專利名稱：基于磁珠和納米金探針的微量蛋白質(zhì)的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)的測定，特別是一種基于磁珠及納米金探針的高 靈敏度微量蛋白質(zhì)的測定方法，可應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
技術(shù)背景酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)在臨床實(shí)驗(yàn)室已得到普遍的應(yīng)用，可用于檢測 各種腫瘤標(biāo)志物、細(xì)胞因子、病毒標(biāo)志物等各種蛋白質(zhì)，目前也已有多種市 售的ELISA試劑盒。但是，ELISA法操作程序復(fù)雜，步驟多，尤其是時(shí)間 較長，需要5、 6個(gè)小時(shí)，給臨床應(yīng)用帶來一些不便。如果縮短檢測的時(shí)間， 則會(huì)降低檢測的靈敏度，達(dá)不到臨床所需要的檢測要求。因此，為滿足臨床 快速檢測的需要，研發(fā)快速、高靈敏度的蛋白質(zhì)檢測方法是近幾年的研究熱 占。"、、o隨著納米科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，納米材料和納米結(jié)構(gòu)取得了引人矚目的 成就，為生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供了新的契機(jī)。納米材料具有傳統(tǒng)材料所不具備 的特有的三大效應(yīng)表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)。對(duì)于小尺 寸的磁珠來說，當(dāng)外加磁場時(shí)，磁珠會(huì)被磁化并吸附在磁極上，而撤去外加 磁場時(shí)，磁珠的磁性消失，磁珠重新分散在溶液中，而不是聚集在一起。由 于納米磁珠對(duì)外磁場具有良好的響應(yīng)性，因此可以通過外磁場作用，利用納 米磁珠進(jìn)行生物樣品的分離和定位等操作，從而實(shí)現(xiàn)生物傳感器系統(tǒng)的集成 化和自動(dòng)化。作為標(biāo)記材料而廣泛應(yīng)用于免疫檢測中的納米膠體金顆粒對(duì)生 物分子有很強(qiáng)的吸附功能，可以與蛋白質(zhì)、核酸等非共價(jià)結(jié)合，因而在生物 醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)中成為非常有用的工具。納米金顆粒標(biāo)記技術(shù)具有 簡單、快速、準(zhǔn)確和無污染等優(yōu)點(diǎn)，且檢測不依賴昂貴的激光檢測儀器，只 需普通光學(xué)儀器，甚至肉眼即可辨別。鑒于以上優(yōu)點(diǎn)，開發(fā)基于磁珠和納米金粒子的檢測技術(shù)已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，特別適合于廣大基層單位、醫(yī)院、 及大批量時(shí)間緊的檢測和大面積普査等，因此該技術(shù)具有巨大的發(fā)展?jié)摿?應(yīng)用前景。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種基于磁珠和納米金探針的微量蛋白質(zhì)的測 定方法，也即本發(fā)明要解決的技術(shù)問題主要是開發(fā)一種微量蛋白質(zhì)的高靈敏 度的快速測定方法。本發(fā)明主要內(nèi)容包括首先用待測蛋白質(zhì)的單克隆抗體標(biāo)記磁珠，在納 米金上標(biāo)記上待測蛋白質(zhì)的多克隆抗體，在納米金上同時(shí)還標(biāo)記一種帶有生物素標(biāo)記的DNA探針，納米金上的DNA探針通過生物素-鏈親和素反應(yīng)，又 標(biāo)記上了辣根過氧化酶Horseradish Peroxidase (HRP)，組成納米金探針，將標(biāo)記好待測蛋白質(zhì)單克隆抗體的磁珠及納米金探針與待測蛋白質(zhì)樣品混合， 3rc孵育一段時(shí)間，然后再洗去沒有反應(yīng)的納米金探針，用四甲基聯(lián)苯胺3，3'5，5-Tetramethylbenzidine (TMB)顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色，從而達(dá)到對(duì)待測蛋白質(zhì)進(jìn)行定量測定的目的，具體測定流程見圖1。主要包括以下具體內(nèi)容一、 所用試劑及材料1. 羧基修飾的磁珠購自Dynal公司，直徑l-3pm。2. 0.1M磷酸鹽緩沖液PBS(PH7.2)組成為137mmol/LNaCl， 2.7mmol/L KC1， 4.3mmol/LNa2HP04.7H20， 1,4 mmol/L KH2P04。3.0.1M磷酸緩沖液PB (PH7.2) : 0.2MNa2HPO4， 0.2MNaH2PO44. 雜交緩沖液O.IMPBS、 0.5%牛血清白蛋白BSA (質(zhì)量％)、 0.05%Tween20 (體積％)。5. 洗液O.IMPBS、 0.1%BSA (質(zhì)量％)、 0.05%Tween20 (體積％)。6. TMB顯色液，購自上海科華生物有限公司。二、 具體的實(shí)施方式1待測蛋白質(zhì)的單克隆抗體標(biāo)記磁珠1.1活化磁珠選用羧基修飾的磁珠，用300 25mMsfonic acid (MES)溶液(pH6)清洗300-500|il磁 珠(相當(dāng)于3-5mg磁珠)兩次，加冰浴的50mg/ml碳二亞胺 (l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride EDC) 溶液40-60|il、 50mg/mlN-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide NHS)溶 液40-60W， 室溫孵育30min;再用300W 25mM MES溶液(pH6)洗兩次。 1.2標(biāo)記磁珠用60-100ial25mMMES溶液(pH6)溶解150-250嗎的待 測蛋白質(zhì)的單克隆抗體，充分混勻，加入到已活化的抗體里，再加40^1 25mM MES (pH6)，使終體積為100-14(Hil;室溫放置半小時(shí)或4。C放置2小時(shí)； 再用300-500pl PBS (含0. 1-0. 5%BSA及0. 01-0. l%Tween-20)洗4次，按 所需濃度重懸磁珠，2-8。C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?多克隆抗體及DNA探針標(biāo)記納米金2.1 確定抗體的最佳用量取lOOpl不同濃度的抗體(濃度分別為 0ug/ml、 0. 5fig/ml、 lpg/ml、 2ng/ml、 3jig/ml、 5ng/ml)加到lml納米金 溶液里，室溫靜置5分鐘，再向上述各管中加入100^x1的lNNaCl溶液，室 溫靜置1小時(shí)，穩(wěn)定lml納米金溶液紅色不變的最低蛋白質(zhì)用量，即為該標(biāo) 記蛋白質(zhì)的最佳用量。2.2 抗體標(biāo)記按照前面確定的抗體用量標(biāo)記lml納米金，室溫放置30分鐘-1小時(shí)。2. 3 DNA探針標(biāo)記向經(jīng)過抗體標(biāo)記的納米金溶液里，加入巰基(5， 端)及生物素標(biāo)記(3，端)的DNA探針，使DNA探針的終濃度為3-5uM，室 溫靜置標(biāo)記17小時(shí)，加入穩(wěn)定劑(終濃度為含0. 5-腦A、 0. 1NNaCl、 lOraM 的PB溶液)穩(wěn)定48-72小時(shí)，離心清洗3-4次，洗去未標(biāo)記上的抗體及DNA 探針。2.4 HRP標(biāo)記將2-3pl鏈親和素-HRP (濃度為lmg/ml)與標(biāo)記了 抗體及DNA探針的納米金溶液混合，在室溫下放置1小時(shí)，用PH7.2的0.1M 磷酸鹽緩沖液PBS清洗3-4次，洗去未標(biāo)記上的鏈親和素-HRP，再加100^1 10mMPB (含1。/。BSA)重懸，4。C保存?zhèn)溆谩?3免疫反應(yīng)取標(biāo)記好抗體的磁珠0. 5-l|ul，先與待測樣品10-2(^1在37。C下孵育30 分鐘-l小時(shí)，引入磁場，用洗液(含0.05。/oTween20及0.線BSA的PBS)清 洗3-4次，再加入1-2pl標(biāo)記好的納米金探針，繼續(xù)雜交30分鐘，雜交體 積為20pl，雜交液為含0. 05%Tween20及0. 5% BSA組成的0. 1M PBS，形成 磁珠-待測蛋白-納米金探針復(fù)合體，引入磁場，清洗4次，洗去未反應(yīng)的納 米金探針。4 顯色反應(yīng)向上述形成的磁珠-待測DNA-納米金探針復(fù)合體中加入20-30pl HRP酶 底物-TMB顯色液，避光孵育10-15分鐘，加入終止液(O. 2M濃硫酸)10-15|il， 90分鐘內(nèi)，450nm測0D值。 本技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)及特點(diǎn)本技術(shù)最大的特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，檢測方便，耗時(shí)短。 1靈敏度高本技術(shù)主要采用基于納米顆粒的、利用信號(hào)探針放大信號(hào)及鏈親和素-生物素反應(yīng)放大系統(tǒng)的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，在納米金顆粒上同時(shí)標(biāo)記抗體及起 信號(hào)放大作用的信號(hào)DNA探針，信號(hào)DNA探針同時(shí)還標(biāo)記有生物素分子， 生物素分子通過與鏈親和素反應(yīng)將HRP引入納米金顆粒上，用來作顯色反 應(yīng)。通過信號(hào)的逐級(jí)放大，達(dá)到對(duì)微量蛋白質(zhì)的檢測，測定蛋白質(zhì)的靈敏度 為pg/ml。2操作方便，耗時(shí)短本發(fā)明提供的測定方法從檢測標(biāo)本開始，只需要1-1.5小時(shí)的時(shí)間，就 可以得到檢測結(jié)果；另外，本技術(shù)操作步驟少加樣品-加納米金探針-顯色 反應(yīng)，操作方便、簡單，適于臨床大批量標(biāo)本的快速檢測。


圖l基于磁珠與納米金探針的蛋白質(zhì)測定流程示意圖A.探針標(biāo)記B. 檢測過程圖2不同濃度p53蛋白質(zhì)的測定結(jié)果具體實(shí)施方式
利用本技術(shù)分析人p53陽性血清，p53蛋白質(zhì)含量為160pg/ml。1 P53單克隆抗體標(biāo)記磁珠1.1活化磁珠用300|il25mMMES (pH6)清洗300)^1磁珠(相當(dāng)于 3mg磁珠)兩次，加冰浴的50mg/mlEDC溶液50nl 、 50mg/mlNHS溶液 50nl， 室溫孵育30min;再用300pl 25mM MES (pH6)洗兩次。1.2標(biāo)記加入p53抗體60nl，再加25mM MES (pH6)，使終體 積為100^1; 4。C放置2小時(shí)；再用300W PBS (含0. 1%BSA及0. 01%Tween-20) 洗4次，再用300nl洗液重懸磁珠，2-8"C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩? p53多克隆抗體及DNA探針標(biāo)記納米金2. 1確定抗體的最佳用量用0. 1M K2C03溶液將納米金溶液的PH值 調(diào)到9，取100|il不同濃度的抗體(濃度分別為Opg/ml、 0. 5ng/ml、 lpg/ml、 2|ig/ml、 3ng/ml、 5pg/ml)加到lml納米金溶液里，室溫靜置5分鐘，再加 入100iil的lNNaCl溶液，確定蛋白的最佳用量。穩(wěn)定lml納米金溶液紅色 不變的最低蛋白質(zhì)用量，即為該標(biāo)記蛋白質(zhì)的最佳用量。蛋白質(zhì)標(biāo)記納米金 時(shí)，蛋白質(zhì)(抗體)的用量是一個(gè)非常重要的因素，抗體用量少了會(huì)使納米 金聚集沉淀，用量多了會(huì)浪費(fèi)昂貴的抗體，還會(huì)影響到DNA探針的標(biāo)記。在 本研究中，p53多克隆抗體的最佳用量為2jig/ml納米金。2. 2抗體標(biāo)記用100)il無菌雙蒸水溶解2pg p53多克隆抗體，并加入 到lml納米金中，室溫放置30分鐘。2.3 DNA探針標(biāo)記向經(jīng)過p53抗體標(biāo)記的納米金溶液里，加入一定量 的巰基(5，端)及生物素標(biāo)記(3，端)的DNA探針(探針序列5， SH-(CH2) 3- (T) 10-AGCTACGAGTTGAGAATCCTGAATGCGACG- (T) 10- (CH2) -Biotin3，)，使探針的終濃度為3pM，室溫靜置標(biāo)記17小時(shí)，加 入穩(wěn)定劑(終濃度為1% BSA、 0. 1N NaCl及l(fā)OmM的PB溶液)穩(wěn)定48小時(shí)， 離心清洗3-4次，洗去未標(biāo)記上的抗體及DNA探針。2. 4服P標(biāo)記取2pl lmg/ml鏈親和素-服P與標(biāo)記了抗體及DNA探針 的納米金溶液混合，在室溫下放置1小時(shí)，用0.1MPBS清洗3-4次，洗去 未標(biāo)記上的鏈親和素-服P，再加lOOpllOmMPB (含1。/。BSA)重懸，4。C保 存?zhèn)溆谩? 免疫反應(yīng)取標(biāo)記好抗體的磁珠1^1，先與待測樣品20|_d在37"C下孵育30分鐘， 引入磁場，用洗液(含0. 05%Tween20及0. 1% BSA的PBS)清洗3-4次， 再加入2pl標(biāo)記好的納米金探針，繼續(xù)雜交30分鐘，雜交體積為2(^1，雜 交液為含0. 05%Tween20及0. 5% BSA的PBS，形成磁珠-待測蛋白-納米金 探針復(fù)合體，引入磁場，清洗4次，洗去未反應(yīng)的納米金探針。4 顯色反應(yīng)向上述形成的磁珠-待測蛋白質(zhì)-納米金探針復(fù)合體中加入20|il HRP酶 底物-TMB顯色液，避光孵育15分鐘，加入終止液(0.2M濃硫酸)lO)il， 90分鐘內(nèi)，450nm測0D值。 5檢測結(jié)果分析用上述方法測定按濃度梯度(p53蛋白質(zhì)濃度分別為32pg/ml、 16pg/ml 、 8pg/ml4pg/ml、 2pg/ml)稀釋的p53陽性血清及陰性對(duì)照血清， 測定結(jié)果如圖2所示，為450nm OD值與p53蛋白質(zhì)濃度的相關(guān)性的柱狀 圖；由圖2可看出所述的測定方法所測定的蛋白質(zhì)的靈敏度為pg/ml。
權(quán)利要求
1、基于磁珠和納米金探針的微量蛋白質(zhì)的測定方法，其特征在于首先用待測蛋白質(zhì)的單克隆抗體標(biāo)記磁珠，在納米金上標(biāo)記上待測蛋白質(zhì)的多克隆抗體，在納米金上同時(shí)標(biāo)記一種帶有生物素標(biāo)記的DNA探針，納米金上的DNA探針通過生物素-鏈親和素反應(yīng)，又標(biāo)記上了辣根過氧化酶，組成納米金探針；將標(biāo)記好待測蛋白質(zhì)單克隆抗體的磁珠及納米金探針與待測蛋白質(zhì)樣品混合，37℃溫度下孵育，然后再洗去沒有反應(yīng)的納米金探針，用四甲基聯(lián)苯胺顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色，從而達(dá)到對(duì)待測蛋白質(zhì)進(jìn)行定量測定的目的。
2、 按權(quán)利要求1所述的基于磁珠和納米金探針的微量蛋白質(zhì)的測定方 法，其特征在于測定步驟是A待測蛋白質(zhì)的單克隆抗體標(biāo)記磁珠a) 活化磁珠選用羧基修飾的磁珠，用300 -500)il 25mM pH6的MES 溶液清洗300-500^1磁珠兩次，加冰浴的50mg/ml碳二亞胺溶液40-60)il、 50 mg/ml N-羥基琥珀酰亞胺溶液40-60W， 室溫孵育30min;再用300pl 25mM pH6的MES溶液洗兩次；b) 標(biāo)記磁珠用60-100pl 25mMpH6的MES溶液溶解150-250嗎的待 測蛋白質(zhì)的單克隆抗體，充分混勻，加入到已活化的抗體里，再加40!il25mM pH6的MES溶液，使終體積為100-140^1;室溫放置半小時(shí)或4。C放置2小 時(shí)；再用300-500pl PBS洗4次，按所需濃度重懸磁珠，2-8"C儲(chǔ)存?zhèn)溆?。B多克隆抗體及DNA探針標(biāo)記納米金a) 確定抗體的用量取lOOpl不同濃度的抗體加到lml納米金溶液里， 室溫靜置5分鐘，再向上述不同濃度的各管中加入10(^1的1N NaCl溶液， 室溫靜置l小時(shí)，穩(wěn)定lml納米金溶液紅色不變的最低蛋白質(zhì)用量，即為該 標(biāo)記蛋白質(zhì)的用量；b) 抗體標(biāo)記按照步驟a)確定的抗體用量，標(biāo)記lml納米金，室溫放 置30分鐘-l小時(shí)；c) DNA探針標(biāo)記向經(jīng)過抗體標(biāo)記的納米金溶液里，加入巰基(5'端) 及生物素標(biāo)記(3，端)的DNA探針，使DNA探針的終濃度為3-5uM，室溫靜 置標(biāo)記，加入穩(wěn)定劑穩(wěn)定48-72小時(shí)，離心清洗3-4次，洗去未標(biāo)記上的抗 體及DNA探針；d) HRP標(biāo)記將2-3^1鏈親和素-HRP與標(biāo)記了抗體及DNA探針的納米 金溶液混合，在室溫下放置1小時(shí)，用PH702的0.1M磷酸鹽緩沖液PBS清 洗3-4次，洗去未標(biāo)記上的鏈親和素-HRP，再加100^1 10mMPB重懸，4°C保存?zhèn)溆?；C免疫反應(yīng)取標(biāo)記好抗體的磁珠0. 5-lpl，先與待測樣品10-20|il在37。C下孵育30 分鐘-l小時(shí)，引入磁場，用洗液清洗3-4次，再加入l-2pl標(biāo)記好的納米金 探針，繼續(xù)雜交30分鐘，雜交體積為20^1，雜交液為含0.05%Tween20及 0.5。/。BSA組成的0. 1MPBS，形成磁珠-待測蛋白-納米金探針復(fù)合體，引入磁 場，清洗4次，洗去未反應(yīng)的納米金探針；D顯色反應(yīng)向上述形成的磁珠-待測DNA-納米金探針復(fù)合體中加入20-3(^1 HRP酶 底物-TMB顯色液，避光孵育10-15分鐘，加入O. 2M濃硫酸終止液10-15)il， 90分鐘內(nèi)，450nm測0D值;上述步驟B中a)內(nèi)，不同濃度分別為Ojug/ml、 0.5pg/ml、 lpg/ml、 2jig/ml、 3(ig/ml禾口 5jxg/ml;上述步驟B中c)內(nèi)穩(wěn)定劑為含0. 5 —1%BSA、 0. 1NnaCl、 10mN的PB 溶液；上述步驟C中的洗液為含體積百分?jǐn)?shù)0.05%TWEEN20和質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為 0. 1%BSA的PBS。
3、 按權(quán)利要求2所述的基于磁珠和納米金探針的微量蛋白質(zhì)的測定方 法，其特征在于選用羥基修飾的磁珠直徑為l一3pm。
4、 按權(quán)利要求2或3所述的基于磁珠和納米金探針的微量蛋白質(zhì)的測 定方法，其特征在于選用羥基修飾的磁珠系Dynal公司生產(chǎn)的。
5、 按權(quán)利要求2所述的基于磁珠和納米金探針的微量蛋白質(zhì)的測定方法，其特征在于步驟B中c)的室溫靜置標(biāo)記17小時(shí)。
6、 按權(quán)利要求2所述的基于磁珠和納米金探針的微量蛋白質(zhì)的測定方 法，其特征在于步驟B中PH7.2的0.1M磷酸鹽緩沖液PBS組成為 137mmol/LNaCl， 2.7mmol/L KC1， 4.3mmol/L Na2HP04.7H20， 1.4 mmol/L KH2P04。
7、 按權(quán)利要求2所述的基于磁珠和納米金探針的微量蛋白質(zhì)的測定方 法，其特征在于步驟B中d)所述的HRP濃度為lmg/ml。
8、 按權(quán)利要求2所述的基于磁珠和納米金探針的微量蛋白質(zhì)的測定方 法，其特征在于所述的TMB顯色液由上?？迫A生物有限公司提供。
9、 按權(quán)利要求2所述的基于磁珠和納米金探針的微量蛋白質(zhì)的測定方 法，其特征在于所述的測定方法所測定的蛋白質(zhì)的靈敏度為pg/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于磁珠及納米金探針的高靈敏度微量蛋白質(zhì)的測定方法，其特征在于首先用待測蛋白的單克隆抗體標(biāo)記磁珠，在納米金上標(biāo)記待測蛋白的多克隆抗體，在納米金上同時(shí)還標(biāo)記一種帶有生物素標(biāo)記的DNA探針，納米金上的DNA探針通過生物素-鏈親和素反應(yīng)，又標(biāo)記上了辣根過氧化酶(HRP)，組成納米金探針，將標(biāo)記好抗體的磁珠及納米金探針與待測蛋白樣品混合，37℃孵育一段時(shí)間，然后再洗去沒有反應(yīng)的納米金探針，用TMB顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色，從而達(dá)到對(duì)待測蛋白進(jìn)行定量檢測的目的。本發(fā)明檢測時(shí)間可縮至1-1.5小時(shí)，靈敏度達(dá)pg/ml。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101256191SQ20081003436
公開日2008年9月3日 申請(qǐng)日期2008年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日
發(fā)明者賈春平, 趙建龍, 金慶輝 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所