專利名稱：白蛋白純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白純化領(lǐng)域，特別是對人血白蛋白的純化。本發(fā)明使用了一系列層析步驟，可適用于大規(guī)模操作的有效純化。
背景技術(shù)：
人血清白蛋白(HSA)是人血中最豐富的蛋白質(zhì)，其作用為維持滲透壓，結(jié)合并運輸營養(yǎng)物和代謝物，HSA有很大的藥用和科研價值。例如作為藥物治療因白蛋白損失、合成和失血造成的白蛋白含量下降引起的低蛋白血癥。最早獲得白蛋白的方法是從血液中純化。然而這一方法存在一些問題，例如血源的缺乏，不經(jīng)濟，以及受乙肝病毒、AIDS病毒等物質(zhì)的污染的可能。為避免這些問題，另一基于重組DNA技術(shù)方法生產(chǎn)重組人血清白蛋白(rHSA)的多種方法最近已經(jīng)得到了開發(fā)。即使為數(shù)不少的重組方法可以使用，但從發(fā)酵液中提純rHSA仍是至關(guān)緊要的且隨時有待提高的步驟。
EP 0 612 761公開了一種生產(chǎn)高純度重組人血清白蛋白的方法，其產(chǎn)品中不含自由的非抗原性雜質(zhì)。這一方法在特定環(huán)境下運用了疏水層析色譜(HIC)及其它步驟如離子交換色譜，硼酸或硼酸鹽處理，超濾及加熱處理。然而，這一方法因步驟多而變得太復(fù)雜，從而難于滿足大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟要求。
EP 0 570 916也公開了用基因操作技術(shù)生產(chǎn)rHSA的方法，該方法包括超濾發(fā)酵液上清、加熱處理、酸處理和再次超濾，隨后使用陽離子交換、疏水層析和陰離子交換以及鹽析等一系列步驟。然而，與上述專利存在相似的問題，純化過程太復(fù)雜，因周期長成本高而不能成為大規(guī)模生產(chǎn)的有效方法。
EP 0 699 687公開的rHSA純化方法為加熱細(xì)胞培養(yǎng)液以滅活蛋白酶，再經(jīng)陽離子交換微粒的流化床處理，洗脫液再經(jīng)超濾、HIC和陰離子交換層析而得到純rHSA。然而，流化床對設(shè)備的要求與常規(guī)裝填的層析設(shè)備不同，因而，仍需更經(jīng)濟有效的方法從發(fā)酵液純化rHSA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種適合于大規(guī)模操作的重組人白蛋白的純化方法，這可通過以下步驟達(dá)到含rHSA的發(fā)酵液上清經(jīng)(a)具雙重功能的耐高鹽材料為基質(zhì)的陽離子交換層析；(b)疏水層析(HIC)；(c)陰離子交換層析。
本發(fā)明方法步驟比前述討論方法的步驟少。另外，用于(a)步的雙重功能的高鹽耐受型陽離子交換介質(zhì)可允許發(fā)酵液上清不經(jīng)稀釋直接上樣，這一優(yōu)點因可有效減少上樣液總體積從而比前述方法相比成本低。
本發(fā)明的另一目的是提高rHSA純化層析過程的吸附量，可由前述步驟(a)使用的陽離子交換介質(zhì)完成，這種介質(zhì)含有高鹽型配基(HSL)，此配基具有一定的雙重性質(zhì)，它至少包含了與目的物作用的兩個位點，一個提供電荷相互作用，一個提供基于氫鍵和/或疏水的相互作用。
本發(fā)明另一個目的是進(jìn)一步降低終產(chǎn)品的色素含量，以便進(jìn)一步提高終產(chǎn)品純度。這一目的可由前述方法中使用弱陰離子交換介質(zhì)來實現(xiàn)。
本發(fā)明內(nèi)容之一是從一種從溶液純化重組人血白蛋白(rHSA)的方法，該方法包括將發(fā)酵液上清中所含的重組人血白蛋白通過層析步驟(a)在具雙重功能的高鹽介質(zhì)上的陽離子交換；(b)疏水層析(HIC)；和(c)陰離子交換。
本發(fā)明的一個具體的例子當(dāng)進(jìn)行步驟(a)時，發(fā)酵液上清電導(dǎo)高于10mS/cm優(yōu)化為20，例25-50mS/cm，多數(shù)情況在25-30mS/cm之間，因為所用的特殊陽離子交換劑含有高鹽(HSL)配基，這完全是可行的。因此，本發(fā)明一個最重要的優(yōu)勢就在于它避免發(fā)酵液上清的稀釋，與前述rHSA純化方法相比，陽離子交換一步上樣量大大減小了。
發(fā)酵液上清可以是各種類型不含菌體的發(fā)酵液，比如可通過離心去除菌體。因而，本發(fā)明方法適用于產(chǎn)生rHSA的任何宿主，例如，微生物細(xì)胞、大腸系統(tǒng)如大腸桿菌、酵母系統(tǒng)如啤酒酵母和畢氏酵母等或動物細(xì)胞系。對于畢氏酵母宿主細(xì)胞效果更好。制備重組宿主細(xì)胞的方法及表達(dá)象rHSA這樣的蛋白的條件已眾所周知，例上述EP0612 761即是涉及該領(lǐng)域的多個專利之一。
步驟(a)的主要目的是消除小分子有色物質(zhì)如帶負(fù)電的雜質(zhì)等。因此，(a)步驟使用了陽離子交換劑，其配基為高鹽型配基(HSL)，這里，“高鹽”是指前文提到的高鹽濃度下的耐受性，這是這類離子交換劑的特性。這一特性是由配基的性質(zhì)決定的，這種特殊配基具有雙重功能，即每個配基含有2種與被分離物(這里指rHSA)相互作用的位點。主要結(jié)合方式是由帶電結(jié)合基團提供的，例如離子交換基團提供，因而這種高鹽類型的介質(zhì)仍歸為離子類型。次要結(jié)合方式是與被分離物質(zhì)間的其它作用，通常，該結(jié)合基團提供氫鍵或疏水相互作用，但其他作用也有，下文會具體談到這些作用。在本文，要注意“bimodal”這一術(shù)語的意義是指涉及2種或2種以上結(jié)合方式，故不僅限定于2種結(jié)合方式。在本應(yīng)用中，陽離子交換劑HSL型被使用，且這種陽離子交換劑已在PCT/EP01/08203詳細(xì)披露，見PCT/EP01/08203(Amersham Pharmacia BiotechAB)。盡管如此，下文仍然對其做一綜述。
陽性高鹽配基(HSL)上的帶電的結(jié)合基團可以從含有如下基團如磺酸(-SO3-/-SO3-H)、硫酸(-OSO3-/-OSO3H)、羧酸(-COO-/-COOH)、磷酸(-OPO32-/-OPO3H-/-OPO3H2)及膦酸(-PO32-/-PO3-H/-PO3H2)的基團中選擇?？蓛?yōu)選的HSL型陽離子交換劑是弱陽離子交換劑，如pKa大于3的陽離子交換劑。另外可選的情況是pka＜3的強陽離子交換介質(zhì)。弱陽離子交換劑典型的例子是羧酸(-COO-/-COOH)、磷酸(-OPO32-/-OPO3H-/-OPO3H2)和膦酸(-PO32-/-PO3H-/-OPO3H2)。
次要結(jié)合基團至少含有一個氫鍵作用原子，并且該原子相距陽離子交換基團有1-7個原子的距離。氫鍵原子是能夠參與形成氫鍵的原子(H原子除外)見Karger et al.，An Introduction into Separation Science，John Wiley&Sons(1973)42頁。氫鍵原子可以從含雜原子的基團中選擇，如氧原子(羰基氧原子、醚氧原子、酯氧原子、羥基氧原子、磺酸基氧原子、磺胺氫原子、亞砜氧原子、芳環(huán)上的氧原子等)，氮原子(氨基氮原子，芳環(huán)氮原子等)，硫原子(硫醚硫原子，芳環(huán)硫原子等)；及sp和sp2-雜化碳原子；和鹵族基團，如F、Cl、Br、I，特別是F。典型次要結(jié)合基團含有不帶電荷的原子或隨pH變化可帶電荷的原子。
步驟(a)中使用的陽離子交換配基的穩(wěn)定性，通常認(rèn)定為可以耐受0.1或1mol/L NaOH水溶液至少40小時。本方法步驟(a)所用陽離子交換劑適用的化學(xué)配基結(jié)構(gòu)示例見PCT/EP01/08203。本方法的特殊應(yīng)用在步驟(a)使用了如圖1A所示的高鹽型基的陽離子交換配基。
本方法步驟(a)中的陽離子交換劑的功能如下(a)在相當(dāng)于0.3MNaCl離子強度的水溶液中，陽離子交換吸附rHSA(b)在上述的離子強度下，對于rHSA的載量突破性地達(dá)到2倍、3倍、5倍甚至10倍于含丙磺?；鶊F的對照陽離子交換劑對應(yīng)情況下的交換量。
PCT/EP01/08203詳述了這種對照離子交換劑。本發(fā)明所使用的陽離子交換劑中陽離子交換配基的濃度通常在1-4000μmol/ml基質(zhì)之間，例2-500μmol/ml基質(zhì)，使用更多的為5-300μmol/ml基質(zhì)?？赡艿募皟?yōu)選的配基范圍取決于基質(zhì)的性質(zhì)、配基的性質(zhì)等。因此，陽離子交換配基的濃度對瓊脂糖基質(zhì)為100-300，葡聚糖基質(zhì)為10-600μmol/ml基質(zhì)。
上文提及的PCT/EP01/08203也對高鹽型陽離子交換劑基質(zhì)材料作了進(jìn)一步的討論。簡單的說，這種基質(zhì)可基于有機或無機材料。較好的是具有親水性的聚合物，并且不溶于水和或多或少在水中可浸潤。在這里疏水性聚合物的定義已被衍生為親水性的。適用的聚合物有多羥基聚合物，例基于多糖的瓊脂糖，葡萄糖，纖維素，淀粉，麥芽糖等，以及全合成聚合物，例聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚(羥烷乙烯醚)，聚(羥烷丙烯酸酯)，和聚甲基丙烯酸酯(如聚甘油甲基丙烯酸酯)，聚乙烯乙醇，和以苯乙烯和二乙烯苯為基礎(chǔ)的聚體和縮聚物(由兩個或更多的上述聚合物的單體形成的物質(zhì))。水溶的聚合物，通過例如交聯(lián)和經(jīng)吸附或共價連接耦合到一種不溶物質(zhì)，從而衍生為不溶性的聚合物，在疏水聚合物(如單烯和二乙烯苯的共聚物)上引入親水基因，可通過含有可轉(zhuǎn)化為-OH基的單體聚合實現(xiàn)，也可通過最終聚合物的親水化實現(xiàn)，例如吸附適當(dāng)?shù)幕衔?，如親水聚合物。舉一個這種基質(zhì)的例子市售可得的球型Sepharose，是瑞典烏普薩拉市安瑪西亞公司生產(chǎn)的以瓊脂糖為基質(zhì)的介質(zhì)，可用做支撐基質(zhì)的無機物如硅膠，氧化鋯，石墨，氧化鉭等。
上文提到的PCT/EP01/08203也進(jìn)一步公開了高鹽型陽離子交換劑制備。而且，Hermanzon，G.T.，Mallia，A.K.&Smith，P.K.，(Eds.)，Immobilisation AffinityLigand Techniqucs，Academic Press，INC，1992綜述了基質(zhì)表面固定配基的方法。
如上所述，高鹽型陽離子交換劑的優(yōu)點之一是與傳統(tǒng)陽離子交換劑，如上文討論的作為參照的丙磺酰陽離子交換劑相比，在較高的離子強度下，有可能通過例如配基對rHSA的結(jié)合被柱吸收。吸附應(yīng)用的離子強度取決于蛋白本身的性質(zhì)和基質(zhì)上配基的類型和濃度。對應(yīng)NaCl在純水中的濃度，使用的離子強度經(jīng)常≥0.1M，如≥0.3M甚至≥0.5M。解析操作時可以如通過增加離子強度或/和改變pH來進(jìn)行。用于改變離子強度的典型的鹽有可溶性銨鹽或磷酸\硫酸的金屬鹽等，特別是堿金屬和/或堿土金屬鹽。同樣的鹽也可用于吸附步驟，但經(jīng)常在較低濃度下使用。
本方法的一個具體應(yīng)用，步驟(a)中使用的陽離子交換劑的數(shù)量為步驟(b)使用HIC介質(zhì)的數(shù)量的一半。因而，與傳統(tǒng)試劑相比的一個優(yōu)點就是具雙重功能的離子交換介質(zhì)非常強的結(jié)合能力，故而可以減小樣品處理量進(jìn)而降低操作成本。在高鹽濃度，如電導(dǎo)25-30mS/cm市售可得的SP Sephrose對rHSA的吸附量約2-4mg/ml膠，而使用高鹽型介質(zhì)(圖1A)，至少可達(dá)50mg/ml，因而，雙功能高鹽配基(HSL)顯然大大簡化并改進(jìn)了純化工藝，從而降低了大規(guī)模操作時的成本。
本方法的一個具體過程包括步驟(a)前對發(fā)酵液上清加熱處理，加熱處理可在宿主細(xì)胞存在時或經(jīng)離心、超濾(離心)或其他合適的方法去掉宿主細(xì)胞后直接進(jìn)行，加熱溫度可達(dá)50-100℃，時間1到幾小時，優(yōu)選60-75℃，20分到3小時，更優(yōu)的為68℃約30min。這一加熱過程可在有溫控的水浴鍋中很方便的完成。另一應(yīng)用，在加熱前，調(diào)pH6.0加入穩(wěn)定劑，例如辛酸鈉，其它穩(wěn)定劑如乙酰色氨酸、有機羧酸等也可以。加熱后，調(diào)低發(fā)酵液上清的pH值如pH4.5以有利于被后續(xù)陽離子交換劑吸附。
本發(fā)明的另一例子，從步驟(a)得到的產(chǎn)品，例如高鹽介質(zhì)的結(jié)合組分，在進(jìn)入步驟(b)前進(jìn)行熱處理。優(yōu)選加入一種還原劑，如半胱氨酸，其他可用的還原劑如巰基乙醇、還原型谷胱甘肽等，其目的有助于在步驟(b)中有色物質(zhì)的去除。這一加熱處理通?？砂辞笆龇椒ㄟM(jìn)行，優(yōu)選低一點的溫度如60℃和較長的加熱時間如60分鐘。
如上所述，步驟(b)使用了疏水作用色譜(HIC)。這一步的主要目的是除去rHSA產(chǎn)品中的蛋白降解物，這些降解物分子量通常在10-50Kda。HIC是眾所周知的色譜技術(shù)，其分離基于蛋白表面疏水性的差異。許多被認(rèn)為是親水性的生物大分子，仍然有足夠多的疏水基團暴露在外面，使其與連接于色譜基質(zhì)的疏水基團相互作用。例如在專利EP0699687中，HIC早被建議用于rHSA的純化。與其他已知的分離原理疏水作用色譜如反相色譜相比，使用的配基濃度低得多。這一特點提高了其選擇性，并且可使用溫和的洗脫條件以助于保持目的蛋白的生物活性。在本文，HIC用于吸附上述的rHSA的降解片段，而全長的rHSA在未結(jié)合部分被洗脫。rHSA與介質(zhì)疏水基團的疏水作用強度可通過小幅度提高所使用的緩沖液的離子強度而得以加強。目前有許多市售可得的HIC介質(zhì)，本發(fā)明不限定任何特定的基質(zhì)和/或配基。總之，步驟(b)所用基質(zhì)可為有機和無機材料，有機材料例如可為天然聚合物如瓊脂糖、葡聚糖、纖維素、淀粉等或合成聚合物，如二乙烯苯、苯乙烯。無機材料中硅膠是眾所周知的廣泛使用的一種。較優(yōu)的基質(zhì)是交聯(lián)瓊脂糖，有多家公司在出售這種基質(zhì)，如安瑪西亞公司(瑞典、烏普薩拉市)出售的SepharoseTM。一個具體例子，步驟(b)所使用的與rHSA有一個或多個作用位點的疏水介質(zhì)，優(yōu)選自含有苯基、丁基、如正丁基、辛基、如正辛基等的基團，優(yōu)選以瓊脂糖為基質(zhì)的，另一方面，以二乙烯苯為基質(zhì)的疏水性配基有醚、異丙基或苯基，如安瑪西亞公司(瑞典、烏普薩拉市)的SourceTM。步驟(b)最尤為應(yīng)用交聯(lián)瓊脂糖連結(jié)苯基配基，介質(zhì)最好為中空微球，其含水量可達(dá)90％以上，最好可到94％左右，濕球的平均粒度例如可在10-150μm之間，優(yōu)選為小于100μm如90μm左右。介質(zhì)的配基濃度例如在20-60之間，例如40μmol/ml膠左右。作為特例，所用介質(zhì)為PhenylSepharose 6FFTM(瑞典烏普薩拉市安瑪西亞公司生產(chǎn))。在這一例中，F(xiàn)ast Flow介質(zhì)的交聯(lián)度被優(yōu)化過，使在1bar壓力下通過15厘米高度的流化床運行時，典型流速達(dá)300-400cm/hr。但是在這一領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員可根據(jù)操作的范圍調(diào)整運行參數(shù)。這步純化可以在pH4-8如6.5-7，鹽濃度0.01-0.5M，優(yōu)化為0.05-0.2之間進(jìn)行。
也如上所述，當(dāng)前方法步驟(c)使用陰離子交換介質(zhì)，優(yōu)化為弱陰離子交換介質(zhì)，去除步驟(b)中痕量的雜質(zhì)，尤其是如小分子片斷類的多余雜質(zhì)。本發(fā)明可以使用任何專一性的陰離子材料，只要它有足夠量的配基，能夠結(jié)合rHSA終產(chǎn)品中多余的負(fù)電荷組份。陰離子層析交換步驟可在例如pH5-8，鹽濃度0.01-0.2M條件下去除雜質(zhì)。至于介質(zhì)的材料，可為有機或無機材料，如同上面討論的那樣。舉一優(yōu)化的例子，介質(zhì)由瓊脂糖交聯(lián)成的中空小球組成，如安瑪西亞公司(瑞典烏普薩拉市)的SepharoseTM產(chǎn)品。所連的配基是弱陰離子交換，配基上的結(jié)合基團例如可為一級和二級胺。這樣的結(jié)合基團可以和最靠近基質(zhì)的醚例如通過烷基鏈連在基質(zhì)上。文獻(xiàn)報道了可通過間臂、分支等多種方式連到基質(zhì)上。如上所述，本發(fā)明不受任何特別結(jié)構(gòu)的限制。具體的示例有-O-CH2CH2-N+(C2H5)2H配基的瓊脂糖，如來自于安瑪西亞公司的DEAESepharoseTM可以使用，在具體使用中層析柱的結(jié)合和未結(jié)合部分均有rHSA，DEAE在某些方面的使用中，還是令人滿意的。然而一種使終產(chǎn)品更純的例子是包含兩個酯基，最優(yōu)的還有兩個羥基作為配基的瓊脂糖。然后結(jié)合基團最好是伯胺。采用它純化的優(yōu)點在于rHSA只在結(jié)合部分出現(xiàn)，這歸于rHSA能夠與介質(zhì)適度結(jié)合，從而導(dǎo)致更好地提高純度，也便于操作。對后提及示例的通用的分子式說明見圖1，而本發(fā)明中，步驟(c)使用了一種方法，此方法使用結(jié)構(gòu)類似的介質(zhì)，這一點也是可以理解的。
然而，本發(fā)明包括使用與上述相似的介質(zhì)，即建立在一般配基結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上的介質(zhì)，這一點也是可以理解的。在圖1A中“Gel”可被理解任意介質(zhì)，如與步驟(b)相關(guān)的在上述討論提及的。包含上述配基的一個市售可得的例子是ButylSephorose(瑞典烏普薩拉安瑪西亞生物科學(xué)公司)。在下述的實驗中，用到160μmol/ml的配基濃度。因而很顯然優(yōu)化基質(zhì)的配基濃度可獲得極好的結(jié)果。當(dāng)使用最先提到的陰離子介質(zhì)如DEAE，接峰體積大約是最后提及的BUTYL介質(zhì)的3倍。因而當(dāng)前方法優(yōu)選使用仲胺作為步驟(c)陰離子交換基團，配基濃度至少約為100μmol/ml。
具體體現(xiàn)，陰離子配基濃度在50-300范圍內(nèi)，如50-200優(yōu)選大約在160μmol/ml。優(yōu)點是在步驟(c)中純rHSA可以在結(jié)合部分分離出來。而DEAE在結(jié)合與未結(jié)合部分均存在純rHSA。
由于這三步純化建立在間歇洗脫基礎(chǔ)上，因此適于大規(guī)模操作，在步驟(c)中使用了高配基的butylSepharose，能夠有效去除未結(jié)合部分的小分子雜質(zhì)，同時也比用DEAE型的介質(zhì)能更好地降低A350/A280的比值。


圖1A-D表明了適用于不同層析步驟(即陽離子交換、疏水相互作用、陰離子交換)可能的基質(zhì)物質(zhì)。更為具體的，圖1A表明了高鹽陽離子配基(HSL)類型，圖1B表明基質(zhì)名為Phenyl Sepharose的層析介質(zhì)的疏水作用，圖1C和1D表明了兩種可供選擇的陰離子交換介質(zhì)一即市售可得的DEAE Sepharose的結(jié)構(gòu)(圖1C當(dāng)n＝0時)和修飾過的Butyl Sepharose，該介質(zhì)的配基濃度提高了。以下會有描述。
圖2表明的是本發(fā)明步驟(a)使用了未稀釋的發(fā)酵液上清所得到的陽離子交換層析結(jié)果，2B組分含有rHSA，如在陽離子交換柱上，未經(jīng)稀釋的147ml發(fā)酵上清液進(jìn)入20ml的柱子內(nèi)，該介質(zhì)的配基結(jié)構(gòu)在圖1A已提及。峰2B包含著rHSA，可以與代表著雜質(zhì)部分的峰2A明顯分離開。
圖3表明圖2中組分2B在疏水層析的結(jié)果，其中rHSA在組分3A中被洗脫出來。具體為圖2的2B部分在此通過40Phenyl Sepharose柱由疏水作用進(jìn)行分離，圖中的A部分是目標(biāo)峰。其中疏水介質(zhì)的結(jié)構(gòu)在圖1B中已闡述。
圖4表明圖3中組分3A在陰離子交換層析中結(jié)果。純rHSA在組分4B中。例如陰離子交換具體為圖3中的峰3A部分進(jìn)入40ml的修飾過的如以下實驗部分所述的BUTYL Sepharose柱進(jìn)行分離，純rHSA分布在峰4B部分。
圖5為使用本發(fā)明三步純化所得主要組分的電泳分析，即Native(8％～25％)和SDS-PAGE(10～15％)電泳分析結(jié)果。所展示的Native電泳，每個點上樣量大約3.3ug蛋白，采用銀染。而SDS-PAGE電泳，有一塊每個點上樣量約為2ug，銀染；另一塊每個點上樣量約為10ug，考瑪斯亮藍(lán)染色。樣品順序為1發(fā)酵上清2高鹽陽離子未結(jié)合部分3高鹽陽離子的結(jié)合部分4疏水未結(jié)合5疏水結(jié)合6修飾BUTYL柱未結(jié)合7修飾BUTYL柱結(jié)合8作為參照的血源白蛋白箭頭指示rHSA位置。
實施例下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
材料和方法
含rHSA的發(fā)酵液上清由基因構(gòu)建的酵母系統(tǒng)進(jìn)行兩周左右或更長時間的發(fā)酵，然后過濾所得。綠色的發(fā)酵上清分裝成200ml一份，冷凍儲存在-20℃待用。發(fā)酵液上清質(zhì)量通過凝膠過濾柱SuperdexTM200 HR 10/30(瑞典烏普薩拉安瑪西亞公司生產(chǎn))進(jìn)行檢測，分析結(jié)果顯示了發(fā)酵液上清中的高分子和低分子雜質(zhì)以及相應(yīng)的白蛋白單體的相對量。
辛酸鈉(八碳酸鈉鹽)和L-半胱氨酸由Sigma化學(xué)公司購進(jìn)。色譜純的血源白蛋白是瑞典烏普薩拉安瑪西亞公司的血液品制備室I.Andersson贊助提供。各種樣品的蛋白濃度用Bio-Rad蛋白分析儀(也稱Bradford方法)測定，用牛血清白蛋白(BSA)建立曲線標(biāo)準(zhǔn)。紫外吸收值用日本島津公司UV-160A。其他所有化學(xué)品均為分析或試劑級。
電泳分析用快速電泳系統(tǒng)和適當(dāng)?shù)碾娪灸z和膠條(均由瑞典烏普薩拉安瑪西亞公司提供)。電泳分析按照生產(chǎn)廠家的建議，Native-PAGE使用8-25％的梯度膠，SDS-PAGE(非還原)使用10-15％的梯度膠。每個點的上樣量為Native電泳每個點上樣量約3.3ug蛋白，采用銀染；SDS-PAGE電泳，有一塊每個點上樣量約為2ug，也采用銀染。SDS處理的另一塊每個點上樣量約為10ug，采用考瑪斯亮藍(lán)染色(CBB)。
質(zhì)譜分析(目的在于確定純rHSA和血源HSA的分子量)由瑞典烏普薩拉安瑪西亞公司的J.Flensburg博士用MALDI-TOF儀器進(jìn)行。天然和重組白蛋白的胰酶裂解肽圖也是用該儀器。從后面的分析結(jié)果確定重組白蛋白的最可能一級序列，并和已知的由純血源白蛋白產(chǎn)生的胰酶的肽圖進(jìn)行比較。
介質(zhì)和層析系統(tǒng)層析分離實驗用AKTATMExplore 100系統(tǒng)通過UNICORETM(3.1版本)軟件控制，在室溫約23℃下進(jìn)行(由瑞典烏普薩拉安瑪西亞公司提供)。步驟(b)使用的分離介質(zhì)是Phenyl SepharoseTM6 Fast Flow(高取代)，是瑞典烏普薩拉安瑪西亞公司的正規(guī)產(chǎn)品。步驟(c)，使用市售可得的DEAE SepharoseTMFast Flow或在Butyl SepharoseTM6 Fast Flow基礎(chǔ)上改進(jìn)的介質(zhì)，該介質(zhì)與商業(yè)化產(chǎn)品配基濃度20-40μmol/ml膠相比有較高的配基濃度(批號為U238025配基濃度為160μmol/ml)，此改進(jìn)的介質(zhì)稱之為“改進(jìn)Butyl Sepharose”。而且步驟(a)使用了高鹽型陽離子phototype交換介質(zhì)，見圖1A。介質(zhì)在20％乙醇中的稠狀懸浮液裝入XK26/20的玻璃柱內(nèi)，柱床體積40ml。使用300cm/h的線性流速，以2倍柱床體積的去離子水沖洗大部分乙醇，然后在上樣之前用合適的緩沖液平衡。每步層析所需緩沖液的總量隨介質(zhì)不同而變化，見下面的表1。
緩沖液緩沖液A25mM的醋酸鈉，pH4.5配制25ml的1M的醋酸鈉與40ml的1M的醋酸混合，用去離子水稀釋至1L。室溫下電導(dǎo)約為2mS/cm(室溫RT表示)。
緩沖液B50mM磷酸鈉，0.1M氯化鈉，10mM的辛酸鈉，pH7.0配制155ml的0.2M磷酸氫二鈉和95ml的0.2M磷酸二氫鈉混合，加入5.8g的氯化鈉及1.66g的辛酸鈉，用去離子水稀釋至1L。室溫下電導(dǎo)約為16mS/cm。
緩沖液C50mM磷酸鈉，0.1M氯化鈉，pH6.0。
配制212ml的0.2M磷酸二氫鈉和38ml的0.2M磷酸氫二鈉混合，加入5.8g的氯化鈉，用去離子水稀釋至1L。室溫下電導(dǎo)約為14mS/cm。
緩沖液D50mM磷酸鈉，0.2M氯化鈉，pH6.0配制212ml的0.2M磷酸二氫鈉和38mL的0.2M磷酸氫二鈉混合，加入11.7g的氯化鈉，用去離子水稀釋至1L。室溫下電導(dǎo)約為22mS/cm。
溶液E在位清洗溶液30％異丙醇溶于1M氫氧化鈉中。
本發(fā)明對每種介質(zhì)優(yōu)化后的條件匯總?cè)绫?。本領(lǐng)域的技術(shù)人員按上述步驟可很容易地進(jìn)行中試或大規(guī)模生產(chǎn)的操作。
表1每一層析步驟所需的平衡、洗脫、再生溶液的體積/柱體積

*表示去離子水**表示2M的氯化鈉實施例1對發(fā)酵液上清熱處理在進(jìn)行陽離子層析前，首先需要加熱發(fā)酵上清液以滅活在P.pastoris.發(fā)酵過程產(chǎn)生的蛋白酶。過程如下解凍發(fā)酵液上清，加入10mM辛酸鈉溶解，pH調(diào)至6.0，水浴加熱30分鐘(水浴溫度用熱電藕恒溫控制在68℃)。樣品冷卻到室溫，調(diào)pH至4.5。
如果步驟(a)使用傳統(tǒng)的陽離子交換介質(zhì)如SP Sepharose BB，則要根據(jù)樣品的電導(dǎo)將樣品用去離子水稀釋2-8倍，使樣品電導(dǎo)處于5-10mS/cm之間。(相當(dāng)于0.1M的鹽濃度)。
然而，本發(fā)明的高鹽型介質(zhì)對高鹽樣品具有更高的耐受性，只要電導(dǎo)低于30mS/cm，樣品無需稀釋可直接用于步驟(a)中.
由步驟(a)得到部分純化的rHSA(如高鹽型介質(zhì)的結(jié)合部分)，在進(jìn)入步驟(b)之前仍然需要如下的熱處理即用1M氫氧化鈉將樣品的pH調(diào)至6.0，加入半胱氨酸至5mM作為還原劑。樣品在60℃水浴加熱60分鐘。這樣處理的目的是便于通過疏水層析去除色素雜質(zhì)。
實施例2步驟(a)使用陽離子交換介質(zhì)捕獲樣品陽離子交換介質(zhì)裝入XK16/20的柱內(nèi)(柱床體積20ml)，用2倍柱床體積緩沖液A平衡。加熱處理過的樣品用150ml的SuperloopTM(由瑞典烏普薩拉安瑪西亞公司生產(chǎn))以300ml/h流速進(jìn)入柱內(nèi)。上樣總量約1g(如50mg rHSA/ml膠)。上樣結(jié)束用3倍柱床體積的緩沖液A洗脫未結(jié)合部分，然后用5倍柱床體積的緩沖液B洗脫。這兩部分分別收取，結(jié)合部分用1M/L氫氧化鈉將樣品的pH調(diào)至6.0，如上述進(jìn)行加熱，冷卻到室溫，通過疏水柱根據(jù)下述方法進(jìn)一步純化。所收集的每一部分均留1ml的分析小樣(如檢測蛋白濃度，A350/A280值和電泳分析)再生處理使用后的柱子通入2倍柱床體積的的溶液E以便清洗結(jié)合更為牢固的物質(zhì)以恢復(fù)介質(zhì)的功能。介質(zhì)可以在該溶液中過夜，然后用4倍柱床體積的去離子水洗去大部分氫氧化鈉和異丙醇。再生后的柱子在下一次進(jìn)行吸附/解吸過程前用4倍柱床體積的緩沖液A平衡。
實施例3步驟(b)利用疏水層析純化步驟將上步得到的包含了rHSA的部分液體注入到150ml SuperloopTM中，然后進(jìn)入柱床體積40ml填充了pheylSepharoseTMFast Flow(高取代)的XK26/20疏水柱進(jìn)行分離。該柱使用前需用3倍柱體積的緩沖液C平衡，上樣結(jié)束后，用2倍柱體積的緩沖液C洗滌，來洗脫含有了rHSA的部分，結(jié)合部分(主要含有rHSA降解產(chǎn)生的45Kda的雜蛋白)通入2倍柱體積的去離子水沈脫下來。
再生處理與實施例2相同。
實施例4步驟(c)使用弱陰離子交換介質(zhì)精制樣品疏水分離的兩部分分別收集后，各留1ml小樣做各種分析(如上所述)。用DEAE SepharoseTMFast Flow或上述提到的改進(jìn)的Butyl SepharoseTM6 FastFlow介質(zhì)裝一根40ml的XK26/20柱。用2倍柱體積的去離子水洗滌柱子然后用5倍柱體積的緩沖液C平衡，疏水分離的未結(jié)合部分注入到150ml SuperloopTM中然后進(jìn)入兩根柱之一進(jìn)行分離。對DEAE柱未結(jié)合部分需用6倍柱體積緩沖液C洗滌，結(jié)合部分用2倍柱體積的2M氯化鈉洗脫，對改進(jìn)的Butyl柱未結(jié)合部分需用2倍柱體積緩沖液C洗滌，結(jié)合部分需用5倍柱體積的緩沖液D洗脫。流速始終保持在90cm/h。
再生處理與實施例2相同。
權(quán)利要求
1.一種純化人重組白蛋白(rHSA)的方法，該方法包括將含rHSA的發(fā)酵液上清經(jīng)以下層析步驟(a)基于雙重功能的可耐受高鹽型的陽離子交換；(b)疏水層析(HIC)；和(c)陰離子交換。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中應(yīng)用于步驟(a)的上柱發(fā)酵液上清的電導(dǎo)高于10mS/cm，優(yōu)化為高于20mS/cm，如25-50mS/cm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所涉及的雙功能的陽離子交換介質(zhì)是通過電荷作用和氫鍵和/或者疏水作用與rHSA相互作用。
4.根據(jù)前面任一權(quán)利要求所述的方法，其中在進(jìn)入步驟(a)前的發(fā)酵液上清進(jìn)行熱處理。
5.根據(jù)前面任一權(quán)利要求所述的方法，其中也包括步驟(b)前的在還原劑存在下對樣品進(jìn)行熱處理。
6.根據(jù)前面任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟(b)所使用的含有苯基、脂肪族和/或雜環(huán)為配基的疏水層析介質(zhì)。
7.根據(jù)前面任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟(a)所使用陽離子交換介質(zhì)的量是步驟(b)疏水介質(zhì)的使用量的一半。
8.根據(jù)前面任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟(c)是弱陰離子交換。
9.根據(jù)前面任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟(c)弱陰離子交換介質(zhì)的配基濃度每毫升膠大于50μmol/ml，更優(yōu)大于100μmol/ml，最優(yōu)為160μmol/ml。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中純rHSA只能從步驟(c)的結(jié)合部分得到。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種純化重組白蛋白(rHSA)的方法，該方法包括將含rHSA的發(fā)酵液上清經(jīng)以下層析步驟(a)基于雙重功能的可耐受高鹽型的陽離子交換；(b)疏水層析(HIC)；和(c)陰離子交換。進(jìn)行純化。具有雙重功能的耐高鹽陽離子介質(zhì)能夠使發(fā)酵液無需稀釋直接上柱進(jìn)行純化，由于它的高載量使其使用量與對應(yīng)情況下所使用的傳統(tǒng)陽離子介質(zhì)相比要少。因而，本發(fā)明節(jié)約了介質(zhì)體積和上樣體積，降低了操作成本。
文檔編號C07K14/765GK1496993SQ0312350
公開日2004年5月19日 申請日期2003年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月15日
發(fā)明者貝洛·麥考恩, 李梅彥, 張煒, 貝洛 麥考恩 申請人:華北制藥集團有限責(zé)任公司, 安瑪西亞公司