專利名稱：蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5在白血病細胞檢測和治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(Protein Arginine Methyltransferase 5，PRMT5)的新用途，特別是涉及PRMT5在白血病細胞檢測和治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶，即PRMT家族，目前在哺乳動物細胞已發(fā)現(xiàn)有8個成員，分別為PRMT1-8。根據(jù)底物和反應(yīng)產(chǎn)物的特異性可將這8個酶分為二類。二類酶的共同特點是都能催化蛋白質(zhì)精氨酸發(fā)生單甲基化；二類酶的不同點在于一類PRMTs能催化蛋白質(zhì)精氨酸發(fā)生不對稱性雙甲基化，而第二類PRMT能催化精氨酸發(fā)生對稱性雙甲基化。除PRMT5和PRMT7屬于第二類催化精氨酸鳥嘌呤基團發(fā)生單甲基化和對稱性的雙甲基化，其它6個酶都屬于一類催化精氨酸鳥嘌呤基團發(fā)生單甲基化和不對稱的雙甲基化(Bedford MT，Richard S.Arginine MethylationAn EmergingRegulator of Protein Function.Molecular Cell，2005，18263-272)。
PRMT5又稱JBP1、Skb1Hs或Hsl7，最早是通過酵母雙雜交分離獲得的，在真核生物中從酵母到哺乳動物其蛋白質(zhì)在進化中高度同源和保守。裂殖酵母PRMT5的同源蛋白Skb1與磷酸激酶Shk1緊密結(jié)合，是Shk1的調(diào)節(jié)子。在酵母中超表達Skb1導(dǎo)致細胞增長，而Skb1缺失突變體卻使細胞變短，說明Skb1是細胞周期的負(fù)調(diào)控因子(Gilbreth，M.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998，9514781-14786)。在哺乳動物細胞中，PRMT5與Jak-Stat途徑中的酪氨酸蛋白激酶結(jié)合，表明PRMT5可能在細胞激動素、生長因子和性激素等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起到重要作用(Pollack BP，etal.The human homologue of the yeast proteins Skb1 and Hsl7p interacts withJak kinases and contains proteinmethyltransferase activity.J Biol Chem 1999，27431531-31542)。PRMT5甲基化神經(jīng)肌疾病SMA相關(guān)的蛋白質(zhì)(Sm proteins)，參與調(diào)控snRNP，包括pre-mRNA的剪接和運輸(Friesen，WJ，et al.The methylosome，a 20S complex containing JBP1 and pICln，produces dimethylarginine-modifiedSm proteins.Mol.Cell.Biol.2001，21，8289-8300)。Kwak等發(fā)現(xiàn)PRMT5與PRMT1都能催化RNA聚合酶II結(jié)合蛋白SPT5上的精氨酸甲基化，以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的延長(Kwak，YT，et al.Methylation of SPT5 regulates its interaction with RNApolymerase II and transcriptional elongation properties.Mol.Cell，2003，11，1055-1066.)。最新的研究發(fā)現(xiàn)PRMT5不僅在細胞周期調(diào)控中起到重要作用，而且還能與組蛋白脫乙?；?HDAC)、染色質(zhì)重塑蛋白Brg1等相互作用，直接催化組蛋白H3、H4甲基化，表明該酶可能通過調(diào)控組蛋白密碼子(Histone code)，在染色質(zhì)重塑和基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用(Pal S，et al.，Human SWI/SNF-AssociatedPRMT5 Methylates Histone H3 Arginine 8 and Negatively Regulates Expressionof ST7 and NM23 Tumor Suppressor Genes；MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY；2004，Vol.24，No.21；9630-9645.)。但是，PRMT5是否與癌癥發(fā)生和白血病直接相關(guān)，目前國內(nèi)外沒有任何報道。
白血病是小兒時期最常見的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，我國每年新診斷的兒童白血病約11000人，白血病已經(jīng)成為小兒時期主要的死亡原因之一。由于化療方案不斷改進，支持治療的日益完善，白血病的治療有了很大的提高，兒童急性淋巴細胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL)的長期無病生存率達80％以上(BFM-orientedtreatment for children with acute lymphoblastic leukemia without cranialirradiation and treatment reduction for standard risk patientsresults ofDCLSG protocol ALL-8(1991-1996).Leukemia.2002，161099-1111；Improvedoutcome in Childhood acute lymphoblastic leukemia despite reduced use ofanthracyclines and cranial radiotherapyresults of trial ALL-BFM 90.Blood.2000，953310-3322；Long-term results of the Italian Association of PediatricHematology and Oncology(AIEOP)Acute Lymphoblastic Leukemia studies，1982-1995.Leukemia.2000，142196-2204；Children’s Cancer Group trials inchildren acute lymphoblastic leukemia1983-1995.Leukemia.2000，142196-2204)，但是白血病的發(fā)病機理仍不清楚，還有一些患兒治療失敗、復(fù)發(fā)，此外髓性白血病、混合白血病的治療效果仍不理想。因此，發(fā)現(xiàn)和深刻了解白血病的發(fā)病機理，將有助于白血病的診治(Acute Lymphoblastic Leukemia.N Engl J Med 2004，3501535-1548；Biology and Treatment of Childhood T-Lineage AcuteLymphoblastic Leukemia.Blood，1998，91735-746；Treatment of AcuteLymphoblastic Leukemia.N Engl J Med 2006，354166-78)。
RNA干擾技術(shù)(RNA interference，簡稱RNAi)是通過小分子雙鏈RNA(ds RNA)特異性互補靶向基因轉(zhuǎn)錄本，從而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默的一種方式。將雙鏈RNA降解成長度為19-25nt的小干擾RNA片段(siRNA，small interfering RNA)，這些小片段會進一步介導(dǎo)與其同源的單鏈RNA降解，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，無須像反義核苷酸那樣進行廣泛的化學(xué)修飾以提高其半衰期，并能在低于反義核苷酸幾個數(shù)量級的濃度下，使靶基因降低至極低水平甚至完全“敲除”，從而產(chǎn)生缺失突變表型。siRNA的干預(yù)效應(yīng)關(guān)鍵取決于其靶基因序列的選擇，任一nt的錯誤均會導(dǎo)致RNAi效應(yīng)的喪失，這種高度序列特異性使其對點突變、序列插入和缺失的選擇性基因靜寂具有重要的藥理作用。已證實，RNA干擾技術(shù)可單獨或與其它現(xiàn)有的治療手段一同用于突變所致的疾病，如病毒感染，還可以用于治療腫瘤等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(PRMT5)的新用途，即在白血病細胞檢測(包括白血病初期診斷、藥物治療效果、預(yù)后殘留等)中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種PRMT5的新用途，即在白血病細胞檢測中的應(yīng)用。
可用常規(guī)的蛋白質(zhì)免疫雜交(Western blot)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、細胞免疫熒光染色(Immunostaining)、免疫組化、流式細胞儀、免疫膠體金等方法檢測待測樣品骨髓細胞中PRMT5在基因轉(zhuǎn)錄及蛋白水平上的表達量，再與正常骨髓細胞中PRMT5的表達量進行比較，若表達量顯著增高，則可初步鑒定為白血病細胞。
實驗證明，白血病患者骨髓細胞中PRMT5的表達水平顯著高于正常骨髓細胞，因此可以PRMT5作為白血病標(biāo)志物，將PRMT5制成單克隆抗體或與其它抗體搭配應(yīng)用于臨床白血病殘留細胞的檢測，且具有檢測方法簡單、快捷、靈敏度高、成本低廉的優(yōu)點。本發(fā)明為白血病細胞檢測提供了一條新的途徑，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
本發(fā)明的另一個目的是提供抑制PRMT5基因表達的小干擾RNA。
本發(fā)明所提供的抑制PRMT5基因表達的小干擾RNA，是下述雙鏈RNA序列之1)正義鏈為序列表中的SEQ ID №1，反義鏈為序列表中SEQ ID №2；2)正義鏈為序列表中的SEQ ID №3，反義鏈為序列表中SEQ ID №4；3)正義鏈為序列表中的SEQ ID №5，反義鏈為序列表中SEQ ID №6；4)正義鏈為序列表中的SEQ ID №7，反義鏈為序列表中SEQ ID №8。
將上述雙鏈RNA序列命名為PRMT5 siRNA1-4。PRMT5 siRNA1的反義鏈與PRMT5mRNA距離PRMT5 cDNA起始密碼子ATG 288-308位置序列互補，序列表中SEQ ID №1由21個堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端，序列表中SEQ ID №2由21個堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端；PRMT5 siRNA2的反義鏈與PRMT5 mRNA距離PRMT5 cDNA起始密碼子ATG 626-646位置序列互補，序列表中SEQ ID№3由21個堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端，序列表中SEQ ID №4由21個堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端；PRMT5 siRNA3的反義鏈與PRMT5 mRNA距離PRMT5 cDNA起始密碼子ATG 852-872位置序列互補，序列表中SEQID №5由21個堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端，序列表中SEQ ID№6由21個堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端；PRMT5 siRNA4的反義鏈與PRMT5 mRNA距離PRMT5 cDNA起始密碼子ATG 1228-1248位置序列互補，序列表中SEQ ID №7由21個堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端，序列表中SEQ ID №8由21個堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端。
上述抑制PRMT5表達的小干擾RNA的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。它為下述雙鏈核苷酸序列之一1)正義鏈具有序列表中SEQ ID №9的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列表中SEQ ID №9限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中SEQ ID №10的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列表中SEQ ID №10限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；2)正義鏈具有序列表中SEQ ID №11的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列表中SEQ ID №11限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中SEQ ID№12的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列表中SEQ ID №12限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；3)正義鏈具有序列表中SEQ ID №13的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列表中SEQ ID №13限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中SEQ ID№14的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列表中SEQ ID №14限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)正義鏈具有序列表中SEQ ID №15的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列表中SEQ ID №15限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中SEQ ID№16的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列表中SEQ ID №16限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中SEQ ID №9由58個堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端；序列表中SEQ ID №10由62個堿基組成，序列的方向從左至右為3′端→5′端；序列表中SEQ ID №11由58個堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端；序列表中SEQ ID №12由62個堿基組成，序列的方向從左至右為3′端→5′端；序列表中SEQ ID №13由58個堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端；序列表中SEQ ID №14由62個堿基組成，序列的方向從左至右為3′端→5′端；序列表中SEQ ID №15由58個堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端；序列表中SEQ ID №16由62個堿基組成，序列的方向從左至右為3′端→5′端。
含有抑制PRMT5表達的小干擾RNA編碼基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和宿主菌以及擴增抑制PRMT5表達的小干擾RNA編碼基因中任一片段的引物也屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種抑制PRMT5基因表達的方法。
本發(fā)明所提供的抑制PRMT5基因表達的方法，是將所述PRMT5基因的小干擾RNA的編碼基因?qū)胨拗?，從而抑制PRMT5基因表達。
所述抑制PRMT5基因表達的小干擾RNA的編碼基因可通過含有所述抑制PRMT5基因表達的小干擾RNA的編碼基因的siRNA表達載體導(dǎo)入宿主；用于構(gòu)建所述siRNA表達載體的出發(fā)載體可為任意一種可在宿主中表達外源基因的載體，如pNeoU6+1、pSilence1.0-U6(美國Ambion公司)或pSilencerTM3.1-H1(美國Ambion公司)等。
以pNeoU6+1為出發(fā)載體，構(gòu)建的PRMT5基因的siRNA表達載體為pDs288、pDs626、pDs852或pDs1228。
本發(fā)明的RNAi表達載體可按常規(guī)方法構(gòu)建。
本發(fā)明提供了PRMT5的新用途，即在白血病細胞檢測(包括白血病初期診斷、藥物治療效果、預(yù)后殘留等)中的應(yīng)用。實驗證明，白血病患者骨髓細胞中PRMT5的表達水平顯著高于正常骨髓細胞，因此可以PRMT5作為白血病標(biāo)志物，將PRMT5制成單克隆抗體或與其它抗體搭配應(yīng)用于臨床白血病殘留細胞的檢測，且具有檢測方法簡單、快捷、靈敏度高、成本低廉的優(yōu)點。此外，本發(fā)明還提供了抑制PRMT5基因表達的小干擾RNA。實驗證明，本發(fā)明的小干擾RNA對PRMT5基因具有顯著的抑制作用，此外，通過沉默PRMT5基因，可以抑制PRMT5基因缺失細胞的增殖，表明PRMT5基因可以作為治療白血病及腫瘤的藥物靶標(biāo)。因此可以以抑制PRMT5基因表達的小干擾RNA的編碼序列作為活性成分制備成白血病及腫瘤治療性藥物。本發(fā)明在醫(yī)學(xué)和生物制藥領(lǐng)域具有較大的實際意義和廣闊的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。


圖1為白血病患兒骨髓細胞中PRMT5表達情況的Western blot檢測結(jié)果圖2為白血病患兒骨髓細胞中PRMT5表達情況的RT-PCR檢測結(jié)果圖3為白血病患兒骨髓細胞中PRMT5表達情況的流式細胞儀檢測結(jié)果圖4為白血病患兒骨髓細胞中PRMT5表達情況的免疫染色檢測結(jié)果圖5為siRNA抑制PRMT5在細胞中的表達的Western Blot檢測結(jié)果及其抑制腫瘤細胞生長的克隆形成實驗結(jié)果
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所有序列均由北京博亞生物技術(shù)公司合成。
臨床標(biāo)本收集從2003年9月至2006年3月期間住院治療的149名初診白血病患兒、23名緩解(Complete Remission，CR)患兒、25名停藥兒童、13名特發(fā)性減少性血小板紫癜(Idiopathic Thrombocytopenic Purpura，ITP)患兒的骨髓，以及24名外科矯形兒童(正常對照組)的骨髓，所有患兒均經(jīng)臨床、形態(tài)學(xué)、細胞化學(xué)染色及免疫學(xué)確診，診斷與分型標(biāo)準(zhǔn)按全國統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)(參見小兒急性白血病診療建議”中華兒科雜志，1999，Vol137(5)305-307)。患兒及對照兒童的具體資料如下(1)初診白血病患兒共選初診白血病患兒149名，男88名，女61名，男女比例1.44∶1。年齡0.3-16歲，均數(shù)6.87歲。其中，急性淋巴細胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL)患兒129名，包括T-ALL患兒27名、前前B-ALL患兒9名、前B-ALL患兒5名、普通B-ALL患兒86名、成熟B-ALL患兒2名；非淋巴細胞白血病患兒17名，包括急性髓性細胞白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)10名、慢性粒細胞白血病(ChronicMyelogenous Leukemia，CML)患兒7名；雙表型急性白血病(Biphenotypic AcuteLeukemia，BAL)3名。
采用多重巢式RT-PCR方法可以檢測出29種染色體結(jié)構(gòu)畸變形成的基因，所有白血病患兒中，檢測結(jié)果呈陰性的白血病患兒74名，檢測結(jié)果呈陽性的白血病患兒75名，其中BCR-ABL融合基因陽性白血病患兒13名，TEL-AML1融合基因陽性白血病患兒23名，HOX11活化的白血病患兒27名，E2A-PBX1融合基因陽性白血病患兒6名、AML1-ETO融合基因陽性白血病患兒3名、PML-RARα融合基因陽性白血病患兒1名，del(1)(p34；p34)陽性的白血病患兒2名。
(2)緩解(CR)患兒由兩部分組成，初診白血病患兒中經(jīng)過治療已經(jīng)緩解3個月的患兒15人，初診白血病患兒中經(jīng)過治療已經(jīng)緩解約12個月的患兒18人(其中10人與緩解3個月的患兒為同一人群)。
(3)停藥兒童停藥兒童25名，男15名，女10名。年齡6-17歲，均數(shù)10.94歲。
(4)對照組兒童由兩部分組成，一部分為外科矯形兒童24人，均無血液系統(tǒng)疾病、近期無感染、及其它疾病(除本身畸形外)，其中男14名，女10名，年齡3-14歲，均數(shù)7.87歲；另一部分為ITP兒童13人，男8名，女5名，年齡2.6-10歲，均數(shù)4.62歲。
實施例1、檢測白血病患兒骨髓細胞中PRMT5的表達情況一、白血病患兒骨髓細胞中PRMT5表達情況的Western blot檢測1、采集骨髓采集上述149名初診白血病患兒、23名緩解患兒、25名停藥兒童、13名特發(fā)性減少性血小板紫癜患兒的骨髓，以及北京兒童醫(yī)院外科矯形24名兒童(正常對照組)的骨髓，具體方法如下從初診白血病患兒、緩解患兒、停藥兒童和對照組兒童的不同部位(如胸骨、髂骨、胸椎或脛骨)，在無菌條件下抽取骨髓2mL，加乙二胺四乙酸鹽(EDTA)抗凝。骨髓標(biāo)本的采集要求EDTA抗凝，骨髓量大于2mL，無血凝塊，標(biāo)本存放時間小于24小時。
2、提取單個核細胞從采集的骨髓中提取單個核細胞，包括以下步驟A、裂解紅細胞取2mL骨髓標(biāo)本，放入提取管中，往提取管中加入10mL紅細胞裂解液(EDTA鈉鹽20mg、氯化銨4.2g、碳酸氫鉀0.5g，加蒸餾水定容至500mL)，與骨髓充分混合，室溫放置3分鐘，1000rpm常溫離心3分鐘。離心結(jié)束，棄去上層液體。
B、觀察提取管底層提取的單個核細胞，如其中混有較多紅細胞，可重復(fù)步驟A1-2次，去除多余紅細胞。
C、洗滌裂解液取10mL生理鹽水放入提取管中，用吸管吹打底層細胞，使其與生理鹽水充分混合，1000rpm常溫離心3分鐘，離心結(jié)束，棄去上層液體。
D、向提取管中加入少量生理鹽水，用吸管吹打，使其與底層細胞混合，轉(zhuǎn)移至1.5mL EP儲存管中，4000rpm常溫離心5秒鐘，棄去上層生理鹽水，提取的單個核細胞數(shù)應(yīng)在107個數(shù)量級。
E、將提取好的單個核細胞標(biāo)本存放于-76℃冰箱，備用。
3、超聲裂解細胞提取蛋白質(zhì)A、從-76℃冰箱取出保存的單個核細胞，對每個EP試管編號，然后根據(jù)細胞量的多少加入150-400ul的RIPB裂解液(2×貯存液2mL Triton X-100、6mL 5M NaCl、8mL 0.5M Na2HPO4調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加蒸餾水定容至100mL。使用液10mL 2×貯存液加10mL PBS液再加2片羅氏Complete藥片。)。
B、在冰上進行超聲細胞，將超聲儀器的振幅設(shè)置為40％，根據(jù)細胞量多少調(diào)節(jié)超聲時間，一般設(shè)置為15秒。
C、每超聲一個標(biāo)本后，用蒸餾水沖洗探頭，并在冰水中冷卻5分鐘后，再超聲下一個標(biāo)本。
D、將超聲后的標(biāo)本用4℃高速離心機，12000rpm離心10分鐘。
E、取上清液轉(zhuǎn)移至另一個相應(yīng)的EP試管中，編號。
4、測定待測蛋白樣品的濃度用BCA試劑盒(購自美國PIETCE公司)并參照試劑盒說明書測定樣品的濃度。
5、SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜對待測蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，先在電壓80V下電泳10-30分鐘，待染料前沿進入分離膠后，將電壓提高到160V繼續(xù)電泳約1小時，直至溴酚藍到達分離膠的底部。電泳結(jié)束后，用電轉(zhuǎn)移法將分離的蛋白樣品轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)，400mA(100V)，1小時(或350mA(95V)，1.5小時)。
6、Western blot檢測用常規(guī)方法進行Western blot檢測，其中PRMT5多克隆抗體購自美國Upstate公司，Tubulin單克隆抗體(內(nèi)參)購自Sigma公司，ECL顯色試劑盒(購自瑞典Amersham公司)，檢測結(jié)果如圖1所示(泳道1為作為陽性對照的直腸癌細胞，泳道2為正常骨髓細胞，泳道3-7為初診白血病患兒樣本，泳道8-13為緩解患兒樣本)，93.95％的初診白血病患兒的骨髓細胞中PRMT5蛋白表達量顯著增高，而緩解患兒、停藥患兒、正常矯形兒童和ITP患兒中均未發(fā)現(xiàn)PRMT5蛋白表達量增高。
二、白血病患兒骨髓細胞中PRMT5表達情況的RT-PCR檢測現(xiàn)對29名初診白血病患兒、23名緩解患兒、25名停藥兒童、13名特發(fā)性減少性血小板紫癜患兒的骨髓，以及北京兒童醫(yī)院外科矯形24名兒童骨髓細胞中PRMT5的表達情況進行RT-PCR檢測，具體方法包括以下步驟1、設(shè)計引物根據(jù)GeneBank中PRMT5基因的cDNA序列(BC025979)設(shè)計PCR擴增產(chǎn)物長度為210bp的引物，引物序列如下P1(上游引物)5’-AGCCAGAACCGTCCTCCACC-3’P2(下游引物)5’-CAGCACCATCAGTACCTGGAC-3’；同時以長度為310bp的ABL基因的PCR擴增產(chǎn)物為內(nèi)對照，引物序列如下P3(上游引物)5’-CCTTCAGCGGCCAGTAGC-3’P4(下游引物)5’-GGACACAGGCCCATGGTAC-3’2、骨髓采集及單個核細胞的提取方法與步驟一相同。
3、Trizol法提取單個核細胞的總RNA用Trizol試劑并參照產(chǎn)品說明書提取單個核細胞的總RNA，包括以下步驟a、將單個核細胞從-70℃冰箱取出，立即加TRIzol試劑1mL，反復(fù)吹打混勻，置室溫5分鐘使細胞溶解。
b、每1mL TRIzol加氯仿0.2mL，劇烈振搖15秒鐘，置室溫3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘。
c、仔細吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至另一EP管(無RNase)中，加0.5mL異丙醇，顛倒混勻3-4次，置室溫10分鐘。4℃、12000rpm離心10分鐘。
d、棄上清，加75％乙醇1mL，搖振，充分洗滌沉淀，4℃、7500rpm離心5分鐘。徹底吸去上清，37℃干燥，將沉淀重懸于約20μl DEPC水中。
f、按1∶1000比例稀釋RNA(1μl RNA+1000μl DEPC水)，通過分光光度法測定樣品OD260及OD280，OD260/OD280比值應(yīng)大于或等于1.8，否則重新提取樣品。
RNA濃度(μg/μl)＝OD260×40×稀釋倍數(shù)/1000＝OD260×404、cDNA的合成以步驟3提取的單個核細胞的總RNA為模板，用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自Promega公司)并參照產(chǎn)品說明書逆轉(zhuǎn)錄合成其cDNA。
5、PCR反應(yīng)以步驟4反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，在引物P1和P2的引導(dǎo)下PCR擴增PRMT5基因的cDNA片段，12.5μl PCR反應(yīng)體系為5×ABI緩沖液II(購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)2.5μl，1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，引物P1、P2各800nM，cDNA 1μl，TaqDNA聚合酶1.25U。PCR反應(yīng)條件為先95℃預(yù)變性5分鐘；然后94℃變性40秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，共30個循環(huán)；最后72℃繼續(xù)反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，4℃保存。
同時以廣泛表達的ABL基因片段為作為內(nèi)對照，12.5μl PCR反應(yīng)體系為5×ABI緩沖液II2.5μl，2.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，引物P3、P4各400nM，cDNA 1μl，TaqDNA聚合酶1.25U。PCR反應(yīng)條件先95℃預(yù)變性5分鐘；然后94℃變性30秒，65℃退火60秒，72℃延伸60秒，共35個循環(huán)；最后72℃繼續(xù)反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，4℃保存。
6、聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染色對步驟5的PCR擴增產(chǎn)物進行6％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，然后進行銀染色，染色方法為A、將聚丙烯酰胺凝膠在固定液(10％乙醇，1％硝酸)中固定5分鐘?；厥展潭ㄒ?，用去離子水漂洗2遍。將凝膠在染色液(0.5mL 20％AgNO3蒸餾水稀釋液至50mL，加入30μL甲醛(37％)，混勻)中作用10分鐘。傾去染色液，去離子水漂洗2遍。
B、將凝膠在顯色液中作用至顯出清晰條帶為止。傾去顯色液(3％Na2CO350mL加入30μL甲醛(37％)和30μL Na2S2O3(10mg/mL)，混勻)，用去離子水漂洗2遍。
C、將凝膠在10％乙酸終止液中作用10-15分鐘以終止顯色反應(yīng)?；厥战K止液，將凝膠用去離子水漂洗1遍。
D、以玻璃紙封膠，至于4℃冰箱中干燥。
結(jié)果如圖2所示(泳道1-2為正常骨髓細胞對照，泳道3-4為初診白血病患兒樣本，泳道5為Marker)，29名初診白血病患兒中的27人檢測到強弱不等的PRMT5 mRNA表達，2人未檢測到PRMT5 mRNA表達，并且步驟一的Western blot檢測結(jié)果表明這2人也未檢測到PRMT5蛋白表達量增高，檢測結(jié)果相符；同時比較初診白血病患兒與CR患兒的PRMT5 mRNA表達情況，發(fā)現(xiàn)初診患兒PRMT5的mRNA表達水平明顯高于CR患兒，說明白血病細胞的PRMT5在mRNA和蛋白水平的表達量均增高。
三、白血病患兒骨髓細胞中PRMT5表達情況的流式細胞儀檢測采集上述部分初診白血病患兒及緩解患兒的骨髓，骨髓采集方法見步驟一，然后對骨髓細胞中PRMT5的表達情況進行流式細胞儀檢測，具體方法包括以下步驟1)差異梯度離心法提取單個核細胞A、用1×PBS或生理鹽水稀釋骨髓2∶1(2∶1，PBS∶骨髓)。
B、將稀釋后的骨髓沿試管壁徐徐加入4mL淋巴細胞分液Ficoll的液面上，勿用力過大，以免造成骨髓液與分離液混合，保持清晰的分層狀態(tài)。
C、在室溫(18-20℃)下2000rpm離心30分鐘后可見試管內(nèi)的骨髓清楚地分為4層上層為血漿層，中層為分離液層(單個核細胞所處于血漿層和分離液層中間)，底層為紅細胞層，紅細胞上層為粒細胞層。
D、用吸管將上層與中層之間的單個核細胞吸出收集到另一個試管中，用PBS洗2遍，每次均以1500rpm離心10分鐘，棄去上清后，得到高純度的單個核細胞懸液。
2)取兩支試管，每個試管中加入1×106單個核細胞懸液進行免疫染色。細胞固定和免疫染色過程參照文獻(Bao S，et al.Oncogene，2004，23(33)5586-93).其中PRMT5多克隆抗體購自Upstate，Cy3標(biāo)記的羊抗兔二抗購自美國JacksonImmunoResearch Laboratories Inc。3)免疫染色的細胞，用流式細胞儀檢測。
結(jié)果如圖3所示，正常骨髓細胞中98.03％細胞微弱表達PRMT5，僅有1.96％細胞PRMT5表達增高；而白血病細胞中0.93％的細胞微弱表達PRMT5，99.07％的細胞表達PRMT5增強。這證明初診白血病患兒骨髓細胞中PRMT5的表達水平較對照組兒童顯著增高，從而進一步證明PRMT5在白血病細胞中的表達量增高。
四、免疫組織化學(xué)染色法對PRMT5在白血病細胞中的表達進行檢測對部分初診白血病患兒、緩解患兒、正常對照兒童的骨髓細胞進行免疫組織化學(xué)染色，具體方法包括以下步驟1)采集骨髓細胞及差異梯度離心法提取單個核細胞方法與實施例1相同。
2)用含4％多聚甲醛的PBS固定細胞，石蠟包埋，切片，厚為4um。
3)對切片進行常規(guī)梯度脫蠟將切片置于二甲苯甲20分鐘，再到二甲苯乙20分鐘，后放入無水酒精5分鐘，然后依次倒95％酒精、80％酒精、蒸餾水各1分鐘。
4)PBS沖洗切片3次，每次3分鐘，加入3％過氧化氫，在孵育盒37℃孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化酶活性。
5)對切片用蒸餾水沖洗，PBS沖洗3次，每次3分鐘，用高壓鍋121℃加熱90秒，滴加正常山羊血清(封閉)，室溫孵育15分鐘。
6)棄去正常山羊血清，勿洗，滴加按1∶200比例稀釋的PRMT5(一抗)，4℃12-24小時(陰性對照以PBS代替一抗)。
7)PBS沖洗，3分鐘×3次，滴加SP-9001生物素標(biāo)記羊抗兔抗體(二抗，購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，在37℃孵育15分鐘，PBS沖洗3次，每次3分鐘。
8)滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液(購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，三抗)，在37℃孵育15分鐘，然后PBS沖洗3次，每次3分鐘。
9)加DAB顯色劑(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)顯色，顯色后用自來水沖洗5分鐘，蘇木素復(fù)染，封片。
結(jié)果如圖4所示(1為正常對照組，2為初診白血病患兒組)，與正常對照組相比，緩解患兒骨髓細胞中有微量的PRMT5表達，初診白血病患兒骨髓細胞中的PRMT5大量表達，與上述檢測結(jié)果一致，進一步證明PRMT5在白血病細胞中的表達量增高。
實施例2、檢測PRMT5的siRNA對腫瘤細胞的抑制作用一、PRMT5 siRNA的設(shè)計及其編碼DNA的合成1、PRMT5 siRNA的設(shè)計根據(jù)PRMT 5mRNA的其中四個區(qū)段(288-308(ggagaagattcgcaggaactc)，626-646(gggctgacctcccatctaatc)，852-872(ggaatacttaagccagaaccg)，1228-1248(ggaagccaagtgaccgtagtc))設(shè)計出四對siRNA，序列如下siRNA1
正義鏈5’-ggagaagauucgcaggaacuc-3’(序列表中序列1)反義鏈5’-gaguuccugcgaaucuucucc-3’(序列表中序列2)；siRNA2正義鏈5’-gggcugaccucccaucuaauc-3’(序列表中序列3)反義鏈5’-gauuagaugggaggucagccc-3’(序列表中序列4)；siRNA3正義鏈5’-ggaauacuuaagccagaaccg-3’(序列表中序列5)反義鏈5’-cgguucuggcuuaaguauucc-3’(序列表中序列6)；siRNA4正義鏈5’-ggaagccaagugaccguaguc-3’(序列表中序列7)反義鏈5’-gacuacggucacuuggcuucc-3’(序列表中序列8)。
2、述PRMT5 siRNA編碼基因的合成再根據(jù)上述四對PRMT5 siRNA序列合成構(gòu)建抑制PRMT5表達的siRNA表達載體所需的互補DNA序列，序列如下第一對PRMT5-dsRNA288-15’-gagaagattcgcaggaactcTTCAAGAGAgagttcctgcgaatcttctccTTTTTTTA-3’(序列表中的序列9)，PRMT5-dsRNA288-23’-AGCTTAAAAAAAggagaagattcgcaggaactcTCTCTTGAAgagttcctgcgaatcttctc-5’(序列表中的序列10)；第二對PRMT5-dsRNA626-15’-ggctgacctcccatctaatcTTCAAGAGAgattagatgggaggtcagcccTTTTTTTA-3’(序列表中的序列11)，PRMT5-dsRNA626-23’-AGCTTAAAAAAAgggctgacctcccatctaatcTCTCTTGAAgattagatgggaggtcagcc-5’(序列表中的序列12)；第三對PRMT5-dsRNA852-15’-gaatacttaagccagaaccgTTCAAGAGAcggttctggcttaagtattccTTTTTTTA-3’(序列表中的序列13)，
PRMT5-dsRNA852-23’-AGCTTAAAAAAAggaatacttaagccagaaccgTCTCTTGAAcggttctggcttaagtattc-5’(序列表中的序列14)；第四對PRMT5-dsRNA1228-15’-gaagccaagtgaccgtagtcTTCAAGAGAgactacggtcacttggcttccTTTTTTTA-3’(序列表中的序列15)，PRMT5-dsRNA1228-23’-AGCTTAAAAAAAggaagccaagtgaccgtagtcTCTCTTGAAgactacggtcacttggcttc-5’(序列表中的序列16)。
然后將合成的四對單鏈DNA序列分別在沸水中變性10分鐘，然后慢慢冷卻至室溫，使四對單鏈DNA退火形成四條雙鏈DNA片段。
二、PRMT5 siRNA表達載體的構(gòu)建將步驟一合成的四條雙鏈DNA片段分別插入到載體pNeoU6+1(pNeoU6+1載體和克隆方法參照文獻Bao S，et al.Oncogene，2004，23(33)5586-93)中，得到四種PRMT5 siRNA的表達質(zhì)粒，分別命名為pDs288、pDs626、pDs852和pDs1228。用Qiangen質(zhì)粒提取試劑盒大量制備質(zhì)粒DNA，測定質(zhì)粒濃度，用于真核細胞轉(zhuǎn)染。
三、檢測PRMT5 siRNA對腫瘤細胞中PRMT5表達的抑制情況1、GFP-PRMT5融合蛋白表達載體的構(gòu)建以人PRMT5的全長cDNA(NCBIBC025979，購自美國OpenBiosystem公司)為模板，在引物P1(5’-cgggatccatggcggcgatggcggtcg-3’)和P2(5’-ccgctcgaggaggccaatggtatatgagc-3’)的引導(dǎo)下PCR擴增PRMT5全長cDNA序列，再將該序列克隆到載體pEGFP-C1(購自Clonetech)多克隆位點的Bgl II和Xho I限制性內(nèi)切酶酶切位點之間，得到GFP-PRMT5融合蛋白表達載體，命名為pGFP-PRMT5。
2、轉(zhuǎn)染細胞1)轉(zhuǎn)染用細胞的培養(yǎng)轉(zhuǎn)染前24h，在60mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)直腸癌細胞系HCT116(購自美國ATCC，Bao S，et al.Oncogene，2004，23(33)5586-93)，密度達到70％時進行轉(zhuǎn)染。
2)轉(zhuǎn)染細胞對照組pGFP-PRMT5(0.3ug)+pDslucif(2.7ug，沉默Luciferase基因的對照siRNA表達質(zhì)粒，構(gòu)建方法參照文獻Bao S，et al.Oncogene，2004，23(33)5586-93)。
實驗組pGFP-PRMT5(0.3ug)+步驟二構(gòu)建的siRNA表達質(zhì)粒(pDs288、pDs626、pDs852或pDs1228)2.7ug。
用Invitrogen公司的Lipofectamine2000(Cat11668-027)試劑盒并參照試劑盒說明書將上述質(zhì)粒組合瞬時轉(zhuǎn)染HCT116細胞。
3、轉(zhuǎn)染細胞中PRMT5表達情況的Western Blot檢測轉(zhuǎn)染36h后，用Western Blot法檢測上述5種轉(zhuǎn)染細胞中PRMT5的表達情況，蛋白提取方法為吸去培養(yǎng)基，將細胞用冷PBS洗兩遍，加300ul RIPA緩沖液(50mMTris pH7.5，150mM NaCl，10mM EDTA，1％NP-40，0.1％SDS，1mM PMSF，10μg/mLAprotinin)，4℃裂解30min，收集細胞；8V電壓超聲15秒，冰浴10min；4℃，12000rpm離心10min。吸取上清，利用Brandford法進行蛋白定量，然后各取50ug總蛋白進行檢測，以GFP為參照，檢測結(jié)果見圖5中的a圖，針對PRMT5設(shè)計的四對siRNA都能有效地降低或抑制腫瘤細胞中PRMT5的表達水平，其中以siRNA1(288-308(ggagaagattcgcaggaactc))的抑制效果最為顯著(見圖5中的圖b，以Tubulin為參照)。
四、檢測PRMT5 siRNA對腫瘤細胞生長的抑制情況以能有效沉默PRMT5的siRNA表達載體pDs288為例，通過細胞克隆存活實驗檢測其對癌細胞生長的影響，具體方法為將pDs288和pDslucif分別轉(zhuǎn)染HCT116細胞，24小時后計數(shù)，20000個細胞/100mm培養(yǎng)皿，每個樣本平行三份，加入終濃度為400ug/mL的新霉素(G418，購自Gibco公司)，培養(yǎng)14-20天至細胞形成直徑大小為2mm左右的克隆，見圖5中的圖c，轉(zhuǎn)染pDs288的癌細胞的生長得到顯著抑制，并最終被殺死，證明本發(fā)明針對PRMT5設(shè)計的siRNA能有效地抑制或殺死腫瘤細胞。
序列表<160>16<210>1<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1ggagaagauu cgcaggaacu c21<210>2<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gaguuccugc gaaucuucuc c21<210>3<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3gggcugaccu cccaucuaau c21<210>4<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4gauuagaugg gaggucagcc c21<210>5<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5ggaauacuua agccagaacc g21<210>6<211>21<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6cgguucuggc uuaaguauuc c21<210>7<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7ggaagccaag ugaccguagu c21<210>8<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8gacuacgguc acuuggcuuc c21<210>9<211>58<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9gagaagattc gcaggaactc ttcaagagag agttcctgcg aatcttctcc ttttttta58<210>10<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>10agcttaaaaa aaggagaaga ttcgcaggaa ctctctcttg aagagttcct gcgaatcttc 60tc 62<210>11<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>11ggctgacctc ccatctaatc ttcaagagag attagatggg aggtcagccc ttttttta58<210>12<211>62
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>12agcttaaaaa aagggctgac ctcccatcta atctctcttg aagattagat gggaggtcag 60cc 62<210>13<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>13gaatacttaa gccagaaccg ttcaagagac ggttctggct taagtattcc ttttttta58<210>14<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>14agcttaaaaa aaggaatact taagccagaa ccgtctcttg aacggttctg gcttaagtat 60tc 62
<210>15<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>15gaagccaagt gaccgtagtc ttcaagagag actacggtca cttggcttcc ttttttta58<210>16<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>16agcttaaaaa aaggaagcca agtgaccgta gtctctcttg aagactacgg tcacttggct 60tc 6權(quán)利要求
1.蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5在白血病檢測中的應(yīng)用。
2.抑制蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5基因表達的小干擾RNA，是下述雙鏈RNA序列之一1)正義鏈為序列表中的SEQ ID №1，反義鏈為序列表中SEQ ID №2；2)正義鏈為序列表中的SEQ ID №3，反義鏈為序列表中SEQ ID №4；3)正義鏈為序列表中的SEQ ID №5，反義鏈為序列表中SEQ ID №6；4)正義鏈為序列表中的SEQ ID №7，反義鏈為序列表中SEQ ID №8。
3.權(quán)利要求2所述的抑制蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5基因表達的小干擾RNA的編碼序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼序列，其特征在于所述抑制蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5基因表達的小干擾RNA的編碼序列是下述雙鏈核苷酸序列之一1)正義鏈具有序列表中SEQ ID №9的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中SEQ ID№10的核苷酸序列；2)正義鏈具有序列表中SEQ ID №11的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中SEQID №12的核苷酸序列；3)正義鏈具有序列表中SEQ ID №13的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中SEQID №14的核苷酸序列；4)正義鏈具有序列表中SEQ ID №15的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中SEQID №16的核苷酸序列。
5.含有權(quán)利要求3或4所述編碼序列的表達載體。
6.含有權(quán)利要求5所述表達載體的轉(zhuǎn)基因細胞系。
7.含有權(quán)利要求5所述表達載體的宿主菌。
8.一種抑制蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5基因表達的方法，是將權(quán)利要求3或4所述的抑制蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5基因表達的小干擾RNA的編碼序列導(dǎo)入宿主中，蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5基因得到抑制。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述抑制蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5基因表達的小干擾RNA的編碼序列通過含有所述抑制蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5基因表達的小干擾RNA編碼序列的siRNA表達載體導(dǎo)入宿主；所述含有抑制蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5基因表達的小干擾RNA編碼基因的siRNA表達載體為pDs288、pDs626、pDs852或pDs1228。
10.權(quán)利要求2所述的抑制蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5基因表達的小干擾RNA在制備白血病治療性藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了PRMT5在白血病細胞檢測和治療中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了抑制PRMT5基因表達的小干擾RNA。實驗證明，本發(fā)明的小干擾RNA對PRMT5基因具有顯著的抑制作用，此外，通過沉默PRMT5基因，可以抑制PRMT5基因缺失細胞的增殖，表明PRMT5基因可以作為治療白血病及腫瘤的藥物靶標(biāo)。因此可以以抑制PRMT5基因表達的小干擾RNA的編碼序列作為活性成分制備成白血病及腫瘤治療性藥物。本發(fā)明在醫(yī)學(xué)和生物制藥領(lǐng)域具有較大的實際意義和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/54GK1908187SQ20061008882
公開日2007年2月7日 申請日期2006年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月19日
發(fā)明者鮑時來, 鄭胡鏞, 周忠衛(wèi), 張瑞東 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所