)果表明溫度和pH值都在變換中起到重要作用。結(jié)果還表明添加相對小量的β-片層肽到隨機(jī)卷曲樣品中可以引起向富含β-片層構(gòu)象的偏移，并根據(jù)樣品的溫度和pH值環(huán)境，這種變化可以加速。
更具體地，附圖4說明了在70μM使用52,000MW的聚L-賴氨酸作為根據(jù)實(shí)施例1-3中描述的實(shí)驗(yàn)技術(shù)的肽探針產(chǎn)生的吸光度圖。附圖4說明了以下內(nèi)容。樣品32(pH11，25℃)顯示大約0.12的平臺，表明以α-螺旋為主的結(jié)構(gòu)。樣品34(維持在pH 7，50℃)顯示大約0.22的平臺，其表明主要為隨機(jī)卷曲結(jié)構(gòu)。樣品36(維持在pH7，50℃和pH11，50℃的樣品的10∶1組合物)顯示從大約0.22到0.33的陡峭傾斜，表明從隨機(jī)卷曲到β-片層結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)換加速。樣品38(維持在pH7，25溫度和在pH11，50℃的樣品的10∶1組合物)顯示從大約0.22到0.26的逐漸傾斜，表明從隨機(jī)卷曲到β-片層結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)換。附圖5以表格形式描繪了這些數(shù)據(jù)。
根據(jù)如上所述所有實(shí)驗(yàn)的觀察顯示，添加相對小量的β-片層肽到隨機(jī)卷曲樣品中可以引起向富含β-片層的構(gòu)象的偏移，且根據(jù)樣品的溫度和pH值環(huán)境，這種變化可以加速。
實(shí)施例4產(chǎn)生附圖1 5中說明的結(jié)果的實(shí)驗(yàn)涉及單獨(dú)使用33-mer靶肽，其是VVAGAAAAGAVHKLNTKPKLKHVAG AAAAGAVV(鼠)或者VVAGAAAAGAMHKMNTKPKMKHMAG AAAAGAVV(人類)(SEQ ID NO1)，和通過激發(fā)二聚體形成的觀測的探針肽締合。
我們比較了我們使用CD(其中肽是未標(biāo)記的)和光譜熒光計研究(使用芘標(biāo)記的肽)觀察的結(jié)果。沒有使用組織勻漿。詳細(xì)研究了導(dǎo)致附圖15中所示結(jié)果的實(shí)驗(yàn)，以了解什么觸發(fā)了33-mer目標(biāo)肽(SEQ ID NO1或29)來從以單體為主變化為二聚(受激物)的構(gòu)象并變成聚集型。發(fā)現(xiàn)了促使33-mer標(biāo)記的肽在μM范圍中締合的條件。
篩選33-mer靶肽的靜電相互作用并從而最小化它的溶解度(p1＝10)的條件在極低的肽濃度(10μM)下觸發(fā)了肽的自我締合。由于在肽末端芘熒光團(tuán)，這種自我締合在二聚體或激發(fā)二聚體的形成和熒光的伴隨性遠(yuǎn)紅外移動中是明顯的。舉例來說，附圖15的曲線1代表pH6-8、KCl(100-500μM)其中主要的肽構(gòu)象體是單體的條件。附圖15的曲線2代表pH值10-11，KCl(100-500μM)的條件，其中在極低濃度的肽時，我們觀察到強(qiáng)烈的激發(fā)二聚體形成(單體的聚集)。
實(shí)施例5產(chǎn)生附圖16所示結(jié)果的實(shí)驗(yàn)涉及使用各種單獨(dú)的肽，和33-mer探針(包含19-mer和14-mer)靶肽(SEQ ID NO1、19、2或3)
(SEQ ID NO29)VVAGAAAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAAAAGAVV(鼠)(SEQ ID NO1)VVAGAAAAGAMHKMNTKPKMKHMAGAAAAGAVV(人類)。
改變分析條件來觀察由CD監(jiān)測的對構(gòu)象的影響。目標(biāo)是確定什么熱力學(xué)條件引起從單體的隨機(jī)卷曲到聚集的β-片層的一步轉(zhuǎn)換，并避免可能是肽的膠束形成的相關(guān)“X”狀態(tài)。
在產(chǎn)生附圖16所示結(jié)果的實(shí)驗(yàn)中，使用特定波長(204nm)來通過CD監(jiān)測肽締合以獲得在溶劑條件的范圍和跨越大范圍的肽濃度的詳細(xì)構(gòu)象信息(肽濃度以log標(biāo)度存在，也參見CD的標(biāo)準(zhǔn)圖表--附圖11)。
從目標(biāo)肽獲得的相關(guān)曲線(θ205)分別顯示了50μM和3mM范圍的兩種構(gòu)象轉(zhuǎn)變，從卷曲通過“X”狀態(tài)并變成β-片層。
參考附圖16，對于高于50％的溶劑條件(遠(yuǎn)處左側(cè)短劃線)，33-mer靶肽(SEQ ID NO1和29)(SEQ ID NO29)VVAGAAAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAAAAGAVV(鼠)(SEQ ID NO1)VVAGAAAAGAMHKMNTKPKMKHMAGAAAAGAVV(人類)在3μM從卷曲狀態(tài)轉(zhuǎn)換到β-片層狀態(tài)，雖然組分19-mer或14-mer能夠轉(zhuǎn)換，但在幾乎高10倍的肽濃度(中線)發(fā)生。在水性條件下(粗線)，沒有肽能夠自我締合成β-片層結(jié)構(gòu)。
33-mer回文肽靶肽(SEQ ID NO1和29)在50％溶劑(乙腈或三氟乙醇(TFE))條件下在極低濃度(即，1μM)顯示獨(dú)特的性質(zhì)，因?yàn)樗苊饬恕八滥┒恕毕嚓P(guān)的狀態(tài)(如在水性條件下由平臺化效應(yīng)(plateauing effect)顯示的)。
附圖16顯示了溶劑和溫度中的變化不顯著地影響靶肽的相關(guān)行為，并且所有的肽遵循相同的曲線，表明序列特異性在這種分子組裝中不是重要的特征。
實(shí)施例6產(chǎn)生附圖17所示結(jié)果的實(shí)驗(yàn)如下進(jìn)行將一克癢病感染的(毒株293)倉鼠腦材料在無菌磷酸鹽緩沖鹽水中在液氮中均質(zhì)化。在無菌PBS中進(jìn)行十倍連續(xù)稀釋。通過毛細(xì)管電泳抗體捕獲來測量腦組織勻漿中蛋白酶抗性朊病毒蛋白(PrPSc)的濃度。將等價于10ng蛋白酶抗性朊病毒蛋白(PrPSc)的腦組織勻漿在50％TFE中與1.5μM33-mer目標(biāo)肽混合，在室溫下保溫1小時，隨后在雙比色計熒光分光光度計中在350 nm處激發(fā)，記錄350到600nm的發(fā)射，在5小時和24小時重復(fù)激發(fā)和發(fā)射掃描。使用單獨(dú)的33-mer肽作為對照。
添加傳染性的朊病毒蛋白引起33-mer目標(biāo)肽的熒光顯著增加，通過CD數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)其在50％Tris50％TFE的條件下接近β-片層構(gòu)象。這種熒光的增加指示了33-mer聚集物的形成。發(fā)現(xiàn)33-mer聚集物是不穩(wěn)定的，并隨時間不可逆地離解。
根據(jù)復(fù)合物相對于肽的熒光發(fā)射隨時間的變化說明了復(fù)合物隨時間解離，而肽熒光保持穩(wěn)定，如通過在兩個不同的波長377nm(三角形)和475納米(正方形)進(jìn)行監(jiān)測所測定的。
實(shí)施例7產(chǎn)生附圖18所示結(jié)果的實(shí)驗(yàn)如下進(jìn)行 將一克癢病感染的和健康的倉鼠腦、綿羊腦和麋鹿腦在無菌磷酸鹽緩沖鹽水中在液氮中均質(zhì)化。在無菌PBS中進(jìn)行十倍連續(xù)稀釋。通過毛細(xì)管電泳抗體捕獲來測定腦組織勻漿中蛋白酶抗性朊病毒蛋白(PrPSc)的濃度。感染和健康的腦組織勻漿與0.52μM 33-mer目標(biāo)肽在50％TFE50％Tris中混合，在室溫保溫1小時，之后在雙比色計熒光分光光度計中在350nm激發(fā)，記錄350到600nm的發(fā)射。在50％TFE50％Tris中單獨(dú)的33-mer肽用作另外的對照。
在Tris∶TFE(1∶1)溶劑中存在感染的腦組織勻漿(圖，線1)、健康腦組織勻漿(圖，線2)和單獨(dú)的肽(圖表，線3)的情況下目標(biāo)肽的熒光光譜(520nM)在附圖18中示出。數(shù)據(jù)來自倉鼠(圖A；270pg/ml)、綿羊(圖B；60pg/ml)和麋鹿(圖C；6pg/ml)的0.01％腦組織勻漿。
實(shí)施例8將本發(fā)明的探針固定在聚苯乙烯平板上來確定是否可以固定特定的探針并確定對不同朊病毒蛋白的特異性。出人意料地發(fā)現(xiàn)，不僅探針可以被固定化，而且固定化的探針保持了它們與朊病毒結(jié)合的能力，和它們對特定朊病毒蛋白的特異性。
從早先的實(shí)驗(yàn)已知(上文討論的)，本發(fā)明的探針(例如，對人類或鼠朊病毒蛋白特異的33-mer探針)將取決于它們存在的環(huán)境例如不同的pH值、溫度、離子強(qiáng)度而采取不同的構(gòu)象。因而，提出不同的構(gòu)象體將顯示不同的結(jié)合特異性。為了研究這一點(diǎn)，進(jìn)行嘗試來固定具有不同構(gòu)象的探針，并使用這些固定的探針來測試對每種構(gòu)象的特異性。
為了獲得α-構(gòu)象體，將33-mer目標(biāo)肽在存在1％SDS的情況下溶于中性的(pH約7.0)磷酸鹽緩沖鹽水。為了獲得β-構(gòu)象體，將肽溶于酸性(pH約4.5到約5.0)檸檬酸鹽緩沖液(50mM)。肽溶液在聚苯乙烯平板上保溫過夜(～16小時)直到特定的構(gòu)象體被固定在固體表面上。令人驚訝地，不僅肽以活性形式固定在平板上(即，能與朊病毒蛋白結(jié)合)，它們還保持了它們特定的構(gòu)象，因而即使被固定時也維持了它們的特異性。更令人驚訝的，即使當(dāng)后來改變緩沖條件時，固定化的33-mer維持了它們的特定構(gòu)象。也就是說，即使探針暴露的條件被改變成有利于α-螺旋構(gòu)象的形成，被設(shè)計并在引起以β片層為主的探針構(gòu)象條件下固定的探針，在固定后也維持了該構(gòu)象。
附圖20圖示α-螺旋33-mer探針和β-片層33-mer探針的獨(dú)立固定的組合結(jié)果。探針用芘標(biāo)記并在如上所述條件下獨(dú)立地固定在兩個不同平板上。在除去特異性緩沖液之后，用磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.0)重新保溫固定化的肽，對固定有α-或β-構(gòu)象體的平板進(jìn)行熒光光譜分析。在α-構(gòu)象體形成條件(PBS，pH 7.0，1％SDS)下，沒有約500nm的峰值(點(diǎn)線)，而在β-構(gòu)象體形成條件下，固定化的33-mer肽顯示了約500nm的峰值(實(shí)線)。約500nm的這個峰值的出現(xiàn)是溶液中存在以β-構(gòu)象體為主的33-mer激發(fā)二聚體的指示。因此，即使固定化的β-構(gòu)象體探針經(jīng)受了α-構(gòu)象體形成的條件，它仍保持它的β-構(gòu)象。
實(shí)施例9肽探針的不同構(gòu)象體可以以不同的特異性結(jié)合PrPC和PrPSc。例如，β-構(gòu)象的33-mer探針特異性結(jié)合PrPSc，而α-構(gòu)象的33-mer探針優(yōu)先地結(jié)合PrPC。使用α-構(gòu)象和β-構(gòu)象的固定化的探針確認(rèn)了這個事實(shí)，數(shù)據(jù)支持在附圖21中示出。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，某些構(gòu)象體(即，β-構(gòu)象體)可以特異性結(jié)合PrPSc，結(jié)合的PrPSc可以通過其他技術(shù)進(jìn)一步檢測，例如用特異于特定構(gòu)象體的抗體檢測。為了證明這個事實(shí)，來自正常的(附圖21A中的虛線)和癢病感染的腦(附圖21A中的實(shí)線)的含有不同量總蛋白的腦溶胞產(chǎn)物與固定在聚苯乙烯平板上33-mer肽(SEQ ID NO1或29)的的α-或β-構(gòu)象體一起保溫。在室溫保溫1-2小時后，用含有0.05％Tween-20的PBS洗去非特異性結(jié)合的物質(zhì)，通過抗PrP單克隆抗體檢測結(jié)合的PrP。如附圖21A所示，當(dāng)β-構(gòu)象體探針被固定在平板上并暴露于含有PrPSc和PrPC的樣品時，探針特異性結(jié)合低濃度(低于約50μg)的PrPSc，并優(yōu)先地結(jié)合蛋白濃度更高的PrPSc(約50μg或更高)。
附圖21B圖示的實(shí)驗(yàn)顯示，固定化的探針區(qū)分PrPSc和PrPC，β-構(gòu)象體優(yōu)先地結(jié)合PrPSc，α-構(gòu)象體優(yōu)先地結(jié)合PrPC。具體地，如上詳述的，兩種探針構(gòu)象體獨(dú)立地結(jié)合到不同平板上。結(jié)合的探針暴露于含有PrPSc和PrPC的腦溶胞產(chǎn)物，測定與每種探針結(jié)合的朊病毒蛋白的數(shù)量(通過標(biāo)為“PrPC”和“PrPSc”柱形顯示)。這兩個實(shí)驗(yàn)的比較顯示，α-螺旋構(gòu)象體探針結(jié)合PrPC，并且結(jié)合較少程度的PrPSc，而β-片層構(gòu)象體探針僅結(jié)合PrPSc達(dá)到任何顯著的程度。當(dāng)用蛋白酶K處理腦溶胞產(chǎn)物時，僅檢測到蛋白酶K抗性PrP結(jié)合β-構(gòu)象體探針(比較標(biāo)記“PrPC(PK處理的)”和“PrPSc(PK處理的)”的柱)。這個數(shù)據(jù)顯示，β-構(gòu)象體可以選擇性地結(jié)合PrPSc。
這些結(jié)果對于大范圍的技術(shù)和工業(yè)努力具有可用性。例如，結(jié)果顯示，β-構(gòu)象體可以化學(xué)偶聯(lián)到固相支持物，例如膜和凝膠基質(zhì)上，然后在中性pH值、低鹽、有或沒有添加劑的水溶液中使用，來特異性結(jié)合并除去PrPC、PrPSc、或兩者。數(shù)據(jù)表明，從血液或血液制品(例如，血漿)清除傳染性朊病毒蛋白，可以通過將β-構(gòu)象體結(jié)合到膜上、使血液或血液制品通過所述固定探針的膜、并從血液或血液產(chǎn)品中分離膜來實(shí)現(xiàn)。實(shí)際上，明顯的是，人們可以單獨(dú)使用固定化的β-構(gòu)象體探針來除去傳染性的朊病毒顆粒，或人們可以使用β-構(gòu)象體和α-構(gòu)象體探針來從樣品，例如血液或血液制品樣品中除去所有的朊病毒顆粒。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在本發(fā)明的實(shí)踐中可以產(chǎn)生各種修改和變化而不背離本發(fā)明的范圍或精神。根據(jù)考慮本發(fā)明的說明書和實(shí)踐，本發(fā)明的其他實(shí)施方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。意圖是，說明書和實(shí)施例被認(rèn)為僅是示范性的，本發(fā)明的真實(shí)范圍和精神由以下的權(quán)利要求說明。
序列表<110>阿德利夫股份有限公司(ADLYFE，INC.)ORSER，CINDY S.
PAN，TAO<120>固定化的探針和檢測構(gòu)象改變的朊病毒蛋白的方法<130>ADL-102<140>11/030,300<141>2005-01-07<150>60/608,541<151>2004-09-10<160>31<170>PatentIn Ver.3.3<210>1<211>33<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Val Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Met His Lys Met Asn Thr1 5 10 15Lys Pro Lys Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val20 25 30Val<210>2<211>19<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly1 5 10 15Ala Val Val<210>3<211>14<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val1 5 10<210>4<211>40
<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val35 40<210>5<211>24<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser1 5 10 15Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu20<210>6<211>24<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>6Glu Val Arg His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser1 5 10 15Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu20<210>7<211>11<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>7Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met1 5 10<210>8<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽探針<400>8
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys1 5 10 15Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys20 25<210>9<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽探針<400>9Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln1 5 10 15Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln20<210>10<211>19<212>PRT<213>人(Hlomo sapiens)<400>10Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly1 5 10 15Ala Val Val<210>11<211>38<212>PRT<213>人(Hlomo sapiens)<400>11Met Gly Ile Leu Lys Leu Gln Val Phe Leu Ile Val Leu Ser Val Ala1 5 10 15Leu Asn His Leu Lys Ala Thr Pro Ile Glu Ser His Gln Val Glu Lys20 25 30Arg Lys Cys Asn Thr Ala35<210>12<211>25<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>12Met Ala Glu Ser His Leu Leu Gln Trp Leu Leu Leu Leu Leu Pro Thr1 5 10 15
Leu Cys Gly Pro Gly Thr Ala Ala Trp20 25<210>13<211>253<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>13Met Ala Asn Leu Gly Cys Trp Met Leu Val Leu Phe Val Ala Thr Trp1 5 10 15Ser Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn20 25 30Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg35 40 45Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly50 55 60Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly65 70 75 80Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His85 90 95Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met100 105 110Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr115 120 125Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp130 135 140Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln145 150 155 160Val Tyr Tyr Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val165 170 175His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr180 185 190Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg195 200 205Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Glu Arg Glu Ser Gln Ala210 215 220Tyr Tyr Gln Arg Gly Ser Ser Met Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val225 230 235 240Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly245 250
<210>14<211>254<212>PRT<213>小鼠(Mu s sp.)<400>14Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp1 5 10 15Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn20 25 30Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg35 40 45Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Thr Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp50 55 60Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp65 70 75 80Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Asn85 90 95Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val Ala100 105 110Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met115 120 125Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp130 135 140Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr Pro Asn Gln Val145 150 155 160Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His165 170 175Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr Thr180 185 190Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg Val195 200 205Val Glu Gln Met Cys Val Thr Gln Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Ala Tyr210 215 220Tyr Asp Gly Arg Arg Ser Ser Ser Thr Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro225 230 235 240Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly245 250<210>15<211>14<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>15Gln Arg Ser Thr Val Val Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Val1 5 10<210>16<211>818<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>16Met Ala Pro His Arg Pro Ala Pro Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu1 5 10 15Ala Leu Cys Ala Leu Ser Leu Pro Val Arg Ala Ala Thr Ala Ser Arg20 25 30Gly Ala Ser Gln Ala Gly Ala Pro Gln Gly Arg Val Pro Glu Ala Arg35 40 45Pro Asn Ser Met Val Val Glu His Pro Glu Phe Leu Lys Ala Gly Lys50 55 60Glu Pro Gly Leu Gln Ile Trp Arg Val Glu Lys Phe Asp Leu Val Pro65 70 75 80Val Pro Thr Asn Leu Tyr Gly Asp Phe Phe Thr Gly Asp Ala Tyr Val85 90 95Ile Leu Lys Thr Val Gln Leu Arg Asn Gly Asn Leu Gln Tyr Asp Leu100 105 110His Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Cys Ser Gln Asp Glu Ser Gly Ala Ala115 120 125Ala Ile Phe Thr Val Gln Leu Asp Asp Tyr Leu Asn Gly Arg Ala Val130 135 140Gln His Arg Glu Val Gln Gly Phe Glu Ser Ala Thr Phe Leu Gly Tyr145 150 155 160Phe Lys Ser Gly Leu Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Val Ala Ser Gly Phe165 170 175Lys His Val Val Pro Asn Glu Val Val Val Gln Arg Leu Phe Gln Val180 185 190Lys Gly Arg Arg Val Val Arg Ala Thr Glu Val Pro Val Ser Trp Glu195 200 205Ser Phe Asn Asn Gly Asp Cys Phe Ile Leu Asp Leu Gly Asn Asn Ile210 215 220His Gln Trp Cys Gly Ser Asn Ser Asn Arg Tyr Glu Arg Leu Lys Ala
225 230 235 240Thr Gln Val Ser Lys Gly Ile Arg Asp Asn Glu Arg Ser Gly Arg Ala245 250 255Arg Val His Val Ser Glu Glu Gly Thr Glu Pro Glu Ala Met Leu Gln260 265 270Val Leu Gly Pro Lys Pro Ala Leu Pro Ala Gly Thr Glu Asp Thr Ala275 280 285Lys Glu Asp Ala Ala Asn Arg Lys Leu Ala Lys Leu Tyr Lys Val Ser290 295 300Asn Gly Ala Gly Thr Met Ser Val Ser Leu Val Ala Asp Glu Asn Pro305 310 315 320Phe Ala Gln Gly Ala Leu Lys Ser Glu Asp Cys Phe Ile Leu Asp His325 330 335Gly Lys Asp Gly Lys Ile Phe Val Trp Lys Gly Lys Gln Ala Asn Thr340 345 350Glu Glu Arg Lys Ala Ala Leu Lys Thr Ala Ser Asp Phe Ile Thr Lys355 360 365Met Asp Tyr Pro Lys Gln Thr Gln Val Ser Val Leu Pro Glu Gly Gly370 375 380Glu Thr Pro Leu Phe Lys Gln Phe Phe Lys Asn Trp Arg Asp Pro Asp385 390 395 400Gln Thr Asp Gly Leu Gly Leu Ser Tyr Leu Scr Ser His Ile Ala Asn405 410 415Val Glu Arg Val Pro Phe Asp Ala Ala Thr Leu His Thr Ser Thr Ala420 425 430Met Ala Ala Gln His Gly Met Asp Asp Asp Gly Thr Gly Gln Lys Gln435 440 445Ile Trp Arg Ile Glu Gly Ser Asn Lys Val Pro Val Asp Pro Ala Thr450455 460Tyr Gly Gln Phe Tyr Gly Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Leu Tyr Asn Tyr465 470 475 480Arg His Gly Gly Arg Gln Gly Gln Ile Ile Tyr Asn Trp Gln Gly Ala485 490 495Gln Ser Thr Gln Asp Glu Val Ala Ala Ser Ala Ile Leu Thr Ala Gln500 505 510Leu Asp Glu Glu Leu Gly Gly Thr Pro Val Gln Ser Arg Val Val Gln515 520 525Gly Lys Glu Pro Ala His Leu Met Ser Leu Phe Gly Gly Lys Pro Met530 535 540
Ile Ile Tyr Lys Gly Gly Thr Ser Arg Glu Gly Gly Gln Thr Ala Pro545 550 555 560Ala Ser Thr Arg Leu Phe Gln Val Arg Ala Asn Ser Ala Gly Ala Thr565 570 575Arg Ala Val Glu Val Leu Pro Lys Ala Gly Ala Leu Asn Ser Asn Asp580 585 590Ala Phe Val Leu Lys Thr Pro Ser Ala Ala Tyr Leu Trp Val Gly Thr595 600 605Gly Ala Ser Glu Ala Glu Lys Thr Gly Ala Gln Glu Leu Leu Arg Val610 615 620Leu Arg Ala Gln Pro Val Gln Val Ala Glu Gly Ser Glu Pro Asp Gly625 630 635 640Phe Trp Glu Ala Leu Gly Gly Lys Ala Ala Tyr Arg Thr Ser Pro Arg645 650 655Leu Lys Asp Lys Lys Met Asp Ala His Pro Pro Arg Leu Phe Ala Cys660 665 670Ser Asn Lys Ile Gly Arg Phe Val Ile Glu Glu Val Pro Gly Glu Leu675 680 685Met Gln Glu Asp Leu Ala Thr Asp Asp Val Met Leu Leu Asp Thr Trp690 695 700Asp Gln Val Phe Val Trp Val Gly Lys Asp Ser Gln Glu Glu Glu Lys705 710 715 720Thr Glu Ala Leu Thr Ser Ala Lys Arg Tyr Ile Glu Thr Asp Pro Ala725 730 735Asn Arg Asp Arg Arg Thr Pro Ile Thr Val Val Lys Gln Gly Phe Glu740 745 750Pro pro Ser Phe Val Gly Trp Phe Leu Gly Trp Asp Asp Asp Tyr Trp755 760 765Ser Val Asp Pro Leu Asp Arg Ala Met Ala Glu Leu Ala Ala Tyr Glu770 775 780Arg Leu Lys Ala Thr Gln Val Ser Lys Gly Ile Arg Asp Asn Glu Arg785 790 795 800Ser Gly Arg Ala Arg Val His Val Ser Glu Glu Gly Thr Glu Pro Glu805 810 815Ala Met<210>17<21l>l46<212>PRT<213>人(Homo sapiens)
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Pro Pro Pro Gln Leu Pro Gln Pro Pro Pro Gln Ala Gln Pro Leu Leu50 55 60Pro Gln Pro Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Pro65 70 75 80Ala Val Ala Glu Glu Pro Leu His Arg Pro Lys Lys Glu Leu Ser Ala85 90 95Thr Lys Lys Asp Arg Val Asn His Cys Leu Thr Ile Cys Glu Asn Ile100 105 110Val Ala Gln Ser Val Arg Asn Ser Pro Glu Phe Gln Lys Leu Leu Gly115 120 125Ile Ala Met Glu Leu Phe Leu Leu Cys Ser Asp Asp Ala Glu Ser Asp130 135 140Val Arg Met Val Ala Asp Glu Cys Leu Asn Lys Val Ile Lys Ala Leu145 150 155 160Met Asp Ser Asn Leu Pro Arg Leu Gln Leu Glu Leu Tyr Lys Glu Ile165 170 175Lys Lys Asn Gly Ala Pro Arg Ser Leu Arg Ala Ala Leu Trp Arg Phe180 185 190Ala Glu Leu Ala His Leu Val Arg Pro Gln Lys Cys Arg Pro Tyr Leu195 200 205Val Asn Leu Leu Pro Cys Leu Thr Arg Thr Ser Lys Arg Pro Glu Glu210 215 220Ser Val Gln Glu Thr Leu Ala Ala Ala Val Pro Lys Ile Met Ala Ser225 230 235 240Phe Gly Asn Phe Ala Asn Asp Asn Glu Ile Lys Val Leu Leu Lys Ala245 250 255Phe Ile Ala Asn Leu Lys Ser Ser Ser Pro Thr Ile Arg Arg Thr Ala260 265 270Ala Gly Ser Ala Val Ser Ile Cys Gln His Ser Arg Arg Thr Gln Tyr275 280 285Phe Tyr Ser Trp Leu Leu Asn Val Leu Leu Gly Leu Leu Val Pro Val290 295 300Glu Asp Glu His Ser Thr Leu Leu Ile Leu Gly305 310 315<210>20<211>17<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>20
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln1 5 10 15Gln<210>21<211>89<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>21Met Gly Ile Leu Lys Leu Gln Val Phe Leu Ile Val Leu Scr Val Ala1 5 10 15Lcu Asn His Leu Lys Ala Thr Pro Ile Glu Ser His Gln Val Glu Lys20 25 30Arg Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe35 40 45Leu Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn50 55 60Val Gly Ser Asn Thr Tyr Gly Lys Arg Asn Ala Val Glu Val Leu Lys65 70 75 80Arg Glu Pro Leu Asn Tyr Leu Pro Leu85<210>22<211>5<212>PRT<213>人(Homos apiens)<400>22Lcu Ala Asn Phe Val1 5<210>23<211>14<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>23Val Phe Asn Ala Leu Pro Pro Pro Pro Leu Ala Asn Phe Val1 5 10<210>24<211>6<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>24Phe Leu Val His Ser Ser1 5
<210>25<211>16<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>25Ser Ser His Val Leu Phe Pro Pro Pro Pro Phe Leu Val His Ser Ser1 5 10 15<210>26<211>147<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>26Met Ala Ser His Arg Leu Leu Leu Leu Cys Leu Ala Gly Leu Val Phe1 5 10 15Val Ser Glu Ala Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu20 25 30Met Val Lys Val Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val35 40 45Ala Val His Val Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe50 55 60Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr65 70 75 80Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys85 90 95Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu100 105 110Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Ile Ala115 120 125Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Thr Asn130 135 140Pro Lys Glu145<210>27<211>22<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>27Glu Ser Val Phe Val Leu Gly Ala Leu Pro Pro Pro Pro Leu Ala Gly1 5 10 15Leu Val Phe Val Ser Glu
20<210>28<211>32<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>28Val Ala Ala Ala Lys Leu Arg Ala Val Val Thr Ser Arg Gln Pro Pro1 5 10 15Pro Pro Gln Arg Ser Thr Val Val Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Val20 25 30<210>29<211>33<212>PRT<213>小鼠(Mus sp.)<400>29Val Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val His Lys Leu Asn Thr1 5 10 15Lys Pro Lys Leu Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val20 25 30Val<210>30<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>30Ala Ala Ala Val1<210>31<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>31Val Ala Ala Ala Lys Leu Arg Ala Val Val Thr Ser Arg Gln1 5 10
權(quán)利要求
1.將朊病毒蛋白特異性探針固定到固相支持物的方法，所述方法包括提供處于預(yù)先選定的構(gòu)象中的第一朊病毒蛋白特異性肽探針；提供固相支持物；和在維持所述第一探針處于其預(yù)先選定的構(gòu)象中的條件下以及在允許所述第一探針固定到所述固相支持物的條件下，使所述固相支持物暴露于所述第一探針，持續(xù)足夠的時間使得所述第一探針固定在固相支持物上。
2.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括除去沒有被固定在所述固相支持物上的任何探針。
3.權(quán)利要求1的方法，還包括在將固相支持物暴露于第一探針之前將所述第一探針暴露于朊病毒蛋白的組合物，所述暴露持續(xù)足夠長的時間并且在適合該第一探針與朊病毒蛋白互相接觸的條件下進(jìn)行。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述朊病毒蛋白是錯折疊的構(gòu)象。
5.權(quán)利要求4的方法，其中朊病毒蛋白和第一探針之間形成復(fù)合物，并且其中第一探針通過該第一探針與固相支持物的結(jié)合直接固定于該固相支持物或通過該第一探針或朊病毒蛋白與第二探針的結(jié)合間接固定于該固相支持物，其中所述第二探針固定于所述固相支持物。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一探針包含序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO29。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一探針的構(gòu)象是β-構(gòu)象。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一探針直接固定于固相支持物。
9.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括通過以下方法將第三軟蛋白特異性肽探針固定于所述固相支持物提供處在預(yù)先選擇的構(gòu)象中的第三朊病毒蛋白特異性肽探針；提供包含所述第一探針的固相支持物；在維持所述第三探針處于它的預(yù)先選擇的構(gòu)象中的條件下，和在允許所述第三探針固定于所述固相支持物的條件下，使所述固相支持物暴露于所述第三探針，持續(xù)足夠長的時間使得所述第三探針固定于所述固相支持物；和任選的除去沒有被固定的任何探針。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述固相支持物包括塑料、膠乳或金屬。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述固相支持物是平板、珠子或膜的形式。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一探針是標(biāo)記的。
13.使得朊病毒蛋白與固定在固相支持物上的探針結(jié)合的方法，所述方法包括提供具有預(yù)定的構(gòu)象并特異于朊病毒蛋白的固定化的探針；提供含有或可疑含有朊病毒蛋白的樣品；和在一定條件下使所述樣品暴露于所述固定化的探針并持續(xù)一段時間，所述時間的量足以使得所述固定化的探針結(jié)合樣品中的朊病毒蛋白。
14.權(quán)利要求13的方法，進(jìn)一步包括檢測與所述固定化的探針結(jié)合的朊病毒蛋白的存在。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述方法被用于篩選動物或人類食物，或動物或人類醫(yī)藥制品中朊病毒蛋白的存在。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述方法被用于篩選動物或人類食物，或動物或人類醫(yī)藥制品中PrPSc的存在。
17.權(quán)利要求13的方法，其中所述樣品包括動物或人類血液或血液制品。
18.權(quán)利要求13的方法，其中所述探針包含序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO29。
19.權(quán)利要求13的方法，其中所述預(yù)定的構(gòu)象是所述探針的β-構(gòu)象。
20.權(quán)利要求13的方法，進(jìn)一步包括從所述樣品分離固定化的探針和固定化的探針-朊病毒蛋白復(fù)合物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述方法是從樣品中除去朊病毒蛋白的方法。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述方法從動物或人類食物或者動物或人類醫(yī)藥產(chǎn)品減少或消除朊病毒。
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述朊病毒蛋白是PrPSc。
24.權(quán)利要求20的方法，其中所述樣品包括動物或人類血液或血液制品。
25.權(quán)利要求20的方法，其中所述探針包含序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO29。
26.權(quán)利要求20的方法，其中所述預(yù)定的構(gòu)象是所述探針的β-構(gòu)象。
27.使得朊病毒蛋白與固定在固相支持物上的探針相結(jié)合的方法，所述方法包括提供探針，其固定在固相支持物上并當(dāng)該探針處于固定化的狀態(tài)中時其特異性結(jié)合朊病毒蛋白；提供包含朊病毒蛋白的樣品；和將所述樣品暴露于固定化的探針，所述暴露在足以使得該固定化的探針結(jié)合樣品中的朊病毒蛋白的條件和時間下進(jìn)行。
28.權(quán)利要求27的方法，還包括在將樣品暴露于固定化的探針之前提供特異性結(jié)合朊病毒蛋白的第二探針；和將所述第二探針暴露于樣品，所述暴露持續(xù)足夠的時間并且在適宜的條件下進(jìn)行，使得所述第二探針結(jié)合存在樣品中的朊病毒蛋白。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述第二探針利用可檢測的標(biāo)記物來標(biāo)記。
30.一種試劑盒，其為包裝的組合，其中包括，至少一個含有至少一種固定在固相支持物上的探針的容器，其中所述固定化的探針具有預(yù)定的構(gòu)象并結(jié)合已知的朊病毒蛋白或朊病毒蛋白的組，并且其中當(dāng)所述固定化的探針暴露于在可導(dǎo)致不固定的探針發(fā)生變化的條件下，所述固定化的探針的預(yù)定構(gòu)象不發(fā)生改變。
31.權(quán)利要求30的試劑盒，其中所述固定化的探針包含序列SEQ IDNO1或SEQ ID NO29。
32.權(quán)利要求30的試劑盒，其中所述預(yù)定的構(gòu)象是所述探針的β-構(gòu)象。
33.權(quán)利要求30的試劑盒，其中所述試劑盒還包含第二探針，其不固定于固相支持物并且其結(jié)合朊病毒蛋白。
34.權(quán)利要求33的試劑盒，其中所述第二探針包含序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO29。
全文摘要
本發(fā)明提供了產(chǎn)生特異于朊病毒蛋白的固定化探針的方法，使用這種探針來結(jié)合、檢測和從樣品除去朊病毒蛋白的方法，和用于實(shí)踐本發(fā)明的試劑盒。本發(fā)明公開了即使在暴露于一般將改變探針的活性和特異性的條件下時，被鎖定在具有特定的、預(yù)定的結(jié)構(gòu)并保持了它們的活性和特異性的固定化的探針。
文檔編號C07K1/00GK101084435SQ200580038439
公開日2007年12月5日 申請日期2005年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月10日
發(fā)明者辛迪·S·奧澤, 潘韜 申請人:阿德利夫股份有限公司