長鏈非編碼rna afap1-as1的引物、檢測試劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1的引物、檢 測試劑及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類基因組計劃及其后續(xù)的DNA元件百科全書計劃（The Encyclopedia of DNA Elements Pr〇ject，ENC0DE)研宄成果表明，蛋白編碼基因序列僅占人類基因組序 列的1-3%，而人基因組中絕大部分可轉(zhuǎn)錄的序列為長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，IncRNA)。LncRNA廣泛地存在于各種生物中，且隨著生物復(fù)雜程度的升高，基因組中 IncRNA序列的比例也相應(yīng)地增大，提示IncRNA在生物進(jìn)化過程中有重要意義。隨著IncRNA 不斷被發(fā)現(xiàn)，它們的功能逐漸被詮釋，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)IncRNA廣泛而活躍地參與到生命活動 不同層面的功能調(diào)控中，作為一個嶄新的領(lǐng)域，已經(jīng)成為國際生命科學(xué)研宄領(lǐng)域新的前沿 與熱點。
[0003] LncRNA可作為功能蛋白質(zhì)的信號（signal)、誘導(dǎo)（guide)、誘館（decoy)或支架 (scaffold)分子等多種方式，在染色質(zhì)重構(gòu)、基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白修飾等多重水平調(diào)控基 因的表達(dá)，并在包括發(fā)育、免疫、生殖等基本生理過程中扮演了不可替代的角色，更重要的 是，IncRNA的表達(dá)與功能失調(diào)已經(jīng)與包括惡性腫瘤在內(nèi)的人類多種疾病緊密聯(lián)系在了一 起。因此，深入研宄IncRNA的功能，揭示由IncRNA介導(dǎo)的遺傳信息傳遞方式和表達(dá)調(diào)控網(wǎng) 絡(luò)，不僅可以從蛋白編碼基因以外的角度重新注釋和闡明基因組的結(jié)構(gòu)與功能，深入發(fā)現(xiàn) 生命活動的本質(zhì)和規(guī)律，還有望從一個新的視角認(rèn)識包括腫瘤在內(nèi)的多種人類常見疾病的 發(fā)病機理，并為這些疾病的診斷與治療提供新的分子標(biāo)志物與治療靶點。
[0004] 鼻咽癌是常見高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤，容易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。研 宄表明，這種腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多步驟、多階段的復(fù)雜過程，LncRNA在鼻咽 癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能也起到了重要的作用。最近我們利用IncRNA芯片，構(gòu)建了鼻咽 癌活檢組織及正常對照樣品中IncRNA的表達(dá)譜，從中篩選了一些在鼻咽癌中差異表達(dá)的 IncRNAs，經(jīng)擴大樣本實時熒光定量PCR驗證，證實IncRNA AFAP1-AS1 (NCBI accession number:NR_026892)在鼻咽癌中表達(dá)顯著上調(diào)，且AFAP1-AS1的表達(dá)水平與鼻咽癌的淋巴 結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)，針對該IncRNA的檢測制劑也可以用于鼻咽癌的輔助診斷。隨 后，我們進(jìn)一步增加樣本，在112例有臨床隨訪資料的鼻咽癌石蠟存檔標(biāo)本中，通過原位雜 交（in situ hybridization)的方法檢測了 AFAP1-AS1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1表達(dá) 高的患者更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，其生存時間短于該IncRNA表達(dá)低的患者，因此針對該IncRNA的 檢測制劑也可以用于鼻咽癌的預(yù)后判斷。
[0005] 我們通過設(shè)計并合成革E向AFAP1-AS1的短發(fā)夾RNA (short-hairpin RNA, shRNAs) 序列，構(gòu)建了靶向AFAP1-AS1的RNA干擾載體，轉(zhuǎn)染到鼻咽癌細(xì)胞株中，在體外培養(yǎng)系統(tǒng)和 裸鼠轉(zhuǎn)移瘤體內(nèi)模型中均證實靶向干擾AFAP1-AS1的表達(dá)可明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲 與轉(zhuǎn)移能力。將AFAP1-AS1的RNA干擾載體負(fù)載到多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒上制成納 米基因轉(zhuǎn)運體，多聚賴氨酸修飾的硅納米顆?？杀Ｗo(hù)AFAP1-AS1的RNA干擾載體免受核酸 酶降解，延長作用時間，且有更高的轉(zhuǎn)染效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1的引物、檢測試劑及其應(yīng)用，利用 AFAP1-AS1序列得到的引物可以制備用于鼻咽癌輔助診斷或者預(yù)后預(yù)測的制劑。長鏈非編 碼RNA AFAP1-AS1的應(yīng)用方法，用于制備鼻咽癌輔助診斷或者療效預(yù)測的實時熒光定量檢 測試劑，該長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1的序列如SEQ NO: 1所示。
[0007] 所述的實時熒光定量檢測試劑中包含：
[0008] 用于實時熒光定量檢測AFAP1-AS1表達(dá)的引物序列：
[0009] 正向引物：5 ' -AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3 '，
[0010] 反向引物：5 ' -CACACAGGGGAATGAAGAGG-3 '。
[0011] 所述的實時熒光定量檢測制劑為試劑盒。
[0012] 試劑盒中含有：
[0013] 用于實時熒光定量檢測AFAP1-AS1表達(dá)的引物序列：
[0014] 正向引物：5 ' -AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3 '，
[0015] 反向引物：5 ' -CACACAGGGGAATGAAGAGG-3 '。
[0016] 內(nèi)參基因 GAPDH特異性PCR引物：
[0017] 正向引物 5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 '
[0018] 反向引物 5 ' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '。
[0019] 試劑盒中還含有：
[0020] (1)從鼻咽癌組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩(wěn)定溶液、Trizol試劑、三氯 甲烷、異丙醇、無酶水；
[0021] (2)以總RNA為模板將LncRNA AFAP1-AS1逆轉(zhuǎn)錄為cDNA所用試劑，包括逆轉(zhuǎn)錄緩 沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及隨機引物；
[0022] (3)將cDNA實時定量PCR所用試劑，包括實時熒光定量SYBR染料、無酶水。
[0023] 我們從鼻咽癌和正常鼻咽上皮組織樣本中抽提RNA后逆轉(zhuǎn)錄，實時熒光定量法檢 測了 AFAP1-AS1的表達(dá)，結(jié)果顯示AFAP1-AS1在鼻咽癌組織中表達(dá)上調(diào)。提示AFAP1-AS1 可作為鼻咽癌預(yù)后預(yù)測的分子標(biāo)志。本發(fā)明為鼻咽癌的輔助診斷和預(yù)后預(yù)測提供了強有力 的分子生物學(xué)工具，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和重要的推廣應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0024] 圖1為實時熒光定量PCR技術(shù)驗證IncRNA AFAP1-AS1在鼻咽癌和正常鼻咽上皮 中的表達(dá)情況；
[0025] AFAP1-AS1在鼻咽癌（NPC)中的表達(dá)比正常鼻咽上皮（Normal)中顯著提高，且與 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（左）及臨床分期（右）密切相關(guān)，AFAP1-AS1的表達(dá)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽 癌組織（NPC_Nl/2)中比沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（NPC_N0)的更高（左圖），AFAP1-AS1的表達(dá)也隨 鼻咽癌患者臨床分期逐漸增高（右圖，I、II、III分別代表臨床I、II、III期）。
[0026] 圖2為原位雜交檢測AFAP1-AS1在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表達(dá)情況；
[0027] 正常鼻咽上皮（NPE)中表達(dá)水平較低（僅在2例正常鼻咽上皮組織中檢測到有低 表達(dá)，其余8例中檢測不到表達(dá)），而在69. 64%的鼻咽癌（112例鼻咽癌組織中的78例） 中檢測到有AFAP1-AS1的表達(dá)，其中55例為低表達(dá)（NPC_Low)，23例為高表達(dá)（NPC_High)， 其余的34例鼻咽癌組織中未檢測到AFAP1-AS1的表達(dá)（NPC_negative) ;P〈0. 001。
[0028] 圖3為鼻咽癌中AFAP1-AS1的表達(dá)與鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系
[0029] 鼻咽癌中AFAP1-AS1的高表達(dá)與鼻咽癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，即AFAP1-AS1高 表達(dá)的患者總的生存時間（Over-all survival，左）和無復(fù)發(fā)生存時間（Relapse-free sruvival，右）要明顯低于AFAP1-AS1低表達(dá)或不表達(dá)的患者。
[0030] 圖4為在鼻咽癌細(xì)胞中導(dǎo)入AFAP1-AS1的干擾載體，可顯著抑制AFAP1-AS1在鼻 咽癌細(xì)胞中的表達(dá)
[0031] 在鼻咽癌細(xì)胞系5-8F、HKl和HNE2中導(dǎo)入靶向AFAP1-AS1的干擾載體（sh-1， sh-2, sh-3)后，實時熒光定量PCR方法檢測了鼻咽癌細(xì)胞中AFAP1-AS1的表達(dá)情況， AFAP1-AS1的表達(dá)均受到明顯的抑制。陰性對照（NC)為scramble干擾載體，Mock為未經(jīng) 任何處理的鼻咽癌細(xì)胞。
[0032] 圖5為在鼻咽癌細(xì)胞中導(dǎo)入AFAP1-AS1的干擾載體抑制AFAP1-AS1表達(dá)后，細(xì)胞 侵襲能力降低
[0033] 細(xì)胞穿膜（transwell)實驗證實，在鼻咽癌細(xì)胞系5-8F、HKl和HNE2中轉(zhuǎn)入靶向 AFAP1-AS1的干擾載體，抑制AFAP1-AS1的表達(dá)后，能穿過基質(zhì)膠膜的鼻咽癌細(xì)胞數(shù)目顯著 減少，表明細(xì)胞侵襲能力降低。
[0034] 圖6為在鼻咽癌細(xì)胞中導(dǎo)入AFAP1-AS1的干擾載體抑制AFAP1-AS1表達(dá)后，細(xì)胞 迀移能力降低
[0035] 細(xì)胞劃痕實驗證實，在鼻咽癌細(xì)胞系5-8F、HKl和HNE2中轉(zhuǎn)入靶向AFAP1-AS1的 干擾載體，抑制AFAP1-AS1的表達(dá)后，鼻咽癌細(xì)胞從劃痕兩邊往劃痕中央迀移速度明顯減 慢，劃痕愈合的時間延長，表明細(xì)胞運動迀移能力降低。
[0036] 圖7.動物實驗進(jìn)一步證實干擾AFAP1-AS1的表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力
[0037] 在鼻咽癌細(xì)胞5-8F中轉(zhuǎn)入shRNA干擾載體抑制AFAP1-AS1表達(dá)后，經(jīng)尾靜脈 將鼻咽癌細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)，觀察肺轉(zhuǎn)移情況，發(fā)現(xiàn)與對照組（NC)相比，shRNA敲低 AFAP1-AS1表達(dá)的5-8F細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目變少（圖7A-C，P〈0. 05)，轉(zhuǎn)移灶的體積變小 (圖7D)，表明鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力受到明顯抑制。
【具體實施方式】
[0038] 以下結(jié)合【具體實施方式】進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0039] 實施例1，實時熒光定量PCR法檢測證實AFAP1-AS1在鼻咽癌中表達(dá)上調(diào)
[0040] 1.材料與方法：
[0041] 收集10例正常鼻咽上皮組織和31例鼻咽癌組織，抽提總RNA，2 μ g RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄 成cDNA后，進(jìn)行實時熒光定量PCR。AFAP-ASl正向引物為5' -AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3' 如 SEQ N0:8 所示，和反向引物 5' -CACACAGGGGAATGAAGAGG-3' 如 SEQ N0:9 所示。
[0042] 用于對照的 GAPDH 正向引物為 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'如 SEQ NO: 10 所示， 和反向引物 5' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，如 SEQ N0:11 所示。
[0043] 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系
[0044] SYBR? Prcmix Ex Taq1 v, (2x) 1 ΟμΙ PCR Forward Primer ( 1 Ομη?) 0.4μΙ PCR Reverse Primer ( ΙΟμητ) 0.4μ1 cDNA 模板 2.0μ1 dH20 7·2μΙ Total 20μ1
[0045] 實時熒光定量PCR反應(yīng)步驟
[0046] 1 94 C 5 min 2 951C IOsec 3 5