專利名稱：重組人ctla4胞外區(qū)蛋白的制備方法及其所得產(chǎn)品和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及使用高表達(dá)酵母工程菌株生產(chǎn)CTLA4胞外區(qū)蛋白的生產(chǎn)方法，其中該工程菌株含有如序列1所示基因片段；以及上述基因工程方法所生產(chǎn)的CTLA4胞外區(qū)蛋白及其在制備用于治療某些與T細(xì)胞過度活化有關(guān)的疾病的藥物中的用途。
但是，迄今，未發(fā)現(xiàn)將該片段作為基因工程藥品來開發(fā)。事實(shí)上，國外某些公司出于其它原因，有將此片段與部分IgG融合進(jìn)行藥物開發(fā)計(jì)劃。而且，正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所能理解的，基因工程方法生產(chǎn)藥品較之于傳統(tǒng)方法的優(yōu)越性是顯而易見的。
因此，現(xiàn)有技術(shù)中迫切需要一種可長期穩(wěn)定地生產(chǎn)與天然CTLA4胞外區(qū)具有相同的生物學(xué)活性的重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白的方法，以解決臨床治療因T細(xì)胞過度活化所導(dǎo)致的各種疾病所需的大量CTLA4胞外區(qū)蛋白的技術(shù)問題。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種制備重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白的方法一種制備重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白的方法，其特征在于使用基因工程構(gòu)建的含有SEQ ID No.1的核甘酸的高表達(dá)酵母工程菌株進(jìn)行。
本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供的一種酵母工程菌株，該菌株基因組中整合了多拷貝重組人CTLA4胞外區(qū)cDNA表達(dá)單位。該酵母菌株能表達(dá)重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白，而該重組蛋白的序列如SEQ ID No.2所述。
本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了由上述方法所生產(chǎn)的重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白，其序列如SEQ ID No.2所示且與CTLA4胞外區(qū)具有相同的生物學(xué)功能，即與B7分子結(jié)合的功能，從而對各種因T細(xì)胞過度活化性疾病有治療及預(yù)防作用。
本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供了上述“第二個(gè)方面”的酵母工程菌株在工業(yè)化生產(chǎn)重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白中的用途。
本發(fā)明的第五個(gè)方面，提供了上述“第三個(gè)方面”的重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白在制備用于治療和預(yù)防那些與T細(xì)胞過度活化有關(guān)的疾病的藥物中的用途。
本發(fā)明的第六個(gè)方面，提供了上述“第三個(gè)方面”的重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白在治療和預(yù)防那些與T細(xì)胞過度活化有關(guān)的疾病中的用途。
但是，在以下的“發(fā)明詳述”，尤其是“實(shí)施例”部分的公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
圖2.本發(fā)明的pPIC9K-400表達(dá)載體的構(gòu)建。
圖3.鑒定本發(fā)明的目的蛋白的表達(dá)的Western Blotting的照片。
圖4.本發(fā)明的CTLA4胞外區(qū)蛋白對IL-2刺激的CTLL-2細(xì)胞增殖的抑制作用。
圖5.本發(fā)明的CTLA4胞外區(qū)對混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中細(xì)胞增殖的抑制作用。
圖6.本發(fā)明的CTLA4胞外區(qū)對混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中產(chǎn)生IL-2的影響。
圖7.本發(fā)明的CTLA4胞外區(qū)與商品化CTLA4Ig抑制混合淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的比較。
圖8.本發(fā)明的CTLA4胞外區(qū)對異基因移植心臟、皮膚、腎臟存活期的的影響。
發(fā)明詳述在本說明書的上下文中，除非特別指明，否則本說明書所用的任何技術(shù)術(shù)語具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在本領(lǐng)域中通常理解的含義，而未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法是按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，如金冬雁等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第二版，科學(xué)出版社，北京，1992；吳乃虎等，基因工程原理，科學(xué)出版社，北京，2000；朱厚礎(chǔ)等譯，蛋白質(zhì)純化與鑒定實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，北京，1999；和李育陽主編，基因表達(dá)技術(shù)，科學(xué)出版社，北京，2000所述的進(jìn)行的；或按照供應(yīng)商所建議的操作說明書進(jìn)行的。
本發(fā)明所公開的是如何制備一種可應(yīng)用于臨床的重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白的方法。人CTLA4全長有237個(gè)氨基酸，由信號(hào)肽41個(gè)氨基酸、胞外區(qū)125個(gè)氨基酸、跨膜區(qū)37氨基酸和胞漿區(qū)34個(gè)氨基酸組成，本發(fā)明所涉及的CTLA4胞外區(qū)實(shí)際上是CTLA4胞外區(qū)的一部分，即胞外區(qū)的第1到第124位的共124個(gè)氨基酸的制備。
本發(fā)明提供了一種制備重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白的方法一種制備重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白的方法，其特征在于使用基因工程構(gòu)建的含有SEQID No.1的cDNA的高表達(dá)酵母工程菌株進(jìn)行。
優(yōu)選地，本發(fā)明的方法的特征在于以下步驟1)自人外周血中克隆出人CTLA4胞外區(qū)cDNA，其序列如SEQ ID No.1；2)將該cDNA插入適當(dāng)載體中，構(gòu)建單拷貝表達(dá)載體；3)在2)基礎(chǔ)上構(gòu)建多拷貝表達(dá)載體；4)將所構(gòu)建表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化入酵母菌中，篩選出含目的基因片段的高表達(dá)菌株；5)將陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，表達(dá)目的蛋白；和6)分離出重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白，其序列如SEQ ID No.2所示。
更優(yōu)選地，該方法包括1)自人外周血中克隆出人CTLA4胞外區(qū)cDNA，其序列如SEQ ID No.1；2)將該cDNA插入pIC9質(zhì)粒中，構(gòu)建單拷貝表達(dá)載體；3)在2)基礎(chǔ)上構(gòu)建pIC9K多拷貝表達(dá)載體；4)將所構(gòu)建表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化入GS115酵母菌中，篩選出含目的基因片段的高表達(dá)菌株；5)將陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，表達(dá)目的蛋白；和6)分離出重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白，其序列如SEQ ID No.2。
其中，在獲得了人CTLA4胞外區(qū)cDNA后，可以將其插入到合適的載體中，以便進(jìn)行轉(zhuǎn)化或鑒定。適用于本發(fā)明的載體包括本領(lǐng)域已知的各種載體。例如選用市售的各種載體，可將本發(fā)明所克隆的人CTLA4胞外區(qū)cDNA插入載體的多克隆位點(diǎn)，形成能與酵母基因組發(fā)生重組的整合型表達(dá)載體?！罢闲捅磉_(dá)載體”是指能與宿主酵母菌基因組發(fā)生DNA重組，從而將外源基因表達(dá)單位整合入宿主菌基因組中的載體。合適的整合型載體包括(但不限于)pIC9，pIC9k，pαADH2等。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞優(yōu)選地為巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)GS115，但還可以為大腸桿菌，昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
各種將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞的方法均適于本發(fā)明，這些方法包括(但不限于)電穿孔法、基因槍法、原生質(zhì)體法、溶細(xì)胞酶法及化學(xué)方法等。
將所構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，可根據(jù)相應(yīng)的抗性標(biāo)記基因進(jìn)行篩選，例如在培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素、G418等，從而篩選出高表達(dá)的陽性克隆。
本發(fā)明人通過上述方法篩選出大量的可達(dá)到本發(fā)明的目的的酵母工程菌株。其表達(dá)水平至少為50mg/L培養(yǎng)物，優(yōu)選地為100mg/L培養(yǎng)物，最優(yōu)選地為200mg/L培養(yǎng)物。
本發(fā)明所篩得的酵母工程菌株之一是巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)，其于2002年2月8日保藏于北京中關(guān)村中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC NO.0714。而該酵母表達(dá)水平為100mg/L培養(yǎng)物。
工程菌株的表達(dá)水平篩選出的基因組中整合了多拷貝重組人CTLA4胞外區(qū)表達(dá)單位的酵母菌克隆，可能在適合表達(dá)本重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白的條件下培養(yǎng)該酵母菌株，以表達(dá)目的蛋白。由于本發(fā)明所采用的表達(dá)載體是分泌型載體，所以表達(dá)的重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白被分泌在培養(yǎng)上清中。
在獲得了含有重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白酵母上清后，可應(yīng)用本領(lǐng)域所知的常規(guī)方法進(jìn)行分離純化，從而獲得高純度的重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白。合適的分離方法包括(但不僅限于)蛋白沉淀、離子交換層析、分子層析、親合層析、HPLC等。
本發(fā)明所制備的重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白及工程菌株有以下優(yōu)點(diǎn)表達(dá)水平高，通常情況下達(dá)50-100mg/L培養(yǎng)物，并可達(dá)到200mg/L培養(yǎng)物的表達(dá)水平，且純化的表達(dá)蛋白生物學(xué)活性在抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)等方面明顯強(qiáng)于商品化的同類試劑重組CTLA4Ig(為后者的兩倍以上)。此外，其還具有以下優(yōu)點(diǎn)1)重組人CTLA4胞外區(qū)表達(dá)單位整合入酵母細(xì)胞基因組中，因而可長期穩(wěn)定地表達(dá)目的蛋白重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白。
2)在工程酵母菌株中重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白為誘導(dǎo)表達(dá)，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中是應(yīng)用純甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
3)本發(fā)明所制備的重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白與天然CTLA4胞外區(qū)具有相同的生物學(xué)活性，可用于臨床治療因T細(xì)胞過度活化所導(dǎo)致的各種疾病。
簡而言之，本發(fā)明得到的重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白工程菌株表達(dá)水平高達(dá)200mg/L培養(yǎng)物，且表達(dá)十分穩(wěn)定，并可調(diào)控，且產(chǎn)物具有與天然片段相同的生物學(xué)功能。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了由上述方法所生產(chǎn)的重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白，其序列如SEQ ID No.2所示且與CTLA4胞外區(qū)具有相同的生物學(xué)功能，即與B7分子結(jié)合的功能，從而對各種因T細(xì)胞過度活化性疾病有治療及預(yù)防作用。
另外，本發(fā)明提供了可應(yīng)用于臨床的重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白的藥物組合物，它含有治療有效劑量的重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，合適的載體包括(但不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、甘露醇、乙醇及其組合。
同時(shí)，本發(fā)明提供了上述重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白在制備用于治療和預(yù)防那些與T細(xì)胞過度活化有關(guān)的疾病的藥物中的用途。基于與給藥方式相匹配，本發(fā)明的藥物組合物可制成各種藥物制劑。例如，本發(fā)明的重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白可被制成干粉針劑形式，而通過應(yīng)用生理鹽水、注射用水或含有葡萄糖的注射液等進(jìn)行常規(guī)方法制備；也可制成片劑、膠囊等口服制劑；還可制成噴霧劑、擦劑等應(yīng)用。活性成份的給藥量是有效治療劑量，例如10ug/kg體重。
另外，本發(fā)明還提供了本發(fā)明所篩選的酵母工程菌株在生產(chǎn)重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白中的用途。
最后，本發(fā)明還提供了本發(fā)明所得的重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白在治療和預(yù)防那些與T細(xì)胞過度活化有關(guān)的疾病中的用途。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，或按照廠商所建議的操作說明進(jìn)行。
取正常人外周血5ml，常規(guī)梯度離心分離人單個(gè)核細(xì)胞，用Qigan公司提供的mRNA提取試劑盒提取其中的mRNA，以此為模板，用隨機(jī)引物行RT-PCR，再以此產(chǎn)物為模板，以以下設(shè)計(jì)序列引物有義5’GGCTCGAGAAAAGAATGCATGTGGCACAGCCTGCT (SEQ No.3)反義5’-GCGAATTCTTAGTCAGAATCTGGGCACGGTTCTGG (SEQ No.4)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出400bp的目的片段。
2)在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中加入所制備的不同濃度重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白，發(fā)現(xiàn)它能明顯抑制混合淋巴細(xì)胞中細(xì)胞增殖及IL-2產(chǎn)生(圖5和6)。
3)與商品化同類試劑CTLA4Ig(Chimerigen公司，英國)比較，發(fā)現(xiàn)本工藝所得到的CTLA4胞外區(qū)蛋白對混合淋巴細(xì)胞活化的抑制率比前者高約2倍(圖7)。體內(nèi)作用檢測在大鼠異體/異種皮膚、腎臟、心臟、氣管等移植模型中，加用所制備的不同劑量重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白，發(fā)現(xiàn)它能明顯延長移植的存活，并呈一定的劑量依賴關(guān)系(圖8)。
本說明書中出現(xiàn)的所有文獻(xiàn)都在本申請中全文引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)單獨(dú)引用作為參考的一樣。此外應(yīng)理解，在閱讀完本說明書的上述教導(dǎo)內(nèi)容后，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可對本發(fā)明作各種改進(jìn)和修改，這些等價(jià)形式同樣落于本說明書所附權(quán)利要求書所限定的范圍內(nèi)。
序列表<110>重慶立丹藥業(yè)科技開發(fā)有限公司<120>重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白的制備方法及其所得產(chǎn)品和用途<130>I020058<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>372<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1atgcatgtgg cacagcctgc tgtggtactg gccagcagcc gaggcatcgc cagctttgtg 60tgtgagtatg catctccagg caaagccact gaggtccggg tgacagtgct tcggcaggct120gacagccagg tgactgaagt ctgtgcggca acctacatga tggggaatga gttgaccttc180ctagatgatt ccatctgcac gggcacctcc agtggaaatc aagtgaacct cactatccaa240ggactgaggg ccatggacac gggactctac atctgcaagg tggagctcat gtacccaccg300ccatactacc tgggcatagg caacggaacc cagatttatg taattgatcc agaaccgtgc360ccagattctg at372<210>2<211>124<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile1 5 10 15Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val20 25 30Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
35 40 45Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser50 55 60Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln65 70 75 80Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu85 90 95Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile100 l05 110Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp115 120<210>3<211>35<212>DNA<213>Artificial<400>3ggctcgagaa aagaatgcat gtggcacagc ctgct35<210>4<211>35<212>DNA<213>Artificial<400>4gcgaattctt agtcagaatc tgggcacggt tctgg3權(quán)利要求
1.一種制備重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白的方法，其特征在于使用基因工程構(gòu)建的含有SEQ ID No.1所示的核苷酸的高表達(dá)酵母工程菌株進(jìn)行。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于以下步驟1)自人外周血中克隆出人CTLA4胞外區(qū)cDNA，其序列如SEQ ID No.1；2)將該cDNA插入適當(dāng)載體中，構(gòu)建單拷貝表達(dá)載體；3)在2)基礎(chǔ)上構(gòu)建多拷貝表達(dá)載體；4)將所構(gòu)建表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化入酵母菌中，篩選出含目的基因片段的高表達(dá)菌株；5)將陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，表達(dá)目的蛋白；和6)分離出重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白，其序列如SEQ ID No.2所示。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于將所說的cDNA插入pIC9質(zhì)粒中，構(gòu)建單拷貝表達(dá)載體。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于其中所構(gòu)建的多拷貝表達(dá)載體是pIC9K多拷貝表達(dá)載體。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于其中作為宿主細(xì)胞的酵母是GS115酵母菌。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于其中的高表達(dá)菌株是巴斯德畢赤酵母工程菌株，其于2002年2月8日保藏于北京中關(guān)村中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，具有保藏號(hào)CGMCC NO.0714。
7.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于其中的酵母工程菌株的表達(dá)是誘導(dǎo)表達(dá)。
8.權(quán)利要求7的方法，其特征在于其中誘導(dǎo)表達(dá)是用甲醇進(jìn)行的。
9.一種表達(dá)載體，它含有SEQ ID No.1所示的核甘酸序列。
10.一種基因工程酵母菌株，它含有權(quán)利要求9的表達(dá)載體。
11.權(quán)利要求10的工程酵母菌株，其是巴斯德畢赤酵母，其于2002年2月8日保藏于北京中關(guān)村中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，具有保藏號(hào)CGMCC NO.0714。
12.一種重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白，其是由權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的并且其序列如SEQ ID No.2所示。
13.一種藥物組合物，含有權(quán)利要求12的重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白以及藥用載體或賦形劑。
14.權(quán)利要求13的藥物組合物，其用于治療和預(yù)防那些與T細(xì)胞過度活化有關(guān)的疾病。
15.權(quán)利要求10或11的工程酵母菌株在工業(yè)化生產(chǎn)重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白中的用途。
16.權(quán)利要求12的重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白在制備用于治療和預(yù)防那些與T細(xì)胞過度活化有關(guān)的疾病的藥物中的用途。
17.權(quán)利要求12的重組人CTLA4胞外區(qū)蛋白在治療和預(yù)防那些與T細(xì)胞過度活化有關(guān)的疾病中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用高表達(dá)酵母工程菌株生產(chǎn)CTLA4胞外區(qū)蛋白的生產(chǎn)方法，其中該工程菌株含有如序列1所示基因片段；以及上述基因工程方法所生產(chǎn)的CTLA4胞外區(qū)蛋白及其在制備用于治療某些與T細(xì)胞過度活化有關(guān)的疾病的藥物中的用途。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1443850SQ0210703
公開日2003年9月24日 申請日期2002年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月8日
發(fā)明者吳軍, 羅高興, 易紹萱, 朱瑾, 陳希煒, 易科亞 申請人:重慶立丹(集團(tuán))藥業(yè)科技開發(fā)有限公司, 重慶西南醫(yī)院