專利名稱：人hARPP－21基因序列、其編碼蛋白及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的人基因和蛋白，尤其涉及一種人hARPP-21基因的核酸序列、其編碼蛋白；此外，本發(fā)明還涉及該基因編碼蛋白的制備方法。
背景技術(shù)：
ARPP-21(cAMP-regulated phosphoprotein，Mr＝21,000)是一種cAMP調(diào)節(jié)的磷蛋白，通過(guò)SDS-PAGE測(cè)得其分子量為21kd。在大鼠神經(jīng)支配的多巴胺區(qū)中，它是一種由cAMP刺激引發(fā)蛋白磷酸化作用的主要的胞漿底物(J Neurosci 1989Oct；9(10)3631-7)。cAMP依賴的蛋白激酶磷酸化的絲氨酰殘基位于55號(hào)氨基酸上(J Neurosci 1989，9849-862)。該蛋白分子在71位氨基酸上有個(gè)半胱氨酰殘基，但不含有甲硫氨酰，酪氨酰，苯丙氨酰，色氨酰與組氨酰殘基。ARPP-21是定位在基底神經(jīng)節(jié)中多巴胺相關(guān)區(qū)域內(nèi)的幾種磷蛋白之一，對(duì)它的一級(jí)結(jié)構(gòu)的研究，將可能有助于闡明多巴胺相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)傳遞機(jī)制。
在本發(fā)明之前，還沒(méi)有出現(xiàn)涉及本發(fā)明的人hARPP-21蛋白的公開(kāi)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一種新的人基因hARPP-21(GenbankAccession No.AF112220)，該基因是一個(gè)hARPP-21蛋白基因。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供一種新的人hARPP-21蛋白。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提供一種利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)上述新的人hARPP-21蛋白的方法。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有hARPP-21蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第60-326位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第60-326位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第60-326位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離出的hARPP-21蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中該宿主細(xì)胞是大腸桿菌；在另一實(shí)例中，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種產(chǎn)生具有hARPP-21蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，該方法包括(1)將編碼具有hARPP-21蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成hARPP-21蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第60-326位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成hARPP-21蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)hARPP-21蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有hARPP-21蛋白活性的多肽。
較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.6中第60-326位的序列。
本發(fā)明還提供了與hARPP-21蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明中，“分離的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“hARPP-21蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人hARPP-21蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.6中第60-326位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO.6序列的編碼框第60-326位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO.6中第60-326位核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO.7所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第60-326位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。其中，“嚴(yán)緊條件”是指核苷酸序列在膜上雜交后的洗膜條件。例如，在本領(lǐng)域中，低嚴(yán)緊度洗膜可以在雜交管中倒入150ml左右洗液，放入雜交膜，室溫持續(xù)搖動(dòng)20分鐘左右，而高嚴(yán)緊度洗膜可以是在雜交管中倒入200ml左右洗液，放入雜交膜，50℃搖床中持續(xù)搖動(dòng)20分鐘左右。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO.6中從核苷酸第60-326位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與hARPP-21相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.6中開(kāi)放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“hARPP-21蛋白或多肽”指具有hARPP-21蛋白活性的SEQ IDNO.7序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與hARPP-21相同功能的、SEQ ID NO.7序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括hARPP-21蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的人hARPP-21多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與hARPP-21DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗hARPP-21多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含hARPP-21多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括hARPP-21多肽的可溶性片段。通常，該片段具有hARPP-21多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
在本發(fā)明中，“hARPP-21保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.7的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。本發(fā)明還包括hARPP-21蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然hARPP-21多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的hARPP-21多肽時(shí)，可以將hARPP-21編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成hARPP-21蛋白表達(dá)載體。
在本發(fā)明中，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
本發(fā)明還提供了對(duì)hARPP-21特異的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。
在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備針對(duì)hARPP-21特異的抗體。例如，將提純的hARPP-21基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動(dòng)物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)hARPP-21或它的抗原片段的細(xì)胞也可以用來(lái)對(duì)動(dòng)物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可以用雜交瘤技術(shù)制備(例如，Kohler et al.，Nature 256495，1975；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6292，1976)。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑hARPP-21功能的抗體，也可以是不影響人hARPP-21功能的抗體。每一類抗體都可以通過(guò)對(duì)人hARPP-21基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而hARPP-21基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的hARPP-21基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以通過(guò)用在原核細(xì)胞例如E.coli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以通過(guò)用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的來(lái)免疫動(dòng)物而得到。
本發(fā)明的人hARPP-21抗體可以用來(lái)鑒定表達(dá)hARPP-21蛋白或多肽的細(xì)胞，如Jurkat T細(xì)胞。例如，可以用一種可檢測(cè)的分子例如熒光素異硫氰酸(FITC)來(lái)標(biāo)記hARPP-21特異抗體，然后讓hARPP-21特異抗體與細(xì)胞樣品接觸，再用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)出與hARPP-21特異抗體結(jié)合的細(xì)胞。
除了在細(xì)胞表面檢測(cè)hARPP-21外，還可以用Western印跡技術(shù)分析該蛋白質(zhì)。細(xì)胞裂解液可以從培養(yǎng)細(xì)胞或取自病人的組織標(biāo)本如下丘腦中提取，并溶解在含有去污劑的裂解緩沖液中。然后用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞提取物(同時(shí)將提純的hARPP-21多肽作為陽(yáng)性對(duì)照)，接著通過(guò)電泳雜交將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。為了用Western印跡免疫探測(cè)hARPP-21多肽，可以使用典型的抗體結(jié)合檢測(cè)方法，例如放射自顯影或堿性磷酸酶檢測(cè)方法。并可使用免疫接種血清或不相關(guān)的單克隆抗體作為非特異反應(yīng)的對(duì)照。
此外，本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有hARPP-21核苷酸編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼hARPP-21的核酸分子。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中是否存在hARPP-21核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于hARPP-21核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為15-50個(gè)核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的hARPP-21核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選hARPP-21同源基因或同源蛋白。
為了得到與hARPP-21基因相關(guān)的人cDNAs或基因組DNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選人cDNA或基因組DNA文庫(kù)，這些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用32P對(duì)hARPP-21的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫(kù)是來(lái)自人下丘腦組織的文庫(kù)。來(lái)自參與內(nèi)分泌的其它人體組織或特定人體細(xì)胞株的cDNA文庫(kù)也可用于篩選目的。構(gòu)建來(lái)自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫(kù)的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫(kù)也可以購(gòu)買(mǎi)到，例如購(gòu)自Clontech，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識(shí)別與hARPP-21相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。
根據(jù)核苷酸相似性篩選hARPP-21同源物可以按如下方法完成。人體下丘腦cDNA文庫(kù)，例如Clontech Cat.#7429(Clontech，Palo Alto，Cal.)可以使用一段包含hARPP-21基因序列的全部或部分的隨機(jī)引物化DNA探針篩選。要完成對(duì)與hARPP-21序列至少有70％同源性的DNA插入序列的克隆的鑒定，可以使用雜交溫度為55℃的雜交液，然后用0.5×SSC和0.1％SDS清洗。用這種方法識(shí)別的克隆的DNA插入序列可以進(jìn)一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和DNA測(cè)序來(lái)評(píng)價(jià)它與hARPP-21基因的相似性。
hARPP-21同源物也可以用針對(duì)hARPP-21蛋白或多肽的抗體來(lái)識(shí)別。例如，可以用標(biāo)準(zhǔn)的方法對(duì)商品化的或者用已知方法構(gòu)建的，來(lái)自細(xì)胞或者組織例如下丘腦的表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選。將文庫(kù)倒入平皿，菌落轉(zhuǎn)移到一張硝化纖維素膜上，使表達(dá)的重組蛋白結(jié)合到膜上。然后就可以用特異性的hARPP-21抗體進(jìn)行典型的抗體結(jié)合和檢測(cè)。
本發(fā)明的hARPP-21核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
通過(guò)同源檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的新基因與已發(fā)表并被確認(rèn)為大鼠ARPP蛋白基因具有高度同源的序列，并且本發(fā)明的新蛋白具有大鼠ARPP蛋白高度保守的氨基酸序列。所以，本發(fā)明的hARPP-21是大鼠ARPP蛋白基因的一個(gè)同源基因而具有相似的功能。
本發(fā)明的人hARPP-21蛋白可以施用于病人，以治療或減輕因人hARPP-21缺失、無(wú)功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。


圖1是本發(fā)明的hARPP-21與大鼠ARPP基因核酸序列(GenBank Acc-essionNo.S65091)的同源比較(FASTA)圖。其中，相同的核苷酸用“|”標(biāo)出，“harpp.seq”指人hARPP-21蛋白核酸序列(GenBank Accession No.AF112220)，“rarpp.seq”指大鼠ARPP蛋白核酸序列(GenBank Accession No.S65091)。
圖2是本發(fā)明的hARPP-21蛋白與大鼠ARPP蛋白的氨基酸序列(Swi-ssProtAccession No.Q63889)的同源比較(FASTA)圖。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出，相似的氨基酸用“+”標(biāo)出，“hARPP-21.pep”代表hARPP-21蛋白氨基酸序列，而“rarpp.pep”代表大鼠ARPP蛋白氨基酸序列(Swiss-ProtAccession No.Q63889)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1hARPP-21基因的克隆1.組織分離(Tissue isolation)下丘腦來(lái)源于5個(gè)正常成年男性供體，在死后四小時(shí)內(nèi)取出下丘腦組織，立即置于液氮中冷凍保存。
2.mRNA的分離(mRNA isolation)取出組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。用帶Oligo d(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA，定量。
3.cDNA文庫(kù)的構(gòu)建(Construction of cDNA library)以mRNA為模板，合成雙鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄引物見(jiàn)SEQ ID NO.1。補(bǔ)平末端后，加含EcoRI切點(diǎn)的接頭，接頭序列分別見(jiàn)SEQ ID NO.2和3。磷酸化EcoRI末端后，用XhoI限制性內(nèi)切酶消化1.5小時(shí)，再進(jìn)行片段分離。過(guò)柱篩選長(zhǎng)度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，無(wú)菌水溶解，連接至Uni-ZAP XR載體(Stratagene，CA9203，USA)，以Zap-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(Stratagene，CA9203，USA)進(jìn)行包裝，宿主菌使用XL 1-Blue MRF’(Stratagene，CA9203，USA)細(xì)菌。涂板并測(cè)定滴度。
4.測(cè)序及數(shù)據(jù)庫(kù)建立(Seqencing and Database Constructing)挑選文庫(kù)中有外源片段插入的克隆，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作為3’端和5’端的通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測(cè)序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行EST大規(guī)模測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用FACTURA軟件去除載體序列，傳輸?shù)絊UN Ultra 450Server上進(jìn)行下一步的處理。所有的序列信息再用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(kù)(Genebank+EMBL)，將無(wú)同源性或同源性低于95％的序列視為新基因建立數(shù)據(jù)庫(kù)。
5.基因的全長(zhǎng)克隆(Cloning of Full-length cDNA)在得到的新基因片段序列信息基礎(chǔ)上，進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆，分兩階段進(jìn)行(1)“電子克隆”(Electronic Cloning)以新基因片段序列作為探針?biāo)褜bEST數(shù)據(jù)庫(kù)，將重疊序列＞50bp，同源性在98％以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tag，簡(jiǎn)稱“EST”)序列認(rèn)為同一序列(consensus sequence)，取出并用AUTOASSEMBLER軟件進(jìn)行拼接，部分EST可以延伸探針序列。再用STRIDER軟件分析被延伸的序列是否具有完整的開(kāi)放閱讀框架(OpenReading Frame，ORF)，用BLAST搜尋Genbank或SwissProt以確定該序列在核苷酸和氨基酸水平上是否與其他物種有同源性，以幫助判別所得到的基因全長(zhǎng)完整性如何。通過(guò)電子克隆的方法，通常可獲取hARPP-21基因的全長(zhǎng)序列。
(2)cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)如果通過(guò)“電子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全長(zhǎng)，則在已有序列的5’或3’端設(shè)計(jì)引物，在人類下丘腦Marathon-Ready cDNA文庫(kù)(Clontech Lab，Inc，USA)中進(jìn)行長(zhǎng)距離PCR反應(yīng)。然后對(duì)PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER軟件分析被延長(zhǎng)的序列有無(wú)完整的ORF，如無(wú)，重復(fù)上述過(guò)程直至獲得全長(zhǎng)。
(3)RT-PCR
對(duì)于5’和3’端已知的序列，如果中間尚有一段間隙(gap)無(wú)法從已有的公共數(shù)據(jù)庫(kù)或自身數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，可考慮采用RT-PCR的方法。在序列5’端設(shè)計(jì)引物，3’端引物采用Oligo-dT，在下丘腦總RNA庫(kù)中進(jìn)行擴(kuò)增。然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序。最后拼接并獲得全長(zhǎng)。
通過(guò)組合使用上述3種方法，獲得了候選的hARPP-21蛋白的全長(zhǎng)編碼序列。在拼接得到全長(zhǎng)(至少包含完整的開(kāi)放讀框)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物R15’-AGCAGGAATTCTGCACCAAAG-3’(SEQ ID NO.4)為正向引物，寡核苷酸R25’-ATCCAAAGAGAGGCTTGCAGTT-3’(SEQ ID NO.5)為反向引物，以下丘腦組織的總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，R1/R2的PCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃30秒、58℃30秒和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后以72℃延伸5分鐘。電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為352bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序，獲得SEQ ID NO.6所示的序列。
實(shí)施例2hARPP-21基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的hARPP-21全長(zhǎng)cDNA(GenBank Accession No.AF112220。因申請(qǐng)保密，故在本申請(qǐng)之前未對(duì)公眾公開(kāi))的長(zhǎng)度為352bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.6，其中開(kāi)放讀框位于60-326位核苷酸。根據(jù)全長(zhǎng)cDNA推導(dǎo)出hARPP-21的氨基酸序列，共89個(gè)氨基酸殘基，分子量9674.49，pI為4.64。詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.7。
將hARPP-21的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與大鼠的基因存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它與大鼠ARPP基因的mRNA全編碼序列(GenBank Accession No.S65091)的210-544位堿基有79.9％的相同性(圖1)，在氨基酸水平上，它與大鼠ARPP蛋白(SwissProt Accession No.Q63889)的第1-89位氨基酸殘基有83.1％的相同性和92％的相似性(圖2)。因此，hARPP-21基因與大鼠ARPP基因無(wú)論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，可以認(rèn)為兩者在功能上也可能具有較高相似性。
實(shí)施例3hARPP-21蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究
將hARPP-21蛋白的氨基酸序列在PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)(網(wǎng)址為http//www.motif.genome.ad.jp/)中檢索基序(motif)，得到以下結(jié)果 (1)在氨基酸序列中，存在以下功能基序(i)加框區(qū)(53-56)cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(cAMP-andcGMP-dependent protein kinase phosphorylation site)(ii)黑體區(qū)(76-78)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(Protein kinase Cphosphorylation site)(iii)斜體區(qū)(17-20，33-36，83-86)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)(Casein kinaseII phosphorylation site)(iv)下劃線區(qū)(27-32，59-64)N-豆蔻酰化位點(diǎn)(N-myristoylation site)(2)功能分析cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，N-豆蔻酰化位點(diǎn)，蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)均與翻譯后修飾(post-translational modifications)有關(guān)；而cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)說(shuō)明本發(fā)明hARPP-21蛋白是一種cAMP調(diào)節(jié)的磷酸化底物蛋白。
hARPP-21蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究顯示本發(fā)明hARPP-21蛋白與大鼠ARPP蛋白在結(jié)構(gòu)上具有較高的相似性。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定了功能特異性的生物化學(xué)原理，因此本發(fā)明的hARPP-21蛋白可能具有大鼠ARPP蛋白相似或相同的功能。
實(shí)施例4hARPP-21基因的組織表達(dá)譜電子Northern表達(dá)譜。按Ton C.等人的方法(Ton C et al.，Biochem BiophysRes Commun 1997 Dec 18241(2)589-594；Hwang DM，et al.，Circulation 1997Dec 16；96(12)4146-4203)，將hARPP-21 cDNA序列在GCG軟件包中的dbgST數(shù)據(jù)庫(kù)中做BLAST檢索，在得到的人類EST中，概率值<10e-10、相同性>95％的EST有6個(gè)，可視為該基因在組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)本，由此得出表達(dá)該基因的組織譜，發(fā)現(xiàn)其在大腦和心臟中有表達(dá)，表明它在人體這些組織器官中可能發(fā)揮著重要作用。
實(shí)施例5
hARPP-21蛋白的制備和提純?cè)谠搶?shí)施例中，將全長(zhǎng)的hARPP-21編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的蛋白質(zhì)融合表達(dá)載體之中，以表達(dá)和提純重組蛋白。
1.原核表達(dá)載體的構(gòu)建，以及轉(zhuǎn)化大腸桿菌根據(jù)hARPP-21的全長(zhǎng)編碼序列(SEQ ID NO.6)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物(分別對(duì)應(yīng)于編碼序列5’和3’端的約20個(gè)以上核苷酸)，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這根據(jù)選用的pGEX-2T載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將hARPP-21基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pGEX-2T載體(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鑒定好的表達(dá)載體利用CaCl2方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，篩選鑒定得到含有pGEX-2T-hARPP-21表達(dá)載體的工程菌DH5α-pGEX-2T-hARPP-21。
2.表達(dá)GST-hARPP-21重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的DH5α-pGEX-2T-hARPP-21工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過(guò)夜，按1∶100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時(shí)，至OD600達(dá)0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續(xù)于37℃分別培養(yǎng)0，1，2，3小時(shí)。取培養(yǎng)時(shí)間不同的1ml菌液離心，在細(xì)菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細(xì)菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導(dǎo)時(shí)間增加而增加的菌株即為表達(dá)GST-hARPP-21融合蛋白的工程菌。
3.GST-hARPP-21融合蛋白的提取純化按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)GST-hARPP-21融合表達(dá)蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-hARPP-21。誘導(dǎo)后的細(xì)菌離心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重懸細(xì)菌，超聲破碎細(xì)菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振搖結(jié)合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉淀結(jié)合了GST-hARPP-21的谷胱苷肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗兩次，然后按每毫升超聲液所得沉淀加入10μl還原型谷胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000rpm離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重復(fù)洗脫兩次。洗脫的上清保存于-80℃，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)純化效果。在9-10kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為hARPP-21蛋白。
實(shí)施例6hARPP-21蛋白或多肽在昆蟲(chóng)細(xì)胞中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)1.hARPP-21桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞株根據(jù)人hARPP-21的全長(zhǎng)編碼序列(SEQ ID NO.6)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將hARPP-21cDNA在保證閱讀框架的前提下克隆至pVL1392載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鑒定好的表達(dá)載體3μg，野生型線性桿狀病毒DNA(BaculoGoldTMACMNPV DNA，Pharmingen，SanDiego，CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL，NY)25μl，加入1ml無(wú)血清的昆蟲(chóng)培養(yǎng)基中，振蕩15秒混勻，室溫孵育15分鐘備用。取1ml(2×106)Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞懸液于60mm組織培養(yǎng)板中，貼壁1小時(shí)后換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，室溫孵育15分鐘后棄培養(yǎng)基，加入前面制備好的DNA載體轉(zhuǎn)染混合物，Parafilm密封培養(yǎng)板，于室溫27℃振搖培養(yǎng)4小時(shí)，然后換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，收集上清備用。
2.轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體的昆蟲(chóng)細(xì)胞株的篩選鑒定轉(zhuǎn)染3天后的昆蟲(chóng)細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液(2×106/1ml)，取1ml細(xì)胞懸液置于60mm組織培養(yǎng)皿中，加入3ml培養(yǎng)基，100μl收集的培養(yǎng)上清，貼壁1小時(shí)，棄2ml培養(yǎng)基，繼續(xù)室溫培養(yǎng)1小時(shí)，棄去所有的培養(yǎng)基，加入預(yù)熱的含20μl4％X-gal的3ml半固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)5-7天后挑取白色細(xì)胞克隆于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3-5天，然后吸取上清感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞。
收集感染的細(xì)胞進(jìn)行Western鑒定。將細(xì)胞裂解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后的膠于Multiphor II半干電轉(zhuǎn)移儀(Pharmacia)中將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，將硝酸纖維膜置于封閉液中封閉1小時(shí)，然后于抗hARPP-21的抗體溶液中封閉1小時(shí)，TBS液振搖清洗5分鐘共2次，然后將膜置于生物素標(biāo)記的抗hARPP-21一抗的第二抗體溶液中振搖1小時(shí)，TBS清洗，加入親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物反應(yīng)30分鐘，TBS清洗2次，加入新鮮配制的顯色液顯色觀察蛋白條帶。
挑取高表達(dá)hARPP-21的Sf9細(xì)胞克隆。
3.hARPP-21蛋白的提取純化用高表達(dá)hARPP-21的Sf9細(xì)胞克隆的上清大量感染Sf9細(xì)胞，感染48小時(shí)后收集細(xì)胞，PBS洗滌。每2×108細(xì)胞加入20ml細(xì)胞裂解液(0.5％Triton X-100，20mM Na3PO4(磷酸鈉，pH7.8)，500mM NaCl，1mM Na3VO4(釩酸鈉)，1mM Pefabloc，1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破細(xì)胞，12000×g離心20min去除細(xì)胞碎片，上清按每2×108的細(xì)胞加入2ml NTA-瓊脂糖(Qiagen，Germany)，4℃吸附1小時(shí)。然后用含100nM咪唑的His緩沖液洗滌兩次，用含20mM N，N’-二哌嗪，500mM NaCl，300mM咪唑的緩沖液洗脫以得到純化的蛋白。洗脫液保存于4℃，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)提取的hARPP-21蛋白的純度。在9-10kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為hARPP-21蛋白。
實(shí)施例7抗人hARPP-21抗體的制備1.免疫小鼠和脾細(xì)胞的制備將實(shí)施例5和實(shí)施例6中獲得的hARPP-21蛋白用層析法進(jìn)行分離后備用，也可以用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中割下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。取6-8周齡Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化過(guò)的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量再加強(qiáng)免疫一次，3-5天后用于融合。其中，脾細(xì)胞制備見(jiàn)鄂征主編，《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》，北京出版社，第210頁(yè)。
2.按《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(同上)，第89頁(yè)中的方法，制備飼養(yǎng)細(xì)胞。
3.按《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(同上)，第213頁(yè)中的方法，進(jìn)行細(xì)胞融合。
4.抗體的檢測(cè)在細(xì)胞融合10-15天后，需逐孔進(jìn)行檢查，一旦發(fā)現(xiàn)旺盛的雜交細(xì)胞集落生長(zhǎng)，就應(yīng)用hARPP-21蛋白做抗體活性的初步篩選，常用的方法有免疫熒光試驗(yàn)、發(fā)射免疫試驗(yàn)(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。檢查出抗體活性的孔后，立刻進(jìn)行克隆培養(yǎng)，并分離出抗體。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>人hARPP-21基因序列、其編碼蛋白及制備方法<130>NP-1938<160>7<210>1<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 50<210>2<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>接頭序列<400>2AATTCGGCAC GA G13
<210>3<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>接頭序列<400>3GCCGTGCTC9<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4AGCAGGAATTCTGCACCAAAG21<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>引物<400>5ATCCAAAGAGAGGCTTGCAGTT 22<210>6<211>352<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(60)..(326)<400>61 AGCAGGAATT CTGCACCAAA GGGCATAAAA TCTTGTTATT TTAATTTGCA51 TCTGGGAGAA TGTCTGAGCA AGGAGACCTG AATCAGGCAA TAGCAGAGGA101 AGGAGGGACT GAGCAGGAGA CGGCCACTCC AGAGAACGGC ATTGTTAAAT151 CAGAAAGTCT GGATGAAGAG GAGAAACTGG AACTGCAGAG GCGGCTGGAG201 GCTCAGAATC AAGAAAGAAG AAAATCCAAG TCAGGAGCAG GAAAAGGTAA251 ACTGACTCGC AGCCTTGCTG TCTGTGAGGA ATCTTCTGCC AGACCAGGAG301 GTGAAAGTCT TCAGGATCAG ACTCTCTGAA AACTGCAAGC CTCTCTTTGG351 AT<210>7<211>89<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>7
1 MSEQGDLNQA IAEEGGTEQE TATPENGIVK SESLDEEEKL ELQRRLEAQN51 QERRKSKSGA GKGKLTRSLA VCEESSARPG GESLQDQTL
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有hARPP-21蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第60-326位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQID NO.6中從核苷酸第60-326位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.7所示的序列的多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第60-326位的核苷酸序列。
4.一種分離出的hARPP-21蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.一種產(chǎn)生具有hARPP-21蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(1)將編碼具有hARPP-21蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成hARPP-21蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第60-326位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成hARPP-21蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)hARPP-21蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有hARPP-21蛋白活性的多肽。
9.一種能與權(quán)利要求4所述的hARPP-21蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
10.一種探針?lè)肿?，其特征在于，它包含?quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人正常下丘腦組織中表達(dá)的新的人ARPP－21基因序列及其編碼蛋白，本發(fā)明還公開(kāi)了該蛋白的制備方法，以及提供了與hARPP－21蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。本發(fā)明的人ARPP－21蛋白可以施用于病人，以治療或減輕因人ARPP－21蛋白缺失、無(wú)功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1920024SQ20051002904
公開(kāi)日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2005年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月24日
發(fā)明者韓澤廣, 黃健 申請(qǐng)人:上海人類基因組研究中心