專利名稱：抑制細(xì)胞毒性蛋白構(gòu)象異構(gòu)體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多環(huán)化合物和使用一種或多種多環(huán)化合物，優(yōu)選具有三至五個(gè)環(huán)的取代的或未取代的多并苯化合物治療和預(yù)防多種以淀粉狀蛋白為基礎(chǔ)的疾病狀態(tài)的方法。在一個(gè)特殊的方面，發(fā)明涉及破壞糊精從可溶形式向不溶形式轉(zhuǎn)變的方法。在另一個(gè)方面，發(fā)明涉及抑制淀粉狀蛋白前-或初原纖維和原纖維的聚集，以及抑制淀粉狀蛋白β-原纖維和β-片層形成所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)變誘導(dǎo)毒性的方法。本發(fā)明提供了破壞II型糖尿病病人胰島淀粉狀蛋白，以及鑒定和評價(jià)用于預(yù)防或治療淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的多環(huán)化合物的方法。
背景技術(shù)：
如所有具有優(yōu)先權(quán)的申請一樣，在此提到的所有文章都整體合并為參考文獻(xiàn)。
1854年，Rudolph Virchow提出并推廣了術(shù)語淀粉狀蛋白，以表示肉眼可見的具有陽性碘染色反應(yīng)的組織異常。隨后的偏振光光鏡研究證明了淀粉樣沉積物所固有的雙折射性，這種特性在用剛果紅染料染色后大大增加。1959年，淀粉樣變性組織超薄切片的電鏡觀察發(fā)現(xiàn)了原纖維的存在，其長度不確定，寬度恒定為80至100。采用Congophilia和原纖維形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，在動物中已經(jīng)鑒定了20或更多種生物學(xué)上不同形式的淀粉狀蛋白；每種形式都特別地與一種獨(dú)特的臨床綜合征有關(guān)。原纖維，寬度也是80至100，已經(jīng)采用差示沉淀或溶解法從組織勻漿中分離。X-線衍射分析表明原纖維排列成β折疊構(gòu)造，多肽骨架的方向與原纖維軸垂直(交叉β結(jié)構(gòu))。
淀粉樣變性是一組病理學(xué)狀態(tài)，其中正常的可溶性蛋白聚合形成不溶的淀粉樣原纖維和淀粉樣沉積物。有超過15種蛋白形成通常與多種臨床狀況有關(guān)的淀粉樣原纖維。淀粉樣變性通常可分為全身性淀粉樣變性和局部淀粉樣變性。全身淀粉樣變性(和括號中已經(jīng)被認(rèn)為引起該變性的蛋白)包括AL淀粉樣變性(AL淀粉狀蛋白)、淀粉樣A淀粉樣變性(淀粉樣A蛋白)和家族性甲狀腺運(yùn)載蛋白淀粉樣變性(甲狀腺運(yùn)載蛋白)。局部淀粉樣變性(和括號中已經(jīng)被認(rèn)為引起該變性的蛋白)包括Alzheimer病(淀粉樣β-肽)、朊病毒病(綿羊瘋癢病朊病毒蛋白)和II型糖尿病(人胰島淀粉狀蛋白)。
淀粉狀蛋白或淀粉樣蛋白是指一組各不相同的細(xì)胞外蛋白，它們形成具有某種形態(tài)學(xué)、結(jié)構(gòu)和化學(xué)特性的淀粉樣沉積物。各種淀粉樣沉積物與某些染料具有相似的親合力，在偏振光下具有特征性的外觀。盡管它們在氨基酸序列上不同，但在淀粉樣沉積物中發(fā)現(xiàn)的淀粉狀蛋白由含有平行排列的原纖維交叉束的聚集物組成，其中原纖維中的蛋白組織成β-折疊片結(jié)構(gòu)。淀粉樣沉積物中許多淀粉狀蛋白富含β-折疊片結(jié)構(gòu)的事實(shí)是剛果紅染色后淀粉樣原纖維雙折射性極大增加的原因(Glenner等人，J.Histochem.Cytochem 221141-1158(1974)；Glenner和Page，Int.Rev.Exp.Pathol.151-92(1976)；Glenner，N.Engl.J.Med.3021283-1292(Pt.1)和133-1343(Pt.2)(1980))。
淀粉狀蛋白原纖維，不論形成它們的是何種淀粉狀蛋白，已被認(rèn)為對多種類型細(xì)胞有細(xì)胞毒效應(yīng)，包括原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元(Yankner等人，Science250279-282(1990))、胰島B細(xì)胞(Lorenzo等人，Nature 368756-760(1994))和無性細(xì)胞系(Behl等人，Biochem Biophys.Res.Commun.186944-952(1992)；O′Brien等人，Am.J.Pathol.147609-616(1995))。的確，僅有原纖維形式中的淀粉狀蛋白顯示有細(xì)胞毒性(Pike等人，Brain Res.563311-314(1991)；Lorenzo和Yankner，Proc.Natl.Acad.Sci.9112243-12247(1994))。曾假設(shè)原纖維的細(xì)胞毒效應(yīng)是由共同的機(jī)制介導(dǎo)的(Lorenzo和Yankner id.(1994)；Schubert等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA921989-1993(1995))。淀粉樣肽從可溶性單體向不溶性纖維沉淀物的自發(fā)轉(zhuǎn)變可成為與Alzheimer病有關(guān)的神經(jīng)變性的原因。在胰腺中纖維狀人胰島淀粉狀蛋白的淀粉樣沉積物在II型糖尿病中是主導(dǎo)性因素。
糖尿病可定義為慢性代謝性紊亂，其特征是血糖升高(高血糖癥)，與胰島素的分泌或功能缺陷有關(guān)，伴隨著慢性血管并發(fā)癥，是最終引起疾病和死亡的主要原因(Zimmet等人，Nature，414782-787(2001))。糖尿病有兩種主要形式，I型和II型。I型糖尿病是一種自體免疫性疾病，由胰腺β細(xì)胞的進(jìn)行性破壞所引起的，其次是異常的細(xì)胞免疫所引起的。這種疾病的特征是絕對需要胰島素治療才能生存，和在疾病的急性期中胰島的淋巴細(xì)胞浸潤。另一方面，II型糖尿病是一種代謝性疾病，其特征是存在胰島β細(xì)胞功能的進(jìn)行性衰竭，形成細(xì)胞毒性胰島淀粉狀蛋白(可溶或不溶形式)，和胰島素抵抗。這些變化引起了血糖調(diào)節(jié)的進(jìn)行性衰竭，血糖升高(高血糖癥)，最終可引起并發(fā)癥，包括糖尿病性眼，腎臟和神經(jīng)病變，和動脈疾病和其他疾病，這些疾病可導(dǎo)致心臟病發(fā)作，中風(fēng)和壞疽。盡管現(xiàn)在對這些原發(fā)性疾病沒有一致認(rèn)可的分子基礎(chǔ)，外周胰島素抵抗可能是啟動疾病進(jìn)展的原發(fā)病因。
在II型糖尿病的早期，外周胰島素抵抗可能會被增加的胰島素量和胰島β細(xì)胞的增生所代償，僅導(dǎo)致輕微的癥狀(Bell & Polonsky，Nature，414788-791(2001))。但增加的胰島素量也可增加胰島淀粉狀蛋白形成的可能性和隨后其在胰島β細(xì)胞鄰近的細(xì)胞外沉積(MacArthur等人，Diabetologia，421219-1227(1999)；Hoppener等人，N.Engl.J. Med.，343411-419(2000)；Jaikaran & Clark，Biochi.m Biophys.Acia，1537179-203(2001))。
在II型糖尿病中胰島淀粉狀蛋白的出現(xiàn)在一個(gè)世紀(jì)以前就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了。最初，在1869年，Paul Langerhans是第一個(gè)描述內(nèi)分泌胰腺以及束細(xì)胞如何在腺泡細(xì)胞中懸浮和與其不連接的。1893年Laguesse將這些神秘的細(xì)胞命名為胰島或朗格罕島。1889年Oskar Minkowski在其切除胰腺的狗中獲得的發(fā)現(xiàn)，將胰腺和糖尿病聯(lián)系在一起。Bliss，M.，“胰島素的發(fā)現(xiàn)”C.J.Pathol.19873-82(1943)。但在1901年，在Johns Hopkins大學(xué)，Eugene Opie提供了一種缺失的聯(lián)系，即顯示在朗格罕島中糖尿病與透明退行性變之間的病理學(xué)聯(lián)系。他描述了一種透明染色物質(zhì)，現(xiàn)在稱為胰島淀粉狀蛋白，并注意到它和糖尿病之間的聯(lián)系。Opie，E.L，“糖尿病與胰腺病變的關(guān)系朗格罕島的透明退行性變，”J,Exp.Med.5527-40(1901)。這種透明物質(zhì)的含淀粉特征是由Ahronheim在1943年所確定的，并由Ehrlick和Ratner在1961年通過堿性剛果紅染色證實(shí)。Ahronheim，J-H.，“糖尿病中胰島透明物質(zhì)的特征”，Am.J.Pathol.19873-82(1943)；Ehrlich J.C.，Ratner I.M.，“朗格罕島的淀粉樣變性。在糖尿病和非糖尿病個(gè)體中胰島透明物質(zhì)的再研究”，Am.J.Pathol3849-59(1961)。
1987年Cooper等人首先報(bào)道他們發(fā)現(xiàn)這種透明染色物質(zhì)含有37個(gè)氨基酸單體，稱為胰島淀粉狀蛋白。Cooper G.J.S.，Willis A.C.，“來自II型糖尿病病人富含淀粉狀蛋白的胰腺的肽的純化和定性”，Proc.Natl.Acad，Sci.USA 848628-32(1987)。淀粉狀蛋白和II型糖尿病的綜述見Melvin R Hayden和Suresh C Tyagi，“在II型糖尿病中‘A’是胰島淀粉狀蛋白和淀粉狀蛋白”，JOP.J.Pancreas(Online)2(4)124-139(2001)。因此，胰島淀粉狀蛋白的主要成分是37氨基酸肽激素，胰島淀粉狀蛋白，通常是由胰腺內(nèi)的β細(xì)胞分泌的(Cooper等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，848628-8632(1987)；Cooper等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，857763-7766(1988)；Cooper等人，Biochim.Biophys.Acta，1014247-258(1989)；Cooper，Endocr.Rev.，15163-201(1994)；Cooper & Tse，Drugs & Aging，9202-212(1996))。胰島淀粉狀蛋白的分泌通常是和胰島素的產(chǎn)生共同調(diào)節(jié)和共同分泌的，受相同的啟動子和轉(zhuǎn)錄元件的控制。但其機(jī)制沒有完全清楚，但可能是由過度分泌引起的，胰島淀粉狀蛋白相互作用形成纖維狀聚集物，已知是胰島淀粉狀蛋白(Cooper，Endocr.Rev.，15163-201(1994))。其他的特異胰島淀粉狀蛋白分子，如來自猴和貓的，含有可引起淀粉樣原纖維形成的氨基酸序列(Cooper，Endocr.Rev.，15163-201(1994)；Goldsbury等人，J.Struct.Biol.，11917-27(1997)；Goldsbury等人，J.Mol.Biol.，28533-39(1999))。在體外由全長人胰島淀粉狀蛋白(1-37)和這種多肽的片段一人胰島淀粉狀蛋白(8-37)和人胰島淀粉狀蛋白(20-29)形成的原纖維進(jìn)行了詳細(xì)地比較。據(jù)報(bào)道圓二色光譜發(fā)現(xiàn)原纖維的形成伴有不規(guī)則螺旋向β-片層/α-螺旋結(jié)構(gòu)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。原纖維的形態(tài)學(xué)可通過電子顯微鏡來觀察，顯示了不同寬度和數(shù)量的初原纖維的形成。Goldsbury等人，“胰島淀粉狀蛋白全長和片段形成的淀粉樣原纖維”，J.Structural Biol.130(2-3)352-362(June 2000)。也見Walsh等人，“淀粉樣β蛋白原纖維形成”，J.Biol.Chem.274(36)25945-25952(1999)。
胰島淀粉狀蛋白與大量的淀粉狀蛋白病理學(xué)情況有關(guān)，涉及幾種疾病如Alzheimer病，免疫球蛋白輕鏈淀粉樣變性，多種器官和全身淀粉樣變性，和朊病毒腦病(Tjernberg等人，J Biol Chem，27412619-12625(1999)；Sipe & Cohen，J.Struct.Biol.，13088-98(2000)；Collinge，Annu Rev Neurosci，24519-550(2001)；Jaikaran &Clark，Biochim.Biophys.Acta.，1537179-203(2001)；Prusincr，N.Engl.J.Med.3441516-1526(2001))。Alzheimer病是一種神經(jīng)變性疾病，其特征是神經(jīng)元的喪失和與其有關(guān)的細(xì)胞外老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)的出現(xiàn)(Lanza等人，NatureBiotechnology，141107-1111(1996)；Yankner，Naure Medicine，2850-852(1996)；Selkoe，Nature，399A23-31(1999))。淀粉樣沉積物主要是由β-淀粉樣肽(Aβ)的聚合形式組成的(Goldsbury等人，Trends MoL Med.，7582(2001))。朊病毒病也是神經(jīng)變性疾病，主要是由正常細(xì)胞宿主朊病毒蛋白，PrPc的破壞形式組成的(Collinge，Annual Rev.Neurosci，24519-550(2001))。在含有這些不同的淀粉樣變的蛋白之間沒有已知的結(jié)構(gòu)同源性(Sipe & Cohen，J.Struct.Biol，13088-98(2000))，但特別是在胰島淀粉狀蛋白和Alzheimer病和朊病毒腦病中見到的淀粉狀蛋白結(jié)構(gòu)之間有一些基本的差異(Tjernberg等人，J Biol Chem，27412619-12625(1999)；Goldsbury等人，J Struct Biol，130217-231(2000)；Baskakov等人，J.Biol.Chem.，27619687-19690(2001)；Collinge，Annual Rev.Neurosci.，24519-550(2001)；Goldsbury等人，Trends Mol.Med.，7582(2001)；Kallberg等人，J.Biol.Chem.，27612945-12950(2001)；Yang等人，Amyloid，810-19(2001))；(Goldsbury等人，J.Struct.Biol.，11917-27(1997)；Goldsbury等人，J.Mol.Biol.，28533-39(1999)；Goldsbury等人，J.Struct.Biol.，130352-362(2000)；Jaikaran & Clark，BiochimBiophys Acta，1537179-203(2001))。
圓二色光譜顯示胰島淀粉樣原纖維的形成伴有不規(guī)則螺旋向β-片層/α-螺旋結(jié)構(gòu)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變(Goldsbury等人，J.Struct.Biol，130352-362(2000))。相比，Alzheimer和朊病毒淀粉樣變性包括多種不同類型的淀粉狀蛋白生成蛋白，其中淀粉狀蛋白的形成伴有α-螺旋含量的減少和β-片層結(jié)構(gòu)的增加(Barrow等人，J.Mol.Biol.，2251075-1093(1992)；Pan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，9010962-10966(1993))。特別是，Aβ和PrP在一個(gè)應(yīng)該形成β鏈的多肽片段中隱藏了一個(gè)α-螺旋(Kallberg等人，J Biol Chem.，27612945-12950(2001))。在PrPc中，這個(gè)區(qū)出現(xiàn)在螺旋2，位點(diǎn)179-191，而對于Alzheimer Aβ-肽，這種不一致性出現(xiàn)在位點(diǎn)16-23。當(dāng)殘基14-23被去除或改變?yōu)榉遣灰恢滦蛄袝r(shí)，Aβ原纖維就不再形成了(Kallberg等人，J.Bio.l Chem.，27612945-12950(2001))。相同的抑制效應(yīng)通過將Aβ與對應(yīng)于殘基16-20的五肽孵育而產(chǎn)生(Tjernberg等人，J.Biol.Chem.，2718545-8548(1996))。因此，α-螺旋/β-鏈不協(xié)調(diào)的伸展與這種類型的淀粉樣原纖維的形成有關(guān)，對于Aβ和PrPc，涉及一種α-螺旋結(jié)構(gòu)向β鏈形成的轉(zhuǎn)變，見(Kallberg等人，J Biol.Chem.，27612945-12950(2001))。這些發(fā)現(xiàn)支持的觀點(diǎn)是在胰島淀粉狀蛋白和其他淀粉狀蛋白病理學(xué)之間存在明顯的結(jié)構(gòu)/功能的聯(lián)系。
以前關(guān)于Alzheimer病和朊病毒腦病的研究主要集中在Aβ的聚合特性上(Mazziotti & Perlmutter，Biochem.J.，332(Pt 2)517-524(1998)；Bohrmann等人，J.Biol.Chem.27415990-15995(1999)；Tjernberg等人，J.Biol.Chem.，27412619-12625(1999)；Tjemberg等人，Chem.Biol，653-62(1999)；Goldsbury等人，J.Struct.Bio.l，130217-231(2000)；Jensen等人，Mol.Med.，6291-302(2000)；Lannfelt & Nordstedt，J.Neural.Transm.Suppl.59155-161(2000)；Nunomura等人，J.Neuropathol Exp.Neurol.，591011-1017(2000)；Chishti等人，J.Biol.Chem.，27621562-21570(2001)；Yang等人，Amyloid，810-19(2001))，和正常細(xì)胞朊病毒蛋白，PrPc轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的綿羊瘋癢病異構(gòu)體，PrPSc(Hill等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9710248-10253(2000)；Kourie & Shorthouse，Am.J.Physiol.Cell Physiol.，278C1063-1087(2000)；Thellung等人，Int.J.Dev.Neurosci.，18481-492(2000)；Baskakov等人，J.Biol.Chem.，27619687-19690(2001)；Jackson & Collinge，Mol.Pathol.，54393-399(2001)；Jansen等人，Biol.Chem.，382683-691(2001)；Prusiner，N.Engl.J.Med.，3441516-1526(2001)；Rudd等人，Biochemistry，403759-3766(2001)；Tagliavini等人，Adv.Protein Chem.，57171-201(2001))。由于這些淀粉樣變與疾病的病理有關(guān)或是其主要原因，很多研究都集中于在體內(nèi)阻止淀粉狀蛋白形成的策略上。對于Aβ，很多研究是針對某些肽和非肽化合物，試圖調(diào)節(jié)原纖維的形成，可通過許多體外測定方法來檢測(Tjemberg等人，J.Biol.Chem.，2718545-8548(1996)；Bohrmann等人，J.Biol.Chem.，27415990-15995(1999)；Chyan等人，J.Biol.Chem.，27421937-21942(1999)；Findeis & Molineaux，Methods Enzymol，309476-488(1999)；Findeis等人，Biochemistry，386791-6800(1999)；Bohrmann等人，J.Struct.Biol.，130232-246(2000)；Findeis，Biochim.Biophys.Acta.，150276-84(2000)；Kuner等人，J.Biol.Chem.，2751673-1678(2000)；Forloni等人，F(xiàn)EBS Lett.，487404-407(2001)；Poeggeler等人，Biochemistry，4014995-15001(2001))。
采用電子顯微鏡，硫磺素-T結(jié)合測定，和對胰島素消化作用的易感性，典型的抗生素，四環(huán)素和強(qiáng)力霉素，據(jù)報(bào)道似乎可調(diào)節(jié)Aβ的形成和去除存在的淀粉狀蛋白(Forloni等人，F(xiàn)EBS Lett.，487404-407(2001))。蒽環(huán)霉素的另一個(gè)類型，4′碘化-4′-去氧阿霉素(IDOX)據(jù)報(bào)道也可在體外和體內(nèi)抑制Aβ淀粉狀蛋白的形成，以及其他的淀粉狀蛋白生成蛋白(Merlini等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，922959-2963(1995))。作者推測IDOX可降低Aβ淀粉狀蛋白的形成，增加存在的斑塊的可溶性，因此可通過正常細(xì)胞的機(jī)制加速清除率(Merlini等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，922959-2963(1995))。Szarek等人(美國專利申請20010027186(2001年5月17日)宣稱可通過含有膦酸酯和羧酸酯基團(tuán)的化合物破壞Aβ-淀粉狀蛋白。也可見Szarek等人1999年2月9日發(fā)布的美國專利No.5,869,469，“治療淀粉樣變性的膦酰羧酸酯化合物”，據(jù)說涉及在受者體內(nèi)通過使用一種含有膦酸酯和羧酸酯基團(tuán)，或一種藥用可接受的鹽類或其酯的化合物來調(diào)節(jié)淀粉狀蛋白沉積的方法。專利宣稱在優(yōu)選的實(shí)施例中，在淀粉狀蛋白生成蛋白和基底膜成分之間的相互作用可被調(diào)節(jié)。
剛果紅，通常用作淀粉狀蛋白染色的一種化合物(Khurana等人，J.Biol.Chem.，27622715-22721(2001))，和多種衍生物也已經(jīng)被認(rèn)為在細(xì)胞培養(yǎng)中可抑制Aβ淀粉狀蛋白的神經(jīng)毒性，可能是通過穩(wěn)定Aβ前淀粉狀蛋白單體(Lorenzo & Yankner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9112243-12247(1994)；Findeis，Biochim.Biophys.Acta.，150276-84(2000))。也見Caughey和Race于1994年1月4日發(fā)布的美國專利No.5,276,059，“抑制與淀粉狀蛋白形成相關(guān)的疾病”。專利提到，剛果紅可用于以下的方法，即鑒定一種哺乳動物患有與斑塊中淀粉狀蛋白生成蛋白沉積有關(guān)的疾病，并“為所述哺乳動物應(yīng)用一種藥理學(xué)有效量的藥用可接受鹽類或其衍生物，或其用量足以干擾淀粉狀蛋白生成蛋白的形成或使已經(jīng)在哺乳動物體內(nèi)形成的淀粉狀蛋白生成蛋白的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定”。專利深入提到該方法考慮到治療大量的這種淀粉狀蛋白生成的疾病，“發(fā)明的優(yōu)選形式”據(jù)說是治療，防止和/或抑制“在中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織出現(xiàn)的與斑塊有關(guān)的疾病”。在另一種形式中，該法據(jù)說可用于針對涉及淀粉樣斑塊形成的內(nèi)部器官疾病，包括胰腺內(nèi)的斑塊和“治療胰腺中出現(xiàn)斑塊的成人II型糖尿病”。
對于朊病毒腦病的其他策略最近也有報(bào)道(Aguzzi等人，Nat.Rev.Neurosci.，2745-749(2001))。朊病毒專門是由一種錯(cuò)構(gòu)的朊病毒異構(gòu)體PrPSc組成的，來自PrPc的一種主要構(gòu)象變化，后者是一種正常的宿主編碼的糖酯錨著蛋白(Collinge，Annu.Rev.Neurosci.，24519-550(2001))。已報(bào)道的關(guān)于吖啶和吩噻嗪衍生物的發(fā)現(xiàn)使作者相信許多化合物可作為治療Creutzfeldt-Jakob病和其他朊病毒疾病的中間候選物質(zhì)(Korth等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，989836-9841(2001))。檢測了一定范圍的三環(huán)化合物，據(jù)報(bào)道氯丙嗪和奎納克林也可有效的逆轉(zhuǎn)綿羊瘋癢病毒感染的鼠細(xì)胞培養(yǎng)物中可形成疾病的朊病毒斑塊(Korth等人，Proc.Natl.Acad，Sci.USA，989836-9841(2001))。作者注意到中央三環(huán)上的脂肪族側(cè)鏈?zhǔn)亲畲笙薅纫种齐貌《景邏K形成羧必須的。Id.在另一項(xiàng)研究中，報(bào)道四環(huán)素可以(i)結(jié)合和抑制淀粉樣原纖維的裝配，該原纖維是由對應(yīng)于人PrPc殘基106-126和82-146的合成肽產(chǎn)生的；(ii)去除從Creutzfeldt-Jakob病患者腦組織中提取的PrP肽聚集物和PrPSc的蛋白酶抗性；(iii)防止體外PrP肽誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡和星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。據(jù)報(bào)道NMR光譜也發(fā)現(xiàn)了四環(huán)素的芳香質(zhì)子和PrP106-126的Ala(117-119)，Val(121-122)以及Leu(125)側(cè)鏈質(zhì)子之間的幾種空間相互作用(Tagliavini等人，J.Mol.Biol.，3001309-1322(2000))。
胰島淀粉狀蛋白在II型糖尿病的發(fā)病機(jī)制中的地位已經(jīng)爭論了很長時(shí)間，現(xiàn)在仍然不清楚(Cooper，Endocr.Rev.，15163-201(1994)；Cooper&Tse，Drugs &Aging，9202-212(1996)；Cooper，生理學(xué)手冊。第7章內(nèi)分泌系統(tǒng)。第II卷內(nèi)分泌胰腺和代謝的調(diào)節(jié)(2001))。但在此認(rèn)為胰島淀粉狀蛋白的慢性沉積可加速β細(xì)胞的喪失，是在II型糖尿病晚期β細(xì)胞功能喪失的重要因素。這種說法可由幾種已出現(xiàn)的證據(jù)體系所支持。首先，人胰島淀粉狀蛋白可在大多數(shù)II型糖尿病患者中形成胰島淀粉狀蛋白(Hoppener等人，N.Engl.J.Mod.，343411-419(2000)；Jaikaran & Clark，Biochim Biophys Acta，1537179-203(2001))。第二，人胰島淀粉狀蛋白，但不是非形成原纖維的變異體，可在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中引起胰腺胰島β細(xì)胞的死亡(Lorenzo & Yankner，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，9112243-12247(1994)；Bai等人，Biochem.J.，343 Pt 153-61(1999))。第三，在轉(zhuǎn)基因小鼠的胰腺中人胰島淀粉狀蛋白的位點(diǎn)特異性表達(dá)可通過β細(xì)胞的喪失重新產(chǎn)生糖尿病樣的綜合征(Verchere等人，Hormone &.Metabolic Research，29311-316(1997)；Soeller等人，Diabetes，47743-750(1998)；Hoppener等人，Diabetologia，42427-434(1999))。
還有其他的不同于在此所描述和聲明的一些途徑已經(jīng)用來嘗試治療淀粉狀蛋白相關(guān)的疾病。Findeis等人公布的美國專利No，5,854,204，“可調(diào)節(jié)β淀粉狀蛋白聚集的αβ肽”認(rèn)為使用一種淀粉狀蛋白生成蛋白或其肽片段，直接或間接與至少一種修飾基團(tuán)偶聯(lián)，這樣化合物化合物當(dāng)與天然的淀粉狀蛋白生成蛋白或肽接觸時(shí)，可調(diào)節(jié)天然淀粉狀蛋白或肽的聚集。專利提到淀粉狀蛋白生成蛋白或片段可以是甲狀腺運(yùn)載蛋白(TTR)，朊病毒蛋白(PrP)，胰島淀粉狀蛋白(LAPP)，心鈉利尿因子(ANF)，κ輕鏈，λ輕鏈，淀粉狀蛋白A，procalcitonin，cystatin C，β2微球蛋白，ApoA-I，凝溶膠蛋白，降鈣素，纖維蛋白原或溶菌酶。
Simpkins等人于1999年1月12日公布的美國專利No.5,859,001，“多環(huán)苯酚化合物的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)”據(jù)說涉及使用一種在四環(huán)的環(huán)戊烷菲化合物結(jié)構(gòu)中具有一個(gè)末端苯酚基團(tuán)的非雌激素化合物來為細(xì)胞賦予神經(jīng)保護(hù)作用，并治療神經(jīng)變性疾病。也可見Simpkins等人在2001年3月6日公布的美國專利No.6,197,833，“多環(huán)苯酚化合物的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)”。
Reiner等人在2001年4月24日公布的美國專利No.6,221,667，“調(diào)節(jié)淀粉樣變的方法和組合物”中涉及的方法和組合物宣稱可用于治療淀粉樣變和與其相關(guān)的疾病和狀態(tài)，如Alzheimer病，通過給予可調(diào)節(jié)淀粉樣變前體蛋白分解和淀粉狀蛋白沉積的藥劑，用來抑制出現(xiàn)淀粉狀蛋白沉積的疾病中的淀粉樣變。該法的基礎(chǔ)據(jù)說是通過使用一種可移動的離子載體，如羰基氰化物p-(三氟甲氧基)苯腙在含有淀粉樣變前體蛋白的細(xì)胞中調(diào)節(jié)淀粉樣變前體蛋白的分解代謝。
Findeis等人在2001年8月21日公布的美國專利No.6,277,826，“含有D-氨基酸的β-淀粉樣肽聚集物的調(diào)節(jié)物”據(jù)說涉及完全由D-氨基酸組成的肽，可調(diào)節(jié)天然β淀粉樣肽的聚集。這些肽據(jù)說優(yōu)選基于一種β淀粉樣肽，優(yōu)選含有3-5 D-氨基酸殘基，包括至少兩個(gè)D-氨基酸殘基，分別選自D-亮氨酸，D-苯丙氨酸和D-纈氨酸。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，專利提到肽是β淀粉樣肽的一種retro-inverso異構(gòu)體，在某些實(shí)施例中，該肽在氨基末端，羧基末端或兩個(gè)末端進(jìn)行修飾。優(yōu)選的氨基末端修飾基團(tuán)據(jù)說包括環(huán)狀的，雜環(huán)的，多環(huán)的和分支的烷基，優(yōu)選的羧基末端修飾基團(tuán)據(jù)說包括酰胺基團(tuán)，烷基酰胺基團(tuán)，芳基酰胺基團(tuán)或羥基。也見Findeis等人2001年10月16日公布的美國專利No.6,303,567，“含有D-氨基酸的β-淀粉樣肽聚集物的調(diào)節(jié)物”。
現(xiàn)在還沒有一種化合物被證明能夠干擾胰島淀粉狀蛋白形成或破壞已有的胰島淀粉狀蛋白。據(jù)報(bào)道剛果紅可在體外抑制胰腺細(xì)胞中人淀粉狀多肽的毒性。但不是胰島淀粉狀蛋白原纖維的形成(Lorenzo & Yankner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9112243-12247(1994))。相反，據(jù)報(bào)道剛果紅可通過抑制原纖維形成或通過與已形成的Aβ原纖維結(jié)合而抑制Aβ淀粉狀蛋白的神經(jīng)毒性。Id.
現(xiàn)在需要其他的方法來阻斷淀粉狀蛋白的產(chǎn)生和阻斷與可溶性胰島淀粉狀蛋白向不溶性淀粉狀多肽轉(zhuǎn)變相關(guān)的毒性，并阻斷初原纖維的形成。也需要阻斷淀粉樣β肽在神經(jīng)元中的毒性，抑制淀粉樣β肽的產(chǎn)生，并阻斷可引起疾病的多種其他細(xì)胞毒性淀粉狀蛋白的產(chǎn)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了采用一種或多種已確定類型的多環(huán)化合物在細(xì)胞中阻斷淀粉狀蛋白毒性的方法。也提供了減少細(xì)胞中淀粉狀蛋白產(chǎn)生的方法。本發(fā)明的化合物和方法可用來防止和治療各種類型的疾病狀態(tài)，已知為所有淀粉狀蛋白沉積物引起的淀粉樣變性。
根據(jù)發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了鑒定可阻斷通常與淀粉狀蛋白有關(guān)的毒性的化合物的方法，這些毒性作用來自可溶的胰島淀粉狀蛋白向不溶的胰島淀粉狀蛋白的轉(zhuǎn)變和初原纖維的形成。
本發(fā)明也提供了鑒定多種淀粉樣變性肽的有活性的細(xì)胞毒性構(gòu)象異構(gòu)體，并防止它們形成的方法。還提供了篩選用于本發(fā)明方法的化合物的方法，包括有效破壞胰島淀粉狀蛋白從可溶形式向不溶形式轉(zhuǎn)變的化合物，抑制淀粉狀蛋白前原纖維和原纖維聚集的化合物，和抑制淀粉狀蛋白β原纖維和β片層形成轉(zhuǎn)變所誘導(dǎo)的毒性的化合物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及II型糖尿病的治療和其中使用的藥物。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明包括在受者體內(nèi)治療II型糖尿病的方法，優(yōu)選人或其他哺乳動物受者或其他需要的合適個(gè)體，該方法包括通過給予本發(fā)明的適合的多環(huán)化合物從胰島β細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外破壞胰島淀粉狀蛋白。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括在受者體內(nèi)治療II型糖尿病的方法，優(yōu)選人或其他哺乳動物受者或其他需要的合適個(gè)體，該方法包括通過給予本發(fā)明的適合的多環(huán)化合物從胰島β細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外破壞胰島淀粉狀蛋白初原纖維形成。仍然在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括通過保護(hù)所述患者的胰島β細(xì)胞免于死亡，通過從所述β細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外破壞胰島淀粉狀蛋白或胰島淀粉狀蛋白初原纖維的形成治療受者的方法，優(yōu)選人或其他哺乳動物受者或其他需要的合適個(gè)體。仍在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括治療受者的方法，優(yōu)選人或其他哺乳動物受者或有需求的其他合適個(gè)體，包括但不限于患有或有II型糖尿病危險(xiǎn)的受者，在用在此所描述和聲明的多環(huán)化合物治療后得到胰島β細(xì)胞功能衰竭的改善或減輕。仍在一個(gè)深入的方面，本發(fā)明包括治療受者的方法，優(yōu)選人或其他哺乳動物受者或其他有需求的合適個(gè)體，包括但不限于患有或有II型糖尿病危險(xiǎn)的受者，包括從所述胰島β細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外破壞胰島淀粉狀蛋白，并有助于清除胰島淀粉狀蛋白。仍在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括治療受者的方法，優(yōu)選人或其他哺乳動物受者或其他有需求的合適個(gè)體，包括但不限于患有或有II型糖尿病危險(xiǎn)的受者，包括破壞人胰島淀粉狀蛋白，并幫助免疫識別和清除淀粉狀蛋白。仍在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括治療受者的方法，優(yōu)選人或其他哺乳動物受者或其他有需求的合適個(gè)體，包括但不限于患有或有II型糖尿病危險(xiǎn)的受者，包括用發(fā)明的多環(huán)化合物聯(lián)合一種輔助治療共同治療所述的受者，所述輔助治療如免疫治療，可促進(jìn)體內(nèi)胰島淀粉狀蛋白或胰島淀粉狀蛋白前體或胰島淀粉狀蛋白初原纖維的清除。仍在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括治療受者的方法，優(yōu)選人或其他哺乳動物受者，或其他有需求的合適個(gè)體，包括但不限于患有或有II型糖尿病危險(xiǎn)的受者，在用本發(fā)明的多環(huán)化合物聯(lián)合其他輔助治療共同治療后得到胰島β細(xì)胞功能衰竭的改善或減輕，所述輔助治療如免疫治療，可激發(fā)體內(nèi)對胰島淀粉狀蛋白、胰島淀粉狀蛋白前體或胰島淀粉狀蛋白初原纖維的清除機(jī)制。仍在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括治療受者的方法，優(yōu)選人或其他哺乳動物受者或其他有需求的合適個(gè)體，包括但不限于患有或有II型糖尿病危險(xiǎn)的受者，含有或包括用發(fā)明的多環(huán)化合物和如免疫治療的輔助治療方法聯(lián)合治療所述患者，它們共同破壞已經(jīng)形成的人胰島淀粉狀蛋白和/或在所述β細(xì)胞中抑制從胰島淀粉狀蛋白形成胰島淀粉狀蛋白。
仍在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括采用硫磺素-T增強(qiáng)熒光法、放射活性淀粉狀蛋白沉淀測定、電子顯微鏡法和在培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞中測定胰島淀粉狀蛋白的細(xì)胞毒性以及圓二色光譜體外測定多環(huán)化合物所致胰島淀粉狀蛋白破壞的方法。仍在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及預(yù)防淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的方法，包括防止初原纖維的形成和/或減少已存在的初原纖維沉積物。
仍在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括采用硫磺素-T增強(qiáng)熒光法、放射活性淀粉狀蛋白沉淀測定、電子顯微鏡法和在培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞中測定胰島淀粉狀蛋白的細(xì)胞毒性以及圓二色光譜在體外篩選作為破壞胰島淀粉狀蛋白的潛在藥物的多環(huán)化合物的方法。
仍在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括使用發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)多環(huán)化合物制造含有或包括多環(huán)化合物和其合適的藥物載體的藥物組合物，該組合物用于治療受者，優(yōu)選人或其他哺乳動物受者或其他有需求的合適個(gè)體，包括但不限于患有或有II型糖尿病危險(xiǎn)的受者，通過下列的一項(xiàng)或多項(xiàng)(i)破壞已形成的人胰島淀粉狀蛋白；(ii)抑制隨后胰島淀粉狀蛋白形成胰島淀粉狀蛋白；(iii)改善胰島β細(xì)胞功能；和/或(iv)減輕胰島β細(xì)胞的功能衰竭。
本發(fā)明包括但不限于以前和/或在此所描述的對所有患有II型糖尿病或有進(jìn)展為II型糖尿病或胰腺胰島淀粉狀蛋白或胰島β細(xì)胞功能不良危險(xiǎn)的哺乳動物種屬的治療方法。
申請人的發(fā)明是指采用一種或多種在此公開的、已鑒定的和/或聲明的化合物制備和/或制造一種(多種)藥物以治療一種或多種紊亂、疾病、狀態(tài)和/或在此提到的目的的方法。


圖1通過硫磺素-T熒光的增強(qiáng)顯示了四環(huán)素和剛果紅對人胰島淀粉狀蛋白的效應(yīng)。
圖2通過硫磺素-T熒光的增強(qiáng)顯示了氯丙嗪對人胰島淀粉狀蛋白的效應(yīng)。
圖3通過硫磺素-T熒光的增強(qiáng)顯示了選擇的多環(huán)化合物對人胰島淀粉狀蛋白的效應(yīng)。
圖4顯示了在四環(huán)素存在和不存在的情況下人胰島淀粉狀蛋白原纖維的電鏡照片。
圖5顯示了在存在和不存在奎納克林的情況下人胰島淀粉狀蛋白原纖維的電鏡照片。
圖6顯示了在存在和不存在選擇的多環(huán)化合物的情況下人胰島淀粉狀蛋白原纖維的電鏡照片。
圖7通過放射性標(biāo)記沉淀顯示了四環(huán)素對胰島糊精原纖維的效應(yīng)。
圖8通過放射性標(biāo)記沉淀顯示了選擇的多環(huán)化合物對胰島糊精原纖維的效應(yīng)。
圖9通過圓二色光譜顯示了剛果紅對胰島糊精原纖維的效應(yīng)。
圖10顯示了剛果紅對胰島淀粉狀蛋白原纖維介導(dǎo)的RJNm5F細(xì)胞毒性的保護(hù)效應(yīng)。
發(fā)明詳述申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了某些多環(huán)化合物可用于破壞胰島淀粉狀蛋白的形成，并可用于治療II型糖尿病。這種策略并不依賴于通過受體介導(dǎo)的機(jī)制來阻斷胰島淀粉狀蛋白介導(dǎo)的作用。實(shí)際上，對于胰島淀粉狀蛋白的細(xì)胞毒性成分不需要任何特異的機(jī)制進(jìn)行結(jié)合，該策略主要針對破壞胰島淀粉狀蛋白的形成。在臨床的環(huán)境下，在體內(nèi)調(diào)節(jié)胰島淀粉狀蛋白，結(jié)合內(nèi)源性清除機(jī)制，有改善β功能或防止β細(xì)胞功能進(jìn)一步喪失和減少損失的潛在可能性。
本申請公開了細(xì)胞毒性效應(yīng)是來自可溶的胰島淀粉狀蛋白向不溶性的轉(zhuǎn)變，不管實(shí)際原纖維的形成與否，β鏈的形成可引起普遍的β-折疊片層結(jié)構(gòu)。此外，這種轉(zhuǎn)變作用的破壞可保護(hù)β細(xì)胞免受死亡。
在此胰島淀粉狀蛋白定義為含有人糊精，通過單體的人糊精的聚集形成不溶性的胰島淀粉狀蛋白或可溶的淀粉狀蛋白前體，或?qū)σ葝uβ細(xì)胞有細(xì)胞毒性的任何形式的人糊精。如在文中所提到的，人糊精原纖維在此也定義為胰島淀粉狀蛋白的成分。
通過多環(huán)化合物破壞胰島淀粉狀蛋白在此定義為不溶的人胰島淀粉狀蛋白全部或部分轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇艿那绑w，和/或減少或防止人糊精形成胰島淀粉狀蛋白的速率。在此定義中所包括的是多環(huán)化合物與胰島淀粉狀蛋白的相互作用，可引起胰島淀粉狀蛋白對胰島β細(xì)胞的細(xì)胞毒性特性的改變。本申請認(rèn)為有效使用非肽分子的前景在于(i)減慢人胰島淀粉狀蛋白形成的速率或抑制其形成，和/或(ii)破壞人胰島淀粉狀蛋白的已存在形式。我們相信使用非肽多環(huán)化合物的方法可達(dá)到(i)和(ii)，可作為一種專門的治療方法或于其他治療方法聯(lián)合使用。
本發(fā)明認(rèn)識到多環(huán)化合物已經(jīng)以單一的用藥方案用于治療普通的精神失調(diào)(Drisko，J.Clin.Periodontol.，25947-952(1998)；Klein & Cunha，Med.Clin.NorthAm.，85125-132(2001))。特別合適的是通過方便的途徑如口服或胃腸外給予人體的一些組合物，這樣可使這些化合物緩慢的應(yīng)用于有II型糖尿病危險(xiǎn)或已經(jīng)患有該病的患者。
如在此所使用的，提到“多環(huán)化合物”也包括合適的多環(huán)化合物的組合?？善茐囊葝u淀粉狀蛋白的多環(huán)化合物，包括的化合物如奎納克林(一種抗瘧疾化合物)，氯丙嗪(一種抗精神病化合物)，和四環(huán)素(一種抗生素)。其他具有四環(huán)素，阿迪平，氯丙嗪和剛果紅的核心結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)(如，吖啶，酚噻嗪，蒽環(huán)霉素以及融合環(huán)和聯(lián)苯基結(jié)構(gòu)的結(jié)合體)也是本發(fā)明的多環(huán)化合物。
根據(jù)本發(fā)明，提供了阻斷通常與淀粉狀蛋白有關(guān)的毒性的方法，所述的毒性來自細(xì)胞中可溶的胰島淀粉狀蛋白向不溶性胰島淀粉狀蛋白的轉(zhuǎn)變和初原纖維的形成，所述的方法包括將所述的細(xì)胞與有效量的至少一種多環(huán)化合物接觸，該化合物選自在此所包含的一組多環(huán)化合物。特別地是，該組多環(huán)化合物包括蒽，phenalene，菲，奎納克林，吖啶，吖啶橙，中性紅，氯丙嗪，亞甲藍(lán)，酚噻嗪，芘，屈，苯[a]蒽，苯[m]蒽，苯[c]菲，和并四苯。這些分子共享一個(gè)多環(huán)結(jié)構(gòu)的通用結(jié)構(gòu)。也可使用具有相似多環(huán)結(jié)構(gòu)的分子。
發(fā)明的方法可選擇性的采用上述化合物的藥物學(xué)可接受的鹽類發(fā)揮效應(yīng)。這些鹽類通?？赏ㄟ^將化合物與一種合適的有機(jī)或無機(jī)酸或堿反應(yīng)而制備。代表性的有機(jī)鹽類包括甲磺酸鹽，乙酸鹽，草酸鹽，己二酸鹽，藻酸鹽，天冬氨酸，戊酸鹽，油酸鹽，月桂酸鹽，硼酸鹽，苯甲酸鹽，乳酸鹽，磷酸鹽，甲苯磺酸鹽(tosylate)，檸檬酸鹽，蘋果酸鹽，馬來酸鹽，富馬酸鹽，琥珀酸鹽，酒石酸鹽，萘磺酸鹽，甲磺酸鹽，2-萘磺酸鹽，煙酸鹽，苯磺酸鹽，丁酸鹽，樟腦酸鹽，樟腦磺酸鹽，環(huán)戊烷丙酸鹽，二葡萄糖酸鹽，十二烷基硫酸酯，葡萄糖庚酸鹽(glucoheptanoate)，甘油磷酸鹽，heptanoate，己酸鹽，十一烷酸鹽(undecanoate)，2-羥基乙磺酸鹽，乙磺酸鹽等。代表性的無機(jī)鹽類可從無機(jī)酸形成，如硫酸鹽，重硫酸鹽，半硫酸鹽，鹽酸鹽，氯酸鹽，高氯酸鹽，氫溴酸鹽，氫碘酸鹽等。堿性鹽的實(shí)例包括銨鹽；堿金屬鹽類如鈉鹽，鉀鹽，等；堿土金屬如鈣鹽，鎂鹽等；含有機(jī)堿的鹽類如二環(huán)己基銨鹽，N-甲基-D-葡萄糖胺，苯乙胺等；含氨基酸的鹽類如精氨酸，賴氨酸等。這樣的鹽類可很容易地采用本領(lǐng)域已知的方法來制備。
如在此所使用的，術(shù)語“阻斷通常與淀粉狀蛋白有關(guān)的毒性”是指防止或抑制可溶性胰島淀粉狀蛋白向不溶性胰島淀粉狀蛋白轉(zhuǎn)變和初原纖維形成所引起的對細(xì)胞和組織的有害和致死作用。
如在此所使用的，術(shù)語“β-構(gòu)象異構(gòu)體”是指具有某些程度β片層結(jié)構(gòu)的非單體胰島淀粉狀蛋白。
如在此所使用的，術(shù)語“初原纖維”是指單一的初原纖維和更高等級的初原纖維結(jié)構(gòu)，包括人胰島淀粉狀蛋白或其他哺乳動物胰島淀粉狀蛋白變異體的寡聚體形式，顯示有一定數(shù)量的β-構(gòu)象異構(gòu)體，并是非單體的。
不受任何一種機(jī)制的限制，可以認(rèn)識到能干擾可溶性胰島淀粉狀蛋白向不溶性胰島淀粉狀蛋白的轉(zhuǎn)變和初原纖維形成的化合物能夠阻斷通常與淀粉狀蛋白有關(guān)的毒性。這些化合物包括如在此所述的多環(huán)化合物。
另外，可防止或抑制淀粉樣肽產(chǎn)生的組合物和防止或抑制淀粉樣原纖維形成的化合物能夠阻斷通常與淀粉狀蛋白有關(guān)的毒性。
傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為過高水平的淀粉狀蛋白對細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。申請人發(fā)現(xiàn)構(gòu)象的變化(如從可溶性胰島淀粉狀蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄砸葝u淀粉狀蛋白，β-構(gòu)象異構(gòu)體和/或初原纖維形成)是治療所需的靶標(biāo)。
此外，以前認(rèn)為淀粉狀蛋白聚集形成淀粉樣原纖維可能是細(xì)胞毒性作用所需要的，但形成淀粉狀蛋白毒性的生化機(jī)制尚不明確。申請人證明了聚集對細(xì)胞毒性的形成不是必須的；但抑制淀粉狀蛋白的聚集是減少細(xì)胞毒性的另一種方式。
如在此所使用的，“淀粉狀蛋白毒性”是指淀粉狀蛋白對細(xì)胞的任何有害效應(yīng)，特別是所述的構(gòu)象轉(zhuǎn)變或前原纖維的形成引起了有害的作用。
如在此所使用的，術(shù)語“接觸”是指將化合物提供給細(xì)胞或細(xì)胞靶標(biāo)。接觸可發(fā)生在固相，液相或氣相，是指發(fā)生在細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的事件。本領(lǐng)域那些專業(yè)技術(shù)人員將認(rèn)識到在體內(nèi)將化合物提供給細(xì)胞可通過多種給藥方式來達(dá)到，包括口服，舌下，靜脈，皮下，經(jīng)皮，肌肉，皮內(nèi)，鞘內(nèi)，硬膜外，眼內(nèi)，顱內(nèi)，吸入，直腸，陰道等。
如在此所應(yīng)用的，術(shù)語“有效量”，當(dāng)用在使用多環(huán)化合物的發(fā)明的方法時(shí)，是指化合物的劑量足以提供足夠高的濃度以獲得所需的結(jié)果。對于任何一種化合物的特異有效量依賴于多種因素，包括細(xì)胞的類型，給藥的時(shí)間，疾病的嚴(yán)重性，所使用的特異化合物的活性，給藥的途徑，特異化合物的清除速率，細(xì)胞接觸化合物的暴露周期，與特異化合物聯(lián)合使用或一起使用的藥物等。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了阻斷淀粉狀蛋白毒性的方法，通過阻斷可溶的胰島淀粉狀蛋白向不溶的胰島淀粉狀蛋白的轉(zhuǎn)變，和初原纖維的形成，其中淀粉狀蛋白的毒性是淀粉狀蛋白β肽的毒性。如在此所使用的，“淀粉狀蛋白β肽”(Aβ)是指大約40至43個(gè)氨基酸殘基的蛋白。淀粉狀蛋白β肽主要是40個(gè)氨基酸的形式，即淀粉狀蛋白β1-40，但淀粉狀蛋白β1-42和淀粉狀蛋白β1-43也與淀粉樣原纖維和沉積有關(guān)。蛋白是通過其更大的前體水解裂解得到的，這些前體已知是淀粉樣β前體蛋白(AβPP)。AβPP，淀粉狀蛋白前體樣蛋白家族的一個(gè)成員，以三種主要的亞型存在，分別為695，751和770個(gè)氨基酸殘基，每種均含有淀粉樣β肽的氨基酸序列。AβPP在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，傳遞至細(xì)胞表面作為內(nèi)膜蛋白。AβPP存在于樹突中，細(xì)胞體中和神經(jīng)元軸突中，盡管其正常的神經(jīng)元功能并不清楚。在細(xì)胞膜中的一些AβPP被內(nèi)化至細(xì)胞中，在此被酶解處理成為一種淀粉狀蛋白β肽。
經(jīng)歷幾種分泌酶的蛋白水解AβPP形成多種形式的淀粉狀蛋白β肽。分泌酶的一種類型，γ-分泌酶，在前體的羧基末端區(qū)切斷AβPP，從每個(gè)前體分子中產(chǎn)生淀粉狀蛋白β肽的單一拷貝。另一種類型的分泌酶，α-分泌酶，可在淀粉狀蛋白β序列之中切斷前體，因此這種酶的切割不產(chǎn)生淀粉狀蛋白β肽。
淀粉狀蛋白β肽是在Alzheimer病患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的老年斑中的主要成分。老年(或神經(jīng)炎斑塊)，由淀粉狀蛋白β蛋白的細(xì)胞外沉積物，營養(yǎng)不良的軸突和星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞瘤組成，可分布在整個(gè)神經(jīng)纖維網(wǎng)和大腦血管壁中。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提供了阻斷淀粉狀蛋白毒性的方法，其中淀粉狀蛋白的毒性是朊病毒蛋白毒性。如在此所使用的，“朊病毒”是指人朊病毒基因(稱為PRNP)的產(chǎn)物，該基因定位于染色體20的短臂上，其開放可讀框包括編碼254個(gè)殘基的一個(gè)外顯子。正常的朊病毒基因產(chǎn)物，朊病毒蛋白(PrP)是一個(gè)結(jié)構(gòu)性表達(dá)的細(xì)胞表面糖蛋白，通過一個(gè)糖脂接頭與細(xì)胞膜結(jié)合。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)了最高水平的PrP信使，但蛋白的功能未知。正常的細(xì)胞朊病毒蛋白和感染的朊病毒蛋白在氨基酸序列上是不同的，但類似于淀粉狀蛋白，正常和感染的蛋白具有不同的三維構(gòu)象。正常的朊病毒蛋白富含α-螺旋，具有四個(gè)推測的區(qū)域，和少量的β折疊片層構(gòu)象。相比，感染的蛋白β折疊片層構(gòu)象較多。正常和感染的蛋白也有不同的糖基化方式(見病理學(xué)，3.sup.rd ed.(1999)Rubin和Farber主編，Lippincott-Raven，1492-1496頁)。
仍根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提供了阻斷淀粉狀蛋白毒性的方法，其中淀粉狀蛋白的毒性是胰島淀粉狀蛋白的毒性。如在此所使用的，“糊精”是指在朗格罕島中的β細(xì)胞所分泌的胰島素一起分泌的一種多肽。胰島淀粉狀蛋白是一個(gè)37-殘基，C末端酰胺化的肽，在殘基2和1的半胱氨酸之間有一個(gè)二硫鍵，序列中的多個(gè)片段足以形成含β片層的淀粉樣原纖維(如，Nilsson和Raleigh，J.Mol.Biol.2941375-85；Rhoades等人，Biochim Biophys Acta 1476230-8(2000)；和Tenidis等人，J.Mol.Biol.2951055-1071(2000))，在超過95％的II型糖尿病患者中發(fā)現(xiàn)有胰腺淀粉狀蛋白，是由胰島淀粉狀蛋白聚集形成的。
仍然根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提供了阻斷淀粉狀蛋白毒性的方法，所述的毒性來自可溶性胰島淀粉狀蛋白向不溶性胰島淀粉狀蛋白的轉(zhuǎn)變和初原纖維的形成，其中淀粉狀蛋白的毒性是淀粉樣A蛋白的毒性。如在此所使用的，“淀粉樣A蛋白”是指具有大約76個(gè)氨基酸的多肽，來自主要在肝內(nèi)合成的更大的前體脂蛋白，稱為血清淀粉樣A蛋白(SAA)。在刺激SAA合成后，SAA被變性，釋放入循環(huán)中一個(gè)稱為apoSAA的亞單位，被網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)化。在從網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞釋放進(jìn)入含有粘多糖的纖維生成環(huán)境的過程中，可形成血清淀粉樣P物質(zhì)，層粘連蛋白，IV型膠原和ApoE和淀粉樣原纖維，能形成淀粉狀蛋白沉積(見病理學(xué)，3.sup.rd ed.見前，1228-1229頁)。
仍然根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提供了阻斷淀粉狀蛋白毒性的方法，其中淀粉狀蛋白的毒性是甲狀腺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的毒性。如在此所使用的，“甲狀腺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白”(TTR)是指一個(gè)27蛋白的突變形式，由肝臟分泌至血漿中，其正常的功能是作為甲狀腺激素的屏障和視黃醛結(jié)合蛋白。已經(jīng)闡明了蛋白的至少60種突變體形式，每種均產(chǎn)生家族性淀粉樣變性多發(fā)神經(jīng)病的一種變異體(FAP)。FAP最普遍的變異體是由甲狀腺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白產(chǎn)生的，其中在殘基30處發(fā)生一個(gè)氨基酸取代，由蛋氨酸取代纈氨酸。序列的修飾作用降低了四聚TTR的穩(wěn)定性，可形成一個(gè)單體的中間產(chǎn)物，其構(gòu)象發(fā)生變化(見病理學(xué)，3.sup.rd ed.見前，1225，1228頁)。
仍然根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提供了阻斷淀粉狀蛋白毒性的方法，其中淀粉狀蛋白的毒性是AL淀粉狀蛋白的毒性。如在此所使用的，“AL淀粉狀蛋白”是指由免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)組成的蛋白，可來自κ或λ部分。免疫球蛋白的過量產(chǎn)生可引起其分泌至循環(huán)系統(tǒng)中，由于粘多糖，血清淀粉樣P物質(zhì)，層粘連蛋白，IV型膠原和ApoE的存在而提供了纖維生長的環(huán)境。在許多類型的細(xì)胞中，包括枯否細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，形成的淀粉樣原纖維然后被蛋白水解處理，引起淀粉狀蛋白沉積的形成(見病理學(xué)，3.sup.rd ed.見前，1226-1227頁)。
仍根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提供了減少細(xì)胞中淀粉狀蛋白產(chǎn)生的方法，所述的方法包括將所述的細(xì)胞與有效量的在此描述的至少一種化合物，或?qū)τ钞悩?gòu)體，雙星狀(diasteriomeric)異構(gòu)體或其中任何兩種或更多種的混合物，或其藥學(xué)可接受的鹽類接觸。
減少淀粉狀蛋白的產(chǎn)生可阻斷或防止過量淀粉狀蛋白對細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，并可阻斷或防止淀粉樣斑塊的形成，如那些與多種淀粉狀蛋白相關(guān)的疾病。可考慮多種減少淀粉狀蛋白產(chǎn)生的方法，包括減少或防止淀粉狀蛋白前體蛋白的產(chǎn)生，減少或防止可產(chǎn)生淀粉狀蛋白的蛋白水解裂解作用，減少或防止淀粉狀蛋白的翻譯后修飾，通過增加膜穩(wěn)定性減少或防止淀粉狀蛋白前體蛋白的內(nèi)化，等等。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，淀粉狀蛋白的產(chǎn)生通過減少淀粉狀蛋白β肽，淀粉樣朊病毒蛋白，胰島淀粉狀蛋白(胰島淀粉狀蛋白)，淀粉樣A蛋白，甲狀腺運(yùn)載蛋白或AL淀粉狀蛋白而被阻斷或防止。
仍根據(jù)發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提供了抑制神經(jīng)細(xì)胞死亡的方法，所述的方法包括將神經(jīng)細(xì)胞與有效量的在此描述或鑒定的至少一種化合物接觸。
如在此所使用的，“神經(jīng)細(xì)胞死亡”是指神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的減少或神經(jīng)細(xì)胞功能的喪失。神經(jīng)細(xì)胞死亡的發(fā)生可通過凋亡通路的活化或加速，即程序性細(xì)胞死亡，或通過不涉及內(nèi)源性細(xì)胞死亡程序的壞死性細(xì)胞死亡。壞死性細(xì)胞死亡通常來自急性創(chuàng)傷性損傷，典型地涉及細(xì)胞膜的迅速溶解。抑制神經(jīng)細(xì)胞死亡可減少與兩種類型的神經(jīng)細(xì)胞死亡有關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞損失或神經(jīng)細(xì)胞功能喪失。
仍然根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提供了為需要治療的受者治療一種疾病的方法，所述的方法包括為受者使用一種治療有效量的在此描述或鑒定的化合物。
如在此所使用的，“治療”是指抑制或靜息一種疾病、紊亂或狀態(tài)的進(jìn)展和/或使一種疾病，紊亂或狀態(tài)減輕，緩解或消退。本領(lǐng)域的那些專業(yè)技術(shù)人員將會理解到多種方法學(xué)和檢測方法可用來評價(jià)一種疾病，紊亂或狀態(tài)的進(jìn)展，多種方法學(xué)和檢測方法可用來評價(jià)一種疾病，紊亂或狀態(tài)的減輕，緩解或消退。
基本上，任何在病因?qū)W上與淀粉狀蛋白形成和/或沉積有關(guān)系的疾病可考慮根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行治療。如在此所使用的，“疾病狀態(tài)”是指下列的紊亂，如Alzheimer病，系統(tǒng)性老年淀粉樣變性，朊病毒病，綿羊瘋癢病，牛海綿狀腦病，克-雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)，格-斯-切三氏綜合征(Gerstmann-Straussler-Scheinker symdrome)，II型糖尿病(或任何糖尿病或其它狀態(tài)，其特征為或具有形成或增加胰島淀粉狀蛋白含量的危險(xiǎn)，包括胰島素瘤)，淀粉樣A蛋白淀粉樣變性，AL淀粉樣變性，家族性淀粉樣多神經(jīng)病(葡萄牙，日本和瑞典型)，家族性甲狀腺運(yùn)載蛋白淀粉樣變性，家族性地中海熱，家族性淀粉樣腎病伴蕁麻疹和耳聾(Muckle-Wells綜合征)，遺傳性非神經(jīng)性系統(tǒng)性淀粉樣變性(家族性淀粉樣多神經(jīng)病III)，芬蘭型家族性淀粉樣變性，家族性淀粉樣心肌病(丹麥型)，單獨(dú)性心臟淀粉樣變性，單獨(dú)性動脈淀粉樣變性，特發(fā)性(原發(fā)性)淀粉樣變性，骨髓瘤或巨球蛋白血癥相關(guān)淀粉樣變性，與斯耶格倫綜合征有關(guān)的原發(fā)性局部皮膚結(jié)節(jié)淀粉樣變性，反應(yīng)性(繼發(fā)性)淀粉樣變性，遺傳性腦出血伴冰島型淀粉樣變性，與長期血液透析有關(guān)的淀粉樣變性，纖維蛋白原相關(guān)的遺傳性腎淀粉樣變性，與甲狀腺髓樣癌有關(guān)的淀粉樣變性，溶菌酶相關(guān)的遺傳性系統(tǒng)淀粉樣變性，等等。
在診斷有Alzheimer病，神經(jīng)變性疾病的受者中發(fā)現(xiàn)有淀粉狀蛋白沉積，神經(jīng)變形疾病的特征是在大腦皮質(zhì)，皮質(zhì)下區(qū)和海馬中神經(jīng)細(xì)胞的萎縮，存在斑塊，營養(yǎng)障礙的軸突和神經(jīng)纖維纏結(jié)。在Alzheimer病中，營養(yǎng)不良或異常的軸突生長，突觸丟失，和神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成與疾病的嚴(yán)重性強(qiáng)烈相關(guān)。營養(yǎng)障礙的神經(jīng)元特征性的在軸突的細(xì)胞漿中含有豐富的電子致密的多層體，并有突觸連接的破壞。營養(yǎng)障礙的神經(jīng)元圍繞著淀粉樣沉積物，因此形成了遍及腦神經(jīng)纖維網(wǎng)和腦血管壁的老年斑。發(fā)明治療Alzheimer病的方法可減少或阻斷神經(jīng)細(xì)胞的萎縮，減輕或阻斷老年斑或神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成等，這樣疾病的進(jìn)展被減慢或中止。
在診斷有II型糖尿病的患者的朗格罕島中也發(fā)現(xiàn)了淀粉樣沉積物。沉積物含有一種淀粉狀蛋白，它來自一種稱為胰島淀粉狀蛋白的更大的前體，它在正常動物中具有激素的作用。胰島淀粉狀蛋白由胰島β細(xì)胞產(chǎn)生，對肝臟和橫紋肌細(xì)胞的葡萄糖攝取有深刻的作用。在給予高脂肪飲食的具有人胰島淀粉狀蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠中，胰島淀粉狀蛋白的過度表達(dá)可引起胰島淀粉狀蛋白的沉積(見病理學(xué)，3.sup.rd ed，(1999)見前，1226頁)。發(fā)明的治療II型糖尿病患者朗格罕島中淀粉狀蛋白沉積的方法可減少或防止淀粉狀蛋白的形成，減少或防止淀粉狀蛋白形成淀粉狀蛋白沉積，等。
淀粉狀蛋白沉積很顯著的其他疾病還有朊病毒病，海綿狀腦病的一種類型。朊病毒病是神經(jīng)變性疾病，其臨床特征是進(jìn)行性共濟(jì)失調(diào)和癡呆，病理學(xué)上可見海綿狀腦組織的空泡形成。淀粉狀蛋白的沉積與至少一種已知的朊病毒病有關(guān)，如庫魯病。在庫魯病中，與結(jié)構(gòu)性表達(dá)的細(xì)胞表面糖蛋白——正常的朊病毒蛋白相比，大約70％的朊病毒蛋白可在細(xì)胞外累積形成斑塊(見see Pathology，3.sup.rd ed.見前，1492-1496頁)。發(fā)明的治療朊病毒病的方法可減少或防止淀粉狀蛋白的產(chǎn)生，減少或防止淀粉狀蛋白斑塊的沉積，等等。
淀粉狀蛋白沉積很明顯的其他疾病還有淀粉狀蛋白A淀粉樣變性。淀粉樣A蛋白淀粉樣變性是指來自似乎無關(guān)的疾病的淀粉樣變性，如慢性炎性疾病，腫瘤和遺傳性疾病。淀粉狀蛋白的沉積繼發(fā)于基礎(chǔ)疾病。前體分子是血清淀粉樣A蛋白(SAA)，一種急性期反應(yīng)物，在許多疾病中可用作炎癥的一種替代標(biāo)志物。發(fā)明的治療淀粉狀蛋白A淀粉樣變性的方法可減少或防止淀粉狀蛋白的產(chǎn)生，減少或防止前體產(chǎn)生淀粉狀蛋白，防止或減少產(chǎn)生活性淀粉狀蛋白的幾個(gè)必須步驟的任何一個(gè)，減少或防止淀粉樣斑塊的沉積，等等。
淀粉狀蛋白沉積很明顯的其他疾病還有家族性甲狀腺運(yùn)載蛋白淀粉樣變性，是家族性淀粉樣變性多神經(jīng)病(FAP)的最普通形式。人淀粉樣病，家族性淀粉樣多神經(jīng)病，家族性淀粉樣心肌病和老年系統(tǒng)性淀粉樣變性，是由不溶性甲狀腺運(yùn)載蛋白(TTR)原纖維引起的，后者沉積在外周神經(jīng)和心臟組織中。甲狀腺運(yùn)載蛋白是一種同型四聚體血漿蛋白，涉及甲狀腺素和視黃醇的轉(zhuǎn)運(yùn)。最普通的產(chǎn)生淀粉狀蛋白的TTR變異體是V30M-TTR，而L55P-TTR是與FAP最易進(jìn)展的形式有關(guān)的變異體。發(fā)明的治療由甲狀腺運(yùn)載蛋白產(chǎn)生的淀粉樣變性的方法可減少或防止淀粉狀蛋白的產(chǎn)生，減少或防止前體產(chǎn)生淀粉狀蛋白，防止或減少產(chǎn)生活性淀粉狀蛋白的幾個(gè)必須步驟的任何一個(gè)，減少或防止淀粉狀蛋白斑塊的沉積，等等。
此外淀粉狀蛋白沉積很顯著的疾病還有AL淀粉樣變性。AL淀粉樣變性是一類與原發(fā)性免疫球蛋白產(chǎn)生障礙有關(guān)的疾病，包括原發(fā)性淀粉樣變性，漿細(xì)胞惡液質(zhì)，免疫母細(xì)胞淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤，等等。原發(fā)性系統(tǒng)性AL(淀粉樣輕鏈)淀粉樣變性是一種漿細(xì)胞疾病，其中淀粉樣輕鏈蛋白的沉積導(dǎo)致進(jìn)行性的器官衰竭。原發(fā)性淀粉樣變性的預(yù)后通常很差，中位生存期為1-2年。前體蛋白是在局部和系統(tǒng)性AL-淀粉樣變性中都存在的一種免疫球蛋白輕鏈，顯示了相同的一級結(jié)構(gòu)斷裂和改變方式。發(fā)明的治療由AL淀粉狀蛋白引起的淀粉樣變性的方法可減少或防止淀粉狀蛋白的產(chǎn)生，減少或防止前體產(chǎn)生淀粉狀蛋白，防止或減少產(chǎn)生活性淀粉狀蛋白的幾個(gè)必須步驟的任何一個(gè)，減少或防止淀粉狀蛋白斑塊的沉積等等。
如在此所使用的，“給藥”是指向受試者提供治療有效量的化合物，采用口服，舌下，靜脈，經(jīng)皮，肌肉，皮內(nèi)，鞘內(nèi)，腦膜外，眼內(nèi)，顱內(nèi)，吸入，直腸，引導(dǎo)和類似的給藥。也可考慮以乳膏，洗劑，片劑，膠囊，丸劑，分散劑，顆粒，栓劑，糖漿劑，酏劑，錠劑，可注射溶液，無菌水溶液或不含水的溶液，懸液或乳劑，藥膏等?；钚猿煞挚膳c無毒的，藥學(xué)可接受的載體包括葡萄糖，乳糖，阿拉伯樹膠，明膠，甘露醇，淀粉糊，三硅酸鎂，滑石，玉米淀粉，角蛋白，膠體硅，馬鈴薯淀粉，尿素，葡聚糖等混合。
優(yōu)選的給藥途徑可根據(jù)臨床的指征而變化。在劑量上的一些變化必須根據(jù)被治療的病人的狀況而進(jìn)行，無論如何，醫(yī)生都可為病人單獨(dú)確定合適的劑量。在各種因素中，每個(gè)單位用藥量中的化合物有效量依賴于體重，生理狀況，所選擇的接種方案。一單位化合物用藥量是指每次用藥所使用的不含載體量的化合物重量(當(dāng)使用載體時(shí))。
靶向遞送系統(tǒng)，如聚合物基質(zhì)，脂質(zhì)體，和微球體可在需要治療藥物的部位增加治療藥物的有效濃度，減少治療藥物的副作用。隨著治療藥物更有效的遞送，藥物的全身濃度降低，因?yàn)榻o予了更少量的治療藥物，而獲得了相同或更好的治療結(jié)果。用于增加治療藥物遞送效率的方法通常集中在將一個(gè)靶向部分附著于治療藥物上或載體上，該載體隨后可與治療藥物裝填在一起。
通過使用如蛋白，肽，多糖，合成聚合物，膠體顆粒(即脂質(zhì)體，囊泡或微膠粒)，微乳劑，微球體和毫顆粒設(shè)計(jì)了多種藥物遞送系統(tǒng)。這些載體，含有載于其中的藥學(xué)有用的藥物，是準(zhǔn)備用來控制細(xì)胞特異性或組織特異性藥物的釋放。
在此所述的化合物可以脂質(zhì)體的形式給藥。如在本領(lǐng)域中已知的，脂質(zhì)體一般來自磷脂或其他脂類物質(zhì)。脂質(zhì)體是通過單層或多層的含水液體結(jié)晶形成的，可以分散在水介質(zhì)中。可使用任何能夠形成脂質(zhì)體的無毒，生理學(xué)可接受的和可代謝的脂類。在此所述的化合物，當(dāng)以脂質(zhì)體形式時(shí)，除在此所述的化合物以外，還可含有穩(wěn)定劑，防腐劑，賦形劑等。優(yōu)選的脂類是磷脂和磷脂酰膽堿(卵磷脂)，天然的和合成的均可。
形成脂質(zhì)體的方法在本領(lǐng)域中是已知的(見，如Prescott主編，細(xì)胞生物學(xué)方法，XIV卷，Academic Press，紐約，N.Y.，(1976)，33頁以及后面等等)。
可使用幾種遞送方法來將治療藥物繞過血腦屏障遞送至腦。這種方法使用鞘內(nèi)注射，手術(shù)植入(Ommaya，Cancer Drug Delivery，1169-178(1984)和美國專利No，5,222,982)，間質(zhì)輸注(Bobo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，912076-2080(1994))等。這些策略通過直接用藥于腦脊液(CSF)或腦實(shí)質(zhì)(ECF)中將藥物遞送至CNS中。
藥物通過腦脊液向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的遞送，例如可通過硬膜下可植入裝置來完成，其發(fā)明者為其命名為“Ommaya儲備池”。藥物注射進(jìn)裝置中，隨后釋放進(jìn)腦周圍的腦脊液中。這樣可直接定向于所接觸的腦組織的特殊區(qū)域，然后可吸收藥物。這種吸收是受限制的，因?yàn)樗幬锊荒茏杂赊D(zhuǎn)移。一種改良的裝置被用來進(jìn)行藥物的給藥，其中儲備池被種植在腹腔中，被注射的藥物通過腦脊液(從脊柱中攝取并返回至脊柱中)被轉(zhuǎn)運(yùn)至腦室腔內(nèi)。通過Ω-3的衍生作用，部位特異的生物分子復(fù)合體可克服受限制的吸收，治療藥物可通過腦組織進(jìn)行移動。
另一種改善藥物向CNS遞送的策略是通過增加藥物經(jīng)血腦屏障的吸收(吸收和轉(zhuǎn)運(yùn))和細(xì)胞對治療藥物的攝取(Broadwell，Acta Neuropathol.，79117-128(1989)；Pardridge等人，J.Pharmacol Experim.Therapeutics，255893-899(1990)；Banks等人，Progress in Brain Research，91139-148(1992)；Pardridge，F(xiàn)uel Homeostasis andthe Nervous System，ed.Vranic等人，Plenum Press，New York，43-53(1991))。藥物通過血腦屏障進(jìn)入大腦可通過提高藥物本身的滲透性或改變血腦屏障的特性而被增強(qiáng)。因此，通過化學(xué)修飾增加藥物的脂質(zhì)溶解度，和/或通過與陽離子載體的偶聯(lián)，或通過與能夠經(jīng)過血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)藥物的肽載體共價(jià)偶聯(lián)來促進(jìn)藥物的通過。肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體也已知是血腦屏障滲透劑化合物(美國專利No.5,268,164)。有親脂特性用于向大腦遞送的部位特異性大分子在美國專利No.6,005,004中進(jìn)行了描述。
其他實(shí)例(美國專利No.4,701,521和美國專利No.4,847,240)描述了將一種藥物和一種陽離子大分子載體共價(jià)結(jié)合的方法，該載體可以相對高的速率進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。這些專利使我們認(rèn)識到當(dāng)與陽離子樹脂共價(jià)結(jié)合時(shí)，細(xì)胞攝取生物分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)是增強(qiáng)的。
美國專利No.4,046,722公開了與陽離子聚合物共價(jià)結(jié)合的抗癌藥物，目的是引導(dǎo)它們到達(dá)攜帶特異抗原的細(xì)胞。聚合的載體的分子量大約為5,000至500,000。這些聚合的載體可用來將在此所述的化合物以靶向的方式進(jìn)行遞送。
進(jìn)一步的工作涉及一種藥物和一種陽離子聚合物通過一種酸敏感的中間體(也認(rèn)為是一個(gè)間隔子)分子共價(jià)結(jié)合，在美國專利No.4,631,190和美國專利No.5,144,011中進(jìn)行了描述。多種間隔分子，如順式烏頭酸，可與藥物和聚合載體共價(jià)結(jié)合。當(dāng)酸度輕度增加時(shí)，如可能發(fā)生在細(xì)胞的溶酶體中，它們可控制藥物從大分子載體中釋放。藥物可選擇性地從分子共軛物中水解，并在細(xì)胞中以其未修飾的和活性的形式釋放。分子共軛物轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體中，在此它們在溶酶體酶的作用下，在較細(xì)胞或體內(nèi)其他區(qū)室或液體實(shí)質(zhì)上更酸性的pH下進(jìn)行代謝。溶酶體的pH顯示大約為4.8，而在共軛物消化的最初階段，pH可能低至3.8。
如在此所使用的，術(shù)語“治療有效量”，當(dāng)用來說明使用多環(huán)化合物的發(fā)明的方法時(shí)，是指足以提供的循環(huán)濃度能夠?qū)邮苷弋a(chǎn)生有益影響的化合物的劑量。對任何特殊患者的特殊的有效劑量水平將依賴于多種因素，包括要治療的疾病，疾病的嚴(yán)重程度，所使用的特殊化合物的活性，給藥的途徑，特殊化合物的清除率，治療的持續(xù)時(shí)間，用來與特殊的化合物聯(lián)合或一起使用的藥物，患者的年齡，體重，性別，飲食和大體健康情況，和在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和科學(xué)中為人熟知的類似因素。劑量水平通常的范圍是大約0.001至100mg/kg/天；大約0.05至10mg/kg/天范圍內(nèi)的水平是優(yōu)選的。
根根據(jù)發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提供了在有發(fā)作危險(xiǎn)的受試者中防止疾病的方法，所述的方法包括給予所述的受試者治療有效量的至少一種在此所述的化合物。
如在此所使用的，術(shù)語“防止疾病”是指避免有疾病發(fā)作危險(xiǎn)，但未診斷出患有疾病的受試者發(fā)生疾病，障礙或病癥。本領(lǐng)域的那些專業(yè)技術(shù)人員將能夠理解可使用多種方法來確定受試者具有患病的危險(xiǎn)，受試者是否有患病危險(xiǎn)將依賴于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員所了解的多種因素，包括受試者的遺傳結(jié)構(gòu)，年齡，體重，性別，飲食，大體健康狀況，職業(yè)，與環(huán)境條件的接觸，婚姻狀況和類似因素。
如在此所使用的，“孵育”是指在待化合物和目標(biāo)細(xì)胞之間的接觸。細(xì)胞可以任何目的細(xì)胞，包括神經(jīng)元細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，心臟細(xì)胞，支氣管細(xì)胞，子宮細(xì)胞，睪丸細(xì)胞，肝細(xì)胞，腎細(xì)胞，腸細(xì)胞，胸腺和脾臟的細(xì)胞，胎盤細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)分泌細(xì)胞包括甲狀腺，甲狀旁腺，腦垂體和類似細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，骨骼肌細(xì)胞和類似細(xì)胞。
候選化合物可從大量的來源中獲得，包括合成的或天然的化合物庫。例如，大量的方法可用來隨機(jī)和定向的合成很多種有機(jī)化合物和生物分子，包括隨機(jī)寡核苷酸和寡肽的表達(dá)?？蛇x擇的是，可使用或很容易產(chǎn)生以細(xì)菌，真菌，植物和動物提取物形式的天然化合物庫。可選擇的是，天然的或合成產(chǎn)生的庫和化合物可以很容易地通過常規(guī)的化學(xué)，物理和生物化學(xué)方式來修飾，可用來產(chǎn)生組合庫。已知的藥物學(xué)物質(zhì)可進(jìn)行定向或隨機(jī)的化學(xué)修飾，如?；饔?，烷化作用，酯化作用，酰胺化作用等，來產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。
許多其他的試劑包括在篩選測定中，包括鹽類，天然蛋白，如白蛋白，去垢劑等，可用來促進(jìn)最佳的結(jié)合和/或減少非特異性或背景相互作用?？墒褂媚芴岣邷y定效率的試劑，如蛋白酶抑制劑，核酸酶抑制劑，抗微生物劑等。為提供所需要的結(jié)合作用，可以任何順序加入混合物的各種成分。可在任何合適的溫度下進(jìn)行孵育，一般在4和40℃之間。選擇孵育時(shí)間以獲得最佳的活性，也可優(yōu)化促進(jìn)迅速的高通量篩選。一般在0.1和10小時(shí)之間就足夠了。
仍根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，提供了調(diào)節(jié)淀粉狀蛋白，特別是胰島淀粉狀蛋白的聚集的方法。調(diào)節(jié)淀粉狀蛋白的聚集可防止或延緩與淀粉狀蛋白沉積相關(guān)疾病的發(fā)作。在調(diào)節(jié)淀粉狀蛋白聚集的方法中，淀粉狀蛋白與在此所述的化合物接觸，以便改變淀粉狀蛋白的聚集。如在此所使用的，術(shù)語“調(diào)節(jié)”是指抑制淀粉狀蛋白聚集和促進(jìn)淀粉狀蛋白的聚集。淀粉狀蛋白的聚集可被在此所述的一種或多種化合物抑制，與缺乏相同的一種或多種化合物時(shí)相比，具有在此所述的一種或多種化合物的情況下，淀粉狀蛋白聚集的量和/或速率減小。聚集的抑制包括完全部分抑制淀粉狀蛋白。聚集的抑制可以聚集的延遲時(shí)間內(nèi)增加的倍數(shù)或在聚集的總體平高限水平(即，聚集的總量)中的降低來定量，使用本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員已知的聚集測定法。可選擇地，淀粉狀蛋白的聚集可被在此所述的一種或多種化合物促進(jìn)，與缺乏一種或多種相同的化合物相比，具有在此所述的一種或多種化合物的情況下淀粉狀蛋白聚集的量和/或速率是增加的。
因此如在此所使用的，術(shù)語“多環(huán)化合物”是指具有這些效應(yīng)或一種效應(yīng)的任何多環(huán)化合物。適合的多環(huán)化合物的實(shí)例(但僅僅限制于)包括融合的三環(huán)化合物，融合的四環(huán)化合物，融合的五環(huán)結(jié)構(gòu)或其他融合的多環(huán)物，以及以二維或非二維方向的融合環(huán)和聯(lián)苯結(jié)構(gòu)的組合。多種化合物描述如下。
如在此所使用的術(shù)語“多并苯”是指通常含有兩個(gè)或多個(gè)融合芳香環(huán)的分子結(jié)構(gòu)。優(yōu)選具有三個(gè)，四個(gè)或五個(gè)融合芳香環(huán)的多并苯。多并苯的環(huán)原子通常是碳結(jié)構(gòu)的，但也可包括一個(gè)或多個(gè)氮，氧和/或硫。多并苯的核心結(jié)構(gòu)實(shí)質(zhì)上是平面的，其特征是可允許核心原子之間的π-電子廣泛的重疊。本發(fā)明的多并苯可選擇性的被一些取代基取代，例如可增強(qiáng)水溶解度，增強(qiáng)π-堆集效應(yīng)，或增強(qiáng)藥物的功效或改善治療效果的取代基。
如在此所使用的術(shù)語“三，四和五元環(huán)的多并苯”是指含有三個(gè)，四個(gè)和五個(gè)融合芳香環(huán)的分子結(jié)構(gòu)。三，四和五元環(huán)的多并苯的環(huán)原子通常是碳，但也可包括一個(gè)或多個(gè)氮，氧，和/或硫。三元環(huán)多并苯的實(shí)例包括但不限于蒽，phenalene，菲，奎納克林，中性紅，氯丙嗪，吖啶，吖啶橙，亞甲藍(lán)，鄰二氮雜菲，吩嗪和吩噻嗪。四元環(huán)多并苯的實(shí)例包括芘，屈，苯[a]蒽，苯[m]蒽，和并四苯。五元環(huán)多并苯的代表性實(shí)例是苯[c]蒽。
多并苯的核心結(jié)構(gòu)優(yōu)選實(shí)質(zhì)上是平面的，其特征是可允許核心原子之間的π-電子的廣泛重疊。本發(fā)明的多并苯可選擇性的被一些取代基取代，例如可增強(qiáng)水溶解度，增強(qiáng)π-堆集效應(yīng)，或增強(qiáng)藥物的功效或改善治療效果的取代基。
從商業(yè)途徑可獲得眾多取代的三-、四-和五-元環(huán)多并苯。其它的可采用專業(yè)技術(shù)人員已知的方法制備。特別用于將取代基引導(dǎo)至三-、四-和五-元環(huán)多并苯上的反應(yīng)是已知為親電子芳香取代的反應(yīng)類。親電子芳香取代的實(shí)例包括Friedel-Crafts烷化作用(用于將烷基附著到三-、四-和/或五-元環(huán)多并苯上的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)；Friedel-Crafts?；饔?用于將羧基共價(jià)地附著到三-、四-和/或五-元環(huán)多并苯上的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)；亞硝化作用(用于引導(dǎo)亞硝基部分(-NO)到三-、四-和/或五-元環(huán)多并苯上的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)；磺化作用(用于引導(dǎo)硫酸根(-SO3-)到三-、四-和/或五-元環(huán)多并苯上的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)；硝化作用，用于引導(dǎo)硝酸根(-NO2)，它也可以是還原的鹵化作用，用于引導(dǎo)F、Cl、Br和I；重氮偶合，用于耦合通過(-N＝N-)部分連接的芳香環(huán)，重氮基見于例如剛果紅、柯胺G和莧菜紅中。
專業(yè)技術(shù)人員會承認(rèn)，經(jīng)親電子芳香取代方法導(dǎo)入三-、四-和/或五-元環(huán)多并苯的幾個(gè)成分可被還原。例如，硝基和亞硝基基團(tuán)可被還原成氨基，磺酸基可被還原成硫醇。此外，專業(yè)技術(shù)人員會承認(rèn)，導(dǎo)入三-、四-和/或五-元環(huán)多并苯的這幾種成分是本身有反應(yīng)性的并可用作功能基團(tuán)。例如，氨基和羧基部分用作酰胺鍵前體；硫醇部分被特別地用作連接子成分。
專業(yè)技術(shù)人員還會在本發(fā)明的其它實(shí)施例中考慮部分還原的多并苯，例如，在四環(huán)素和強(qiáng)力霉素分子中的并四苯框架。
三-元環(huán)多并苯 蒽 PHENALENE 菲R(在任何化合物中可以是相同或不同的，并可以包括H)表示采用專業(yè)技術(shù)人員已知的方法導(dǎo)入的成分，例如已知為親電子芳香取代的方法。上面顯示的結(jié)構(gòu)也表示化合物的一個(gè)、幾個(gè)或所有R是氫的情況。融合的三環(huán)化合物還包括在任何如上顯示編號的核心原子上取代的衍生物。還包括在核心三環(huán)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的雙鍵結(jié)構(gòu)修飾，以及隨后的核心原子或側(cè)鏈修飾，包括如蒽和菲插圖所示在4a、4b、5a、8a、9a和10a原子處的修飾。代表性的例子是奎納克林、中性紅、氯丙嗪、吖啶、吖啶橙、亞甲藍(lán)和苯二嗪(如下)。雖然多并苯分子通常實(shí)質(zhì)上是平面的，專業(yè)技術(shù)人員公認(rèn)多并苯的部分還原可引起非平面化。因此，本發(fā)明的融合環(huán)狀化合物可以是平面的或非平面的，并可有飽和或非飽和環(huán)狀結(jié)構(gòu)的任意聯(lián)合。結(jié)構(gòu)還可具有位于所展示的任何可選擇方位的任意苯基環(huán)。
取代和非取代的三-元環(huán)多并苯 四-和五-元環(huán)多并苯 R(在任何化合物中可以是相同或不同的，并可以包括H)表示采用專業(yè)技術(shù)人員已知的方法導(dǎo)入的成分，例如已知為親電子芳香取代的方法。上面顯示的結(jié)構(gòu)也表示化合物的一個(gè)、幾個(gè)或所有R是氫的情況。融合的蒽環(huán)結(jié)構(gòu)還包括如所示在任何編號的核心原子上取代的衍生物。還包括在核心蒽環(huán)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的雙鍵結(jié)構(gòu)修飾，以及隨后的核心原子或側(cè)鏈修飾，包括如以上并四苯插圖所示在4a、5a、6a、10a、11a和12a原子處的修飾。雖然多并苯分子實(shí)質(zhì)上是平面的，專業(yè)技術(shù)人員公認(rèn)多并苯的部分還原引起非平面化。因此，本發(fā)明的融合環(huán)狀化合物可以是平面的或非平面的，并可有飽和或非飽和環(huán)狀結(jié)構(gòu)的任意組合。結(jié)構(gòu)還可具有位于所展示的任何可選擇方位的任意苯基環(huán)。代表性的例子是四環(huán)素和強(qiáng)力霉素。
四環(huán)素 強(qiáng)力霉素融合環(huán)和聯(lián)苯結(jié)構(gòu)結(jié)合的代表性例子 結(jié)構(gòu)也可具有融合的與聯(lián)苯環(huán)同位于所展示的任何可選擇方位的任意苯基環(huán)的任何組合。這些結(jié)構(gòu)可以是平面的或非平面的，對稱的或非-對稱的，以及可具有飽和或非飽和環(huán)狀結(jié)構(gòu)的任何組合。結(jié)構(gòu)還可具有位于所展示的任何可選擇方位的任意苯基環(huán)。這些結(jié)構(gòu)還包括在任何芳香環(huán)原子上取代的衍生物。還包括在環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的雙鍵結(jié)構(gòu)修飾，和隨后的原子或側(cè)鏈修飾。
下面的實(shí)施例是要舉例說明，并不以任何方式、形態(tài)或形式明確地或暗示地限制本發(fā)明。雖然可能被使用的是典型的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它步驟、方法學(xué)或技術(shù)是可選擇使用的。
實(shí)施例1材料和方法材料合成的人(Lot 5429559和Lot 0551805)和大鼠糊精(Lot 0542554和Lot0542554)是來自Bachem California(Torrance，CA)的HPLC-純化產(chǎn)物。肽新鮮溶解在滅菌的milliQ水中，然后在適當(dāng)?shù)木彌_液中稀釋至其終濃度。按照以前描述的的方案(25)合成Tritated人糊精(145.3MBq/mmol和大鼠糊精(22.6GBq/mmol)。所有含糊精肽的孵育在22℃進(jìn)行。所有多環(huán)化合物和硫黃素-T購自Sigma(StLouis，MO)。每次實(shí)驗(yàn)在滅菌的milliQ水中新鮮制備儲備液。鈣黃綠素-AM和溴乙非啶同型二聚體-1(EthD-1)獲取自分子探針(Eugene，OR，USA)。大鼠胰島瘤細(xì)胞系RINm5F從National Institutes of Health，Bethesda，MD獲得，并在含5％CO2的濕化氣中37℃培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)基及其添加物購自GibcoBRL-Life Technologies(Auckland，New Zealand)。
硫黃素-T結(jié)合熒光試驗(yàn).使用SpectraMAX Gemini XS熒光分光光度計(jì)(MolecularDevices Corporation，Sunnyvale，CA)，通過熒光分光術(shù)檢測各種多環(huán)化合物對胰島淀粉形成的影響。采用495nm處分界濾光片設(shè)置激發(fā)和發(fā)射峰值分別為450nm和510nm。硫黃素-T與糊精原纖維結(jié)合，但不與單體糊精結(jié)合(Goldsbury等人，(1999)，J.Mol.Biol.，28533-39)。當(dāng)與糊精原纖維結(jié)合時(shí)，硫黃素-T顯示了顯著增加的熒光，可以用熒光分光光度計(jì)量化(Goldsbury等人，(1999)，J.Mol.Biol.，28533-39)。在有或無可能的抑制性藥物的情況下，通過跟蹤硫黃素-T熒光測定糊精原纖維形成的速率。在這些條件下，多環(huán)化合物四環(huán)素、剛果紅、中性紅、亞甲藍(lán)和氯丙嗪沒有固有熒光。在沒有糊精情況下，吖啶和吖啶橙的本底熒光被從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中減去。在沒有藥物情況下，對照制劑含人糊精和硫黃素-T。在這些條件下，熒光增強(qiáng)的速率被用來比較有和無藥物情況下糊精原纖維的形成。所有其它的實(shí)驗(yàn)條件是相同的。
帶有硫黃素-T的三脯氨酰糊精和大鼠糊精也被用作另外的對照。三脯氨酰糊精是修飾形式的糊精，它不再含有淀粉狀蛋白生成區(qū)，因而不能形成原纖維(Evans & Krentz，(1999)，Drugs R D，275-94)，而大鼠糊精不能自發(fā)地形成原纖維(Cooper，(1994)，Endocr.Rev，15163-201)。
電子顯微鏡法 在有或無奎納克林或四環(huán)素的情況下，人糊精孵育在10mM tris pH7.4溶液中。在不同的時(shí)間點(diǎn)取出樣本并準(zhǔn)備電子顯微鏡檢查。等分試樣(8μl)的糊精原纖維制劑在200目銅網(wǎng)上的輝光放電的碳包被膠棉膜上被吸收1min。吸干銅網(wǎng)，用去離子水滴沖兩次并用2％(w/v)乙酸雙氧鈾染色，在120kV運(yùn)行的Phillips Technai透射電子顯微鏡中檢查銅網(wǎng)。
放射性標(biāo)記沉淀試驗(yàn) 放射標(biāo)記的人和大鼠糊精原纖維沉淀被用作獨(dú)立的方法，監(jiān)測在有或無可能的糊精原纖維形成抑制劑的情況下，糊精原纖維的組裝。在無或有100μM四環(huán)素(這里的實(shí)施例5)或200μM可能的抑制性藥物(這里的實(shí)施例5)的情況下，痕量[3H]-人糊精以不同次數(shù)加入至10μM糊精溶液中。然后以16,000xg或100,000xg離心孵育的混合物20min，測定離心后殘存在上清中的[3H]-人糊精的量(Beckman LSW3801 β-計(jì)數(shù)器，USA)。結(jié)果表示為每分鐘的沉淀性計(jì)數(shù)相對于上清總放射活性的百分比。
單體人糊精的制備人糊精(批號0551805)獲自Bachem(Torrence，CA)。如Padrick和Miranker，2002所述制備糊精儲備液。人糊精溶解在6M鹽酸胍/50mM磷酸鉀，pH6.0中，并加載在C18反相旋轉(zhuǎn)柱(Harvard Biosciences)上。然后順序地用10％乙腈、0.2％三氟乙酸和水沖洗柱。以100％HFIP(六氟異丙醇)洗脫單體糊精。此糊精儲備液然后用于所有的圓二色性實(shí)驗(yàn)。
圓二色性試驗(yàn)(circular dichroism assay).在Pi-Star 180分光儀(AppliedPhotophysics，Leatherhead，UK)上檢測圓二色性譜。在100％HFIP或100mM氯化鉀/50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.4)和2.5％HFIP中25℃進(jìn)行檢測。單體人糊精儲備液被稀釋成2.5％HFIP和大約5μM糊精終濃度的緩沖液以啟動糊精原纖維的形成。用25μs的采樣周期和±0.01mdeg的適應(yīng)性抽樣，以1nm間隔采集譜。在有或無剛果紅或莧菜紅的情況下，在人糊精儲備液加入磷酸鹽緩沖液后立即記錄檢測結(jié)果。
細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞毒性試驗(yàn) 在含10％胎牛血清、290μg/mL L-谷氨酸鹽、100IU/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)RINm5F細(xì)胞。以每孔15×104細(xì)胞的密度覆蓋細(xì)胞，孵育48h，用PBS漂洗并置于含剛果紅的新鮮培養(yǎng)基中。在Milli-Q水中新鮮制備的人糊精與剛果紅預(yù)孵育30min，然后加入細(xì)胞培養(yǎng)基中至終濃度30μM。在有或無100μM剛果紅的情況下，用人糊精處理細(xì)胞22h。通過用鈣黃綠素-和溴乙非啶同型二聚體-1雙染色測定細(xì)胞活力。用配有Zeiss濾器裝置#09的Zeiss AxiovertS100顯微鏡同時(shí)顯現(xiàn)綠色熒光的活細(xì)胞和紅色熒光標(biāo)記核的死細(xì)胞。采用ZeissAxioCam數(shù)碼相機(jī)拍攝400x放大倍數(shù)的照片。
實(shí)施例2多環(huán)化合物對人糊精引起的硫黃素-T熒光增強(qiáng)的影響四環(huán)素和剛果紅對人糊精引起的硫黃素-T 熒光增強(qiáng)的影響(圖1).在有硫黃素-T(10μM)情況下，四環(huán)素(700μM)(▲)或剛果紅(700μM)(●)在10mM tris pH7.4中與單體人糊精(70μM)孵育。如本方法所述在72小時(shí)內(nèi)監(jiān)測反應(yīng)的熒光。僅含人糊精和硫黃素-T(■)的對照制劑被用來比較沒有藥物情況下的糊精原纖維形成和存在四環(huán)素或剛果紅情況下的原纖維形成。帶有硫黃素-T的三脯氨酰糊精()和大鼠糊精(◆)作為另外的對照，因?yàn)樵谶@些試驗(yàn)條件下，三脯氨?；虼笫蠛蛔园l(fā)地形成原纖維。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示為三個(gè)獨(dú)立反應(yīng)的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
在有四環(huán)素情況下，糊精原纖維相關(guān)的熒光開始形成但明顯減少直至2小時(shí)，隨后在接下來的70小時(shí)內(nèi)熒光逐漸減少(圖1A)。此熒光減少與糊精原纖維的分解相關(guān)，如電子顯微鏡法所見。硫黃素-T和人糊精聯(lián)合在有四環(huán)素情況下的初始相(圖1B)與硫黃素-T單獨(dú)與人糊精聯(lián)合的初始相相似，但低于后者。然而，在有四環(huán)素情況下，有第二個(gè)顯著的硫黃素-T與糊精原纖維的解離相，在對照反應(yīng)中未見(圖1C)。這與24小時(shí)及以后的糊精原纖維破壞相關(guān)，如電子顯微鏡下所見。在有剛果紅和硫黃素-T情況下，人糊精顯示沒有超過大鼠對照制劑的熒光增加，提示剛果紅可抑制糊精原纖維形成或抑制硫黃素-T與糊精原纖維的結(jié)合。
氯丙嗪對人糊精引起的硫黃素-T熒光增強(qiáng)的影響(圖2).在有硫黃素-T(10μM)情況下，氯丙嗪(700μM)(▲)在10mM tris pH7.4中與單體人糊精(70μM)孵育。如本方法所述在24小時(shí)內(nèi)監(jiān)測反應(yīng)的熒光。曲線顯示僅含人糊精和硫黃素-T的對照(■)符合單相關(guān)聯(lián)，而存在氯丙嗪情況下，人糊精和硫黃素-T的曲線符合雙相指數(shù)關(guān)聯(lián)。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示三個(gè)獨(dú)立反應(yīng).的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
在有氯丙嗪情況下，糊精原纖維的形成大約抑制60％。含人糊精、硫黃素-T和氯丙嗪的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最佳擬合曲線顯示硫黃素-T與人糊精的初始指數(shù)關(guān)聯(lián)，與僅含人糊精和硫黃素-T的對照所見相似。然而，其后跟隨對照中未見的第二個(gè)較慢的指數(shù)關(guān)聯(lián)相，這顯示了氯丙嗪對糊精原纖維形成的抑制作用。
選擇的多環(huán)化合物對人糊精引起的硫黃素-T熒光增強(qiáng)的影響(圖3).吖啶、吖啶橙、中性紅和亞甲藍(lán)是選擇的融合三環(huán)環(huán)狀化合物的實(shí)例，四環(huán)素是融合的四環(huán)化合物，而剛果紅是兩對具有插入聯(lián)苯結(jié)構(gòu)的融合環(huán)的聯(lián)合?；衔锝Y(jié)構(gòu)顯示在適當(dāng)插圖的旁邊。在有硫黃素-T(10μM)情況下，終濃度為1200μM的吖啶橙(◇)、中性紅(◆)、亞甲藍(lán)(□)、剛果紅(▲)、吖啶(△)、氯丙嗪()和四環(huán)素(●)，在10mM tris pH7.4中與單體人糊精(60μM)孵育。如本方法所述在24小時(shí)內(nèi)監(jiān)測反應(yīng)的熒光。包括僅含人糊精和硫黃素-T(■)的制劑作為無藥物比較。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，具有硫黃素-T的大鼠糊精(○)作為陰性對照，因?yàn)榇笫蠛蛔园l(fā)地形成原纖維。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
與人糊精同硫黃素-T單獨(dú)孵育的熒光立即和持續(xù)增加相比，在有20倍摩爾過量的吖啶橙、中性紅、亞甲藍(lán)或剛果紅存在時(shí)，人糊精和硫黃素-T的孵育顯示硫黃素-T強(qiáng)化的熒光沒有增加。此熒光的相對減少可能是由于結(jié)合到現(xiàn)有淀粉狀蛋白上的硫黃素-T的置換，或可選擇地由于這些多環(huán)化合物的存在導(dǎo)致淀粉狀蛋白含量的直接減少。
當(dāng)四環(huán)素與人糊精和硫黃素-T孵育時(shí)，發(fā)生熒光立即增加，隨后在接下來的24h內(nèi)熒光逐漸減少。硫黃素-T與人糊精聯(lián)合的初始相在有四環(huán)素情況下和僅有硫黃素-T和人糊精的情況相似但顯著地低。然而，當(dāng)四環(huán)素存在時(shí)，具有半衰期為3.4小時(shí)的顯著的第二個(gè)解離相，這在對照反應(yīng)中并未見到。
此改變與沉淀性淀粉狀蛋白含量的減少相關(guān)(圖7和8)，如24h時(shí)通過電子顯微鏡法觀察到的淀粉樣原纖維形態(tài)學(xué)的改變(圖4C、4D、6C和6D)。在中心芳香環(huán)上含脂肪族側(cè)鏈的三環(huán)化合物氯丙嗪，顯示對糊精原纖維相關(guān)的硫黃素-T熒光增強(qiáng)的抑制很少，表明此化合物與吖啶橙、中性紅、亞甲藍(lán)、剛果紅和四環(huán)素相反，不能有效地置換硫黃素-T或抑制淀粉狀蛋白的形成。相反，僅含母體吩嗪結(jié)構(gòu)的吖啶顯示可中度程度地降低硫黃素-T強(qiáng)化的熒光。
實(shí)施例3通過電子顯微鏡法檢測多環(huán)化合物對人胰島淀粉狀蛋白形成的影響在有和無四環(huán)素情況下人糊精原纖維的電子顯微鏡觀察(圖4).10倍摩爾過量的四環(huán)素與人糊精孵育。在不同時(shí)間點(diǎn)取出樣本并按照本方法描述的步驟準(zhǔn)備進(jìn)行電子顯微鏡觀察。
1.70μM人糊精，孵育1.5h后。放大倍率x20,5002.70μM人糊精+700μM四環(huán)素，孵育1.5h后。放大倍率x20,5003.70μM人糊精，孵育5h后。放大倍率x20,5004.70μM人糊精+700μM四環(huán)素，孵育5h后。放大倍率x20,5005.70μM人糊精，孵育29h后。放大倍率x20,5006.70μM人糊精+700μM四環(huán)素，孵育29h后。放大倍率x20,5007.70μM人糊精，孵育48h后。放大倍率x20,5008.70μM人糊精+700μM四環(huán)素，孵育48h后。放大倍率x20,5009.70μM人糊精，孵育29h后。放大倍率x220,00010.70μM人糊精+700μM四環(huán)素，孵育29h后。放大倍率x220,00011.70μM人糊精+700μM四環(huán)素，孵育48h后。放大倍率x105,00012.70μM人糊精+700μM四環(huán)素，孵育48h后。放大倍率x220,000同沒有四環(huán)素的人糊精對照孵育(4A，4C)相比，四環(huán)素的存在看起來在1.5小時(shí)和5小時(shí)的孵育早期時(shí)間點(diǎn)可減慢人糊精原纖維形成的速率(4B，4D)。在29小時(shí)和48小時(shí)的較晚時(shí)間點(diǎn)，四環(huán)素的存在顯示可改變?nèi)撕w維的形態(tài)學(xué)以及原纖維形成的速率。形態(tài)學(xué)上以短的成碎片的原纖維為特征(4F，4H)，相比各自的對照表現(xiàn)為較長的、更密集和特征性的糊精原纖維(4E，4G)。在較高的放大倍數(shù)下，可見我們稱為初原纖維(較輕染色的原纖維)的不同類型原纖維結(jié)構(gòu)與原纖維的短片段在一起(4J-4L)。這些初原纖維在糊精對照中以高放大倍數(shù)觀察不到(4I)。這些初原纖維的存在提示現(xiàn)有不溶性糊精原纖維的破壞。
在有和無奎納克林情況下人糊精原纖維的電子顯微鏡觀察(圖5).100倍摩爾過量的奎納克林與人糊精孵育。在不同時(shí)間點(diǎn)取出樣本并按照本方法描述的步驟準(zhǔn)備進(jìn)行電子顯微鏡觀察。
A.70μM人糊精，孵育1.5h后。放大倍率x20,500B.70μM人糊精+7000μM奎納克林，孵育1.5h后。放大倍率x20,500C.70μM人糊精，孵育5h后。放大倍率x20,500
D.70μM人糊精+7000μM奎納克林，孵育5h后。放大倍率x20,500E.70μM人糊精，孵育26h后。放大倍率x20,500F.70μM人糊精+7000μM奎納克林，孵育26h后。放大倍率x20,500G.70μM人糊精+7000μM奎納克林，孵育26h后。放大倍率x20,500H.70μM人糊精+7000μM奎納克林，孵育26h后。
I.放大倍率x220,000同沒有奎納克林的人糊精對照孵育(4A，4C，4E)相比，奎納克林的存在看起來在1.5小時(shí)、5小時(shí)和26小時(shí)孵育的所有三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上減慢人糊精原纖維形成的速率(4B，4D，4F)。在5小時(shí)和26小時(shí)還出現(xiàn)原纖維形態(tài)學(xué)上的差異(4D，4F，4G)，糊精原纖維已形成大的聚集物，含有很少的已確定的原纖維(4F，4G)，而不是對照中所見的特征性的較長纖維(4E)。有四環(huán)素情況下所見的人糊精短的成碎片的原纖維在人糊精和奎納克林情況下未觀察到。然而，初原纖維(4H中的輕染色原纖維)可在26小時(shí)孵育時(shí)間點(diǎn)中出現(xiàn)。這些初原纖維也見于糊精與四環(huán)素孵育的電子顯微照片中。
在有和無選擇的多環(huán)化合物情況下人糊精原纖維的電子顯微鏡觀察(圖6).在有或無四環(huán)素、剛果紅、中性紅或氯丙嗪(1200μM)情況下，人糊精(60μM)在10mMtris pH7.4中孵育24h。如本方法描述的方法取出樣本并準(zhǔn)備進(jìn)行電子顯微鏡觀察。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行三次，以上照片是每個(gè)放大倍數(shù)拍攝的至少6個(gè)照片中典型的。人糊精(Ax20,500，Bx105,000)；與四環(huán)素孵育的人糊精(Cx20,500，Dx105,000)；與剛果紅孵育的人糊精(Ex20,500)；與中性紅孵育的人糊精(Fx20,500)；與氯丙嗪孵育的人糊精(Gx20,500)。
人糊精與四環(huán)素孵育24h的透射電子顯微鏡顯示，得到的淀粉樣原纖維在形態(tài)學(xué)上有顯著的改變(圖6)。這里，原纖維在形態(tài)學(xué)上以短的成碎片的結(jié)構(gòu)為特征(圖6C)，相比各自對照為較長的、更密集和特征性的糊精原纖維表現(xiàn)(圖6A)。以較高的放大倍數(shù)可見沿著原纖維的短片段有小球狀的輕染色結(jié)構(gòu)(圖6D)。這些球狀結(jié)構(gòu)在糊精對照中以較高的放大倍數(shù)沒有觀察到(圖6B)。這些結(jié)構(gòu)的存在提示現(xiàn)有的糊精原纖維在與四環(huán)素孵育后破壞。有趣地，當(dāng)人糊精與其它多環(huán)化合物孵育時(shí)沒有觀察到球狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)人糊精與剛果紅(圖6E)、中性紅(圖6F)或氯丙嗪(圖6G)孵育時(shí)，仍然形成特征性的糊精原纖維。另外的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)人糊精制劑預(yù)孵育20h，隨后與四環(huán)素孵育48h時(shí)，也顯示糊精原纖維片段內(nèi)部分布著與圖6C、6D所見相似的較小原纖維。
實(shí)施例4通過放射活性沉淀檢測多環(huán)化合物對人胰島淀粉狀蛋白形成的作用通過放射性標(biāo)記沉淀觀察四環(huán)素對糊精原纖維形成的影響(圖7).在無(▲)或有(●)100μM四環(huán)素的情況下，10μM人糊精在10mM tris pH7.4中與痕量[3H]-人糊精孵育。[3H]-糊精摻入糊精原纖維進(jìn)行24小時(shí)。通過16,000xg(圖7A)或100,000xg(圖7B)離心沉淀人糊精原纖維。存在[3H]-大鼠糊精時(shí)大鼠糊精(10μM)被用作無原纖維形成的對照(◆)(圖7A)。結(jié)果顯示為每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的沉淀性放射活性糊精相對于上清總放射活性的百分比。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示為三個(gè)獨(dú)立反應(yīng).的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
在人糊精原纖維形成過程中，放射活性單體糊精的摻入可被用于檢測在有或無可能的抑制性藥物情況下糊精原纖維形成的速率。糊精原纖維可以通過離心從溶液中分離，然后糊精原纖維團(tuán)中放射活性糊精沉淀的量被用來檢測當(dāng)時(shí)存在的糊精原纖維的量。
圖5顯示，如果沒有四環(huán)素，那么在2小時(shí)孵育后，可獲得的總放射活性人糊精的大約75％被摻入沉淀性糊精原纖維中。然而，在有四環(huán)素情況下，放射活性人糊精摻入沉淀性糊精原纖維減少大約50％。而且，此減少不隨時(shí)間增加。通過100,000xg離心反應(yīng)混合物也不影響四環(huán)素沉淀性糊精原纖維的百分比(圖7B)。這些觀察顯示，四環(huán)素存在對胰島淀粉狀蛋白形成的抑制是由于不溶性糊精聚集物的減少。
通過放射性標(biāo)記沉淀觀察選擇的多環(huán)化合物對糊精原纖維形成的影響(圖5).在無(■)或有200μM吖啶(△)、氯丙嗪()、亞甲藍(lán)(□)、硫黃素-T()、剛果紅(▲)、四環(huán)素(●)、吖啶橙(◇)或中性紅(◆)情況下，添加了[3H]-人糊精的人糊精10μM孵育在10mM tris pH7.4中?；衔锝Y(jié)構(gòu)顯示在適當(dāng)插圖的旁邊。硫黃素-T，盡管不是多環(huán)的，被廣泛用于熒光試驗(yàn)中檢測糊精原纖維的形成。放射活性的摻入在指示的時(shí)間段內(nèi)監(jiān)測以16,000xg離心20分鐘的反應(yīng)混合物的等分試樣沉淀中摻入的放射活性。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，具有添加的[3H]-大鼠糊精的大鼠糊精(10μM)被用作無原纖維形成對照(○)。結(jié)果顯示為每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的沉淀性放射活性淀粉狀蛋白相對于上清總放射活性的百分比。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
這些沉淀實(shí)驗(yàn)清楚地顯示，如硫黃素-T一樣，三環(huán)化合物吖啶、氯丙嗪和亞甲藍(lán)對淀粉狀蛋白形成沒有影響。相反地，剛果紅顯示顯著而快速的抑制作用，5h后大約減少淀粉狀蛋白含量3倍并隨孵育時(shí)間持續(xù)下去。在沒有剛果紅情況下，人糊精在5h孵育后顯示超過75％的放射性標(biāo)記糊精摻入沉淀性淀粉狀蛋白中。
吖啶橙也顯示沉淀性淀粉狀蛋白形成的顯著減少，72h后達(dá)50％水平，使整體減少30％。中性紅，另一個(gè)在結(jié)構(gòu)上與吖啶橙相似的三環(huán)分子，顯示較小但顯著的減少。四環(huán)素也具有顯著的抑制作用，但僅在50h孵育期間后，其間百分比減少從大約85％至60％。在此情況下，抑制作用的方式得自于硫黃素-T熒光實(shí)驗(yàn)所見，即淀粉狀蛋白初始形成后隨時(shí)間出現(xiàn)四環(huán)素依賴的裂解相。
亞甲藍(lán)是對原纖維相關(guān)的硫黃素-T熒光顯示完全抑制作用的化合物實(shí)例，但對沉淀性淀粉狀蛋白含量沒有影響，表明硫黃素-T與現(xiàn)有淀粉狀蛋白結(jié)合和/或置換不一定與淀粉狀蛋白形成的抑制作用相關(guān)。
實(shí)施例5
通過圓二色光譜檢測多環(huán)化合物對人糊精原纖維形成的抑制作用通過圓二色光譜剛果紅對糊精原纖維形成的影響(圖9).下面概述的數(shù)據(jù)顯示多環(huán)化合物剛果紅對糊精原纖維形成抑制作用的影響，采用圓二色光譜分光光度法技術(shù)，用于比較純二級結(jié)構(gòu)的圓二色光譜譜(圖9A)。如本方法所述，在C18旋轉(zhuǎn)柱上純化人糊精(100μg)以得到100％HFIP的儲備液。此儲備液的光譜在0.1cm道寬的石英室內(nèi)以1nm間隔采集(圖9B)。單體糊精的100％HFIP儲備液在100mM氯化鉀/50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.4)中稀釋至2.5％HFIP。人糊精濃度大約為5μM。在無(圖9C)或有超過人糊精20倍摩爾過量剛果紅(圖9D)的情況下，在0.5cm道寬的石英室內(nèi)以1nm間隔采集光譜。如圖所示，單體糊精的100％HFIP儲備液在含濃度漸減的剛果紅的100mM氯化鉀/50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.4)中稀釋至4％HFIP。人糊精濃度大約為4μM。在0.1cm道寬的石英室內(nèi)以1nm間隔采集光譜(圖9E)。單體糊精的100％HFIP儲備液在含200μM莧菜紅的100mM氯化鉀/50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.4)中稀釋至4％HFIP。人糊精濃度大約為4μM。在0.1cm道寬的石英室內(nèi)以1nm間隔采集光譜(圖9F)。
純化的糊精當(dāng)保存在100％HFIP溶液中時(shí)穩(wěn)定于隨意卷曲的構(gòu)型(圖9B)。室溫下，溶液數(shù)天時(shí)間內(nèi)在構(gòu)造上是穩(wěn)定的。不形成原纖維的大鼠糊精在水溶液中顯示相似的光譜。然而，在人糊精從儲備液稀釋成磷酸鹽緩沖液時(shí)，立即出現(xiàn)β-片層形成，如特征性的217nm最小值所示(圖9C)。形成人糊精β-片層構(gòu)象異構(gòu)體是不溶性糊精原纖維形成的第一個(gè)步驟。
相反，糊精稀釋于含過量剛果紅的緩沖液阻止形成β-片層構(gòu)象異構(gòu)體(圖9D)，而改為引起糊精成為α-螺旋構(gòu)造(在205和223nm的最小值)。糊精以此α-螺旋結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定至少24hr，且不發(fā)生不溶性原纖維的形成。漸減濃度的剛果紅對人糊精的滴定(圖9E)顯示，在亞化學(xué)計(jì)量的剛果紅濃度下，可引起從α-螺旋(200μM和4μM剛果紅)直至隨意卷曲(0.8μM剛果紅)的改變，然后形成β-片層(0.8μM剛果紅，1hr后)?？雌饋?，剛果紅以化學(xué)計(jì)量的比率與糊精結(jié)合以阻止形成β-片層。
剛果紅是多環(huán)化合物實(shí)例，在所述條件下，看起來引起糊精成為α-螺旋構(gòu)造狀態(tài)并阻止進(jìn)行β-構(gòu)象異構(gòu)體形成，從而阻止不溶性原纖維的形成。
莧菜紅是在結(jié)構(gòu)上與剛果紅相關(guān)的食品染料，對糊精的作用與剛果紅相似，即過量的莧菜紅阻止β-構(gòu)象異構(gòu)體的形成，并相反引起糊精成為α-螺旋構(gòu)造。
實(shí)施例6多環(huán)化合物對糊精原纖維介導(dǎo)的毒性的防護(hù)作用剛果紅在RINm5F細(xì)胞中對糊精原纖維介導(dǎo)的毒性的防護(hù)作用(圖10).在培養(yǎng)的RINm5Fβ細(xì)胞中進(jìn)一步研究對淀粉狀蛋白形成顯示抑制作用的化合物對淀粉狀蛋白引起的細(xì)胞毒性的潛在效應(yīng)。
A.用30μM人糊精處理22h并用鈣黃綠素-AM和溴乙非啶同型二聚體-1染色以顯示活細(xì)胞(綠色)和死細(xì)胞(紅色)的RINm5F細(xì)胞典型熒光顯微照片。箭頭表示死細(xì)胞實(shí)例。
B.用30μM人糊精處理和100μM剛果紅如上染色的RINm5F細(xì)胞典型顯微照片。
C.測定活細(xì)胞百分比，細(xì)胞用賦形劑、30μM人糊精、30μM人糊精與100μM剛果紅、或30μM大鼠糊精處理22h。除人糊精加剛果紅(A+CR)實(shí)驗(yàn)重復(fù)五次以外，所有實(shí)驗(yàn)分別重復(fù)10次。誤差棒表示每個(gè)條件6-12個(gè)視野內(nèi)活的和死細(xì)胞計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過單側(cè)ANOV A檢驗(yàn)，隨后采用Dunnett′s檢驗(yàn)通過pos-hoc分析檢驗(yàn)。***p＜0.001，##p＜0.01。
中性紅、吖啶橙和四環(huán)素化合物在對淀粉狀蛋白聚集產(chǎn)生抑制作用的相對摩爾比率(低μM)下，對RINm5F β細(xì)胞是有細(xì)胞毒性的。因此，研究僅限于在這些實(shí)驗(yàn)條件下不顯示固有細(xì)胞毒作用的剛果紅。結(jié)果顯示，同賦形劑對照相比，用30μM糊精孵育RIN5mF細(xì)胞22h引起細(xì)胞死亡的顯著增加(圖10C)。相反，在相同條件下大鼠糊精制劑是無細(xì)胞毒的。死細(xì)胞是在綠色活細(xì)胞本底上可見到的紅色細(xì)胞(圖10A)。人糊精與3倍摩爾過量的剛果紅共孵育抑制了糊精的細(xì)胞毒作用(圖10B，10C)。在本底上可見到糊精原纖維的紅色剛果紅染色(圖10B)。對三個(gè)不同商品批次的糊精進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，每次都觀察到剛果紅存在的顯著防護(hù)作用。
在此研究中，探索應(yīng)用小的多環(huán)化合物作為淀粉狀蛋白形成的抑制劑。為了解可能的結(jié)構(gòu)/性關(guān)系，根據(jù)化合物的芳香環(huán)拓?fù)鋵W(xué)及側(cè)鏈成分，或根據(jù)以前報(bào)道的對其它淀粉狀蛋白相關(guān)過程的抑制作用，選擇代表性的系列小多環(huán)化合物。剛果紅是常規(guī)在組織病理學(xué)中用作診斷性非特異淀粉狀蛋白染色的共扼聯(lián)苯結(jié)構(gòu)(Khurana等人，J.Biol，Chem.27622715-22721(2001))。此化合物也曾報(bào)道在原代大鼠海馬趾培養(yǎng)物中抑制原纖維β-淀粉狀蛋白的神經(jīng)毒性(Lorenzo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9112243-12247(1994))，可能是通過穩(wěn)定淀粉狀蛋白前體的單體。又見Forloni G等人，F(xiàn)EBS Lett.487404-407(2001)關(guān)于四元并四苯衍生物四環(huán)素的報(bào)道，抑制β-淀粉狀蛋白的形成并裂解預(yù)先形成的β-淀粉狀蛋白。吩噻嗪衍生物氯丙嗪，據(jù)報(bào)道在綿羊瘋癢病感染的小鼠細(xì)胞培養(yǎng)物中逆轉(zhuǎn)形成疾病的朊病毒斑并延長細(xì)胞生存(Korth等人，Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A 989836-9841(2001))。其異構(gòu)體硫黃素-T已被廣泛地用作熒光探針以檢測淀粉狀蛋白的形成(Goldsbury CS等人(2000)J.Struct.Biol 130217-231)。像氯丙嗪一樣，亞甲藍(lán)具有三環(huán)核心結(jié)構(gòu)，臨床用于治療高鐵血紅蛋白癥以及在組織病理學(xué)中作為組織染色的染料(Wright RO等人(1999)Ann.Emerg.Med 34646-656)。三環(huán)吩嗪衍生物中性紅常規(guī)地用作特異性熒光染料標(biāo)記以鑒定和分離胰腺胰島(Jager S等人(1990 Eur，Surg.Res.228-13)。吖啶和吖啶橙分別是核心結(jié)構(gòu)和衍化的吩嗪結(jié)構(gòu)的實(shí)例。
本研究顯示，發(fā)明的多環(huán)化合物可以在體外抑制淀粉狀蛋白的形成。芳香吩嗪核心足以使原纖維結(jié)合，如化合物吖啶所證明的作用。在此核心結(jié)構(gòu)的2和8位置添加兩個(gè)二甲胺基則產(chǎn)生了吖啶橙，它作為不溶性淀粉狀蛋白形成的強(qiáng)力抑制劑起作用。吩嗪衍生物中性紅也抑制淀粉狀蛋白形成，但顯著地比吖啶橙速率低。相反，除吩噻嗪核心以外與吖啶橙結(jié)構(gòu)相同的亞甲藍(lán)則沒有作用。
如放射性沉淀研究所示，這些三環(huán)化合物間對淀粉狀蛋白形成的驚人差異清楚地表明，存在使淀粉狀蛋白結(jié)合并能夠抑制淀粉狀蛋白形成的明顯結(jié)構(gòu)關(guān)系。特別地，可能通過芳香π-π相互作用，當(dāng)核心環(huán)結(jié)構(gòu)足以結(jié)合淀粉狀蛋白時(shí)(Gazit EFASEB J 1677-83(2002))，從環(huán)上發(fā)出的二甲胺側(cè)鏈的存在對于抑制淀粉狀蛋白形成是重要的。同樣地，帶電荷或不帶電荷的吩噻嗪衍生物的作用顯著地低于其各自的吩嗪衍生物。側(cè)鏈基團(tuán)相互作用的重要性也可應(yīng)用于擴(kuò)大范圍的聯(lián)苯結(jié)構(gòu)和并四苯衍生物，分別以剛果紅和四環(huán)素為代表。
觀察到的淀粉狀蛋白含量減少的分子機(jī)制尚不清楚。與包括Alzheimer β-淀粉和朊病毒但被，PrPc的其它淀粉樣變性病不同，其中α-螺旋/β-鏈-不協(xié)調(diào)延伸看起來與淀粉狀蛋白形成有關(guān)(Kallberg Y等人J.Biol.Chem.27612945-12950(2001))，關(guān)于糊精的淀粉形成可能通過一個(gè)途徑進(jìn)行，該途徑涉及相對不折疊的淀粉狀蛋白形成區(qū)的聚集。盡管涉及的折疊組裝的精確特性不確定，這些聚集物導(dǎo)致形成由延伸的β-片層結(jié)構(gòu)組成的初原纖維，其β-鏈方向與長軸垂直。特別引起注意的是，產(chǎn)生淀粉狀蛋白的區(qū)域由包括序列NFGAIL的殘基20-29限定的區(qū)域(Tenidis K.等人，J.Mol Biol 2951055-1071(2000))。在此區(qū)域內(nèi)，25、28和29位置的脯氨酰殘基取代足以充分地減少完整分子產(chǎn)生的淀粉狀蛋白形成。本研究中試驗(yàn)的一些多環(huán)化合物所觀察到的沉淀性淀粉狀蛋白含量的減少可能是由于這些淀粉狀蛋白形成區(qū)內(nèi)的破壞性相互作用所致。
含剛果紅和人糊精的制劑比單獨(dú)用人糊精孵育對培養(yǎng)的胰島β-細(xì)胞的細(xì)胞毒性小。因此，通過多環(huán)化合物破壞淀粉狀蛋白可能不一定是有細(xì)胞毒的，甚至可能是保護(hù)細(xì)胞的。此外，體內(nèi)對胰島淀粉狀蛋白形成的更敏感的抑制作用可能足以補(bǔ)償內(nèi)在的清除機(jī)制以控制和促進(jìn)淀粉狀蛋白的去除。
這些發(fā)現(xiàn)證明應(yīng)用小的多環(huán)化合物可作為胰島淀粉狀蛋白形成的潛在抑制劑。
權(quán)利要求
1.一種抑制細(xì)胞毒性蛋白構(gòu)象異構(gòu)體的方法，包括給予有效劑量的三-元環(huán)多并苯、取代的三-元環(huán)多并苯、四-元環(huán)多并苯、五-元環(huán)多并苯、融合的四環(huán)化合物或融合環(huán)和聯(lián)苯化合物。
2.一種預(yù)防淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的方法，包括預(yù)防初原纖維形成和/或減少現(xiàn)有的初原纖維沉積物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的疾病在哺乳動物內(nèi)預(yù)防。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的疾病在人類中預(yù)防。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的疾病選自AL淀粉樣變性病、淀粉A淀粉樣變性病、家族性甲狀腺運(yùn)載蛋白淀粉樣變性病、Alzheimer′s病、朊病毒病或II型糖尿病。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的疾病是AL淀粉樣變性病。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的疾病是淀粉A淀粉樣變性病。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的疾病是家族性甲狀腺運(yùn)載蛋白淀粉樣變性病。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的疾病是Alzheimer′s病。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的疾病是朊病毒病。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的疾病是II型糖尿病。
12.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的初原纖維形成通過給予有效劑量的三-元環(huán)多并苯、取代的三-元環(huán)多并苯、四-元環(huán)多并苯、五-元環(huán)多并苯、融合的四環(huán)化合物或融合環(huán)和聯(lián)苯化合物而預(yù)防。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的三-元環(huán)多并苯包括蒽、phenalene或菲。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的取代的三-元環(huán)多并苯包括奎納克林、中性紅、氯丙嗪、吖啶、吖啶橙、亞甲藍(lán)或吩噻嗪。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的四-元環(huán)多并苯包括芘、屈、苯[α]蒽、苯[m]蒽或并四苯。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的五-元環(huán)多并苯包括苯并[c]菲。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的融合的四環(huán)化合物包括四環(huán)素或強(qiáng)力霉素。
18.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的融合環(huán)和聯(lián)苯化合物包括剛果紅或柯胺G或莧菜紅。
19.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的三-元環(huán)多并苯是蒽。
20.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的三-元環(huán)多并苯是phenalene。
21.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的三-元環(huán)多并苯是菲。
22.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的取代的三-元環(huán)多并苯是奎納克林。
23.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的取代的三-元環(huán)多并苯是中性紅。
24.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的取代的三-元環(huán)多并苯是氯丙嗪。
25.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的取代的三-元環(huán)多并苯是吖啶。
26.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的取代的三-元環(huán)多并苯是吖啶橙。
27.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的取代的三-元環(huán)多并苯是亞甲藍(lán)。
28.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的取代的三-元環(huán)多并苯是吩噻嗪。
29.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的四-元環(huán)多并苯是芘。
30.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的四-元環(huán)多并苯是屈。
31.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的四-元環(huán)多并苯是苯[α]蒽。
32.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的四-元環(huán)多并苯是苯[m]蒽。
33.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的四-元環(huán)多并苯是苯并[c]菲。
34.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的四-元環(huán)多并苯是并四苯。
35.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的融合的四環(huán)化合物是四環(huán)素。
36.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的融合的四環(huán)化合物是強(qiáng)力霉素。
37.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的融合環(huán)和聯(lián)苯化合物是剛果紅。
38.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的融合環(huán)和聯(lián)苯化合物是柯胺G。
39.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的給予的化合物基本上選自蒽、菲、奎納克林、中性紅、氯丙嗪、吖啶、吖啶橙、亞甲藍(lán)、苯二嗪、吩噻嗪、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、剛果紅、芘、屈、苯[α]蒽、苯[m]蒽、苯并[c]菲和并四苯。
40.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的初原纖維形成通過聯(lián)合給予三-元環(huán)多并苯、取代的三-元環(huán)多并苯、四-元環(huán)多并苯、五-元環(huán)多并苯、融合的四環(huán)化合物和/或融合環(huán)和聯(lián)苯化合物而被預(yù)防。
41.一種預(yù)防或抑制初原纖維形成的方法，包括給予有效劑量的三-元環(huán)多并苯、取代的三-元環(huán)多并苯、四-元環(huán)多并苯、五-元環(huán)多并苯、融合的四環(huán)化合物、或融合環(huán)和聯(lián)苯化合物。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述的三-元環(huán)多并苯、取代的三-元環(huán)多并苯、四-元環(huán)多并苯、五-元環(huán)多并苯、融合的四環(huán)化合物、或融合環(huán)和聯(lián)苯化合物包括蒽、菲、奎納克林、中性紅、氯丙嗪、吖啶、吖啶橙、亞甲藍(lán)、苯二嗪、吩噻嗪、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、剛果紅、芘、屈、苯[α]蒽、苯[m]蒽、苯并(c)菲或并四苯。
43.一種改善淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的方法，包括防止初原纖維形成。
44.一種預(yù)防胰島β-細(xì)胞死亡的方法，包括防止初原纖維形成。
45.一種在易患者中預(yù)防淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的方法，包括防止初原纖維形成。
46.一種防止可溶性糊精轉(zhuǎn)變成不溶性糊精的方法，包括給予有效劑量的適合的三-元環(huán)多并苯、取代的三-元環(huán)多并苯、四-元環(huán)多并苯、五-元環(huán)多并苯、融合的四環(huán)化合物、或融合環(huán)和聯(lián)苯化合物。
47.一種防止細(xì)胞毒性β-構(gòu)象異構(gòu)體形成的方法，包括給予有效劑量的三-元環(huán)多并苯、取代的三-元環(huán)多并苯、四-元環(huán)多并苯、五-元環(huán)多并苯、融合的四環(huán)化合物、或融合環(huán)和聯(lián)苯化合物。
48.一種預(yù)防或改善淀粉樣變性病相關(guān)疾病的方法，包括在初原纖維形成前給予有效劑量的三-元環(huán)多并苯、取代的三-元環(huán)多并苯、四-元環(huán)多并苯、五-元環(huán)多并苯、融合的四環(huán)化合物、或融合環(huán)和聯(lián)苯化合物。
49.一種篩選有效下調(diào)糊精例如人糊精β-構(gòu)象異構(gòu)體的化合物的方法，含有或包括以下步驟(i)將該化合物用于有或無β-構(gòu)象異構(gòu)體存在的糊精制劑中；(ii)鑒定和/或測定β-構(gòu)象異構(gòu)體的水平，從而確定有效性。
50.一種鑒定能夠阻斷通常與淀粉狀蛋白相關(guān)的毒性的化合物的方法，包括將化合物用于糊精制劑中并觀察β-構(gòu)象異構(gòu)體的形成，其中所述的淀粉狀蛋白來自可溶性糊精轉(zhuǎn)變成不溶性糊精或初原纖維的形成。
51.一種篩選有效下調(diào)糊精例如人糊精β-構(gòu)象異構(gòu)體的化合物的方法，含有或包括以下步驟(i)將該化合物用于有或無β-構(gòu)象異構(gòu)體存在的糊精制劑中；(ii)鑒定和/或測定β-構(gòu)象異構(gòu)體的水平，從而確定有效性。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中的化合物是多環(huán)的。
53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過物理分離、純化、離析和/或沉淀進(jìn)行。
54.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中的糊精至少部分被標(biāo)記和/或做記號。
55.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中的標(biāo)記或記號包括以下任何一種或多種放射性同位素、熒光記號、抗體、光學(xué)可探測物或酶。
56.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過親合性標(biāo)記的結(jié)合或釋放進(jìn)行。
57.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中的親合性標(biāo)記是硫黃素-T。
58.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中的親合性標(biāo)記是肝素或其功能變體。
59.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過圓二色光譜進(jìn)行。
60.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過電子顯微鏡法進(jìn)行。
61.根據(jù)權(quán)利要求51的方法鑒定的化合物。
62.一種篩選化合物所述的方法，該化合物有效抑制人糊精從含有或包括隨意卷曲和/或α-螺旋的構(gòu)型轉(zhuǎn)變成含有或包括β-片層的構(gòu)型和/或降低所述的轉(zhuǎn)變的速率，其中所述的方法含有或包括以下步驟(i)將該化合物用于有或無β-構(gòu)象異構(gòu)體存在的糊精制劑中；(ii)鑒定和/或測定β-構(gòu)象異構(gòu)體的水平，從而確定有效性。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中的化合物是多環(huán)的。
64.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過物理分離、純化、離析和/或沉淀進(jìn)行。
65.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中的糊精至少部分被標(biāo)記和/或做記號。
66.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中的標(biāo)記或記號包括以下任何一種或多種放射性同位素、熒光記號、抗體、光學(xué)可探測物或酶。
67.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過親合性標(biāo)記的結(jié)合或釋放進(jìn)行。
68.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中的親合性標(biāo)記是硫黃素-T。
69.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中的親合性標(biāo)記是肝素或其功能變體。
70.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過圓二色光譜進(jìn)行。
71.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過電子顯微鏡法進(jìn)行。
72.根據(jù)權(quán)利要求62的方法鑒定的化合物。
73.一種篩選有效抑制胰島β-細(xì)胞變性和/或逆轉(zhuǎn)疾病狀態(tài)的化合物的方法，含有或包括以下步驟(i)將該化合物用于有或無β-構(gòu)象異構(gòu)體存在的糊精制劑中；(ii)鑒定和/或測定β-構(gòu)象異構(gòu)體的水平，從而確定有效性。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中的化合物是多環(huán)的。
75.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過物理分離、純化、離析和/或沉淀進(jìn)行。
76.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中的糊精至少部分被標(biāo)記和/或做記號。
77.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中的標(biāo)記或記號包括以下任何一種或多種放射性同位素、熒光記號、抗體、光學(xué)可探測物或酶。
78.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過親合性標(biāo)記的結(jié)合或釋放進(jìn)行。
79.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中的親合性標(biāo)記是硫黃素-T。
80.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中的親合性標(biāo)記是肝素或其功能變體。
81.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過圓二色光譜進(jìn)行。
82.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過電子顯微鏡法進(jìn)行。根據(jù)權(quán)利要求73的方法鑒定的化合物。
83.篩選有效抑制胰島β-細(xì)胞變性和/或逆轉(zhuǎn)疾病狀態(tài)的化合物的方法，含有或包括以下步驟(i)將該化合物用于能夠產(chǎn)生人糊精β-構(gòu)象異構(gòu)體的細(xì)胞中；(ii)鑒定和/或測定細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外β-構(gòu)象異構(gòu)體的水平，從而確定有效性；(iii)將化合物與能夠形成細(xì)胞毒性β-構(gòu)象異構(gòu)體的外源性人糊精一起用于細(xì)胞中，通過細(xì)胞死亡測定確定對細(xì)胞活力的影響。
84.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中的化合物是多環(huán)的。
85.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過物理分離、純化、離析和/或沉淀進(jìn)行。
86.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中的糊精至少部分被標(biāo)記和/或做記號。
87.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中的標(biāo)記或記號包括以下任何一種或多種放射性同位素、熒光記號、抗體、光學(xué)可探測物或酶。
88.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過親合性標(biāo)記的結(jié)合或釋放進(jìn)行。
89.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中的親合性標(biāo)記是硫黃素-T。
90.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中的親合性標(biāo)記是肝素或其功能變體。
91.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過圓二色光譜進(jìn)行。
92.根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過電子顯微鏡法進(jìn)行。
93.根據(jù)權(quán)利要求83的方法鑒定的化合物。
94.一種篩選有效下調(diào)人糊精β-構(gòu)象異構(gòu)體的化合物的方法，含有或包括以下步驟(i)將該化合物用于能夠產(chǎn)生人糊精β-構(gòu)象異構(gòu)體的細(xì)胞中；(ii)鑒定和/或測定細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外β-構(gòu)象異構(gòu)體的水平，從而確定有效性；(iii)將化合物與能夠形成細(xì)胞毒性β-構(gòu)象異構(gòu)體的外源性人糊精一起用于細(xì)胞中，通過細(xì)胞死亡測定確定對細(xì)胞活力的影響。
95.根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其中的化合物是多環(huán)的。
96.根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過物理分離、純化、離析和/或沉淀進(jìn)行。
97.根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其中的糊精至少部分被標(biāo)記和/或做記號。
98.根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其中的標(biāo)記或記號包括以下任何一種或多種放射性同位素、熒光記號、抗體、光學(xué)可探測物或酶。
99.根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過親合性標(biāo)記的結(jié)合或釋放進(jìn)行。
100.根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其中的親合性標(biāo)記是硫黃素-T。
101.根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其中的親合性標(biāo)記是肝素或其功能變體。
102.根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過圓二色光譜進(jìn)行。
103.根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過電子顯微鏡法進(jìn)行。
104.根據(jù)權(quán)利要求94的方法鑒定的化合物。
105.一種篩選化合物的方法，該化合物有效抑制人糊精從含有或包括隨意卷曲和/或α-螺旋的構(gòu)型轉(zhuǎn)變成含有或包括β-片層的構(gòu)型和/或降低所述的轉(zhuǎn)變的速率，其中所述的方法含有或包括以下步驟(i)將該化合物用于能夠產(chǎn)生人糊精β-構(gòu)象異構(gòu)體的細(xì)胞中；(ii)鑒定和/或測定細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外β-構(gòu)象異構(gòu)體的水平，從而確定有效性；(iii)將化合物與能夠形成細(xì)胞毒性β-構(gòu)象異構(gòu)體的外源性人糊精一起用于細(xì)胞中，通過細(xì)胞死亡測定確定對細(xì)胞活力的影響。
106.根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中的化合物是多環(huán)的。
107.根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過物理分離、純化、離析和/或沉淀進(jìn)行。
108.根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中的糊精至少部分被標(biāo)記和/或做記號。
109.根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中的標(biāo)記或記號包括以下任何一種或多種放射性同位素、熒光記號、抗體、光學(xué)可探測物或酶。
110.根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過親合性標(biāo)記的結(jié)合或釋放進(jìn)行。
111.根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中的親合性標(biāo)記是硫黃素-T。
112.根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中的親合性標(biāo)記是肝素或其功能變體。
113.根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過圓二色光譜進(jìn)行。
114.根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法，其中β-構(gòu)象異構(gòu)體的鑒定和/或β-構(gòu)象異構(gòu)體水平的測定通過電子顯微鏡法進(jìn)行。
115.根據(jù)權(quán)利要求105的方法鑒定的化合物。
116.一種篩選有效下調(diào)人糊精β-構(gòu)象異構(gòu)體的化合物的方法，含有或包括以下步驟(i)將該化合物用于能夠產(chǎn)生人糊精β-構(gòu)象異構(gòu)體的細(xì)胞中；(ii)定性和/或測定細(xì)胞死亡的細(xì)胞標(biāo)記的活化和/或上調(diào)作為無效指示，從而確定有效性。
117.根據(jù)權(quán)利要求116所述的方法，其中的化合物是多環(huán)的。
118.根據(jù)權(quán)利要求116所述的方法，其中的細(xì)胞標(biāo)記是凋亡標(biāo)記。
119.根據(jù)權(quán)利要求116所述的方法，其中的細(xì)胞標(biāo)記是壞死性標(biāo)記。
120.根據(jù)權(quán)利要求116所述的方法，其中的細(xì)胞標(biāo)記是選自以下任何一個(gè)或多個(gè)caspase8、caspase3、cJun、JNK、p21、WAF1、p53。
121.根據(jù)權(quán)利要求116所述的方法，其中的定性或測定使用至少一種能夠編碼以下一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的mRNA種類caspase8、caspase3、cJun、JNK、p21、WAF1、p53。
122.根據(jù)權(quán)利要求116所述的方法，其中的定性或測定使用RT-PCR、Northern分析、雜交或微陣列。
123.根據(jù)權(quán)利要求116所述的方法，其中的定性或測定使用以下一個(gè)或多個(gè)多肽caspase8、caspase3、cJun、JNK、P21、WAF1、P53。
124.根據(jù)權(quán)利要求116的方法鑒定的化合物。
全文摘要
本發(fā)明披露了預(yù)防淀粉狀蛋白相關(guān)疾病的方法，包括采用公開的多環(huán)化合物相關(guān)的篩選和方法學(xué)防止初原纖維形成。
文檔編號A61K31/00GK1688299SQ03807531
公開日2005年10月26日 申請日期2003年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月29日
發(fā)明者G·J·S·庫珀, K·M·盧麥斯, J·F·艾特肯 申請人:普羅特米克斯公司