一種用于細(xì)胞原位檢測(cè)小分子化合物與靶蛋白相互作用的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子藥理學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于細(xì)胞原位檢測(cè)小分子化合物與靶 蛋白相互作用的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在藥物作用機(jī)理研宄過(guò)程中，藥物都是通過(guò)與靶點(diǎn)相互作用來(lái)發(fā)揮藥效作用，其 中蛋白質(zhì)通常是藥物發(fā)揮作用的主要靶點(diǎn)，因此在細(xì)胞原位水平研宄小分子化合物與靶蛋 白之間的相互作用，不僅有助于從分子水平闡述藥物的作用機(jī)制，同時(shí)也為以特定蛋白為 靶點(diǎn)的先導(dǎo)藥物的篩選和開發(fā)提供新的方法。通常情況下小分子配體與靶蛋白相互作用后 會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，構(gòu)象的改變會(huì)直接影響蛋白質(zhì)的功能或代謝（激活、抑制、穩(wěn) 定或降解），從而引發(fā)一系列生理反應(yīng)，這是藥物發(fā)揮作用的分子基礎(chǔ)。
[0003] 目前，研宄小分子化合物與蛋白質(zhì)相互作用的通用方法包括平衡透析法、電化學(xué) 分析法、X-晶體衍射法、毛細(xì)管電泳法、光譜法（熒光光譜、紅外光譜、圓二色光譜、紅外光 譜、拉曼光譜、紫外-可見吸收光譜）等。此外，有些蛋白激酶是新藥研發(fā)的重要靶點(diǎn)，利用 其催化特定底物產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)的特征開發(fā)成商用試劑盒用于藥物篩選，該方法通過(guò)檢測(cè)酶 的活性間接反應(yīng)小分子化合物與蛋白質(zhì)的相互作用。但是，這些方法僅適用于小分子化合 物與特定蛋白質(zhì)在單一環(huán)境下的相互作用，對(duì)于在細(xì)胞原位這種復(fù)雜體系的相互作用很難 適用。此外，這些方法分析的結(jié)果都是在理想狀態(tài)下得出的結(jié)論，一旦應(yīng)用于細(xì)胞或組織內(nèi) 呈現(xiàn)很高的脫靶性。因此，開發(fā)一種能在細(xì)胞原位水平檢測(cè)小分子化合物與靶蛋白相互作 用的分析方法尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于細(xì)胞原位檢測(cè)小分子化合物與靶蛋白 相互作用的方法。采用該方法可以在細(xì)胞原位水平上檢測(cè)小分子化合物與靶蛋白之間是否 相互作用，可直接應(yīng)用于先導(dǎo)藥物的靶點(diǎn)驗(yàn)證或者用于以特定蛋白為靶點(diǎn)的先導(dǎo)藥物的篩 選，可靠性高，靈敏度高。
[0005] 本發(fā)明所述的用于細(xì)胞原位檢測(cè)小分子化合物與靶蛋白相互作用的方法為：以細(xì) 胞在非變性條件下裂解時(shí)所獲得的具有完整生理結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)，選用適當(dāng)?shù)男》肿?化合物與靶蛋白孵育形成復(fù)合體，通過(guò)特異性的抗體誘捕靶蛋白并將與靶蛋白相互作用的 小分子化合物一同捕獲，結(jié)合質(zhì)譜分析以實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞原位水平檢測(cè)小分子化合物與靶蛋白 之間是否具有相互作用。
[0006] 更為具體的方法包括以下步驟：
[0007] (I)選定小分子化合物；
[0008] (II)蛋白質(zhì)的提取：將細(xì)胞在非變性條件下進(jìn)行裂解以獲得具有完整生理結(jié)構(gòu) 的蛋白質(zhì)；
[0009] (III)復(fù)合體的形成：將小分子化合物與蛋白質(zhì)進(jìn)行孵育得到小分子化合物與靶 蛋白的復(fù)合體；
[0010] (IV)復(fù)合體的分離：用與靶蛋白特異性結(jié)合的抗體捕獲復(fù)合體，通過(guò)免疫共沉淀 的方法分離；
[0011] (V)復(fù)合體的變性：將經(jīng)步驟（IV)分離后的復(fù)合體進(jìn)行變性處理；
[0012] (VI)質(zhì)譜分析：將經(jīng)步驟（V)變性后的復(fù)合體進(jìn)行質(zhì)譜分析，同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)樣品 和陰性對(duì)照樣品對(duì)比，檢測(cè)變性后的復(fù)合體中是否有前述選定的小分子化合物析出，并以 此來(lái)判斷靶蛋白與小分子化合物之間是否相互作用。
[0013] 本發(fā)明所述的技術(shù)方案中，所述的蛋白質(zhì)可以是用于腫瘤治療、炎癥治療、心腦血 管疾病治療、神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療或其他類型疾病治療的靶點(diǎn)（如癌癥治療靶點(diǎn)EGFR、拓?fù)?異構(gòu)酶等，炎癥治療靶點(diǎn)Toll樣受體、前列腺素合成酶，心腦血管疾病治療靶點(diǎn)鈉泵、鈣 泵、鉀泵等，神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療靶點(diǎn)膽堿酯酶、膽堿受體等，鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)阿片受體等），也可以 是與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收、代謝或排泄相關(guān)的蛋白質(zhì)（如藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體、P-糖蛋白、細(xì)胞色素P450、 a1-酸性糖蛋白、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶等）。
[0014] 本發(fā)明所述的技術(shù)方案中，所述的小分子化合物根據(jù)體外活性初篩結(jié)果進(jìn)行確 定。具體來(lái)源可以是目前已經(jīng)上市的藥物，如癌癥治療藥物吉非替尼、解熱鎮(zhèn)痛藥阿司匹 林、抗高血壓藥物尼莫地平、抑制胃酸分泌藥奧美拉唑等，也可以是自行合成的化合物，或 者是天然的化合物。
[0015] 上述方法的步驟（II)中，將細(xì)胞在非變性條件下進(jìn)行裂解以獲得具有完整生理 結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的具體操作與現(xiàn)有技術(shù)相同。
[0016] 上述方法的步驟（III)中，所述小分子化合物與蛋白質(zhì)進(jìn)行孵育的條件與時(shí)間與 現(xiàn)有技術(shù)相同，通常是在35~37°C條件下孵育0. 5~lh。本申請(qǐng)中，在孵育時(shí)，優(yōu)選所述 小分子化合物與蛋白質(zhì)的混合比例為1umol/L:50~100yg。
[0017] 上述方法的步驟（IV)中，根據(jù)前序步驟確定的靶蛋白來(lái)選擇與靶蛋白特異性結(jié) 合的抗體，這一選擇為本領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識(shí)，在此不再詳述。所述通過(guò)免疫共沉淀的 方法分離的操作與現(xiàn)有技術(shù)相同，具體可以采用已經(jīng)商品化的試劑盒（如Millipore公司 生產(chǎn)的CatchandReleasev2.OReversibleImmunoprecipitationSystemkit免疫共沉 淀試劑盒等），也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要自己準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料制備。
[0018] 上述方法的步驟（V)中，所述的變性處理與現(xiàn)有技術(shù)相同，具體可以是將經(jīng)步驟 (IV)分離后的復(fù)合體進(jìn)行超聲處理或煮沸處理以達(dá)到使蛋白質(zhì)變性的目的，并最終使與 蛋白質(zhì)結(jié)合的小分子化合物游離出來(lái)。
[0019] 上述方法的步驟（VI)中，當(dāng)變性后的復(fù)合體中有前述選定的小分子化合物析出， 則表示在選定的細(xì)胞（即步驟（II)中用于在非變性條件下進(jìn)行裂解以獲得具有完整生理 結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的細(xì)胞）中，該選定的小分子化合物可以與捕獲抗體特異性識(shí)別的蛋白質(zhì)相 互作用；否則則表示不能相互作用。
[0020] 當(dāng)采用本發(fā)明所述方法在細(xì)胞原位水平檢測(cè)在胃癌細(xì)胞株MGC-803中，小分子化 合物與P53是否相互作用時(shí)，具體包括以下步驟：
[0021] (I)選定下述式（A)所示結(jié)構(gòu)的化合物作為小分子化合物：
[0022]
[0023] 上述式（A)所示結(jié)構(gòu)的小分子化合物的合成方法具體包括：
[0024] 取如下式⑶所示結(jié)構(gòu)的化合物溶于甲醇和/或乙醇中，然后加入3-二甲氨基丙 胺，所得混合物在加熱條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，所得反應(yīng)物冷卻，過(guò)濾，收集濾餅，即得到 如下式（C)所示結(jié)構(gòu)的中間產(chǎn)物；所得中間產(chǎn)物與正丙胺溶于二甲基亞砜或四氫呋喃中， 于加熱條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)物倒入冰水中，有固體析出，收集固體，即得到目標(biāo) 產(chǎn)物粗品；
[0026] 上述式（A)所示結(jié)構(gòu)的小分子化合物的合成方法中，式（B)所示結(jié)構(gòu)的化合物與 3_二甲氨基丙胺的物質(zhì)的量之比通常為1 :1~1.2。所述的甲醇和/或乙醇作為溶劑使用， 所述甲醇優(yōu)選采用體積濃度為90%~100 %甲醇，乙醇優(yōu)選采用體積濃度為90%~100% 乙醇，也可以是甲醇和乙醇任意比例的混合物。溶劑的用量以可以溶解參加反應(yīng)的原料的 量為宜。所述式（B)所示結(jié)構(gòu)的化合物與3-二甲氨基丙胺的反應(yīng)優(yōu)選是在50~70°C條件 下進(jìn)行，反應(yīng)是否完全可采用薄層層析跟蹤檢測(cè)；合成得到的式（C)所示結(jié)構(gòu)的中間產(chǎn)物 可以直接進(jìn)行下一步反應(yīng)，也可以經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的硅膠薄層色譜或硅膠柱層析純化后再進(jìn)行 下一步反應(yīng)。式（C)所示結(jié)構(gòu)的中間產(chǎn)物與正丙胺的物質(zhì)的量之比通常為1 :1~1. 5。所 述的二甲基亞砜或四氫呋喃作為溶劑使用；溶劑的用量以可以溶解參加反應(yīng)的原料的量為 宜。所述式（C)所示結(jié)構(gòu)的中間產(chǎn)物與正丙胺的反應(yīng)優(yōu)選是在110~135°C的條件下進(jìn)行， 反應(yīng)是否完全可采用薄層層析跟蹤檢測(cè)。
[0027] 為了提高目標(biāo)化合物的純度，可將所得目標(biāo)產(chǎn)物粗品進(jìn)行進(jìn)一步純化的純化步 驟，具體是將制得的目標(biāo)物粗品進(jìn)行硅膠薄層色譜或硅膠柱層析，得到純化后的目標(biāo)物。在 將制得的目標(biāo)產(chǎn)物粗品硅膠薄層色譜或上硅膠柱層析時(shí)，通常用由體積比為100 :1~10的 CH2CldP CH 3OH組成的洗脫劑洗脫，收集洗脫液，洗脫液減壓蒸除溶劑，得到純化后的目標(biāo) 產(chǎn)物。所述組成洗脫劑的〇12(：12和CH 3OH的體積比優(yōu)選為100 :5~1