專利名稱：包含含有精氨酸和/或賴氨酸的基序的抗微生物肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供抗微生物肽。本發(fā)明還涉及包含該抗微生物肽的藥物組合物以及該肽在治療尤其是微生物感染中的用途。
內源性抗菌肽的一重要家族，即β-防御素是由內襯高等哺乳動物的消化道、呼吸道和泌尿生殖道的上皮細胞分泌的。皮膚中的角質化細胞也生產該β-防御素。它們的主要作用是提供抵御由病原微生物通過上述途徑引起的感染的第一道重要防線。
防御素是被研究得最多的一類抗微生物肽。該類物質由具有三個二硫橋的富含半胱氨酸的分子組成。其存在于植物、昆蟲和多種哺乳動物中。在人類中存在兩類防御素，這兩類防御素在6個半胱氨酸殘基間的間距和鍵上存在不同。這兩類防御素中的第一種是α-防御素(6種類型)，其是從中性粒細胞(HNP 1-4，人嗜中性肽)中分離的并且位于胃腸道的Paneth細胞中(α-防御素5和6)的。第二類，即β-防御素更長、堿性更強，并且在內襯和/或包含和/或存在于消化道、呼吸道和泌尿生殖道和皮膚中的上皮細胞和角質化細胞中的粘膜中表達。hBD1(人β-防御素1)是組成型分泌的并且人β-防御素2、3和4(hBD2、hBD3和hBD4)響應感染或炎癥而產生。細菌尤其是鞭毛菌的刺激(Harder et al，Nature 1997；387861)和IL1[α]和IL1[β](白細胞介素1)(Liu et al，J Invest Dermatol 2002；118；275-281)引起hBD2的表達和分泌。在某些組織位置，腫瘤壞死因子α(TNF-α)和脂多糖(LPS)還也可以起誘導hBD2的表達的作用。體外實驗已經揭示，hBD2具有對抗諸如大腸埃希桿菌(E.coli)等革蘭氏陰性菌的活性，并且在較小范圍內低程度上具有抗諸如肺炎鏈球菌(Str.pneumoniae)等革蘭氏陽性菌的活性。hBD2還顯示出體外對酵母白色念珠菌(yeast Candida albicans)的殺滅活性。細菌刺激、TNF-α并且尤其是干擾素γ(IFNγ)誘導hBD3的表達和分泌，這些因素具有共同特性，即都為涉及炎性過程的分子。
β-防御素除了提供有效的、組成型的以及調節(jié)的廣譜固有抗微生物保護以外，這些分子，尤其是hBD2還具有通過對未成熟樹突狀細胞和記憶T淋巴細胞的趨化性影響調動免疫應答適應臂(adaptive arm)的能力(Yang et al，Science 1999；286525-528)。
重要的是，有證據(jù)表明β-防御素不僅提供抵御由病原微生物引起的感染，而且對調節(jié)并維持機體必需的諸如皮膚上、胃腸道和生殖道內的共生微生物生態(tài)系統(tǒng)的最佳密度和多樣性起關鍵作用(Ganz，T，Nat Rev Immunol.20033(9)710-20)。
β-防御素的作用方式為在活性濃度下其對宿主細胞基本沒有毒性。因此，β-防御素成為用于治療廣泛感染的潛在目標。然而，在重組體系統(tǒng)中生產天然形式的防御素具有技術上的挑戰(zhàn)性，導致其產率低。此外，越來越多的證據(jù)表明，通過其趨化性作用，β-防御素是有效的炎性化合物(Yang et al，Science 1999；286525-528；Van Weteringet al.Inflamm Res.2002；51(1)8-15；Niyonsaba et al.Curr Drag TargetsInflamm Allergy 2003；2(3)224-231)。這些因素一起使得天然防御素不適于治療應用。
β-防御素是高度鹽敏感的(Porter et al.，Infect.Immun.1997；65(6)2396-401；Bals et al.J Clin Invest.1998；102(5)874-80；Valore et al.，JClin Invest 1998；101(8)1633-42；Goldmann et al.，Cell 1997；88(4)553-609；Singh et al.，Proc Natl Acad Sci USA 95(25)14961-6)。由于該原因，在諸如囊性纖維化的條件下，β-防御素不能提供抗微生物保護，其中，雖然呼吸上皮響應與該疾病狀態(tài)相關的持續(xù)細菌感染而產生大量的β-防御素，但是由于跨呼吸上皮膜的離子轉運的不平衡，β-防御素失活，所述不平衡導致增加的陽離子再吸收(尤其是Na+)和增加的氯化物分泌Donaldson SH and Boucher RC.Curr.Opin.PuIm.Med.2003Nov；9(6)486-91；Davies JC.Pediatr Pulmonol Suppl.2004；26147-8)。
因此，需要可以用于治療微生物感染的其它試劑。
本發(fā)明鑒別出了與天然防御素相比，意想不到地具有改善的抗微生物活性的肽。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了包含3至200個D和/或L氨基酸的肽，該氨基酸可以是相同的或不同的，其中該氨基酸選自疏水性氨基酸和/或陽離子氨基酸。所述肽可以包含3至約100個D和/或L氨基酸，例如3至50個D和/或L氨基酸，包括4至約50個D和/或L氨基酸。
本發(fā)明的肽尤其可以用于治療或預防微生物感染。
本發(fā)明的另一方面，提供了包含如通式I所示的氨基酸的肽((X)l(Y)m)n(I)其中l(wèi)和m是0至10的整數(shù)，例如0至5；n是1至10的整數(shù)；X和Y是選自疏水性氨基酸和/或陽離子氨基酸的氨基酸，所述X和Y可以是相同的或不同的。
本發(fā)明的優(yōu)選方面中，所述肽具有3至200個氨基酸，例如3、4、5、6或7至100個氨基酸，包括3、4、5、6或7至20、25、30、35、40或42個氨基酸。
本發(fā)明的肽可以包含100至200個氨基酸、27至100個氨基酸、28至86個氨基酸、7至27個氨基酸或3至14個氨基酸。
優(yōu)選地，所述肽包含3至15個氨基酸，例如3至7個氨基酸。
另一優(yōu)選方面中，所述肽還包含一個或多個半胱氨酸殘基，例如包含多達6個的半胱氨酸殘基，例如包含1、2、3、4、5、6個半胱氨酸殘基。
在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，，提供了包含如通式II所示的氨基酸的肽C((X)l(Y)m)nC((X)l(Y)m)n(II)其中C是半胱氨酸，l、n和m是0至10的整數(shù)，X和Y是選自疏水性氨基酸和/或陽離子氨基酸的氨基酸，所述X和Y可以是相同的或不同的。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，提供了包含如通式III所示的氨基酸的肽
C((X)l(Y)m)nC((X)l(Y)m)nC((X)l(Y)m)nC((X)l(Y)m)nC(III)其中C、X、Y、l、m和n如本文所定義。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，，提供了包含如通式IV所示的氨基酸的肽C((X)l(Y)m)nC((X)l(Y)m)nC((X)l(Y)m)nC((X)l(Y)m)nCC(IV)其中C、X、Y、l、m和n如本文所定義。
因為本發(fā)明的肽在結構上比天然β-防御素簡單，所以本發(fā)明的肽易于生產并且產率較高。而且所述肽基本上對鹽不敏感并且是非肝毒的。此外，其物理形式的而非生物代謝的(即，直接的膜破壞相對靶向重要生物代謝途徑的組成元素)作用方式，如果沒有排除，但也最小化了靶微生物可能形成對所述抗微生物劑抗性的可能性。
本領域技術人員已知，主要根據(jù)氨基酸側鏈的化學和物理性質可以將氨基酸分成不同的類型。例如，通常將某些氨基酸認為是親水的或極性氨基酸而將其它氨基酸認為是疏水的或非極性氨基酸。本文使用的術語“疏水的”和“陽離子的”可以指具有Fauchere and Pliska Eur.J.Med Chem.1039(1983)中所述的疏水性大于等于-1.10和/或凈電荷大于等于0的氨基酸。疏水性或非極性氨基酸還可以指具有在生理pH下不帶電的側鏈的氨基酸，所述氨基酸是非極性的并且通常與水溶液不相溶。
本發(fā)明的優(yōu)選方面中，X和/或Y選自由甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和蘇氨酸組成的疏水性氨基酸和/或由鳥氨酸、組氨酸、精氨酸和賴氨酸組成的陽離子氨基酸。X和/或Y可以是D或L-氨基酸。此外，X和/或Y可以是交替使用氨基酸。
本發(fā)明還包括已知的異構體(結構的、立體的、構象的和構型的)和上述氨基酸的結構類似物，以及天然(例如翻譯后修飾)或包括但不僅限于磷酸化、糖基化、磺酰化和/或羥基化等化學修飾的類似物。
通常，本發(fā)明的肽不包含的氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或絲氨酸，但是即使存在這些氨基酸，本發(fā)明的某些肽也可以具有活性。
本發(fā)明的肽可以包含與通式II、III或IV的一個或兩個末端的半胱氨酸殘基相鄰的一個或多個額外的氨基酸殘基，例如所述肽可以含有多達10個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)的額外的氨基酸殘基。優(yōu)選地，該額外的氨基酸殘基是非半胱氨酸殘基。更優(yōu)選地，該額外氨基酸是X和/或Y。
此外，可以修飾肽的氨基酸序列以便得到包括至少肽的一個氨基酸殘基替代了另一個氨基酸殘基的肽變體，所述替代包括使用D型替代L型。
肽的一個或多個殘基可以與另一個交換以改變、加強或保護肽的生物活性。例如，這樣的變體可以具有相應非變體肽的至少約10％的生物活性。經常使用保守氨基酸，即使用具有上述的類似化學和物理性質的氨基酸進行替換。
因此，例如保守氨基酸替代可以涉及將賴氨酸替換為精氨酸、鳥氨酸或組氨酸；將一個疏水性氨基酸替換為另一個。在引入替代后，篩選變體的生物活性。
所述肽可以含有至少4個氨基酸，例如4至50個氨基酸，或諸如20至45個氨基酸的4至50個氨基酸，所述20至45個氨基酸例如20、25、30、35、40、42或45個氨基酸。
本發(fā)明的優(yōu)選方面中，X和Y是相同的并且是亮氨酸或甘氨酸。
本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，X是亮氨酸并且Y是甘氨酸。
另一優(yōu)選方面中，X和Y是相同的并且是賴氨酸或精氨酸。因此本發(fā)明提供選自多-L-賴氨酸、多-D-賴氨酸、多-L-精氨酸和多-D-精氨酸的肽。
另一優(yōu)選方面中，X是賴氨酸并且Y是精氨酸。
在本發(fā)明的肽中，l和m可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10并且n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在本發(fā)明的肽中，l可以是1，n可以是1并且和m可以是4至9，例如m可以是3、4、5、6、7、8或9。
在本發(fā)明的肽中，l、n和/或m可以是1至5，例如1、2、3、4或5。
優(yōu)選的肽是非環(huán)狀的。所述肽可以是直鏈的，即線形的或支鏈的。
本文使用的術語“肽”指，通常來說是通過肽鍵相結合的大量氨基酸殘基。它可以與多肽和蛋白質相互交換使用并且與其意義相同。
在本發(fā)明的一實施方案中，所述肽包含選自下列的氨基酸序列CGGGGGGCGGGGCGGGGGGGGGCGGGGGGCC(i)CLLLLLLCLLLLCLLLLLLLLLCLLLLLLCC(ii)CLGLGLGCGLGLCLGLGLGLGLCGLGLGLCC(iii)CRKRKRRCRKRKCKRKRKEKRKCRKRKRKCC(iv)KKK(v)KKKKKKK(vi)RRR(vii)RRRRRRR(viii)在本發(fā)明另一方面中，所述肽包含氨基酸序列(i)至(viii)中的至少一個以及與一個或兩個末端半胱氨酸殘基相鄰的額外的氨基酸殘基。因此，在本發(fā)明另一實施方案中，提供了包含選自

圖1所示氨基酸序列的氨基酸序列的肽。
本發(fā)明的肽通常是合成的肽。所述肽可以是分離的、純化的肽或其變體，它們可以在體外合成，例如通過固相肽合成法、酶催化的肽合成或使用重組DNA技術。
為了鑒定對哺乳動物細胞具有極小或不具有不期望的毒性的活性肽，可以制備個別肽或肽文庫并且可以篩選該個別肽或來自該肽文庫的肽的抗微生物活性和毒性，其包括但不限于抗真菌的、抗細菌的、抗病毒的、抗原蟲的、抗寄生物的活性和毒性。
本發(fā)明的肽可以以不同的形式存在，例如游離酸、游離堿、酯或其它前藥、鹽和互變異構體，并且本發(fā)明包括化合物的全部變體形式。
因此，本發(fā)明包括本發(fā)明的肽或肽變體的鹽或前藥。
可以以藥物可接受鹽的形式給藥本發(fā)明的肽?？梢酝ㄟ^常規(guī)的化學方法由包含堿性或酸性部分的母體肽合成本發(fā)明的藥物可接受鹽。通常，通過將這些游離酸或游離堿的形式的肽與水或有機溶劑或二者的混合物中化學計量的合適的堿或酸反應來制備所述的鹽，通常優(yōu)選諸如醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈的非水溶劑。Remington′sPharmaceutical Sciences(雷明頓藥物科學)，17th ed.，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.，US，1985，p.1418中給出了合適的鹽，本文引入其作為參考；還可以參見Stahl et al，Eds，″Handbook of PharmaceuticalSalts Properties Selection and Use″(藥物鹽性質的選擇與用途手冊)，Verlag Helvetica Chimica Acta and Wiley-VCH，2002。
因此本發(fā)明包括所公開的肽的藥物可接受鹽，其中通過形成母體化合物的酸性鹽或堿性鹽來修飾該母體化合物，例如由諸如無機或有機酸或堿形成的常規(guī)的非毒性鹽或季銨鹽。酸加合鹽的實例包括乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、延胡索酸鹽、葡萄糖庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫氯化物、氫溴化物、氫碘化物、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽和十一酸鹽。堿性鹽包括銨鹽、諸如鈉鹽和鉀鹽的堿金屬鹽、諸如鈣鹽和鎂鹽的堿土金屬鹽、與諸如二環(huán)己胺和N-甲基-D-谷酰胺等有機堿所形成的鹽，以及與諸如精氨酸和賴氨酸等氨基酸所形成的鹽?？梢允褂弥T如低級鹵代烷、二烷基硫酸鹽、長鏈鹵化物和芳烷基鹵化物等試劑季銨化含有堿性氮的基團，所述低級鹵代烷例如甲基、乙基、丙基和丁基氯、溴和碘；所述二烷基硫酸鹽例如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸鹽；所述長鏈鹵化物例如癸基、十二烷基、十四烷基和十八烷基氯、溴和碘；所述芳烷基鹵化物例如芐基和苯乙基溴等。
可以使用通常的方法通過將所述肽與一當量或多當量的期望的堿接觸來制備本發(fā)明的肽或肽變體的羧基鹽，該堿例如是諸如氫氧化鈉的金屬氫氧化物堿；諸如碳酸鈉或碳酸氫鈉的金屬碳酸鹽或碳酸氫鹽；或諸如三乙胺、三乙醇胺等的胺。
可以通過使用用于最終濃縮的N-?；槐Ｗo的氨基酸、或通過?；槐Ｗo的或未被保護的氨基酸來制備本發(fā)明的肽或肽變體的氨基的N-酰基衍生物?？梢酝ㄟ^例如?；哂杏坞x羥基的肽或肽樹脂來制備O-酰基衍生物。可以使用諸如酰鹵、酐、?；溥虻鹊臉藴术；瘎┻M行上述的任何一種?；饔?。
本發(fā)明包括所述肽的活性藥物種類的前藥，例如其中被保護或衍生修飾的一個或多個官能團了可以在體內被轉化為所述官能團，例如羧酸酯類在體內可以轉化為游離酸的的情況，或被保護的胺可以轉化為游離氨基的情況。本文使用的術語“前藥”尤其表示可以在體內迅速轉化為母體結構的結構，例如通過在血液中的水解作用。T.Higuchiand V.Stella，Pro-drugs as Novel Delivery Systems(前藥作為新的輸送系統(tǒng))，Vol.14 of the A.C.S.Symposium Series，Edward B.Roche，ed.，Bioreversible Carriers in Drug Design，American PharmaceuticalAssociation and Pergamon Press，1987；H Bundgaard，ed，Design ofProdrugs，Elsevier，1985；and Judkins，et al.Synthetic Communications，26(23)，4351-4367(1996)提供了詳細的討論，此處引入上述文獻作為參考。
因此，前藥包括具有已經轉化為其可逆衍生物的官能團的藥物。通常，這些前藥通過水解作用轉化為活性藥物?？赡芴峒暗膶嵗缦?
前藥還包括通過氧化或還原反應可以轉化為活性藥物的化合物?？赡芴峒暗膶嵗缦卵趸罨饔谩-和O-脫烷基化·氧化脫氨·N-氧化·環(huán)氧化還原活化作用·偶氮還原·亞砜還原·二硫化物還原·生物還原烷基化·硝基還原還應提及前藥的代謝活化是核苷酸活化、磷酸化活化和脫羧活化。
″Protective Groups in Organic Chemistry″(有機化學中的保護基)，edited by J W F McOmie，Plenum Press(1973)和″Protective Groups inOrganic Synthesis″(有機合成中的保護基)，2nd edition，T W Greene & PG M Wutz，Wiley-Interscience(1991)中充分描述了保護基的用途。
因此，本領域技術人員應該理解，雖然被保護的所述肽的衍生物可能本身不具有藥物活性，但是可以將其例如腸胃外或口服給藥，并且其后在機體內進行代謝以形成具有藥物活性的化合物。因此，這樣的衍生物是“前藥”的實例。本發(fā)明的范圍內包括所述化合物的全部前藥。
本發(fā)明的另一方面提供藥物組合物，其包含藥物有效劑量的至少一種本發(fā)明的肽，或兩種或更多種本發(fā)明的肽。
這些肽還包括藥物可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。本文使用的術語“藥物可接受的”指在合理的醫(yī)學評判范圍內，具有合理的利益/風險比的，適合用于與人類或某些情況中動物的組織接觸的化合物、材料、組合物和/或劑型而沒有過度的毒性、刺激、過敏反應或其它問題或合并癥。
本發(fā)明的肽尤其可以用作抗微生物肽，例如可以用于抗細菌、真菌、酵母、寄生蟲、原生動物和病毒。本文使用的術語“抗微生物肽”定義為具有殺滅微生物和/或只抑制其生長(microbistatic)的活性的任何肽，并且非排他地包括據(jù)稱具有抗細菌、抗真菌、抗霉菌、抗寄生蟲、抗原蟲、抗病毒、抗傳染、抗感染和/或殺菌、殺滅藻、殺滅阿米巴、殺滅微生物、殺滅細菌、殺滅真菌、殺滅寄生蟲、殺滅原生動物(protozoacidal)、殺滅原蟲(protozoicidal)性質的任何肽。
因此，本發(fā)明還提供用作藥物的本發(fā)明的肽。本發(fā)明的肽可以用作體內和用于體內回輸?shù)捏w外處理(ex vivo)的抗微生物劑。
在優(yōu)選方面中，本發(fā)明提供本發(fā)明的肽在制造治療微生物感染的藥物中的用途。
“微生物感染”指由細菌、寄生蟲、原生動物、病毒或真菌病原體造成的感染。通常將“病原體”定義為引起疾病的任何生物體。
細菌病原體可以來自于選自下列的細菌種類葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.)，例如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)；腸球菌屬(Enterococcusspp.)，例如糞腸球菌(Enterococcus faecalis)；化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)；利斯特菌屬(Listeria spp.)；假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)；分枝桿菌屬(Mycobacterium spp.)，例如結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)；腸桿菌屬(Enterobacter spp.)；彎曲桿菌屬(Campylobacterspp.)；沙門菌屬(Salmonella spp.)；鏈球菌屬(Streptococcus spp.)，例如鏈球菌A群或B群(Streptococcus Group A or B)、肺炎鏈球菌(Streptoccocus pneumoniae)；螺桿菌屬(Helicobacter spp.)，例如幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)；奈瑟菌屬(Neisseria spp.)，例如淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)、腦膜炎萘瑟菌(Neisseria meningitidis)；伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)；志賀桿菌屬(Shigella spp.)，例如弗氏志賀菌(Shigella flexneri)；大腸埃希桿菌(Escherichia coli)；嗜血桿菌屬(Haemophilus spp.)，例如流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)；衣原體屬(Chlamydia spp.)，例如沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)、鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci)；土拉弗朗西絲菌(Francisella tularensis)；芽胞桿菌屬(Bacillus spp.)，炭疽桿菌(Bacillus anthracis)；梭狀芽孢桿菌屬(Clostridia spp.)，例如肉毒梭菌(Clostridium botulinum)；耶爾森菌屬(Yersinia spp.)，例如鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)；密螺旋體屬(Treponema spp.)；伯爾霍爾德菌屬(Burkholderia spp.)，例如鼻疽伯爾霍爾德菌(Burkholderia mallei)和假鼻疽伯爾霍爾德菌(B pseudomallei)。
病毒病原體可以來自于選自下列的病毒人免疫缺陷癥病毒(HIV1&2)(Human Immunodeficiency Virus(HIV1&2))；人T細胞白血病病毒(HTLV1&2)(Human T Cell Leukaemia Virus(HTLV1&2))；埃博拉病毒(Ebola virus)；人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus)(例如HPV-2、HPV-5、HPV-8HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-52、HPV-54和HPV-56)；乳多空病毒(papovavirus)；鼻病毒(rhinovirus)；脊髓灰質炎病毒(poliovirus)；皰疹病毒(herpesvirus)；腺病毒(adenovirus)；EB病毒(Epstein Barr virus)；流感病毒(influenzavirus)；乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒(hepatitis B and C viruses)；類天花病毒(Variola virus)；輪狀病毒(rotavirus)或SARS冠狀病毒(SARScoronavirus)。
寄生病原體可以來自于選自下列的寄生病原體錐蟲屬(Trypanosoma spp.)(克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、布氏錐蟲(Trypansosoma brucei))、利什曼原蟲屬(Leishmania spp.)、賈第蟲屬(Giardia spp.)、毛滴蟲屬(Trichomonas spp.)、內阿米巴屬(Entamoebaspp.)、耐格里原蟲屬(Naegleria spp.)、棘阿米巴屬(Acanthamoeba spp.)、血吸蟲屬(Schistosoma spp.)、瘧原蟲屬(Plasmodium spp.)、隱孢子蟲屬(Crytosporidium spp.)、等孢子球蟲屬(Isospora spp.)、小袋蟲屬(Balantidium spp.)、羅阿絲蟲(Loa Loa)、人蛔蟲(Ascaris lumbricoides)、犬惡絲蟲(Dirofilaria immitis)、弓形體屬(Toxoplasma ssp.)，例如鼠弓形體(Toxoplasma gondii)。
真菌病原體可以來自于選自下列的真菌病原體念珠菌屬(Candida spp.)(例如白色念珠菌(C.albicans))、表皮癬菌屬(Epidermophyton spp.)、外瓶柄霉屬(Exophiala spp.)、小孢霉屬(Microsporum spp.)、發(fā)癬菌屬(Trichophyton spp.)(例如深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)和趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale))、癬屬(Tinea spp.)、曲霉菌屬(Aspergillus spp.)、芽生菌屬(Blastomyces spp.)、芽生裂殖菌屬(Blastoschizomyces spp.)、球孢子菌屬(Coccidioides spp.)、隱球菌屬(Cryptococcus spp.)、組織胞漿菌屬(Histoplasma spp.)、副球孢子菌屬(Paracoccidiomyces spp.)、孢子絲菌屬(Sporotrix spp.)、犁頭菌屬(Absidia spp.)、支孢霉屬(Cladophialophora spp.)、產色芽生菌屬(Fonsecaea spp.)、瓶霉菌屬(Phialophora spp.)、Lacazia spp.、爪甲白癬菌屬(Arthrographis spp.)、支頂孢菌屬(Acremonium spp.)、馬都拉放線菌屬(Actinomadura spp.)、鱗質霉屬(Apophysomyces spp.)、金孢子菌屬(Emmonsia spp.)、團擔子菌屬(Basidiobolus spp.)、白僵菌屬(Beauveria spp.)、金孢子菌屬(Chrysosporium spp.)、耳霉屬(Conidiobolus spp.)、小克銀漢霉屬(Cunninghamella spp.)、鐮孢霉屬(Fusarium spp.)、地菌屬(Geotrichum spp.)、粘束孢屬(Graphium spp.)、小球腔菌屬(Leptosphaeria spp.)、馬拉塞霉菌屬(Malassezia spp.)、毛霉菌屬(Mucor spp.)、新龜甲屬(Neotestudina spp.)、諾卡爾菌屬(Nocardiaspp.)、諾卡爾土壤菌屬(Nocardiopsis spp.)、擬青霉屬(Paecilomycesspp.)、莖點霉屬(Phoma spp.)、毛孢子菌屬(Piedraia spp.)、肺孢子蟲屬(Pneumocystis spp.)、偽霉樣真菌屬(Pseudallescheria spp.)、須殼孢屬(Pyrenochaeta spp.)、根毛霉屬(Rhizomucor spp.)、酒曲菌屬(Rhizopusspp.)、紅酵母屬(Rhodotorula spp.)、酵母菌屬(Saccharomyces spp.)、足放線病菌屬(Scedosporium spp.)、帚霉屬(Scopulariopsis spp.)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces spp.)、并頭狀菌屬(Syncephalastrum spp.)、木霉屬(Trichoderma spp.)、毛孢子菌屬(Trichosporon spp.)、齦枝孢屬(Ulocladium spp.)、黑粉菌屬(Ustilago spp.)、輪枝孢菌屬(Verticilliumspp.)、萬吉拉菌屬(Wangiella spp.)。
本發(fā)明的肽可以治療的微生物感染可以選自如表1所示的任何人細菌、真菌、寄生蟲、包膜病毒病原體。
因此，本發(fā)明提供本發(fā)明的肽在制造治療微生物感染的藥物中的用途，其中該微生物感染是全身的、局部的、皮下的、皮膚的或粘膜的真菌感染。
霉菌感染可以分為全身的或局部的感染，所述全身感染指感染程度較重并且影響內臟或經血液傳播，局部(皮膚真菌的)感染指感染是表面的并且發(fā)生在皮膚上。此外，酵母感染可以影響機體的粘膜。酵母感染也可以是全身的(例如念珠菌血癥和其它經常是致命性的疾病狀態(tài))。通?？梢允褂萌楦嗷蜍浉?局部抗真菌藥)治療皮膚上的真菌感染。然而，全身感染、酵母感染或在使用乳膏或軟膏治療后沒有消除的局部感染可能需要使用全身性抗真菌藥物(口服或靜脈內)來進行治療。使用這些藥物來治療諸如癬(癬菌病)或念珠菌病的普通真菌感染，所述癬發(fā)生在皮膚上，所述念珠菌病(酵母感染，也被成為真菌性口炎)發(fā)生在咽喉、陰道或機體的其它部分。全身性抗真菌藥物還被用來治療諸如組織胞漿菌病、芽生菌病和曲霉病等可以影響肺部和其它器官的其它深層的真菌感染。有時使用這些藥物來預防或治療諸如骨髓或器官移植和HIV-AIDS患者等免疫系統(tǒng)被削弱的人的感染。
通常不會引起死亡或嚴重疾病的局部或皮膚真菌感染是廣泛流行的并且經濟上是重要的，因為對其進行治療是昂貴的。局部或表面真菌感染可以包括皮膚、蹄葉、角質層、甲和毛發(fā)的感染。皮膚感染是皮膚、指甲和趾甲的感染。
在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，真菌感染是甲癬。來自但不限于發(fā)癬菌屬(Trichophyton spp.)的真菌可以引起甲癬，例如該真菌可以是趾間發(fā)癬菌(Trichophyton interdigitale)或深紅色發(fā)癬菌(Trichophytonrubrum)。
術語“甲癬”包括但不限于末端側生甲下的、表面白色的、接近白色的甲下的、繼發(fā)營養(yǎng)不良的、原發(fā)營養(yǎng)不良的、endonyx、念珠菌屬引起的(例如甲松離和慢性粘膜皮膚病)類型的甲癬。已經證明甲癬是諸如手臂/腿的急性細菌性蜂窩織炎以及其它繼發(fā)細菌感染的多種嚴重慢性并發(fā)癥的重要危險因子，因此本發(fā)明包括這些感染的治療。
對于多種病原生物體來說，本發(fā)明的肽是有效的抗微生物肽。然而，本發(fā)明的肽還可以用于包括但不限于囊性纖維化以及諸如胃腸感染、泌尿生殖器感染或呼吸感染的與粘膜感染相關的其它疾病狀態(tài)的其它疾病狀態(tài)的治療。
本發(fā)明的肽還可以尤其用于創(chuàng)傷、潰瘍和損傷的治療或預防，例如割傷或燒傷的表皮創(chuàng)傷以及與其相關的疾病狀態(tài)。
術語“治療”涉及本文所述的肽給予患有(傳染性的)疾病的患者益處的效果，其包括患者疾病狀態(tài)的改善或疾病進程的延緩。
本文使用的“創(chuàng)傷治療”可以包括創(chuàng)傷愈合以及促進、加強或加速組織愈合并且包括術后瘢痕、燒傷、牛皮癬、諸如整形手術和器官移植后的組織重塑的加速的相關條件和療法。
因此，本發(fā)明的另一方面提供了應用本發(fā)明的肽的基質或與本發(fā)明的肽連接的基質。優(yōu)選地，該基質適合用于創(chuàng)傷或向創(chuàng)傷部位輸送。優(yōu)選地，該基質允許本發(fā)明的肽從基質轉移至創(chuàng)傷床以實現(xiàn)其抗菌效果。該基質可以是敷料，例如創(chuàng)傷敷料。該敷料可以包括織物材料或者其可以是膠原樣材料。
本發(fā)明的還可以用作消毒劑或用于消毒劑之中。在這方面，可以將本發(fā)明的肽或藥物組合物單獨應用于需要處理的表面，或將其與其它消毒劑聯(lián)合應用于需要處理的表面。本文使用的“需要處理的表面”可以是本文定義的基質或醫(yī)療器械。
在另一方面中，本發(fā)明提供治療或預防個體微生物感染的方法，其包括對所述個體給藥治療有效量的本發(fā)明的肽。
在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述微生物感染是真菌感染。在本發(fā)明的方法中，所述肽可以用于所述個體的皮膚或甲上。
可以使用本文所述的肽、組合物或方法來治療哺乳動物、鳥和其它動物。這樣的哺乳動物和鳥包括人、狗、貓和家畜，該家畜例如馬、牛、綿羊、山羊、雞、火雞等等。此外，還可以使用本發(fā)明的肽、組合物或方法來治療植物。
當所述個體為動物時，可以將本發(fā)明的方法用于非排他地包括蹄、爪和腳的甲樣部分。
除了肽治療以外，本發(fā)明的方法可以包括增強肽向甲中滲透的治療?？梢酝ㄟ^化學或物理方法促進上述的治療。諸如刻蝕或挫蝕甲背層的物理處理可以增強本發(fā)明的肽的滲透性?？梢酝ㄟ^破壞甲板角蛋白的物理或化學鍵來實現(xiàn)化學增強本發(fā)明的肽的甲滲透性。甲軟化劑增強了甲的水合作用以減小甲的密度，因此可以提高本發(fā)明的肽的滲透性，所述甲軟化劑非排他地包括脲和水楊酸。含有巰基基團的化合物將破壞甲角蛋白中的雙硫鍵，并且可以導致不穩(wěn)定以及增強的藥物滲透性。非排他地包括乙酰半胱氨酸和巰基乙醇衍生物等的化合物可以與本發(fā)明的肽組合使用。其它已知的可以與本發(fā)明的肽組合使用的甲滲透性賦形劑/佐劑包括甲磺?；淄?、脲、聚乙二醇、N-(-2-巰丙酰基)甘氨酸、二甲砜和2-n-壬基-1，3-二氧戊環(huán)。
另一方面，本發(fā)明提供治療個體創(chuàng)傷的方法，其包括對個體的創(chuàng)傷應用治療有效劑量的本發(fā)明的肽或基質。
可以將包括其鹽在內的本發(fā)明的肽給藥以便實現(xiàn)降低與感染、征候或疾病相關的至少一種癥狀，或降低與癥候或疾病相關的抗體的量。
為了達到期望的效果，可以將所述肽、其變體或其組合以單一劑量或分立劑量給藥，所述劑量例如至少約0.01mg/kg體重至約500至750mg/kg體重、至少約0.01mg/kg體重至約300至500mg/kg體重、至少約0.1mg/kg體重至約100至300mg/kg或至少約1mg/kg體重至約50至100mg/kg體重或至少約1mg/kg體重至約20mg/kg體重，雖然其它劑量也可能提供有益結果。根據(jù)包括但不限于所選擇的肽及其臨床效果、疾病、哺乳動物的體重、身體條件、健康狀況、年齡、是要實現(xiàn)預防還是要實現(xiàn)治療、以及所述肽是否是化學修飾的等多種因素，給藥量是可以變化的。通過臨床醫(yī)生檢查臨床試驗的經驗數(shù)據(jù)以及檢查臨床前動物模型的結果或其它本領域可以得到的測試體系，可以容易地確定這些因素。
例如根據(jù)受體的生理條件、給藥的目的是治療的還是預防、以及技術人員已知的其它因素，可以以連續(xù)的或間斷的方法將本發(fā)明的治療劑進行單次劑量、多次劑量給藥。可以在預定的時間段內基本上連續(xù)地給藥本發(fā)明的肽，也可以以一系列間隔劑量給藥本發(fā)明的肽?？梢赃M行局部給藥和全身給藥。
為了制備組合物，合成所述肽或者以其它方式得到所述肽，如果必須或愿意，可以純化所述肽，然后凍干并使其穩(wěn)定。然后將所述肽調節(jié)至合適的濃度并任意地與其它試劑混合。包含在單位劑量中的給定肽的絕對重量可以大范圍地變化。例如可以給藥約0.01至約2g或約0.01至約500mg的至少一種本發(fā)明的肽或對特定細胞類型特異的多種肽?；蛘?，單位劑量可以是約0.01g至約50g、約0.01g至約35g、約0.1g至約25g、約0.5g至約12g、約0.5g至約8g、約0.5g至約4g、或約0.5g至約2g。
本發(fā)明的肽的日劑量也可以變化。例如該日劑量可以是約0.001g/天至約100或50g/天、約0.1g/天至約25g/天、約0.1g/天至約12g/天、約0.1g/天至約5g/天、約0.1g/天至約2.5g/天、約0.1g/天至約2g/天、約0.5g/天至約8g/天、約0.5g/天至約4g/天、約0.5g/天至約2g/天、以及約0.5g/天至約1g/天。
因此，可以通過包括口服、腸胃外(包括皮下、靜脈、肌內和腹膜內)、直腸、皮膚、經皮膚、胸內、肺內和鼻內(呼吸)途徑在內的多種途徑將一種或多種包含本發(fā)明的治療肽的合適單位劑型進行給藥。還可以將所述治療肽組方為脂質劑型或持續(xù)釋放(例如使用微囊法，參見WO 94/07529和美國專利第4,962,091號)。如果合適，所述制劑可以方便地存在于不連續(xù)的單位劑型中并且可以通過制藥領域公知的任何方法制備。這樣的方法可以包括將治療劑與脂質載體、固體基質、半固體基質、精細分離的固體載體或其組合進行混合的步驟，然后，如果需要，將產物引入或成型至期望的輸送體系中。
當制備本發(fā)明的治療肽用于口服給藥時，通常將其與藥物可接受載體、稀釋劑或賦形劑混合以形成藥物制劑，或單位劑型。對于口服給藥，所述肽可以以粉末、顆粒制劑、溶液、混懸液、乳液的形式存在或存在于天然的或合成的聚合物或樹脂中，以便于從口香糖中吸收所述活性成分。所述活性肽還可以以大藥丸、藥糖劑或糊劑的形式存在。還可以將口服給藥的本發(fā)明的治療肽進行組方使其持續(xù)釋放，例如可以將所述肽包被、微囊化或者置于持續(xù)輸送的裝置中。在這樣的制劑中總活性成分為制劑重量的0.1至99.9％。
可以通過本領域已知的方法，使用公知的并易于獲得的原料來制備含有本發(fā)明的治療肽的藥物制劑。例如，可以使用普通的賦形劑、稀釋劑或載體與所述肽進行組方，形成片劑、膠囊劑、溶液、混懸液、粉末、氣霧劑等等。適于這些制劑的賦形劑、稀釋劑和載體的實例包括緩沖液、填充物以及諸如淀粉、纖維素、糖、甘露醇和硅衍生物等膨脹劑。所述制劑還可以包括結合劑，例如羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素和其它纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮。所述制劑可以包括諸如甘油的增濕劑，諸如碳酸鈣和碳酸氫鈉的崩解劑。還可以包括諸如石蠟等的延緩溶出的試劑。還可以包括諸如季胺類化合物的吸收加速劑?？梢园ㄖT如十六醇和單硬脂酸甘油酯等的表面活化劑?？梢约尤胫T如高嶺土和膨潤土等吸附載體。還可以包括諸如滑石、硬脂酸鈣和硬脂酸鎂以及固態(tài)聚乙二醇等潤滑劑。還可以加入防腐劑。本發(fā)明的組合物還可以含有諸如纖維素和/或纖維素衍生物等的增稠劑。它們還可以含有諸如黃原膠、瓜兒膠或卡波膠或阿拉伯膠等樹膠，或者含有聚乙二醇、膨潤土和蒙脫石等等。
例如，含有本發(fā)明的肽的片劑或膠囊藥片(caplet)可以含有諸如碳酸鈣、氧化鎂和碳酸鎂等緩沖劑。合適的緩沖劑還可以包括乙酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽和磷酸鹽。膠囊藥片和片劑還可以含有非活性成分，諸如纖維素、預膠化淀粉、二氧化硅、羥丙基甲基纖維素、硬脂酸鎂、微晶纖維素、淀粉、滑石、二氧化鈦、苯甲酸、檸檬酸、玉米淀粉、礦物油、聚丙二醇、磷酸鈉、硬脂酸鋅等等。含有至少一種本發(fā)明的肽的硬明膠膠囊或軟明膠膠囊可以含有諸如明膠、微晶纖維素、十二烷基硫酸鈉、淀粉、滑石、二氧化鈦等非活性成分，以及諸如聚乙二醇(PEGs)和植物油等液體載體。此外，含有一種或多種本發(fā)明的肽的包有腸溶衣的膠囊藥片或片劑被設計為在胃中抵抗崩解以及在十二指腸的更加中性至堿性的環(huán)境中溶解。
還可以將本發(fā)明的治療肽組方為酏劑或用于方便口服給藥的溶液或適于通過諸如肌內、皮下、腹膜內或靜脈內等途徑腸胃外給藥的溶液。本發(fā)明的肽的藥物制劑還可以是水溶液或無水溶液或分散液的形式，或者是乳液、混懸液或藥膏的形式。
因此，可以將所述治療肽進行組方用于腸胃外給藥(例如通過諸如團注或連續(xù)輸注等注射)，并且其可以以單位劑型存在于安瓿、預裝注射器、小體積輸注容器或者多次劑量容器中。如上所述，可以加入防腐劑以幫助保持劑型的貨架壽命。所述活性肽和其它成分可以在油介質或水介質中形成混懸液、溶液或乳液，并且可以含有諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑等組方劑。或者，所述活性肽和其它成分可以是通過無菌固體的無菌分離或通過將溶液凍干獲得的粉末形式，其在使用前與諸如無菌無熱原水的合適載體組成。
這些制劑可以含有本領域公知的藥物可接受的載體、介質和佐劑。例如除了水以外，可以使用一種或多種生理學觀點可以接受的有機溶劑制備溶液，所選的有機溶劑可以是丙酮、乙酸、乙醇、異丙醇、二甲基亞砜、乙二醇醚(例如以名字″Dowanol″出售的產品)、聚乙二醇(polyglycol)和聚乙二醇(polyethylene glycol)、短鏈酸的C1-C4烷基酯、乳酸乙酯或乳酸異丙酯、甘油三脂肪酸酯(例如以名字″Miglyol″銷售的產品)、肉豆蔻酸異丙酯、動物油、礦物油和植物油以及聚硅氧烷。
優(yōu)選地，本發(fā)明的治療肽的藥物制劑還可以是含有該肽的溶劑或稀釋劑的形式。溶劑或稀釋劑可以包括酸溶液、二甲砜、N-(-2-巰丙?；?甘氨酸、2-n-壬基-1，3-二氧戊環(huán)和乙醇。該溶劑/稀釋劑優(yōu)選為酸性溶劑，例如乙酸、檸檬酸、硼酸、乳酸、丙酸、磷酸、苯甲酸、丁酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、琥珀酸或酒石酸。
更優(yōu)選地，所述溶劑是乙酸溶液。諸如乙酸溶液的所述溶劑可以以低于1％、0.5％、0.25％、0.1％、0.05％或0.01％酸的濃度存在于所述組合物中，該酸例如是乙酸。
本發(fā)明的另一方面提供了酸在制造治療微生物感染，尤其是真菌感染的藥物中的用途。所述真菌感染可以是甲癬。甲癬可以由來自但不限于發(fā)癬菌屬(Trichophyton spp.)的真菌引起的，例如該真菌可以是趾間發(fā)癬菌(Trichophyton interdigitale)或深紅色發(fā)癬菌(Trichophytonrubrum)。所述酸可以是上文所述的。優(yōu)選的酸是乙酸。優(yōu)選地，在溶液中以低于1％、0.5％、0.25％、0.1％、0.05％或0.01％酸的濃度提供所述酸，該酸例如乙酸。通常使所述藥物適合局部給藥來治療例如甲。
下文使用的術語“活性劑”包括單一一種本發(fā)明的肽或本文所述肽的組合。術語“活性劑”還可以包括藥物有效量的本文所述的酸?？梢詫⒃摶钚詣┩瑫r、連續(xù)或分別給藥。通常優(yōu)選局部給藥。
可以將所述活性劑以協(xié)同有效量給藥。因此，本發(fā)明包括協(xié)同有效量的活性劑的用途，例如本發(fā)明的肽和藥物有效量的本文所述酸用于制造例如藥物的產品，用于在治療微生物感染中同時、分別或連續(xù)給藥所述活性劑。
如果需要，可以加入選自抗氧化劑、表面活性劑、其它防腐劑、成膜劑、角質分離劑或剝離劑、香料、調味劑和著色劑的佐劑。可以加入諸如叔丁基對苯二酚、丁基化羥基苯甲醚、丁基化羥基甲苯和α-生育酚及其衍生物等抗氧化劑。
本發(fā)明還涉及包含一種或多種本發(fā)明的肽以及一種或多種其它抗微生物劑或抗真菌劑的組合產品，所述抗微生物劑或抗真菌劑例如兩性霉素B、兩性霉素B脂質體復合物(ABCD)、脂質體兩性霉素B(L-AMB)和脂質體制霉菌素、唑類和三唑類，例如伏立康唑(voriconazole)、氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、pozaconazole等等；葡聚糖合成酶抑制劑，例如卡泊芬凈(caspofungin)、米卡芬凈(micafungin，F(xiàn)K463)和V-棘白菌素(LY303366)；灰黃霉素；丙烯胺類，例如特比萘芬；氟胞嘧啶或包括本文所述的抗真菌劑在內的其它抗真菌劑。此外，本發(fā)明還涉及所述肽可以與諸如環(huán)吡酮胺(ciclopirox olamine)、鹵普羅近、發(fā)癬退、十一烯酸酯、局部制霉菌素、阿莫羅芬(amorolfine)、布替萘芬(butenafine)、萘替芬、特比萘芬和其它局部用試劑等局部抗真菌劑混合。
此外，所述肽還適用于持續(xù)釋放劑型等的制劑。該制劑可以以特定方式組成，使得其例如在一定時間段內在腸道或呼吸道特定部分釋放活性肽?？梢杂芍T如聚交酯-甘醇酸酯、脂質體、微乳劑、微粒、納米顆粒或蠟等聚合基質制備包被、包膜和保護性基質。這些包被、包膜和保護性基質可以用于包被內置的裝置，例如支架、導管、腹膜透析管、引流裝置等等。
對于局部給藥，可以將所述活性劑如本領域已知的那樣組方以直接應用于靶區(qū)。局部應用的主要習慣形式是乳膏、乳狀物、凝膠、粉末、分散劑或微乳劑、或多或少增稠的洗液、浸漬墊、軟膏或棒狀物、氣霧劑制劑(例如噴霧劑或泡沫)、肥皂、去污劑、肥皂洗液或肥皂塊。用于該目的的其它常規(guī)形式包括創(chuàng)傷敷料、涂敷的繃帶或其它聚合物覆蓋物、軟膏、乳膏、洗液、糊劑、凝膠、噴霧劑和氣霧劑。因此，可以通過貼劑或繃帶來輸送本發(fā)明的治療肽以用于皮膚給藥?；蛘撸梢詫⑺鲭慕M方為諸如聚丙烯酸酯或丙烯酸酯/乙酸乙烯酯共聚物等粘性聚合物的一部分。對于長期應用，也許需要使用微多孔和/或透氣的襯背層，以便將水合作用或皮膚浸漬最小化。襯背層可以是提供需要的保護和支撐功能的任何合適的厚度。合適的厚度通常為10至200微米。
可以以甲涂層或甲漆層的形式局部給藥。例如，可以將抗真菌肽組方在含有乙酸乙酯(NF)、異丙醇(USP)和聚[甲基乙烯基醚/馬來酸]的丁基單酯的異丙醇溶液的溶液中以局部給藥。
局部給藥的藥物制劑可以包含例如生理學可接受的緩沖鹽溶液，該鹽溶液含有約0.001mg/ml至約100mg/ml的一種或多種對于要治療的征候或疾病特異的本發(fā)明的肽，該肽的濃度例如約0.1mg/ml至約10mg/ml。
可以用加入合適的增稠劑和/或膠凝劑的水性基質或油性基質組方軟膏和乳膏?？梢杂盟曰|或油性基質組方洗液，該洗液通常還含有一種或多種乳化劑、穩(wěn)定劑、分散劑、助懸劑、增稠劑或著色劑。還可以通過美國專利第4,140,122、4,383,529或4,051,842號公開的離子電滲療法輸送活性肽。存在于局部制劑中的本發(fā)明的治療劑的重量百分比將取決于多種因素，但是通常為制劑總重的0.01％至95％，典型為0.1-85％重量比。
可以用水性或非水性基質中的一種或多種所述治療肽組方諸如滴眼劑和滴鼻劑等滴劑，該水性或非水性基質還含有一種或多種分散劑、增溶劑或助懸劑。液體噴霧劑可被泵出，或方便地從壓力包裝中輸出?？梢酝ㄟ^簡單的封口眼滴瓶、通過適于逐滴輸送液體內容物的塑料瓶或者通過特殊形狀的封裝物輸送滴劑。
還可以將所述治療肽組方用于口或咽喉內的局部給藥。例如，可以將所述活性成分組方為錠劑、軟錠劑和漱口劑，所述錠劑含有通常為蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍膠等調味基質，所述軟錠劑在諸如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠等惰性基質中含有所述組合物，所述漱口劑在合適的液體載體中含有本發(fā)明的組合物。
本發(fā)明的藥物制劑可以包括作為可選成分的藥物可接受的載體、稀釋劑、增溶劑或乳化劑，以及本領域中可得到的類型的鹽。這樣的物質的實例包括通常的鹽溶液，例如生理緩沖鹽溶液和水?？梢杂糜诒景l(fā)明的藥物制劑的載體和/或稀釋劑的具體但非限制性實例包括水和生理學可接受的緩沖鹽溶液，例如pH 7.0-8.0的磷酸鹽緩沖鹽溶液。
還可以將本發(fā)明的肽對呼吸道給藥。因此，本發(fā)明還提供氣霧劑藥物制劑和用于本發(fā)明方法的劑型。通常，這些劑型包括一定量的有效治療或預防特定感染、征候或疾病的臨床癥狀的至少一種本發(fā)明的試劑。依照本發(fā)明方法進行治療的感染、征候或疾病的任何統(tǒng)計學顯著的減弱均被認為是在本發(fā)明的范圍內對這些感染、征候或疾病的治療。
或者，對于吸入吹入給藥，可以將組合物制成干粉的形式，例如治療劑和諸如乳糖和淀粉等合適的粉末基質的粉末混合物。粉末組合物可以以單位劑型存在于膠囊或藥筒內，或例如明膠或水泡眼包裝內，使用吸入器或吹入器，或定量吸入器從上述包裝中將所述粉末給藥(例如參見Newinan，S.P.in Aerosols and the Lung，Clarke，S.W.and Davia，D.eds.，pp.197-224，Butterworths，London，England，1984中公開的壓力定量吸入器(MDI)和干粉吸入器)。
當以氣霧劑或吸入形式給藥時，可以將本發(fā)明的治療肽以水溶液形式給藥。因此，其它氣藥物制劑可以含有例如生理學可接受的緩沖鹽溶液，該鹽溶液含有約0.001mg/ml至約100mg/ml的對于要治療的征候或疾病特異的一種或多種本發(fā)明的肽。精細分離的固體肽或者不溶于液體的或不混懸于液體中的核酸顆粒形式的干氣霧劑也可以用于本發(fā)明的實踐中。還可以將本發(fā)明的肽組方為撲粉并且含有具有平均粒徑為約1至5μm或者2至3μm的精細分離的顆粒?？梢允褂帽绢I域公知的技術，通過粉碎或篩選過濾制備精細分離的顆粒?？梢酝ㄟ^吸入預定量的精細分離的物質給藥所述顆粒，該精細分離的物質可以是粉末形式。應該理解，活性成分的單位含量或每一劑型的單獨氣霧劑劑量中所含的成分其自身并不需要構成治療特定感染、征候或疾病的有效量，因為可以通過多次單位劑量的給藥達到必需的有效量。此外，可以在一次給藥或多次給藥中使用低于劑型中的劑量而達到有效量。
對于通過吸入向上呼吸道(鼻)或下呼吸道給藥，可以方便地從噴霧器或壓力包裝或其它輸送氣溶膠噴霧劑的合適裝置中輸送本發(fā)明的治療肽。壓力包裝可以含有合適的壓縮氣體，諸如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適氣體等。在壓力氣霧劑的情況下，可以通過提供閥輸送計量的量來確定劑量單位。噴霧器包括但不限于美國專利第4,624,251、3,703,173、3,561,444和4,635,627號中公開的噴霧器?？梢詮陌‵isons Corporation(Bedford，Mass.)、Schering Corp.(Kenilworth，NJ)和American Pharmoseal Co.(Valencia，CA)在內的許多商業(yè)來源獲得本文公開類型的氣霧劑輸送系統(tǒng)。對于鼻內給藥，還可以通過滴鼻劑、液體噴霧劑給藥所述治療劑，例如通過塑料瓶噴霧器或定量吸入器將。通常的噴霧器是Mistometer(Wintrop)和Medihaler(Riker)。
此外，無論是用于所述疾病狀態(tài)還是某些其它疾病狀態(tài)，所述活性成分還可以與諸如鎮(zhèn)痛劑、抗炎劑、抗組胺劑、支氣管擴張劑等其它治療劑組合使用。
本發(fā)明還提供對特定肽的篩選分析，該特定肽對普通人或其它動物細胞具有低毒性但具有期望的諸如抗真菌等抗微生物特性(滲透真菌的細胞膜、溶解或以其它方式殺死或抑制真菌的生長)。
可以從本文所述的本發(fā)明的肽文庫中得到候選肽。還可以單獨或理性地設計所述肽以使其具有特定的結構特征。
參考以下附圖并藉實施例來說明本發(fā)明圖1顯示了本發(fā)明的4種肽的氨基酸序列；圖2是顯示在使用圖1的肽治療(a)4天和(b)7天以后，真菌趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)生長的直方圖；圖3是顯示在使用圖1的肽治療(a)4天和(b)7天以后，真菌深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)生長的直方圖；圖4是顯示在使用圖1的肽治療(a)24小時和(b)48小時以后，真菌白色念珠菌(Candida albicans)生長的直方圖；圖5是顯示治療24小時以后，肽1(圖1所示)對白色念珠菌(Candida albicans)生長的劑量響應實驗的結果的直方圖；圖6是顯示在圖1所示的肽4的不同劑量下，念珠菌屬(Candidaspp.)的24小時存活率的圖；圖7是顯示在圖1所示的肽4的不同劑量下，3種不同的細菌菌株的24小時存活率的圖；圖8是顯示在生長3天時，0.01％的乙酸對肽4(1mg/ml)的抗真菌(抗深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum))活性的協(xié)同影響的直方圖；圖9是顯示肽4對趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)和深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)的抑制的直方圖；圖10是顯示肽3和肽4對趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)的影響的直方圖；圖11是顯示乙酸對趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)生長的影響的直方圖；圖12是顯示多聚賴氨酸對趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)生長的影響的直方圖；圖13是顯示多聚賴氨酸和多聚精氨酸對深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)生長的影響的直方圖；圖14是顯示多聚-L-精氨酸對趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)和深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)的抑制的直方圖15是顯示降低濃度的多聚精氨酸對深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)和趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)的影響的直方圖；圖16是顯示三聚體對深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)生長的影響的直方圖；圖17是顯示肽4和NaCl對趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)生長的影響的直方圖；圖18是顯示在增加的鹽濃度下，肽4對白色念珠菌(Candidaalbicans)的影響的圖；圖19是顯示多聚賴氨酸和多聚精氨酸對白色念珠菌(Candidaalbicans)存活的影響的直方圖；表1列出了本發(fā)明的肽可以治療的人類細菌、真菌、寄生蟲和包膜病毒病原體；表2詳細說明了與結果和附圖中所示的氨基酸聚合物代碼相應的肽。
通過參考下列實施例來描述本發(fā)明。
實施例材料與方法試劑或者通過與Invitrogen-Evoquest，Carlsbad，CA，USA簽訂合同，使用固相合成生產，或者從肽供應商NeoMPS SA(Strasbourg，F(xiàn)rance)或Sigma-Aldrich Chemical Company Ltd.(Poole，UK)處得到全部的肽。對于使用真菌的測試，在分析緩沖液中將凍干的肽配制為1,000μg/ml的儲液。當?shù)贸鰣D2至8和圖11的實驗中明確說明時，加入作為溶劑的乙酸使其最終濃度達到0.5％。
病原體從National Collection of Pathogenic Fungi，Bristol得到趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)(NCPF 117)和深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)(NCPF 335)菌株，并且以約一個月的時間間隔將菌種轉移至Sabuoraud′s瓊脂斜面和馬鈴薯右旋糖瓊脂斜面上，在30℃下保持培養(yǎng)。在37℃下將白色念珠菌(Candida albicans)菌株3179(從National Collection of TypeCultures[NCTC]，Colindale獲得)供養(yǎng)在Oxoid Mueller Hinton Broth中。從NCTC，Colindale獲得化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)菌株8198、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株10642(抗甲氧西林)和E.coli O157菌株12900并在37℃下將其供養(yǎng)在Oxoid MuellerHinton Broth中。
真菌生長敏感性分析為了確定真菌菌株對每一測試肽的敏感性，如下評價該測試肽對真菌生長的影響。通過向斜面培養(yǎng)基中加入10ml的新鮮營養(yǎng)葡萄糖肉湯(NGB)(含有2％w/v葡萄糖的Oxoid Nutrient broth)并使用刮刀攪拌來制備趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)和深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)的分生孢子和菌絲段的混懸液。通過2層無菌外科紗布過濾所得的分生孢子/菌絲段混懸液以除去較大的菌絲叢和瓊脂塊。向已經加入了總體積為80μl營養(yǎng)培養(yǎng)基(NGB)和適量肽溶液的無菌96孔微滴定板的每一孔中接種20μl的該混懸液(540nm處的吸光度為約0.1，對應約106繁殖體/ml)。對照孔是只使用NGB培養(yǎng)基和溶劑(如果適用，并且如果使用的話與肽樣品的濃度相同)所得到的最終分析體積為100μl的孔。在30℃下孵育24小時、4天、7天后，通過Microtek板讀數(shù)器讀取在540nm處的吸光度來監(jiān)測板內的真菌生長。
白色念珠菌(Candida albicans)存活分析為了確定真菌菌株對每一測試肽的敏感性，如下評價該測試肽對白色念珠菌(Candida albicans)存活的影響。白色念珠菌(C.albicans)培養(yǎng)物生長18至24小時，然后使用前在4℃下儲存。將過夜生長的新鮮培養(yǎng)物以2000xg離心分離10分鐘并使用新鮮的Mueller HintonBroth洗滌，調整活細胞數(shù)目至5×106至1×107/ml。通過向6.9ml的10mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.7)中加入100μl的NGB培養(yǎng)基來制備分析緩沖液。向無菌的螺旋帽封的聚丙烯小瓶中加入35μl含有或不含有一定濃度的肽的分析緩沖液，并加入15μl上述的白色念珠菌(Candidaalbicans)接種物。在37℃下在水浴中孵育所述小瓶2小時，并且通過在無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的連續(xù)稀釋并在9cm含有OxoidSabouraud′s Agar(20ml)的Petri培養(yǎng)皿上涂板來確定存活的念珠菌屬(Candida spp.)的數(shù)目。將這些板在37℃下孵育18至24小時后計數(shù)。
細菌存活率分析化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)菌株8198、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株10642(抗甲氧苯青霉素)和E.coli O157菌株12900(均從NCTC，Colindale獲得)生長18至24小時，然后使用前在4℃下儲存。將過夜生長的新鮮培養(yǎng)物以2000xg離心分離10分鐘并使用新鮮的Mueller Hinton Broth洗滌。根據(jù)上述白色念珠菌(C.albicans)的方法對4種肽中的每一種進行分析。對于E.coli和金黃色葡萄球菌(S.aureus)，肽敏感性分析種使用的細胞的起始數(shù)目為108/ml，并且用于計數(shù)的培養(yǎng)基是Nutrient Agar(Oxoid)。在MuellerHinton agar上化膿性鏈球菌(Srt.pyogenes)不如其它菌株生長的好并且因此用于這些分析的起始細胞數(shù)目要比用于其它菌株的少，后者的細起始胞數(shù)目為106/ml。使用Oxoid Tryptose Soya Agar代替NutrientAgar來確定化膿性鏈球菌(Srt.pyogenes)的存活。
結果肽1至肽4對發(fā)癬菌屬(Trichophtyon spp.)生長的抑制如材料與方法部分所述，在單獨的生長培養(yǎng)基(對照培養(yǎng))或含有50μl/ml的肽1、肽2、肽3或肽4的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩種臨床相關的皮膚真菌病原體深紅色發(fā)癬菌(Trichophtyon rubrum)和趾間發(fā)癬菌(Trichophtyon interdigitale)(如圖1所示)。培養(yǎng)4天和7天后，通過測量光密度(540nm處的吸光度)來評定趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)和深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)的生長。與對照樣品、未處理樣品相比，在第4天和第7天每一測試肽均顯著地抑制了趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)(圖2)和深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)(圖3)的生長。在4至7天如OD讀數(shù)增加所顯示的那樣，每一測試菌株的對照培養(yǎng)物繼續(xù)生長。
肽1至肽4對念珠菌屬(Candida spp.)生長和存活的抑制如材料與方法部分所述，在單獨的生長培養(yǎng)基(對照培養(yǎng))或含有50μl/ml或100μl/ml和300μl/ml或500μl/ml的肽1、肽2、肽3或肽4的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母白色念珠菌(Candida albicans)。培養(yǎng)24小時(圖4a)和48小時(圖4b)后，通過測量光密度(540nm處的吸光度)來評價白色念珠菌(C.albicans)的生長。與對照樣品、未處理樣品相比，每一測試肽均以時間和劑量依賴的方式顯著地抑制了白色念珠菌(C.albicans)的生長。在對照(單獨的生長培養(yǎng)基)條件下或存在50μg/ml至500μg/ml的肽1時培養(yǎng)24小時后光學評價白色念珠菌(C.albicans)生長的實驗中進一步證明了生長抑制的劑量依賴性(圖5)。在另一實驗中，在單獨培養(yǎng)基(對照)或含有1μg/ml至1000μg/ml的肽4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長18至24小時后，評價白色念珠菌(C.albicans)的存活(圖6)。通過培養(yǎng)24小時后的生存計數(shù)，白色念珠菌(C.albicans)的存活以劑量依賴的方式降低(圖6)。
肽4對細菌存活的抑制如材料與方法部分所述，將三種臨床相關的細菌病原體E.coliO157、甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA)和化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)暴露于含有一定濃度肽4中。3小時后將每一細菌培養(yǎng)樣品轉移至合適的固體生長培養(yǎng)基平板上，并且在18至24小時后評價對照(僅有生長培養(yǎng)基)和經處理(含有肽4的生長培養(yǎng)基)的樣品中的成活菌落的數(shù)目。暴露3小時后，與對照培養(yǎng)物、未處理的培養(yǎng)物相比，肽4以劑量依賴的方式顯著地抑制了每一細菌菌株的存活(圖7)。
乙酸增強了肽4的抗真菌活性因為在圖2和圖3所示的實驗中，對照(不含肽)和測試(含有肽1、肽2、肽3或肽4)培養(yǎng)基均含有0.5％乙酸作為肽溶劑(材料與方法部分有詳細說明)，所以進行單獨實驗以確定乙酸自身是否可以在肽活性和/或真菌存活中起作用。為此，根據(jù)材料與方法部分，使用僅有生長培養(yǎng)基、含有0.01％乙酸的生長培養(yǎng)基、含有1mg/ml肽4的生長培養(yǎng)基以及含有1mg/ml肽4和0.01％乙酸的生長培養(yǎng)基來建立深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)生長實驗。如上述培養(yǎng)3天后通過OD確定真菌的生長。正如所預期的那樣，肽4抑制深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)的生長。單獨的0.01％乙酸對深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)的生長沒有顯著影響(圖8)，但是被包括在含有肽4的培養(yǎng)基中時，存在0.01％乙酸比單獨的1mg/ml肽4更顯著地抑制了深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)的生長。
肽4對趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)和深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)生長的抑制根據(jù)材料與方法，通過真菌生長分析來確定肽4對發(fā)癬菌屬(Trichophtyon spp.)生長的抑制作用。在單獨的培養(yǎng)基或含有3種不同濃度的肽4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)和趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)。任何樣品中均不含乙酸。使用對照培養(yǎng)基以說明培養(yǎng)基的背景吸光度。如前所述在30℃下孵育96小時后通過OD來確定真菌的生長。如圖9所示，這些分析證明了肽4對兩種真菌的生長均具有抑制作用，趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)始終比深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)更易感于肽4的抑制作用。在肽的濃度為0.55mg/ml時抑制了趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)的生長。
肽3和肽4對趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)生長的影響評價了肽3和肽4對趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)的抗真菌潛力。在不含乙酸的條件下，根據(jù)材料與方法，進行生長抑制分析。因為肽1至肽3是非常疏水的并且因此不溶，所以從前只在作為溶劑的乙酸中測試了其對發(fā)癬菌屬(Trichophtyon spp.)的抑制。當在不含乙酸溶劑的存在肽3、肽4或單獨的培養(yǎng)基中使趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)生長7天且通過OD測量其生長時，觀察到肽4顯著地抑制了真菌的生長(圖10)，而肽3沒有顯示出抑制活性(圖10)。在不存在0.5％乙酸時，陽離子肽4高于疏水肽3的活性表明乙酸對之前觀察到的上述疏水肽的活性有顯著貢獻。
乙酸對趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)生長的影響根據(jù)材料與方法部分，通過建立真菌生長實驗來評價乙酸對趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)生長的抑制。在30℃下，未經處理的趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)培養(yǎng)物或使用3種不同濃度的乙酸處理的(T.interdigitale)培養(yǎng)物生長96小時(圖11)。這表明與上述作為肽1至肽4溶劑的濃度相同的0.5％乙酸存在顯著影響。本實驗與乙酸不存在時肽3缺乏活性的實驗共同表明，肽4是抗發(fā)癬菌屬(Trichophtyon spp.)的最具活性的化合物。
多聚-L-賴氨酸對趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)生長的影響因為肽4是包含賴氨酸和精氨酸殘基的高度陽離子肽，所以使用材料與方法中詳細描述的生長抑制分析，在不存在乙酸的條件下，測試了這些氨基酸的多聚-L形式對趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)的抗真菌活性。建立到了對照趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)培養(yǎng)物、未處理的趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)培養(yǎng)物以及含有1mg/ml至50μg/ml長度為27-100個殘基至100-200個殘基的多聚-L-賴氨酸分子的發(fā)癬菌屬(Trichophtyon spp.)培養(yǎng)物。在30℃下培養(yǎng)96小時后評價每一培養(yǎng)物中的趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)的生長。兩種大小的多聚-L-賴氨酸均抑制了發(fā)癬菌屬(Trichophtyon spp.)的生長(圖12)，但是盡管更大的分子在所有測試濃度下均抑制生長，長度為27-100個氨基酸的分子僅在較高濃度下具有抑制活性(圖12)。這表明賴氨酸對發(fā)癬菌屬(Trichophtyon spp.)的生長抑制作用是大小和劑量依賴的。
多聚-L-精氨酸和多聚-L-賴氨酸對深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)生長的影響然后測試多聚-L-精氨酸與多聚-L-賴氨酸對深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)的抗真菌活性。在不存在乙酸的條件下，根據(jù)材料與方法，確定生長的抑制。在單獨的培養(yǎng)基、含有多聚-L-精氨酸(長28-86個氨基酸)和多聚-L-賴氨酸(100-200個氨基酸)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)。建立非接種的對照培養(yǎng)基。在30℃下保持并監(jiān)測生長96小時。多聚-L-精氨酸和多聚-L-賴氨酸均抑制了深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)的生長(圖13)。當在相同劑量下測試時，多聚-L-精氨酸對深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)抑制影響的活性高于多聚-L-賴氨酸，多聚-L-精氨酸在1mg/ml下完全抑制生長(圖13)。
多聚-L-精氨酸對趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)和深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)的抑制根據(jù)材料與方法部分，通過建立真菌生長實驗來測試多聚-L-精氨酸對發(fā)癬菌屬(Trichophtyon spp.)生長的抑制。在單獨的培養(yǎng)基或含有3種不同濃度的多聚-L-精氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)深紅色發(fā)癬菌(Trichophtyon rubrum)和趾間發(fā)癬菌(Trichophtyon interdigitale)。在任何樣品中均不存在乙酸。使用對照培養(yǎng)基以說明培養(yǎng)基的背景吸光度。如前所述在30℃下孵育96小時后通過OD來確定真菌的生長(圖14)。觀察到濃度低至0.55mg/ml的多聚精氨酸對抗兩種真菌均具有活性(圖14)。
降低濃度(100μg/ml)的多聚精氨酸對深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)和趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)的影響根據(jù)材料與方法部分，通過建立真菌生長實驗來測試多聚精氨酸對發(fā)癬菌屬(Trichophtyon spp.)生長的抑制。在任何樣品中均不存在乙酸的條件下，未經處理的深紅色發(fā)癬菌(Trichophtyon rubrum)和趾間發(fā)癬菌(Trichophtyon interdigitale)培養(yǎng)物生長，或使用單一濃度的多聚精氨酸(100μg/ml)處理深紅色發(fā)癬菌(Trichophtyon rubrum)和趾間發(fā)癬菌(Trichophtyon interdigitale)培養(yǎng)物。使用對照培養(yǎng)基以說明培養(yǎng)基的背景吸光度。如前所述在30℃下孵育96小時后通過OD來確定真菌的生長(圖15)。濃度降低導致活性丟失，這說明了多聚精氨酸對發(fā)癬菌屬(Trichophtyon spp.)的劑量影響。
肽三聚體(3個氨基酸)對深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)生長的影響測試了多聚-L-賴氨酸、多聚-L-精氨酸、多聚-L-組胺酸和多聚-L-色氨酸的肽三聚體對深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)生長的活性。根據(jù)材料和方法建立生長抑制，并且或者不對深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)進行處理或者將其暴露于2mg/ml的每一三聚體。在30℃下供養(yǎng)培養(yǎng)物96小時。通過OD測量真菌的生長，并且以未處理培養(yǎng)物中的生長的百分比來表示結果(圖16)。多聚-L-精氨酸是抗深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)的最具活性的肽，并且只需要含有3個氨基酸的多肽即可引起深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)生長的顯著降低。
肽4(1.2mg/ml)和NaCl對趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)生長的影響研究了不同鹽濃度對肽4的抗趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)抗真菌活性的影響。在不存在乙酸的條件下，根據(jù)材料與方法，建立趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)的生長抑制分析。不對培養(yǎng)物進行處理或將其暴露于肽4和濃度為100mM至500mM的NaCl中。在30℃下供養(yǎng)趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale)96小時，并如前所述通過OD來評價生長(圖17)。接近或超過生理條件的鹽濃度并不影響肽4的抗真菌活性(圖17)。關于低鹽濃度抑制內源性β-防御素的抗微生物活性已有充分報道。
在高鹽濃度下，肽4對白色念珠菌(Candida albicans)的影響使用不同濃度的肽4在37℃下孵育2小時后，如方法與材料所述，評價白色念珠菌(C.albicans)的存活。向生長培養(yǎng)基中引入兩種濃度的NaCl以確定生理條件和極高鹽條件(已知抑制內源性β-防御素肽的活性)的影響。在極高鹽條件下觀察到肽4的顯著殺滅活性(圖18)。當增加肽4的濃度時，可以觀察到更高鹽濃度的影響降低了(圖18)。因此，鹽并沒有抑制肽4的抗真菌活性。
多聚-L-賴氨酸、多聚-D-賴氨酸和多聚-D-精氨酸抗白色念珠菌(Candida albicans)的活性評價了多聚-L-精氨酸對賴氨酸和多聚-L-賴氨酸對多聚-D-賴氨酸的抗真菌活性以便確定這些肽變體中是否有任何一種顯示出抗白色念珠菌(Candida albicans)的增強的活性。如材料與方法部分所述，在存在100μg/ml、1mg/ml和10mg/ml的多聚-D-賴氨酸，多聚-L-賴氨酸和多聚-L-精氨酸下，在37℃下將念珠菌屬(Candida spp.)孵育2小時。如前所述評價存活并且顯示出多聚-L-精氨酸的抗真菌活性高于多聚-L-賴氨酸(圖19)。還表明多聚-D-賴氨酸具有與多聚-L-賴氨酸非常相似的抗真菌活性。
權利要求
1.具有藥物用途的包含通式I所示的氨基酸的肽、其變體或其藥物可接受的鹽((X)l(Y)m)n(I)其中l(wèi)和m是0至10的整數(shù)；n是1至10的整數(shù)；X和Y是選自精氨酸和賴氨酸的氨基酸，所述X和Y可以是相同的或不同的。
2.如權利要求1所述的肽或肽變體，其中X和/或Y是D-氨基酸或L-氨基酸。
3.如權利要求1所述的肽或肽變體，其中X和Y是交替氨基酸。
4.如權利要求1所述的肽或肽變體，其中X和Y是相同的。
5.如權利要求1所述的肽或肽變體，其中X是賴氨酸并且Y是精氨酸。
6.如權利要求1所述的肽或肽變體，其中所述肽包含3至約200個氨基酸。
7.如權利要求6所述的肽或肽變體，其中所述肽包含3至100個氨基酸。
8.如權利要求1所述的肽或肽變體，其中所述肽包含3至50個氨基酸。
9.如權利要求8所述的肽或肽變體，其中所述肽包含3至15個氨基酸。
10.如權利要求9所述的肽或肽變體，其中所述肽包含3至7個氨基酸。
11.如前述任一權利要求所述的肽或肽變體，其中所述肽是非環(huán)狀的。
12.組合物，其包含藥物有效劑量的至少一種前述任一權利要求所述的肽以及藥物可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
13.如權利要求12所述的組合物，其中所述組合物包含至少兩種前述任一權利要求所述的肽，其中所述肽是不同的。
14.如權利要求12或13所述的組合物，其中所述賦形劑或稀釋劑選自酸、二甲砜、N-(-2-巰丙?；?甘氨酸、2-n-壬基-1，3-二氧戊環(huán)和乙醇。
15.如權利要求14所述的組合物，其中所述賦形劑或稀釋劑是選自乙酸、檸檬酸、硼酸、乳酸、丙酸、磷酸、苯甲酸、丁酸、丙二酸、蘋果酸、草酸、琥珀酸或酒石酸的酸。
16.如權利要求15所述的組合物，其中所述酸是乙酸。
17.如權利要求16所述的組合物，其中所述乙酸以低于1％、0.5％、0.25％、0.1％、0.05％或0.01％乙酸的濃度存在于所述組合物中。
18.權利要求1至11中任一權利要求所述的肽或肽變體在制造治療微生物感染的藥物中的用途。
19.如權利要求18所述的用途，其中所述微生物感染是由細菌、寄生蟲、原生動物、病毒或真菌病原體引起的。
20.如權利要求19所述的用途，其中所述細菌病原體來自于選自下列的細菌葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.)，例如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)；腸球菌屬(Enterococcus spp.)，例如糞腸球菌(Enterococcus faecalis)；化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)；利斯特菌屬(Listeria spp.)；假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)；分枝桿菌屬(Mycobacterium spp.)，例如結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)；腸桿菌屬(Enterobacter spp.)；彎曲桿菌屬(Campylobacter spp.)；沙門菌屬(Salmonella spp.)；鏈球菌屬(Streptococcus spp.)，例如鏈球菌A群或B群(Streptococcus Group Aor B)、肺炎鏈球菌(Streptoccocus pneumoniae)；螺桿菌屬(Helicobacterspp.)，例如幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)；奈瑟菌屬(Neisseria spp.)，例如淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)、腦膜炎萘瑟菌(Neisseriameningitidis)；伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)；志賀桿菌屬(Shigellaspp.)，例如弗氏志賀菌(Shigella，flexneri)；大腸埃希桿菌(Escherichiacoli)；嗜血桿菌屬(Haemophilus spp.)，例如流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)；衣原體屬(Chlamydia spp.)，例如沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)、鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci)；土拉弗朗西絲菌(Francisella tularensis)；芽胞桿菌屬(Bacillus spp.)，炭疽桿菌(Bacillus anthracis)；梭狀芽孢桿菌屬(Clostridia spp.)，例如肉毒梭菌(Clostridium botulinum)；耶爾森菌屬(Yersinia spp.)，例如鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)；密螺旋體屬(Treponema spp.)；伯爾霍爾德菌屬(Burkholderia spp.)，例如鼻疽伯爾霍爾德菌(Burkholderia mallei)和假鼻疽伯爾霍爾德菌(Bpseudomallei)。
21.如權利要求19所述的用途，其中所述病毒病原體來自于選自下列病毒的病毒人免疫缺陷癥病毒(HIV 1&2)；人T細胞白血病病毒(HTLV 1&2)；埃博拉病毒；人乳頭狀瘤病毒(例如HPV-2、HPV-5、HPV-8HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-52、HPV-54和HPV-56)；乳多空病毒；鼻病毒；脊髓灰質炎病毒；皰疹病毒；腺病毒；Epstein Barr病毒；流感病毒；乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒；類天花病毒；輪狀病毒或SARS冠狀病毒。
22.如權利要求19所述的用途，其中所述寄生蟲病原體來自選自下列寄生蟲的寄生蟲病原體錐蟲屬(Trypanosoma spp.)(克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、布氏錐蟲(Trypansosoma brucei))、利什曼原蟲屬(Leishmania spp.)、賈第蟲屬(Giardia spp.)、毛滴蟲屬(Trichomonasspp.)、內阿米巴屬(Entamoeba spp.)、耐格里原蟲屬(Naegleria spp.)、棘阿米巴屬(Acanthamoeba spp.)、血吸蟲屬(Schistosoma spp.)、瘧原蟲屬(Plasmodium spp.)、隱孢子蟲屬(Crytosporidium spp.)、等孢子球蟲屬(Isospora spp.)、小袋蟲屬(Balantidium spp.)、羅阿絲蟲(Loa Loa)、人蛔蟲(Ascaris lumbricoides)、犬惡絲蟲(Dirofflaria immitis)、弓形體屬(Toxoplasma ssp.)，例如鼠弓形體(Toxoplasma gondii)。
23.如權利要求19所述的用途，其中所述真菌病原體來自選自下列屬的真菌病原體念珠菌屬(Candida spp.)(例如白色念珠菌(C.albicans))、表皮癬菌屬(Epidermophyton spp.)、外瓶柄霉菌屬(Exophiala spp.)、小孢霉屬(Microsporum spp.)、發(fā)癬菌屬(Trichophytonspp.)(例如深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)和趾間發(fā)癬菌(T.interdigitale))、癬屬(Tinea spp.)、曲霉菌屬(Aspergillus spp.)、芽生菌屬(Blastomycesspp.)、芽生裂殖菌屬(Blastoschizomyces spp.)、球孢子菌屬(Coccidioidesspp.)、隱球菌屬(Cryptococcus spp.)、組織胞漿菌屬(Histoplasma spp.)、副球孢子菌屬(Paracoccidiomyces spp.)、孢子絲菌屬(Sporotrix spp.)、犁頭菌屬(Absidia spp.)、支孢霉屬(Cladophialophora spp.)、產色芽生菌屬(Fonsecaea spp.)、瓶霉菌屬(Phialophora spp.)、Lacazia spp.、爪甲白癬菌屬(Arthrographis spp.)、支頂孢菌屬(Acremonium spp.)、馬都拉放線菌屬(Actinomadura spp.)、鱗質霉屬(Apophysomyces spp.)、金孢子菌屬(Emmonsia spp.)、團擔子菌屬(Basidiobolus spp.)、白僵菌屬(Beauveria spp.)、金孢子菌屬(Chrysosporium spp.)、耳霉屬(Conidiobolus spp.)、小克銀漢霉屬(Cunninghamella spp.)、鐮孢霉屬(Fusarium spp.)、地菌屬(Geotrichum spp.)、粘束孢屬(Graphium spp.)、小球腔菌屬(Leptosphaeria spp.)、馬拉塞霉菌屬(Malassezia spp.)、毛霉菌屬(Mucor spp.)、新龜甲屬(Neotestudina spp.)、諾卡爾菌屬(Nocardiaspp.)、諾卡爾土壤菌屬(Nocardiopsis spp.)、擬青霉屬(Paecilomycesspp.)、莖點霉屬(Phoma spp.)、毛孢子菌屬(Piedraia spp.)、肺孢子蟲屬(Pneumocystis spp.)、偽霉樣真菌屬(Pseudallescheria spp.)、須殼孢屬(Pyrenochaeta spp.)、根毛霉屬(Rhizomucor spp.)、酒曲菌屬(Rhizopusspp.)、紅酵母屬(Rhodotorula spp.)、酵母菌屬(Saccharomyces spp.)、足放線病菌屬(Scedosporium spp.)、帚霉屬(Scopulariopsis spp.)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces spp.)、并頭狀菌屬(Syncephalastrum spp.)、木霉屬(Trichoderma spp.)、毛孢子菌屬(Trichosporon spp.)、齦枝孢屬(Ulocladium spp.)、黑粉菌屬(Ustilago spp.)、輪枝孢菌屬(Verticilliumspp.)、萬吉拉菌屬(Wangiella spp.)。
24.如權利要求23所述的用途，其中所述病原體是發(fā)癬菌屬(Trichophyton spp.)。
25.如權利要求24所述的用途，其中所述病原體是趾間發(fā)癬菌(Trichophyton interdigitale)。
26.如權利要求24所述的用途，其中所述病原體是深紅色發(fā)癬菌(Trichophyton rubrum)。
27.如權利要求19所述的用途，其中所述真菌感染是甲癬。
28.權利要求1至11中任一權利要求所述的肽或肽變體在制造治療粘膜感染的藥物中的用途。
29.如權利要求28所述的用途，其中所述感染是囊性纖維化。
30.基質，權利要求1至11中任一權利要求所述的肽或肽變體或權利要求12或13所述的組合物附著于所述基質或應用于所述基質。
31.如權利要求30所述的基質，其中所述基質包括織物材料或者膠原材料。
32.權利要求1至11中任一權利要求所述的肽或肽變體在制造治療創(chuàng)傷的藥物中的用途。
33.如權利要求32所述的用途，其中所述創(chuàng)傷是割傷或燒傷。
34.權利要求1至11中任一權利要求所述的肽或肽變體在制造治療潰瘍的藥物中的用途。
35.治療或預防個體微生物感染的方法，所述方法包括對所述個體給藥治療有效劑量的權利要求1至11中任一權利要求所述的肽或肽變體或權利要求12或13所述的組合物。
36.如權利要求31所述的方法，其中所述微生物感染是真菌感染。
37.如權利要求35或36所述的方法，其中對所述個體的皮膚或甲局部給藥所述肽、肽變體或組合物。
38.治療個體創(chuàng)傷的方法，所述方法包括對所述創(chuàng)傷應用治療有效劑量的權利要求1至11中任一權利要求所述的肽或肽變體或權利要求12或13所述的組合物或權利要求30或31所述的基質。
全文摘要
本發(fā)明涉及作為藥物用途的包含通式(I)所示的氨基酸的肽((X)
文檔編號C07K7/08GK101031583SQ200580028121
公開日2007年9月5日 申請日期2005年8月18日 優(yōu)先權日2004年8月18日
發(fā)明者德沃拉·奧尼爾 申請人:諾瓦生命科學有限公司