專利名稱：將dna的特定堿基序列烷基化的新吲哚衍生物和使用其的烷基化劑以及藥劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將DNA的特定堿基序列烷基化的新吲哚衍生物和使用其的烷基化劑以及藥劑，具體地，涉及通過將特定堿基序列烷基化而尤其抑制基因的異常表達(dá)、具有高的抗癌作用、反應(yīng)性極其高的新吲哚衍生物和使用其的烷基化劑以及藥劑。
背景技術(shù)：
在人類基因序列的破解基本上完成的今天，對(duì)某一特定的堿基序列具有特異性的結(jié)合能力的分子受到很多研究者的注目。在非專利文獻(xiàn)1等中報(bào)道了Dervan等人發(fā)現(xiàn)逆平行取向的“N-甲基吡咯(以下，簡稱為“吡咯”或稱為“Py”)”-“N-甲基咪唑(以下，簡稱為“咪唑”或稱為“Im”)”聚酰胺對(duì)堿基序列特異地結(jié)合到DNA的小溝(minor groove)。此外，導(dǎo)出如下的一般規(guī)則Py-Im識(shí)別C-G堿基對(duì)、Im-Py識(shí)別G-C堿基對(duì)、Py-Py識(shí)別A-T堿基對(duì)或T-A堿基對(duì)。
此外，為了在Py-Im聚酰胺中引入共價(jià)鍵，以防止結(jié)合中的熵?fù)p失并得到更強(qiáng)的結(jié)合和識(shí)別能力，合成了各種發(fā)夾結(jié)構(gòu)和環(huán)狀的聚酰胺。作為代表性的物質(zhì)，已知β連接體(β-linker)(-NHCH2CH2CO-)、γ連接體(-NHCH2CH2CH2CO-)。其中具有γ連接體(-NHCH2CH2CH2CO-)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)具有優(yōu)異的結(jié)合能力和識(shí)別能力，其與DNA的復(fù)合體的結(jié)構(gòu)也已被確定(參照非專利文獻(xiàn)2)。另外，β-β識(shí)別A-T堿基對(duì)或T-A堿基對(duì)。γ連接體也同樣地識(shí)別A-T堿基對(duì)或T-A堿基對(duì)，γ連接體形成以折彎發(fā)夾型的鼎的部分為代表的γ-轉(zhuǎn)角(γ-turn)結(jié)構(gòu)。
這些分子具有與轉(zhuǎn)錄因子等匹配的結(jié)合常數(shù)以及特異性，但由于基因表達(dá)的控制是通過抑制轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合而進(jìn)行的，因此可作為靶的堿基序列極端受限制(例如，參照非專利文獻(xiàn)3)。
本發(fā)明人開發(fā)出在Py-Im聚酰胺上結(jié)合抗生物質(zhì)DuocarmycinA的烷基化部位的區(qū)段A(Du)而成的雜交分子，并申請了專利(例如，參照專利文獻(xiàn)1)。該雜交分子基于Py-Im聚酰胺的序列識(shí)別能力而將450堿基對(duì)的DNA片段的一處進(jìn)行選擇性烷基化(例如，參照非專利文獻(xiàn)4)。但完成反應(yīng)需要數(shù)天，反應(yīng)效率也低，是數(shù)％。
相對(duì)于此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在對(duì)DNA進(jìn)行烷基化的官能團(tuán)(以下，也稱為“烷基化反應(yīng)部位”)和Py-Im聚酰胺之間插入乙烯連接體(L)而制成的ImPyLDu86成為二聚體后，在低濃度下，與序列5’-YG(A/T)CR-3’(這里，Y表示嘧啶堿基，R表示嘌呤堿基)中相隔5堿基對(duì)的鏈的兩處選擇性地反應(yīng)，以70％的高效率進(jìn)行烷基化。即，發(fā)現(xiàn)通過連接體部分的導(dǎo)入，使得反應(yīng)性以及效率劇增(例如，參照非專利文獻(xiàn)5)。
專利文獻(xiàn)1國際公開第00/15641號(hào)非專利文獻(xiàn)1J.Am.Chem.Soc.1997，119，7636非專利文獻(xiàn)2J.Am.Chem.Soc.1997，119，7909非專利文獻(xiàn)3J.Am.Chem.Soc.2000，122，4856非專利文獻(xiàn)4J.Am.Chem.Soc.1999，121，4961非專利文獻(xiàn)5J.Am.Chem.Soc.2000，122，1602發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的課題但是，上述非專利文獻(xiàn)5記載的雜交分子在合成的困難度、連接體部位不穩(wěn)定性、烷基化部位的反應(yīng)性等方面存在問題。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種可以由比現(xiàn)有的雜交分子更短的反應(yīng)步驟合成、而且兼有反應(yīng)性高的DNA烷基化能力和序列識(shí)別能力的、將DNA的特定堿基序列烷基化的吡咯-咪唑聚酰胺類新型化合物以及使用其的烷基化劑以及藥劑功能分子。
解決課題的手段本發(fā)明人為了實(shí)現(xiàn)上述目的而進(jìn)行了積極的研究，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過制作成在吡咯-咪唑聚酰胺的末端隔著吲哚連接體具有烷基化反應(yīng)部位的化合物，可以解決上述課題，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明的吲哚衍生物，其特征在于，以下述通式(1)表示 (式中，R1為將DNA烷基化的官能團(tuán)，R2為氫原子、烷基或者?；?；X是以下式 為結(jié)構(gòu)單元(m是0～10的整數(shù))并由該結(jié)構(gòu)單元之一構(gòu)成的2價(jià)基團(tuán)或者由可以相同或可以不同的2個(gè)以上的該結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的2價(jià)基團(tuán)。其中，在上述結(jié)構(gòu)單元中，上述R2側(cè)末端的結(jié)構(gòu)單元可以是下式 (K為0～10的整數(shù)))。
此外，本發(fā)明的DNA的烷基化劑，其特征在于，其是由上述本發(fā)明的吲哚衍生物構(gòu)成。
進(jìn)而，本發(fā)明的藥劑，其特征在于，該藥劑使用本發(fā)明的烷基化劑，并抑制或活化基因的表達(dá)。
發(fā)明效果本發(fā)明的吲哚衍生物是對(duì)在基因上存在的特定的堿基序列選擇性地進(jìn)行烷基化的功能分子，通過改變分子內(nèi)的咪唑、吡咯等的配置，可以改變所識(shí)別的堿基序列。此外，其合成方法從提供多品種方面出發(fā)也是實(shí)用的、應(yīng)用性高。這在人類基因組上，作為針對(duì)重要的基因序列或者源自癌等疾病的基因異常的有用且合乎邏輯的藥劑，可實(shí)現(xiàn)基因水平上的藥物設(shè)計(jì)。


圖1表示本發(fā)明化合物(4-1)以及(3-1)對(duì)長鏈DNA(pUC-II以及pUC-II’)的DNA序列特異性烷基化能力以及其堿基序列識(shí)別模型。
圖2表示本發(fā)明化合物(3-2)以及(3-3)對(duì)長鏈DNA(pUC-II以及pUC-I’)的DNA序列特異性烷基化能力以及其堿基序列識(shí)別模型。
圖3表示本發(fā)明化合物(3-2)的堿基序列特異性DNA烷基化模型。
圖4表示本發(fā)明化合物(3-2)、(3-4)以及(3-5)對(duì)長鏈DNA(λ-F10906)的DNA序列特異性烷基化能力以及其堿基序列識(shí)別模型。
圖5表示本發(fā)明化合物(3-6)對(duì)長鏈DNA(pQBI63)的DNA序列特異性烷基化。
圖6表示本發(fā)明化合物(4-1)以及(3-1)在酸性、堿性條件下的穩(wěn)定性。
圖7表示本發(fā)明化合物(3-7)單體、或者在化合物(3-7)和(6)共存下對(duì)長鏈DNA(727bp)的DNA序列特異性烷基化。
圖8表示本發(fā)明化合物(4-3)對(duì)具有24次端粒重復(fù)序列的DNA片段(446bp)的端粒序列特異性烷基化。
圖9表示使用乳癌、前列腺癌等39種人工培養(yǎng)癌細(xì)胞評(píng)價(jià)本發(fā)明化合物(3-2)的抗癌活性的柱狀圖。
具體實(shí)施例方式
以下，具體地說明本發(fā)明的最優(yōu)實(shí)施形態(tài)。
本發(fā)明的吲哚衍生物以下述通式(1)表示， X是以下式 為結(jié)構(gòu)單元、并由該結(jié)構(gòu)單元的一個(gè)構(gòu)成的2價(jià)基團(tuán)、或者由可以相同也可以不同的2個(gè)以上的該結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的2價(jià)基團(tuán)。其中，在上述結(jié)構(gòu)單元中，上述R2側(cè)末端的結(jié)構(gòu)單元可以是下式 其中，m或k為0～10、優(yōu)選1～6、更加優(yōu)選2～3的整數(shù)。此外，結(jié)構(gòu)單元的數(shù)量并沒有特別的限制，根據(jù)成為烷基化對(duì)象的DNA的序列來適當(dāng)選擇，但通常優(yōu)選1～20、更優(yōu)選2～7。另外，結(jié)構(gòu)單元的順序并沒有特別的限制，根據(jù)成為烷基化對(duì)象的DNA的序列來適當(dāng)選擇而設(shè)計(jì)聚酰胺。)本發(fā)明的吲哚衍生物所識(shí)別的DNA的序列，與現(xiàn)有已知的一般規(guī)則一樣，作為原則，Py-Im識(shí)別C-G堿基對(duì)、Im-Py識(shí)別G-C堿基對(duì)、Py-Py識(shí)別A-T堿基對(duì)或T-A堿基對(duì)、β-β以及γ-γ等識(shí)別A-T堿基對(duì)或T-A堿基對(duì)。此外，β-β以及γ-γ等不僅識(shí)別堿基對(duì)，還構(gòu)成折彎發(fā)夾型的鼎的部分。另外，如現(xiàn)有已知那樣，根據(jù)D NA的靶序列的前后周圍的序列狀況，偶爾能觀察到錯(cuò)配。例如，在富含AT(AT rich)的序列多時(shí)，發(fā)夾型分子中的γ轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)旁邊的Im-Py等常出現(xiàn)錯(cuò)配識(shí)別。
此外，成為本發(fā)明化合物的特征的吲哚連接體，針對(duì)1個(gè)吲哚，可以配對(duì)2個(gè)Im、Py等，但并不是必須是通常配對(duì)的2個(gè)Im、Py等，也可以是1個(gè)。另外，作為原則，吲哚本身存在進(jìn)行與Py相同的識(shí)別的傾向，存在識(shí)別C或者T的傾向。進(jìn)而，本發(fā)明的吲哚衍生物的烷基化反應(yīng)部位是在嘌呤堿基的N-3位，特別是在腺嘌呤的N-3位烷基化。
作為上述式(1)中以R1表示的烷基化反應(yīng)部位，只要是對(duì)于在DNA上存在的特定的堿基序列兼有烷基化能力和序列識(shí)別能力的基團(tuán)，就可以是任何基團(tuán)而沒有特別的限制。另外，作為R1例如，作為適宜例子可以列舉下式 所表示的烷基化反應(yīng)部位。另外，在不阻礙烷基化反應(yīng)的范圍內(nèi)，上述式(2)～(5)中可以引入取代基，或者可以將結(jié)構(gòu)簡單化。
上述式(2)和(5)是源自Duocarmycin A的CPI，以下稱式(2)為DU86，稱式(5)為Du。此外，將式(3)所示的1，2，2，9a-四氫環(huán)丙[c]苯并[e]吲哚-4-酮稱為CBI。另外，式(3)存在下式(3-S)以及(3-R)所示的旋光異構(gòu)體。
上式(4)中，R3表示氫原子、肽鏈、糖鏈、聚乙二醇基。作為具體例可以列舉肽鏈、蛋白質(zhì)、單糖類、二糖類，多糖類、聚乙二醇類等。E表示鹵素原子、甲磺?；?、甲苯磺酰基等的離去性高的取代基；鹵素的具體例可列舉溴、氟、碘，優(yōu)選氯。
上述(4)式的具體例可列舉以下式(4-A) 表示的seco-CBI(1-氯甲基-5-羥基-1，2-二氫-3H-苯并[e]吲哚)的殘基。另外，式(4-A)存在下式(4-A-S)以及(4-A-R)所示的旋光異構(gòu)體。
上式(3-S)以及(3-R)，如下述反應(yīng)式所示那樣，可以通過用弱堿處理(4-A-S)以及(4-A-R)而得到。
其中，式(3-S)所表示的S-CBI，其三元環(huán)具有與上述式(5)表示的天然型Du同樣的配置，R1為式(3-S)的式(1)所示的吲哚衍生物具有烷基化活性。另一方面，R1為式(3-R)所示的R-CBI的式(1)所示的吲哚衍生物其烷基化活性很弱，是失活型。
上式(1)中，R2是氫原子、烷基或者酰基。其中，烷基或者?；?除去CO的部分)通?？闪信e碳原子數(shù)1～20、優(yōu)選1～10、更優(yōu)選1～6的直鏈狀或者支鏈狀的低級(jí)烷基，作為具體例，例如可列舉甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基等。另外，R2可以適宜地使用乙酰基。此外，烷基或?；梢跃哂腥〈?。
作為通式(1)所表示的吲哚衍生物，例如可列舉R1是上式(3)、R2是?；南率龌衔?

R1是上式(4-A)、R2是?；南率龌衔锏?以上述化合物(3-1)為例，按照下述合成路線1來說明本發(fā)明的吲哚衍生物的合成方法的概要。首先，將AcImImCO2H(3-1-1)和5-硝基吲哚-2-羧酸乙脂經(jīng)接觸還原而得到的氨體(3-1-2)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，通過在該溶液中添加縮合劑O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、二異丙基乙胺(iPr2NEt)而進(jìn)行縮合反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成Py-Im吲哚乙基酯(3-1-3)。通過將化合物(3-1-3)供于堿性水解條件，可以得到羧酸(3-1-4)。接著，通過將得到的羧酸(3-1-4)與可由市售的1，3-萘二醇合成的seco-CBI(3-1-5)偶聯(lián)，可以得到作為本發(fā)明化合物的開環(huán)體(4-1)。進(jìn)一步，通過將開環(huán)體(4-1)在水中弱堿性條件(NaHCO3)下進(jìn)行處理，可以轉(zhuǎn)化成作為本發(fā)明化合物的環(huán)化體(3-1)。
(合成路線1)
此外，以上述化合物(3-2)為例，按照下述合成路線2說明本發(fā)明的吲哚衍生物的其它合成方法的概要。首先，運(yùn)用使用肟樹脂(oxime resin)的Py-Im聚酰胺的Fmoc固相合成法，合成到目前為止的發(fā)夾型Py-Im聚酰胺所對(duì)應(yīng)的羧酸(3-2-1)。接著，使用羧酸(3-2-1)和HATU在反應(yīng)系中轉(zhuǎn)化成活性At酯(3-2-2)后，通過在其中添加氨基吲哚羧酸(3-2-3)，一舉合成吲哚羧酸(3-2-4)。將化合物(3-2-4)與可由市售的1，3-萘二醇合成的seco-CBI(3-1-5)偶聯(lián)，可以得到作為本發(fā)明化合物的開環(huán)體(4-2)。進(jìn)一步，通過將開環(huán)體(4-2)在水中弱堿性條件(NaHCO3)下進(jìn)行處理，可以轉(zhuǎn)化成作為本發(fā)明吲哚衍生物的環(huán)化體(3-2)。另外，作為本發(fā)明吲哚衍生物的環(huán)化體(3-3)、(3-4)以及(3-5)等也可以按照同樣的方法進(jìn)行合成。
(合成路線2)
此外，本發(fā)明的DNA的烷基化劑的特征在于，是由通式(1)所示的本發(fā)明的吲哚衍生物形成。
另外，作為烷基化劑而使用時(shí)，本發(fā)明的吲哚衍生物通過形成發(fā)夾型結(jié)構(gòu)來識(shí)別DNA，此外，也可以通過形成二聚體而識(shí)別DNA。
此外，不僅是發(fā)夾型結(jié)構(gòu)或者形成二聚體，也可以通過添加以下式 (式中，n是0～10的整數(shù))為結(jié)構(gòu)單元、并具有由該結(jié)構(gòu)單元之一構(gòu)成的2價(jià)基團(tuán)或者由可以相同或不同的2個(gè)以上的該結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的2價(jià)基團(tuán)的化合物(其中，在上述結(jié)構(gòu)單元中，N端側(cè)末端的結(jié)構(gòu)單元可以是下式
(q是0～10的整數(shù)))來識(shí)別DNA。即，可以與不同種類的本發(fā)明的吲哚衍生物(1)配對(duì)并識(shí)別堿基對(duì)，進(jìn)一步也可以與已知的小溝結(jié)合物(minor groove binder，MGB)配對(duì)并識(shí)別堿基對(duì)。
本發(fā)明的藥劑的特征在于，抑制或活化使用本發(fā)明的烷基化劑的基因的表達(dá)。
作為抑制或者控制表達(dá)的基因，可以列舉異常基因、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)、癌基因等。此外，作為本發(fā)明的藥劑的有效成分化合物而使用的本發(fā)明的吲哚衍生物，可以是其藥學(xué)上可接受的鹽，作為該鹽，可以列舉通常使用的鹽例如鹽酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、磺酸鹽等與酸形成的鹽、或者與甲胺、乙二胺等有機(jī)鹽等的堿形成的鹽。
本發(fā)明的吲哚衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽具有以下特征(a)向癌細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入很高，少量即可以看到效果；(b)對(duì)酸或者堿性穩(wěn)定，可以期待口服吸收性；(c)可以控制特定基因的表達(dá)；(d)比起現(xiàn)有的DNA烷基化劑，對(duì)正常細(xì)胞無損傷。
本發(fā)明的藥劑通過控制基因的表達(dá)，期待對(duì)各種疾病有治療效果，特別是對(duì)于癌癥的治療、預(yù)防是有用的，也可用于深部癌癥。作為抗癌劑使用時(shí)，可以制劑成注射劑、錠劑、散劑、膠囊劑等通常使用的劑型。在制劑化時(shí)，可以使用通常使用的藥學(xué)上可接受的載體例如結(jié)合劑、潤滑劑、崩解劑、溶劑、分散劑、穩(wěn)定劑、色素、香料等。制劑中的吲哚衍生物的量根據(jù)吲哚衍生物的種類和劑型而不同，通常為0.2～50重量％。
此外，將本發(fā)明的藥劑作為抗癌劑使用時(shí)的投藥量根據(jù)年齡、體重、病情、治療效果、投藥方法、投藥時(shí)期、投藥天數(shù)、投藥期間而不同，通常以一天一次10～400mg投藥1、2或3周后停藥一周的方法作為一個(gè)療程反復(fù)投藥。進(jìn)而，通過改變咪唑、吡咯、β連接體的配置而可以適應(yīng)各個(gè)種類的癌細(xì)胞。此外，用于更多地表達(dá)基因異常的癌、特別是用于現(xiàn)有的抗癌劑難以發(fā)揮效果的癌的基因異常。
實(shí)施例以下，通過實(shí)施例具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。
合成例1、2化合物(4-1)以及(3-1)的合成(路線1)(1)AcImImCO2H(3-1-1)的合成化合物(3-3-1)按照如下的文獻(xiàn)記載方法合成[(a)Tao，Z.-F.；Fujiwara，T.；Saito，I.；Sugiyama，H.J.Am.Chem.Soc.1999，121，4961.(b)Tao，Z.-F.；Saito，I.；Sugiyama，H.J.Am.Chem.Soc.2000，122，1602.(c)Bando，T.；Narita，A.；Saito，I.；Sugiyama，H.Chem.Eur.J.2002，8，4781.]1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ10.37(s，1H；NH)，9.60(s，1H；NH)，7.63(s，1H；CH)，7.48(s，1H；CH)，3.96(s，3H；NCH3)，3.93(s，3H；NCH3)，2.03(s，3H；COCH3)；對(duì)C12H15N6O4進(jìn)行ESIMS m/e測定[M++H]307.1，計(jì)算值307.3(2)H2N-吲哚-CO2Et(3-1-2)的合成化合物(3-1-2)將市售的5-硝基吲哚-2-羧酸乙脂用作起始原料，利用Pd-C通過在氫氣氣氛下的接觸還原而合成。不進(jìn)行精制而作為(3-1-3)的合成原料使用。
(3)AcImIm-吲哚-CO2Et(3-1-3)的合成將化合物(3-1-1)(305mg，1.05mmol)和化合物(3-1-2)(215mg，1.05mmol)溶于DMF(2mL)中，添加iPr2NEt(550μL，3.15mmol)、HATU(480mg，1.26mmol)，在氮?dú)鈿夥障拢覝財(cái)嚢?5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，減壓下蒸餾除去反應(yīng)溶液的溶劑，用硅膠柱色譜(3～5％MeOH的CH2Cl2溶液，梯度洗脫)精制所得到的殘留物，通過蒸餾除去溶劑而得到黃色粉末(3-1-3)(326mg，52％)。
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ11.83(s，1H；NH)，10.32(s，1H；NH)，10.08(s，1H；NH)，9.40(s，1H；NH)，8.16(s，1H；CH)，7.60(s，1H；CN)，7.56(d，1H，J＝9.0Hz；CH)，7.50(s，1H；CH)，7.40(d，1H，J＝9.0Hz；CH)，7.12(s，1H；CH)，4.33(q，2H，J＝7.0Hz；OCH2)，4.01(s，3H；NCH3)，3.98(s，3H；NCH3)，2.03(s，3H；COCH3)，1.33(t，3H，J＝7.0Hz；CH3)；對(duì)C23N25N8O5進(jìn)行ESIMS m/e測定[M++H]493.2，計(jì)算值493.2(4)AcImIm-吲哚-CO2H(3-1-4)的合成在化合物(3-1-3)(326mg，0.66mmol)中添加MeOH(8mL)和1N氫氧化鈉水溶液(8mL)后，在室溫下攪拌30分鐘。減壓下蒸餾除去MeOH后，在0℃下加入10％HCl水溶液使成為酸性(pH＝2)。將生成的沉淀物用桐山漏斗收集，水洗后干燥，得到化合物(3-1-4)(297mg，96％)。
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ11.71(s，1H；NH)，10.35(s，1H；CH)，10.08(s，1H；NH)，9.49(s，1H；NH)，8.13(d，1H，J＝1.0Hz；CH)，7.60(s，1H；CH)，7.54(dd，1H，J＝2.0，9.0Hz；CH)，7.49(s，1H；CH)，7.38(d，1H，J＝9.0Hz；CH)，7.06(d，1H，J＝2.0Hz；CH)，4.01(s，3H；NCH3)，3.97(s，3H；NCH3)，2.03(s，3H；COCH3)；對(duì)C21H21N8O5進(jìn)行ESIMS m/e測定[M++H]465.2，計(jì)算值465.2
(5)seco-CBI(3-1-5)的合成化合物(3-1-5)按照如下文獻(xiàn)記載的方法，作為鹽酸鹽進(jìn)行合成。光譜數(shù)據(jù)已在文獻(xiàn)中報(bào)道。
(6)AcImIm-吲哚-seco-CBI(4-1)的合成在化合物(3-1-4)(60.3mg，0.13mmol)的反應(yīng)容器中添加seco-CBI(3-1-5)(32.7mg，0.13mmol)和EDCI(50.3mg，0.26mmol)、NaHCO3(41.9mg，0.52mmol)，溶于DMF(700μL)中，在8小時(shí)氮?dú)鈿夥障率覝財(cái)嚢琛４_認(rèn)反應(yīng)結(jié)束后，蒸餾除去溶劑，用硅膠柱色譜(5～10％MeOH的CH2Cl2溶液，梯度洗脫)精制殘留物。將得到的固體用CHCl3洗凈、干燥后，得到茶色粉末(4-1)(85.2mg，96％)。
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ11.71(s，1H；NH)，10.43(s，1H；OH)，10.34(s，1H；NH)，10.11(s，1H；NH)，9.41(s，1H；NH)，8.16(s，1H；CH)，8.12(d，1H，J＝8.0Hz；CH)，7.97(brs，1H；CH)，7.85(d，1H，J＝8.0Hz；CH)，7.62(m，1H；CH)，7.61(s，1H；Im-H)，7.52(t，1H，J＝8.0Hz；CH)，7.51(s，1H；Im-H)，7.45(d，1H，J＝9.0Hz；CH)，7.36(t，1H，J＝8.0Hz；CH)，7.19(s，1H；CH)，4.81(t，1H，J＝11.0Hz；NCHH)，4.56(d，1H，J＝11.0Hz；NCHH)，4.23(brt，1H；CH)，4.03(s，3H；NCH3)，3.99(s，3H；NCH3)，3.87(dd，2H，J＝7.0，11.0Hz；CH2)，2.04(s，3H；COCH3)；對(duì)C34H31ClN9O5進(jìn)行ESI-TOFMS m/e測定[M++H]680.22，計(jì)算值680.23(7)AcImIm-吲哚-CBI(3-1)的合成在化合物(4-1)(6.3mg，9.28mmol)的DMF(150μL)溶液中添加5％aq.NaHCO3(100μL)，在1小時(shí)氮?dú)鈿夥障率覝財(cái)嚢?。確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束后，蒸餾除去溶劑，用硅膠柱色譜(5～15％MeOH的CH2Cl2溶液，梯度洗脫)精制殘留物。蒸餾除去溶劑、干燥后，得到茶色粉末(3-1)(6.0mg，quant.)。
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ11.85(s，1H；NH)，10.35(s，1H；NH)，10.16(s，1H；NH)，9.41(s，1H；NH)，8.17(s，1H；CH)，8.00(d，1H，J＝8.0Hz；CH)，7.94(s，1H；CH)，7.62(s，1H；Im-H)，7.52(m，2H；CHx2)，7.51(s，1H；Im-H)，7.43(m，2H；CH)，7.25(d，1H，J＝8.0Hz；CH)，6.95(s，1H；CH)，4.64(m，1H；NCHH)，4.49(d，1H，J＝10.0Hz；NCHH)，4.02(s，3H；NCH3)，3.98(s，3H；NCH3)，3.27(brt，1H；CH)，2.03(s，3H；COCH3)，1.75(m，1H；CHH)，1.70(m，1H；CHH)；對(duì)C34H30N9O5進(jìn)行ESI-TOFMS m/e測定[M++H]644.23，計(jì)算值644.21合成例3化合物(3-2)的合成反應(yīng)(路線2)(1)AcImImPyPy-γ-ImPyCO2H(3-2-1)的合成化合物(3-2-1)通過Fmoc固相合成儀合成。精制是在使用Chemcobond 5-ODS-H柱的HPLC的條件(0～50％0.1％醋酸-乙腈線性梯度，40min，254nm)下進(jìn)行，作為合成原料使用。
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ10.32(s，1H；NH)，10.29(s，1H；NH)，10.23(s，1H；NH)，10.00(s，1H；NH)，9.91(s，1H；NH)，9.32(s，1H；NH)，8.02(s，1H；NH)，7.56(s，1H；Im-H)，7.50(s，1H；Im-H)，7.45(s，1H；Py-H)，7.44(s，1H Im-H)，7.27(s，1H；Py-H)，7.16(s，1H；Py-H)，7.14(s，1H；Py-H)，6.92(s，1H；Py-H)，6.89(s，1H；Py-H)，4.00(s，3H；NCH3)，3.97(s，3H；NCH3)，3.93(s，3H；NCH3)，3.84(s，3H；NCH3)，3.81(s，3H；NCH3)，3.79(s，3H；NCH3)，3.19(m，2H；CH2)，2.34(m，2H；CH2)，2.03(s，3H；COCH3)，1.78(m，2H；CH2)；對(duì)C39H45N16O9進(jìn)行ESI-TOFMS m/e測定[M++H]881.35，計(jì)算值881.36(2)H2N-吲哚-CO2H(3-2-3)的合成化合物(3-2-3)是通過將市售的5-硝基吲哚-2-羧酸乙脂用作起始原料的二工序反應(yīng)((i)1N NaOH的堿水解、(ii)使用Pd-C的氫氣氣氛下的接觸還原)來合成。
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ11.22(s，1H；NH)，7.11(d，1H，J＝8.5Hz；CH)，6.75(d，1H，J＝2.0Hz；CH)，6.67(s，1H；CH)，6.65(dd，1H，J＝2.0，8.5Hz；CH)，3.31(brs，2H；NH2，H2O)(3)AcImImPyPy-γ-ImPy-吲哚-CO2H(3-2-4)的合成將由固相合成得到的化合物(3-2-1)(3.5mg，3.98mmol)溶于DMF(75μL)中，添加Pr2NEt(1.4μL，8.04mmol)、HATU(1.4mg，3.68mmol)，在氮?dú)鈿夥障率覝財(cái)嚢?小時(shí)。確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束后，添加化合物(3-2-3)(1.3mg，7.38mmol)和iPr2NEt(1.3μL，7.46mmol)，在氮?dú)鈿夥障率覝剡M(jìn)行整夜攪拌。反應(yīng)后，蒸餾除去反應(yīng)溶液的溶劑，邊用桐山漏斗過濾提取、邊將殘留物分別用CH2Cl2和H2O洗凈。其結(jié)果得到化合物(3-2-4)的粗結(jié)晶(3.0mg，73％)。
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ11.33(brs，1H；NH)，10.34(s，1H；NH)，10.33(s，1H；NH)，10.27(s，1H；NH)，9.92(s，2H；NH)9.73(s，1H；NH)，9.32(brs，1H；NH)，8.01(brt，1H；NH)，7.94(s，1H；CH)，7.56(s，1H；Im-H)，7.50(s，1H；Im-H)，7.46(s，1H；Im-H)，7.40(brd，1H，J＝8.5Hz；CH)，7.31(brd，1H，J＝8.5Hz；CH)，7.30(d，1H，J＝1.5Hz；Py-H)，7.26(d，1H，J＝1.5Hz；Py-H)，7.17(d，1H，J＝1.5Hz；Py-H)，7.16(s，2H；y-Hx2)，6.90(d，1H，J＝1.5Hz；Py-H)，6.85(brs，1H；CH)，4.00(s，3H；NCH3)，3.97(s，3H；NCH3)，3.95(s，3H；NCH3)，3.85(s，3H；H3)，3.84(s，3H；NCH3)，3.80(s，3H；NCH3)，3.20(dt，2H，J＝6.0，7.5Hz；CH2)，2.36(t，2H，J＝7.5Hz；CH2)，2.04(s，3H；COCH3)，1.79(qu，2H，J＝7.5Hz；CH2)；對(duì)C48H51N18O10進(jìn)行ESI-TOFMS m/e測定[M++H]1039.40，計(jì)算值1039.39(4)AcImImPyPy-γ-ImPy-吲哚-CBI(3-2)的合成在裝有粗結(jié)晶(3-2-4)(3.0mg，2.89mmol)的反應(yīng)容器中繼續(xù)添加seco-CBI(3-1-5)(1.4mg，6.01mmol)和EDCI(1.2mg，6.25mmol)、NaHCO3(1.0mg，12.0mmol)，溶解于DMF(100μL)中，在氮?dú)鈿夥障率覝財(cái)嚢?小時(shí)。確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束后，添加300μL的5％NaHCO3、DMF(300μL)，攪拌30分鐘。反應(yīng)后，蒸餾除去溶劑，用硅膠柱色譜(5～15％MeOH的CH2Cl2溶液，梯度洗脫)精制殘留物，通過蒸餾除去溶劑而得到粗結(jié)晶(3-2)(1.33mg，兩步驟27％)。進(jìn)一步，通過HPLC(0～50％0.1％醋酸-乙腈線性梯度，40min，254nm)進(jìn)行精制，減壓濃縮、冷凍干燥后，得到黃色結(jié)晶(3-2)(0.5mg，0.41μmol兩步驟11％)。
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ11.77(s，1H；NH)，10.32(s，1H；NH)，10.29(s，1H；NH)，10.26(s，1H；NH)，9.95(s，1H；NH)，9.92(s，1H；NH)，9.82(s，1H；NH)，9.33(s，1H；NH)，8.08(s，1H；CH)，8.01(brs，1H；NH)，8.00(d，J＝7.5Hz，1H；CH)，7.60(t，J＝7.5Hz，1H；CH)，7.56(s，1H；CH)，7.53(d，J＝8.5Hz，1H；CH)，7.50(s，1H；CH)，7.46(s，1H；CH)，7.43(t，J＝7.5Hz，1H；CH)，7.42(s，1H；CH)，7.31(s.1H；CH)，7.27(s，1H；CH)，7.24(d，J＝8.5Hz，1H；CH)，7.22(s，1H；CH)，7.19(s，1H；CH)，7.16(d，J＝7.5Hz，1H；CH)，7.06(s，1H；CH)，6.95(s，1H；CH)，6.89(s，1H；CH)，4.62(dd，J＝10.0，5.0Hz，1H；NCH2)，4.48(d，J＝10.0Hz，1H；NCH2)，4.00(s，3H；NCH3)，3.97(s，3H；NCH3)，3.95(s，3H；NCH3)，3.86(s，3H；NCH3)，3.84(s，3H；NCH3)，3.80(s，3H；NCH3)，3.20(m，2H；CH2)，2.90(m，1H；CH)，2.35(m，2H；CH2)，2.03(s，3H；COCH3)，1.79(m，2H；CH2)，1.76(dd，J＝7.5，5.0Hz，1H；CH)，1.70(t，J＝5.0Hz，1H；CH)；對(duì)C61H60N19O10進(jìn)行ESI-TOFMS m/e測定[M++H]1218.48，計(jì)算值1218.48另外，得到AcImImPyPy-γ-ImPy-吲哚-seco-CBI(4-2)的情況下，反應(yīng)后，不經(jīng)5％NaHCO3處理而蒸餾除去溶劑，用硅膠柱色譜(5～15％MeOH的CH2Cl2溶液，梯度洗脫)、HPLC(0～100％0.1％醋酸-乙腈線性梯度，20min，254nm)精制殘留物。減壓濃縮、冷凍干燥后，可得到黃色結(jié)晶(4-2)。
對(duì)C61H61ClN19O10進(jìn)行ESI-TOFMS m/e測定[M++H]1254.45，計(jì)算值1254.50合成例4AcImImPy-γ-Im-吲哚-CBI(3-3)的合成化合物(3-3)通過與合成例3相同的合成順序進(jìn)行合成。精制是在使用Chemcobond 5-ODS-H柱的HPLC條件(0～50％0.1％醋酸-乙腈線性梯度，40min，254nm)下進(jìn)行，用于DNA烷基化反應(yīng)。
對(duì)C49H48N15O8進(jìn)行ESI-TOFMS m/e測定[M++H]974.37，計(jì)算值974.26合成例5AcImImPyPy-γ-PyPy-吲哚-CBI(3-4)的合成化合物(3-4)通過與合成例3相同的合成順序進(jìn)行合成。精制是在使用Chemcobond 5-ODS-H柱的HPLC條件(0～50％0.1％醋酸-乙腈線性梯度，40min，254nm)下進(jìn)行，用于DNA烷基化反應(yīng)。
對(duì)C62H61N18O10進(jìn)行ESI MS m/e測定[M++H]1217.5，計(jì)算值1217.4合成例6AcImPyPyPy-γ-ImPy-吲哚-CBI(3-5)的合成化合物(3-5)通過與合成例3相同的合成順序進(jìn)行合成。精制是在使用Chemcobond 5-ODS-H柱的HPLC條件(0～50％的0.1％醋酸-乙腈線性梯度，40min，254nm)下進(jìn)行，用于DNA烷基化反應(yīng)。
對(duì)C62H61N18O10進(jìn)行ESI-TOFMS m/e測定[M++H]1217.5，計(jì)算值1217.4合成例7AcImImPyPyβPyPy-γ-ImPyβImPy-吲哚-CBI(3-6)的合成化合物(3-6)通過與合成例3相同的合成順序進(jìn)行合成。精制是在使用Chemcobond 5-ODS-H柱的HPLC條件(0～50％的0.1％醋酸-乙腈線性梯度，40min，254nm)下進(jìn)行，用于DNA烷基化反應(yīng)。
對(duì)C90H93N30O16進(jìn)行ESI MS m/e測定[M++H]1849.7，計(jì)算值1850.1合成例8AcImImPy-β-ImPy-吲哚-CBI(3-7)的合成化合物(3-7)通過與合成例3相同的合成順序進(jìn)行合成。精制是在使用Chemcobond 5-ODS-H柱的HPLC條件(0～50％的0.1％醋酸-乙腈線性梯度，40min，254nm)下進(jìn)行，用于DNA烷基化反應(yīng)。
對(duì)C54H52N17O9進(jìn)行ESI-TOFMS m/e測定[M++H]1082.5，計(jì)算值1082.4
合成例9AcImImIm-γ-PyPy-吲哚-seco-CBI(4-3)的合成化合物(4-3)應(yīng)用已報(bào)道的Py-Im聚酰胺的液相合成法進(jìn)行合成。精制是在使用Chemcobond 5-ODS-H柱的HPLC條件(0～100％的0.1％醋酸-乙腈線性梯度，20min，254nm)下進(jìn)行，用于DNA烷基化反應(yīng)。
對(duì)C55H55ClN17O9進(jìn)行ESI-TOFMS m/e測定[M++H]1132.5，計(jì)算值1132.4合成例10AcImImPyPy-β-PyPyPy-β-Dp(6)的合成 化合物(6)使用fmoc固相合成儀合成，用二甲基氨基丙胺加熱并從固相載體中分離出來。精制是在使用Chemcobond5-ODS-H柱的HPLC條件(0～100％的0.1％醋酸-乙腈線性梯度，20min，254nm)下進(jìn)行。
對(duì)C53H67N20O10進(jìn)行ESI-MS m/e測定[M++H]1143.9，計(jì)算值1143.5在上述合成例1～10中，試劑“iPr2NEt(N，N-二異丙基乙胺)”、HATU(O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲)”、溶劑“DMF(N，N-二甲基甲酰胺)”類主要從Aldrich等試劑公司購入且未經(jīng)精制而使用。在沒有特別標(biāo)明的情況下，反應(yīng)蹤跡通過254nm UV條件下的高效液相色譜(HPLC)來監(jiān)控。1H-NMR光譜使用JEOL JNM-A 500(500MHz)，使用TMS(四甲基硅烷)作為內(nèi)標(biāo)物。此外，記號(hào)中的多重性省略為s(單峰)、d(雙重峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、qu(五重峰)、m(多重峰)、br(寬峰)。電噴霧電離質(zhì)譜(ESIMS)使用PE SCIEX API 165。電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(ESI-TOFMS)使用Bio TOFII(Bruker Daltonics)質(zhì)譜儀。聚丙烯酰胺凝膠電泳使用HITACHI 5500-S DNA序列分析儀，其加樣緩沖液(loading dye)(fushin red的二甲基甲酰胺溶液)從Amersham Co.Ltd.購入。50％Long RangerTM凝膠溶液從FMCBioproducts購入，小牛腸堿性磷酸酶(AP，1000unit/mL)從Boehringer Mannheim購入。
5’-德州紅標(biāo)記的DNA片段的合成以5’-德州紅標(biāo)記的DNA片段(pUC-I’序列號(hào)1)是使用以5’-德州紅標(biāo)記的20堿基對(duì)引物5’-TexRed-AGAATCAGGGGATAACGCAG-3’(pUC18正向，780-799序列號(hào)2)和20堿基對(duì)引物5’-TTACCAGTGGCTGCTGCCAG-3’(pUC18反向，1459-1478序列號(hào)3)，以puc18作為模板，通過PCR法合成的(450bp)。DNA片段是含有互補(bǔ)鏈的雙鏈體狀態(tài)(以下同樣)。
以5’-德州紅標(biāo)記的DNA片段(pUC-II序列號(hào)4)是使用以5’-德州紅標(biāo)記的21堿基對(duì)引物5’-TexRed-TGCTGGCCTTTTGCTCACATG-3’(pUC18反向，1861-1881序列號(hào)5)和19堿基對(duì)引物5-TGTAAAACGACGGCCAGTG-3’(pUC18正向，328-345序列號(hào)6)，以puc18作為模板，通過PCR法合成的(450bp)。
以5’-德州紅標(biāo)記的DNA片段(pUC-II’序列號(hào)7)是使用以5’-德州紅標(biāo)記的19堿基對(duì)引物(pUC18正向，328-345序列號(hào)6)和21堿基對(duì)引物(pUC18反向，1861-1881序列號(hào)5)，以puc18作為模板，通過PCR法合成的(450bp)。
以5’-德州紅標(biāo)記的DNA片段(λ-F10906序列號(hào)8)是使用以5’-德州紅標(biāo)記的23堿基對(duì)引物5’-TexRed-ATCAGGGCAACTCAACCCTGTCC-3’(λ-DNA正向，10960-10982序列號(hào)9)和20堿基對(duì)引物5’-CAGGACGACCAATATCCAGC-3’(λ-DNA反向，37007-37026序列號(hào)10)，以λ-DNA作為模板，通過PCR法合成的(537bp)。
以5’-德州紅標(biāo)記的DNA片段(pQBI63序列號(hào)11)是使用20堿基對(duì)引物5’-GGTGATGTCGGCGATATAGG-3’(序列號(hào)12)和以5’-德州紅標(biāo)記的20堿基對(duì)引物5’-TexRed-CCCCAAGGGGTTATGCTAGT-3’(序列號(hào)13)，以pQBI63質(zhì)粒作為模板，通過PCR法合成的(994bp)。
以5’-德州紅標(biāo)記的727bp DNA片段(序列號(hào)14)是以在MLP中插入了人β-珠蛋白的編碼堿基序列的質(zhì)粒作為模板，使用以5’-德州紅標(biāo)記的20堿基對(duì)引物5’-TexRed-CCCATTCTAAACTGTACCCT-3’(序列號(hào)15)和21堿基對(duì)引物5’-GGCATCAAGGAAGGTGATTGG-3’(序列號(hào)16)，通過PCR法合成的。
具有24次端粒重復(fù)序列的以5’-德州紅標(biāo)記的DNA片段(序列號(hào)17)是以從EcoRI切割點(diǎn)插入了包含端粒重復(fù)序列的低聚物的pCR2.1質(zhì)粒作為模板，使用以5’-德州紅標(biāo)記的20堿基對(duì)引物5’-TexRed-GGCCAGTGAATTGTAATACG-3’(序列號(hào)18)和20堿基對(duì)引物5’-CCAGGCTTTACACTTTATGC-3’(序列號(hào)19)，通過PCR法合成的(446bp)。所得到的各個(gè)DNA片段用Suprec-02過濾精制后，測定UV吸收來確定其濃度。
對(duì)直鏈DNA(400bp～)的烷基化能力使用長鏈DNA(pUC-II’序列號(hào)7)研究上述合成例中合成的化合物(3-1)、(4-1)與DNA的反應(yīng)。烷基化反應(yīng)是在23℃下進(jìn)行8小時(shí)，利用測序用聚丙烯酰胺電泳來解析烷基化序列的結(jié)果示于圖1。其結(jié)果，開環(huán)體(4-1)、成環(huán)體(3-1)具有相同的序列特異性，在nM濃度下，對(duì)位點(diǎn)1(5’-CGGCCA-3’)的腺嘌呤進(jìn)行選擇性烷基化。該序列特異性可以根據(jù)在DNA小溝內(nèi)二聚化而識(shí)別堿基序列的模型來說明。
另外，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳的解析是按照如下方法進(jìn)行的將在總量為10μL的5mM磷酸鈉緩沖液(pH＝7.0)中含有5’末端以德州紅標(biāo)記的DNA片段10nM、DMF10％(v/v)和在先標(biāo)明濃度的藥劑的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溶液放入微量離心分離管(Eppendorf)中，在23℃下靜置8小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加入小牛胸腺(calf thymus)DNA(1mM，1μL)進(jìn)行淬滅(quench)，在90℃下震蕩5分鐘。在離心減壓下得到的DNA中加入8μL的加樣緩沖液(顏料填充劑loading dye)(fushin red的DMF溶液)，溶解后，在94℃震蕩20分鐘。立即在0℃急劇冷卻后，對(duì)其中的2μL使用HITACHI5500-S DNA序列分析儀在6％改性聚丙烯酰胺凝膠下進(jìn)行電泳。以下的實(shí)驗(yàn)也同樣。
使用長鏈DNA(pUC-II序列號(hào)4、pUC-I’序列號(hào)1)研究上述合成例中合成的化合物(3-2)、(3-3)與DNA的反應(yīng)。進(jìn)行8小時(shí)的烷基化反應(yīng)，利用測序用聚丙烯酰胺電泳來解析的結(jié)果示于圖2。其結(jié)果，化合物(3-2)、(3-3)都可以在nM濃度下觀察到即使與以前的具有乙烯連接體的Py-Im聚酰胺相比都毫不遜色的高效的DNA烷基化。但是，在序列識(shí)別能力方面觀察到了不同之處。即，化合物(3-3)中，盡管可以觀察到作為匹配序列的位點(diǎn)4(5’-AGCCA-3’)的烷基化，但另一方面，也觀察到了位點(diǎn)1(5’-AGCTA-3’)、位點(diǎn)2(5’-AGTCA-3’)、位點(diǎn)5(5’-TACCA-3’)等一個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配序列。對(duì)照性地，在化合物(3-2)中，僅可以觀察到位點(diǎn)3(5’-TGACCA-3’)、位點(diǎn)6(5’-AGTCCA-3’)的匹配序列的烷基化，在序列識(shí)別能力方面，化合物(3-2)的分子設(shè)計(jì)是優(yōu)異的。更有意思的是，pUC-I’(序列號(hào)1)中也含有相當(dāng)于化合物(3-3)的匹配序列的位點(diǎn)(5’-TGCCG-3’)，但完全觀察不到對(duì)鳥嘌呤的烷基化。
結(jié)合圖2的結(jié)果考慮，該吲哚連接體和CBI的組合可以認(rèn)為是以高的序列特異性對(duì)腺嘌呤的N-3位進(jìn)行烷基化?？梢哉J(rèn)為，在序列識(shí)別中，吲哚連接體邊起到Py的作用，邊將CBI的環(huán)丙烷環(huán)和腺嘌呤的N-3位的距離調(diào)整到發(fā)生烷基化的距離(圖3)。
使用長鏈DNA(λ-F10906序列號(hào)8)對(duì)化合物(3-2)、(3-4)、(3-5)與DNA的反應(yīng)進(jìn)行研究。評(píng)價(jià)其DNA烷基化能力的結(jié)果示于圖4。與圖2結(jié)果同樣地觀察到化合物(3-2)在nM濃度下的序列特異性DNA烷基化(位點(diǎn)2，35’-TGACCA-3’，位點(diǎn)45’-AGACCA-3’，位點(diǎn)55’-TGTCCA-3’)。也可以觀察到化合物(3-4)在nM濃度下的序列特異性DNA烷基化(位點(diǎn)65’-AATCCA-3’，位點(diǎn)75’-TAACCA-3’)。另一方面，化合物(3-5)僅觀察到對(duì)錯(cuò)配序列(位點(diǎn)15’-TGCTCA-3’)的烷基化。這些結(jié)果顯示，在含有吲哚連接體的發(fā)夾型Py-Im聚酰胺的分子設(shè)計(jì)中，僅通過改變Py-Im的配置，就可以自由地制作成具備不同的序列識(shí)別能力的烷基化劑。
此外，通過確立使用吲哚連接體的合成路線，在現(xiàn)有的乙烯連接體中不能合成的具有更長的堿基序列識(shí)別能力的烷基化劑的合成也成為可能。例如，使用肟樹脂的Py-Im聚酰胺的Fmoc固相合成法，由于可以提供具有長的序列識(shí)別能力的Py-Im羧酸，因此合成例7所示的化合物(3-6)的合成成為可能。對(duì)來自pQBI63的D NA片段(序列號(hào)11)進(jìn)行烷基化研究的結(jié)果，可以確認(rèn)nM濃度下的化合物(3-6)對(duì)1000堿基對(duì)DNA進(jìn)行高效的烷基化(圖5)。另一方面，觀察到了1bp錯(cuò)配(mis-match)識(shí)別引起的烷基化(位點(diǎn)2)，還可以觀察到對(duì)富含AT的(AT-rich)堿基序列(位點(diǎn)1，3)的烷基化。在化合物(3-6)這樣具有長的識(shí)別能力的Py-Im聚酰胺中，保持高的特異性是重要的課題?？梢哉J(rèn)為，今后，通過對(duì)目前的分子設(shè)計(jì)進(jìn)行最優(yōu)化，通用性優(yōu)異的具有10堿基對(duì)以上的序列識(shí)別能力的實(shí)用的烷基化會(huì)成為可能。
發(fā)夾型聚酰胺的穩(wěn)定性按照如下方法，使用HPLC對(duì)酸性、堿性條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行。將總量10μL的5％HCl水溶液(pH＝1，DMF∶H2O＝1∶9)或者5％NaHCO3水溶液(pH＝9，DMF∶H2O＝1∶9)中含有化合物(3-1)或者(4-1)(100μM)的反應(yīng)溶液放入微量離心分離管(Eppendorf)中，在37℃下靜置。從開始靜置起，在30分鐘、2小時(shí)、24小時(shí)之后，分別以HPLC(0～100％50mM甲酸銨-乙腈線性梯度，20min，流速1.0mL/min，254nm)分析化合物(4-1)(16.8min)、化合物(3-1)(15.1min)。
使用化合物(4-1)、(3-1)，通過HPLC的產(chǎn)品分析(productanalysis)來評(píng)價(jià)含有吲哚連接體的Py-Im聚酰胺的穩(wěn)定性，其結(jié)果示于圖6。明確了化合物(4-1)針對(duì)HCl酸性(pH＝1)水溶液(37℃、靜置24小時(shí))條件，完全不會(huì)水解。此外，針對(duì)NaHCO3堿性(pH＝9)水溶液(37℃、靜置24小時(shí))條件，化合物(4-1)轉(zhuǎn)化成化合物(3-1)(30分鐘50％、2小時(shí)78％)，但完全不會(huì)生成其它水解產(chǎn)物。另一方面，如果將化合物(3-1)置于HCl酸性(pH＝1)水溶液(37℃)條件，則迅速轉(zhuǎn)化成化合物(4-1)(30分鐘96％)。即，明確了含有吲哚連接體的Py-Im聚酰胺在酸性(pH＝1)中以化合物(4-1)這樣的seco-CBI的形態(tài)、在堿性(pH＝9)中以化合物(3-1)這樣的CBI的形態(tài)穩(wěn)定地存在。
利用異二聚體型聚酰胺進(jìn)行的DNA序列特異性烷基化Py-Im聚酰胺的Fmoc固相合成法可以提供具有序列識(shí)別能力的Py-Im羧酸或小溝結(jié)合物，所以如合成例8以及10所示那樣，還可以合成化合物(3-7)、(6)。就727bp DNA片段(序列號(hào)14)，研究了化合物(3-7)的DNA烷基化，其結(jié)果可以確認(rèn)化合物(3-7)在nM濃度下，高效地進(jìn)行基于發(fā)夾型識(shí)別的烷基化(位點(diǎn)1，2)和基于直鏈型識(shí)別的烷基化(位點(diǎn)3)(圖7)。有意思的是，在作為小溝結(jié)合物的化合物(6)(500nM)的共存下形成異二聚體，可以觀察到基于正確的10堿基對(duì)識(shí)別的烷基化(位點(diǎn)4)?；衔?3-7)以及(6)那樣的二個(gè)分子通過共同作用而可以證實(shí)長的堿基對(duì)識(shí)別能力，這從擴(kuò)大Py-Im聚酰胺的識(shí)別的角度考慮，是重要的想法。
以端粒序列作為靶的DNA烷基化在細(xì)胞內(nèi)的DNA末端上存在有由5’-GGGTTA-3’組成的連續(xù)的堿基序列，已有啟示其與細(xì)胞的增殖、復(fù)制非常相關(guān)。研究了化合物(4-3)對(duì)具有24次端粒重復(fù)序列的DNA片段(446bp序列號(hào)17)的烷基化，其結(jié)果，觀察到化合物(4-3)在nM濃度下高效地進(jìn)行基于發(fā)夾型識(shí)別的端粒序列選擇性烷基化(5’-ACCCTA-3’)(圖8)。利用含有吲哚連接體的Py-Im聚酰胺的烷基化劑，其分子設(shè)計(jì)富于通用性，可以認(rèn)為能夠進(jìn)行各種靶堿基序列識(shí)別。
發(fā)夾型聚酰胺的體外抗癌作用為了調(diào)查顯示出最優(yōu)良的序列特異性烷基化的包含吲哚連接體的Py-Im聚酰胺(3-2)對(duì)癌細(xì)胞的效果，使用乳癌到前列腺癌的39種人培養(yǎng)癌細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)(圖9)。柱狀圖的縱軸表示39種人培養(yǎng)癌細(xì)胞的種類，橫軸的“0”值表示IC50的對(duì)數(shù)的平均值。若柱延伸到右側(cè)，則表示對(duì)于該癌種類的效果好，若延伸到左側(cè)，則表示效果差?；衔?3-2)對(duì)人培養(yǎng)癌細(xì)胞具有比較強(qiáng)的活性[39種的平均logIC50值約為-7(100nM)]，顯示出令人感興趣的抗癌活性。此外，使用乳癌到前列腺癌的39種人培養(yǎng)癌細(xì)胞的抗癌活性評(píng)價(jià)是按照癌研究會(huì)進(jìn)行的篩選試驗(yàn)來進(jìn)行評(píng)價(jià)。
進(jìn)而，用含0.1％DMF的10-5～10-8M的AcImImPyPy-γ-ImPy-吲哚-CBI(3-2)，對(duì)HCT-116(源自人大腸癌的細(xì)胞)、HeLa(源自人子宮癌的細(xì)胞)、HLC-2(源自人肺癌的細(xì)胞)、SH-SY-5Y(源自人成神經(jīng)的細(xì)胞)進(jìn)行48小時(shí)的處理，評(píng)價(jià)該化合物作為抗癌劑的效果。其結(jié)果，對(duì)HCT-116、HeLa、HLC-2、SH-SY-5Y的50％細(xì)胞增殖抑制濃度(IC50)分別為7.42×10-8、5.97×10-8、5.35×10-8、7.43×10-9M。此外，對(duì)293T(源自人腎臟的正常細(xì)胞)、WI-38(源自人正常成纖維細(xì)胞)也進(jìn)行了同樣的評(píng)價(jià)，其結(jié)果，IC50分別為6.99×10-8、6.79×10-8M，顯示出與正常細(xì)胞相比對(duì)癌細(xì)胞大約高10倍的高抗癌作用(IC50值是以用0.1％DMF處理48小時(shí)的體系作為對(duì)照來計(jì)算的)。
另外，抗癌活性的評(píng)價(jià)是根據(jù)如下方法進(jìn)行的。在96孔平底板中，將HCT-116、HeLa、HLC-2、SH-SY-5Y細(xì)胞分別以4.0×103、3.6×103、1.6×103、7.0×102、5.0×102、8.0×102細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度在完全培養(yǎng)基[含10％的胎牛血清的RPMI1640(HCT-116、SH-SY-5Y細(xì)胞；Sigma-Aldrich公司)、以及Dulbecco’s改良培養(yǎng)基(HeLa、HLC-2、239T、WI-38；Sigma-Aldrich公司)]中接種，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行24小時(shí)預(yù)培養(yǎng)。接著，將培養(yǎng)基換成含有0.1％的DMF和10-5～10-8M的AcImImPyPy-γ-ImPy-吲哚-CBI(3-2)的完全培養(yǎng)基，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行48小時(shí)的處理。之后，加入每孔10μL的細(xì)胞增殖分析試劑盒(cell counting kit-8)試劑(同仁化學(xué))，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)放置2小時(shí)，通過酶標(biāo)儀(Micro plate reader)MPR-A4I(TOSOH公司)測定吸光度。
發(fā)夾型聚酰胺的體內(nèi)抗癌作用研究了化合物(4-2)對(duì)裸鼠可移植性人ER(+)乳癌Br-10的抗腫瘤效果。用套管針在8周歲BALB/cA-nu/nu小鼠的背側(cè)部皮下移植人ER(+)乳癌Br-10。對(duì)移植Br-10的小鼠，同時(shí)肌肉內(nèi)投藥E·P·緩釋型激素(hormone depot)0.1mL。腫瘤體積大約達(dá)到100mm3時(shí)，分成5只/組開始投藥。
將化合物(4-2)溶于乙醇中，稀釋到生理鹽水中，1天1次、每三天3次，分在腫瘤附近的三、四處投藥?；衔?4-2)的投藥量是以0.05mL/10g的容量注射50mg/kg(大約1mg/鼠)。此外，對(duì)照組中，在皮下注射生理鹽水。每三天測定腫瘤的長徑(L)以及短徑(W)，通過下式求得腫瘤的體積。
腫瘤體積(mm3)＝L(mm)×W2(mm2)/2將化合物(4-2)投藥組與對(duì)照組的腫瘤體積的對(duì)比結(jié)果示于下表1中。表中的數(shù)值表示以各組在1天后的腫瘤體積設(shè)為1.0時(shí)的各組中的相對(duì)評(píng)價(jià)、以及以(化合物(4-2)投藥組的腫瘤體積T)/(對(duì)照組的腫瘤體積C)×100％表示的組之間的相對(duì)評(píng)價(jià)。
由上述表1可知，在皮下注射化合物(4-2)的組中，第一次投藥就顯示出增殖的抑制，隨著以后的投藥，顯示出更顯著的增殖抑制效果。另外，本試驗(yàn)中，并沒有觀察到小鼠的體重減少等毒性。
權(quán)利要求
1.一種吲哚衍生物，其特征在于，以下述通式(1)表示 (式中，R1為將DNA烷基化的官能團(tuán)，R2為氫原子、烷基或者?；?；X是以下式 作為結(jié)構(gòu)單元(m是0～10的整數(shù))、并由該結(jié)構(gòu)單元之一構(gòu)成的2價(jià)基團(tuán)或者由可以相同也可以不同的2個(gè)以上的該結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的2價(jià)基團(tuán)。其中，在上述結(jié)構(gòu)單元中，上述R2側(cè)末端的結(jié)構(gòu)單元可以由下式表示 (K為0～10的整數(shù)))。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吲哚衍生物，上述R1由下式表示。 (式(4)中，R3為氫原子、肽鏈、糖鏈或者聚乙二醇基；E為從由鹵素原子、甲磺?；约凹妆交酋；M成的組中選擇的離去基團(tuán)。)
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吲哚衍生物，其中，上述R2為乙?；?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的吲哚衍生物，其由下式(3-1)表示。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的吲哚衍生物，其由下式(3-2)表示。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的吲哚衍生物，其由下式(3-3)表示。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的吲哚衍生物，其由下式(3-4)表示。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的吲哚衍生物，其由下式(3-5)表示。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的吲哚衍生物，其由下式(3-6)表示。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的吲哚衍生物，其由下式(3-7)表示。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的吲哚衍生物，其由下式(4-1)表示。
12.根據(jù)權(quán)利要求3所述的吲哚衍生物，其由下式(4-2)表示。
13.根據(jù)權(quán)利要求3所述的吲哚衍生物，其由下式(4-3)表示。
14.一種DNA的烷基化劑，其特征在于，其由權(quán)利要求1所述的吲哚衍生物構(gòu)成。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的DNA烷基化劑，其中，通過上述吲哚衍生物形成發(fā)夾型結(jié)構(gòu)來識(shí)別DNA。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的DNA烷基化劑，其中，通過上述吲哚衍生物形成二聚體來識(shí)別DNA。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的DNA烷基化劑，其是通過添加如下的化合物而形成的，該化合物以下式 (式中，n是0～10的整數(shù))為結(jié)構(gòu)單元，是具有由該結(jié)構(gòu)單元之一構(gòu)成的2價(jià)基團(tuán)或者由可以相同或不同的2個(gè)以上的該結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的2價(jià)基團(tuán)的化合物(其中，在上述結(jié)構(gòu)單元中，N端側(cè)末端的結(jié)構(gòu)單元可以是下式 (q是0～10的整數(shù)))。
18.一種藥劑，其特征在于，該藥劑使用權(quán)利要求14所述的烷基化劑，并抑制或者活化基因的表達(dá)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的藥劑，其中，上述基因是異?；颉?br> 20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的藥劑，其中，上述基因是單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的藥劑，其中，上述基因是癌基因。
全文摘要
本發(fā)明提供一種可以由比現(xiàn)有的雜交分子更短的反應(yīng)步驟合成、而且兼具反應(yīng)性高的DNA烷基化能力和序列識(shí)別能力的將DNA的特定堿基序列烷基化的吡咯－咪唑聚酰胺類的新化合物和使用其的烷基化劑以及藥劑功能分子。該吲哚衍生物如式(1)表示其中，R
文檔編號(hào)A61K31/4178GK1930151SQ20058000810
公開日2007年3月14日 申請日期2005年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月13日
發(fā)明者杉山弘, 板東俊和 申請人:Tmrc株式會(huì)社