專利名稱：人源化重組噬菌體抗體庫方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種用來合成完全人源化噬菌體抗體的新型實(shí)驗(yàn)方法。

背景技術(shù)：
抗體技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)重要階段第一代為多克隆抗體，其特點(diǎn)是用抗原免疫動物而獲得的針對混合抗原的多克隆抗體；第二代是利用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的針對一種抗原決定簇的單克隆抗體。第一、二代抗體技術(shù)為免疫學(xué)的發(fā)展作出了重要貢獻(xiàn)，但由于它們是動物源性抗體，對人有較強(qiáng)的免疫原性，易產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)；此外，雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的單克隆抗體產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本高，穩(wěn)定性和親和力差，抑制了臨床應(yīng)用。于是第三代抗體-基因工程抗體應(yīng)運(yùn)而生。基因工程抗體包括嵌合抗體、改型抗體、全套抗體庫抗體。嵌合抗體是將鼠免疫球蛋白可變區(qū)基因和人免疫球蛋白恒定區(qū)基因重組利用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的人鼠雜合抗體，改型抗體是將鼠可變區(qū)中的互補(bǔ)決定區(qū)基因替代人可變區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)基因而制備的抗體，這兩種經(jīng)改造的抗體與第二代單克隆抗體相比，既保持了原單抗的親和力，又大大減少了免疫原性，但它們?nèi)院惺笤葱曰?，仍有免疫原性，只屬于部分人源化抗體。目前還沒有可表達(dá)完全人源化抗體的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，限制了科研的發(fā)展。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明屬于一種合成完全人源化噬菌體抗體的新型實(shí)驗(yàn)方法，可用于新型抗體的研究。
本發(fā)明所采用的技術(shù)原理，就是用PCR技術(shù)從人類免疫細(xì)胞中擴(kuò)增出整套的抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因，克隆到噬菌體載體上，并以融合蛋白的形式表達(dá)在其外殼蛋白表面。然后利用抗原-抗體特異性結(jié)合而篩選出所需要的抗體，并進(jìn)行克隆性擴(kuò)增，使抗體基因通過宿主以分泌的方式表達(dá)，獲得可溶性抗體片段。
與以往的抗體制備技術(shù)相比，本發(fā)明所采用的技術(shù)省去了傳統(tǒng)單克隆抗體抗制備中的細(xì)胞融合，可不經(jīng)免疫直接利用抗原從抗體庫中篩選特異性抗體，該技術(shù)篩選容量大，篩選能力強(qiáng)，并可直接克隆到抗體基因，使人源化單抗的制備簡單易行，穩(wěn)定有效；此外，噬菌體抗體是片段抗體，完全人源化，并能在原核系統(tǒng)中表達(dá)易于生產(chǎn)，必將替代傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)，是制備單抗的重要手段。
本發(fā)明所采用的技術(shù)路線包括以下過程 (1)從人外周血或脾、淋巴結(jié)等組織中分離B淋巴細(xì)胞，提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA； (2)根據(jù)免疫球蛋白基因序列，設(shè)計(jì)一組數(shù)對帶有簡并序列的抗體重鏈和輕鏈引物，根據(jù)抗體庫的需要PCR技術(shù)擴(kuò)增全套或特定的Ig基因片段； (3)構(gòu)建噬菌體載體，并將克隆的免疫球蛋白基因表達(dá)于載體中，構(gòu)成全套抗體庫，絲狀噬菌體、噬菌粒是常用的載體； (4)經(jīng)過多輪的抗原親合吸附-洗脫-擴(kuò)增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆，然后轉(zhuǎn)化宿主使目標(biāo)抗體表達(dá)； (5)利用免疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)(如酶聯(lián)免疫反應(yīng)技術(shù))，對純化后的抗體進(jìn)行體內(nèi)活性鑒定。
具體實(shí)施例方式 本發(fā)明的檢測方法步驟如下 1、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離和純化 (1)無菌采集目標(biāo)人群靜脈血20ml注入盛有2ml肝素的無菌小瓶中，加蓋晃勻，抗凝。
(2)無菌吸管加入等體積的PBS緩沖液，稀釋血液，提高分離效果。
(3)吸取淋巴細(xì)胞分層液10ml置于50ml錐底離心管中，然后將離心管傾斜45°角，將稀釋后的血液在距分層液界面上1CM處沿試管壁緩慢加至分層液上面，使兩者界面清晰，勿使血液混入分層液內(nèi)。
(4)將離心管置于水平離心機(jī)內(nèi)，在18～20℃下，以2000r/min離心20min。
(5)用毛細(xì)吸管輕輕插入灰白色單個(gè)核細(xì)胞層(位于血漿與分層液交界處)，沿管壁輕輕吸出灰白色的單個(gè)核細(xì)胞，盛入另一離心管。
(6)將得到的單個(gè)核細(xì)胞懸液用5倍體積的RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌2次，分別用2000r/min、1500r/min在室溫下離心10min，可去除大部分血小板。
(7)用完全RPMI-1640培養(yǎng)液定容細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞后調(diào)整至所需濃度。
(8)用2％臺盼藍(lán)染液檢查所分離的細(xì)胞活性2滴細(xì)胞加1滴臺盼藍(lán)染液，3～5min后取樣做濕片高倍鏡檢?；钚詰?yīng)在95％上。
(9)氯化銨去除紅細(xì)胞在沉淀的單個(gè)核細(xì)胞中加入1ml0.83％氯化銨溶液，輕輕搖晃2min即可裂解紅細(xì)胞，洗滌后可去除紅細(xì)胞。
(10)單核細(xì)胞的去除將單個(gè)核細(xì)胞懸液在室溫下1300r/min離心10min，棄上清，用完全RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/ml。將50ml細(xì)胞懸液移至150ml斜頸培養(yǎng)瓶中。在5％CO2溫箱中，37℃及95％濕度下培養(yǎng)1h。將非粘附細(xì)胞吸至離心管中，再用37℃預(yù)溫的RPMI-1640培養(yǎng)液輕輕蕩洗培養(yǎng)瓶，并將洗滌液收集到離心管中，室溫下1300r/min離心10min。棄上清，用10ml完全RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞，用2％臺盼藍(lán)染液檢查細(xì)胞活性。
2、提取總RNA (1)將純化的單個(gè)核細(xì)胞1000r/min離心10min，棄上清，在5×106～1×107細(xì)胞中加入TRIzol試劑1ml，用吸頭混勻細(xì)胞懸液，室溫靜置5min，加入0.2ml氯仿，蓋好EP管(1.5ml)，用手快速搖動15秒，室溫靜置2～3min (2)2～8℃16000r/min離心15min，取上層無水相層(RNA溶于此層中)，約占整個(gè)細(xì)胞勻漿的60％，將其轉(zhuǎn)移至一新的EP管中 (3)加入0.5ml異丙醇，輕搖均勻，室溫靜置10min后，2～8℃16000r/min離心10min，在管壁下底處可見-乳白色小沉淀，即RNA。
(4)棄上清，用75％乙醇1ml洗RNA沉淀一次，再在2～8℃7500r/min離心5min。除去上層乙醇后，于無菌層流臺中風(fēng)干RNA沉淀。但不能使沉淀過于干燥，以免影響RNA的溶解。
(5)用20μl DEPC處理的雙蒸水溶解RNA沉淀，置-80℃的冰箱備用。
3、ScFv基因的合成及抗體庫構(gòu)建 3、cDNA的合成 (1)取純化后的RNA約10μg，放入DEPC處理的EP管，加入4μl(0.5μg/μl)oligodT16，分為2管，至于70℃10min，然后置于冰浴1分鐘。
(2)制備下列混合液體10×PCR緩沖液8μl、25mM MgCl28μl、10mM Dntp41、100mM DTT8μl (3)取14μl上述混合液分別加入上述EP管，離心混勻，室溫放置5min (4)每管加入2μl(200單位)逆轉(zhuǎn)錄酶Super script II RT，42℃60min，然后70℃10min終止反應(yīng)，置冰浴中。加2μlRNAase H于每管中，37℃20min。
(5)反應(yīng)產(chǎn)物置于冰浴或-20℃保存。
4、VH和VL基因的擴(kuò)增和純化 (1)將下列混合物加入到0.5ml EP管中 上游引物(20pmol/μl) 2μl 下游引物(20pmol/μl) 2μl 10×PCR緩沖液5μl 25mM MgCl2 5μl Taq DNA聚合酶0.5μl 20mM dNTP 2.5μl cDNA2μl 加去離子水至50μl (2)每管加入50μl石蠟油，PCR反應(yīng)程序94℃1min；94℃30s，55℃1min，72℃1min 30循環(huán)；72℃5min。
(3)PCR結(jié)束后，從每管中取5μl反應(yīng)產(chǎn)物1.5％的瓊脂糖電泳觀察結(jié)果，VH基因約為400bp，VL基因約為380bp。
(4)PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化用低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳純化或用MicroSpinTM離心純化柱735g離心純化。
5、純化VH和VL基因的定量 (1)取3個(gè)1.5ml EP，分別加入5純化VH、5μl純化VL和2.5μlVH Marker，加TE緩沖液每管調(diào)至6μl。
(2)將6μl混合液用1.5％的瓊脂糖電泳觀察結(jié)果，用凝膠掃描系統(tǒng)對電泳出現(xiàn)的3條380bp左右條帶進(jìn)行分析。
(3)已知2.5μlVH Marker約為12.5ng，根據(jù)掃描結(jié)果3條帶亮度的比值計(jì)算出VH和VL的濃度。
6、linker的擴(kuò)增和純化 (1)將下列混合物加入到0.5ml EP管中 pHEN2質(zhì)粒模板 1μl(約1ng) 上游引物(50pmol/μl)1μl 下游引物(50pmol/μl)1μl 10×PCR緩沖液 5μl 25mM MgCl2 5μl Taq DNA聚合酶酶 0.5μl 20mM dNTP 2.5μl 加去離子水至50μl (2)每管加入50μl石蠟油，PCR反應(yīng)程序94℃3min；94℃30s，40℃1min，72℃1min 30循環(huán)；72℃5min。
(3)PCR結(jié)束后，從每管中取5μl反應(yīng)產(chǎn)物1.5％的瓊脂糖電泳觀察結(jié)果，linker基因片斷約為100bp。
(4)PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化用低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳純化。定量方法同VH和VL基因的定量(同步驟5)。
7、ScFv的連接連接成功的關(guān)鍵在于VH、VL、linker的量要保持適當(dāng)?shù)谋壤?，三者的摩爾?shù)之比應(yīng)為1∶1∶1，質(zhì)量比應(yīng)為4∶4∶1。
(1)將下列混合物加入到0.5ml EP管中 純化的VH1μg 純化的VL1μg 純化的linker0.25ng 10×PCR緩沖液 5μl 25mM MgCl2 5μl Taq DNA聚合酶 0.5μl 20mM dNTP 2.5μl 加去離子水至50μl 上述反應(yīng)體系不加引物，linker與VH的3’端、VL5’端分別存在互補(bǔ)序列，通過PCR三者可自動連接成ScFv。
(2)每管加入50μl石蠟油，PCR反應(yīng)程序94℃5min；94℃1min，60℃4min，72℃2min 25循環(huán)；72℃10min。
(3)PCR反應(yīng)結(jié)束后，每管再加入下列混合反應(yīng)液 上游Sfi I酶切位點(diǎn)引物(50pmol/μl)1μl 下游Not I酶切位點(diǎn)引物(50pmol/μl)1μl 10×PCR緩沖液5μl 25mM MgCl2 5μl Taq DNA聚合酶1μl(5U) 20mM dNTP2.5μl 加去離子水至50μl (4)混合后再次PCR，反應(yīng)程序94℃1min，55℃2mi，72℃2min 30循環(huán)；72℃10min。
(5)PCR結(jié)束后，從每管中取5μl反應(yīng)產(chǎn)物1.5％的瓊脂糖電泳觀察結(jié)果，連接成功的ScFv約為780bp。
(6)用低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳純化或裝有S-400HR樹脂的MicroSpinTM純化柱純化反應(yīng)產(chǎn)物。
(7)ScFv定量方法同VH和VL基因的定量。
8、ScFv的酶切 (1)Sfi I酶切 純化的ScFv產(chǎn)物40μl(400ng) 10×酶切緩沖液8.5μl Sfi I酶(10U/μl) 5μl 加去離子水至85μl 加入石蠟油85μl，于50℃反應(yīng)完畢后，置于室溫，瞬時(shí)離心，將管壁上的液體甩下，然后進(jìn)行Not I酶切。
(2)Not I酶切在上述酶切反應(yīng)體系中加入 3M NaCl 3.6μl 10×酶切緩沖液1.5μl Not I酶(10U/μl) 6μl 加去離子水至15μl 37℃進(jìn)行4小時(shí)酶切反應(yīng)。
(3)將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至另一EP管中，用低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳純化或加入100μl酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)，劇烈振蕩1分鐘，14000g離心2～3分鐘，將上清液用裝有S-400HR樹脂的MicroSpinTM純化柱純化。
(4)純化后酶切產(chǎn)物定量方法同VH和VL基因的定量(見2.3)。
9、TG1細(xì)胞感受態(tài)的制備 (1)從微量培養(yǎng)基平皿中挑選單個(gè)菌落，接種于5ml 2×YT培養(yǎng)基(17g蛋白胨，10g酵母提取物，5gNaCl，加水至1000ml)中。37℃振蕩過夜。
(2)取上述過夜菌1∶100稀釋接種于500ml新鮮的培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD值＝0.5。
(3)將上述帶有菌液的三角瓶置冰浴20分鐘。
(4)4000r/m 4℃離心20分鐘，棄上清，用500ml預(yù)冷無菌的1mol/l Hepes(PH7.0)溶液重懸細(xì)胞。
(5)重復(fù)2.7.4步驟。
(6)4℃離心20分鐘，用10ml含10％甘油的1mol/l Hepes(PH7.0)溶液重懸細(xì)胞。
(7)4000r/m 4℃離心20分鐘，最后用1ml 10％甘油重懸細(xì)胞沉淀。100μl每管分裝細(xì)菌，置于冰浴待用，或立即凍于干冰中，存放于-70℃。
10、ScFv-pCANTAB-5E載體的構(gòu)建和鑒定 (1)將上述純化ScFv和pCANTAB-5E載體進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系 純化ScFv 20μl(150ng) 10×連接緩沖液5μl pCANTAB-5E載體5μl(250ng) T4連接酶 1μl(5U) 加去離子水至50μl 同時(shí)設(shè)一對照管，僅有載體ScFv，無ScFv。在16℃連接1小時(shí)，置于70℃滅活連接酶，乙醇沉淀，用20μl離子水溶解沉淀。
(2)將2.7.7步驟中制備好的感受態(tài)TG1200μl分別加入上述連接反應(yīng)產(chǎn)物中，置于冰浴。取0.2CM的電轉(zhuǎn)化杯一支，將上述混合物沿管壁輕輕加入，避免氣泡產(chǎn)生，置電轉(zhuǎn)化杯于電轉(zhuǎn)化儀中，設(shè)置電轉(zhuǎn)化時(shí)的電壓為2.5Kv，電擊1秒種。加10ml2×YT-G(含2％的葡萄糖)，37℃培養(yǎng)1小時(shí)。
(3)分別將100μl ScFv-pCANTAB-5E載體和載體本身(陰性對照)的100μl轉(zhuǎn)化菌涂到含2×YTAG(含2％葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素)培養(yǎng)基的平皿中，30℃培養(yǎng)過夜。通過計(jì)算菌落而測量庫容量，剩余的細(xì)菌可以直接進(jìn)行下一步輔助噬菌體拯救試驗(yàn)，或加入15％的甘油，分小包裝保存于-70℃。
(4)在2.8.3步驟中的2×YTAG培養(yǎng)皿中隨機(jī)挑選隨機(jī)15個(gè)分隔良好的菌落，加入2ml 2×YTAG，37℃振蕩過夜培養(yǎng)。
(5)將菌液倒入1.5ml的EP管，10000r/m離心5分鐘，棄去上清液，加250μl重懸液，劇烈振蕩，重懸菌體。
(6)加250μl裂解液，上下懸倒4次，放置5分鐘后加10μl堿性磷酸酶，室溫放置5分鐘。加350μl中和液，顛倒混勻4次，室溫12000r/m10分鐘。
(7)小心吸取上清液加入結(jié)合柱中，12000r/ml分鐘棄去廢液。70％乙醇洗一次，TE溶解，-20℃保存。
(8)提取質(zhì)粒的Sfi I/Not I酶切鑒定。
Sfi I酶切 提取的質(zhì)粒 10μl(約400ng) 10×酶切緩沖液 8.5μl Sfi I酶(10U/μl)5μl 加去離子水至85μl 加入石蠟油85μl，于50℃反應(yīng)完畢后，置于室溫，瞬時(shí)離心，將管壁上的液體甩下，然后進(jìn)行Not I酶切。
Not I酶切在上述酶切反應(yīng)體系中加入 3MNaCl3.6μl 10×酶切緩沖液1.5μl Not I酶(10U/μl) 6μl 加去離子水至15μl 37℃進(jìn)行4小時(shí)酶切反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物用1.5％的瓊脂糖電泳觀察結(jié)果，應(yīng)出現(xiàn)兩條帶，其中一條帶為780bp大小。
11、噬菌體抗體庫的構(gòu)建 (1)將100μl 2×YT-G培養(yǎng)液稀釋后的電轉(zhuǎn)化菌加入202×YTAG培養(yǎng)液，30℃過夜培養(yǎng)，至OD600值＝0.5。
(2)加入2×1010輔助噬菌體M13K07，37℃1小時(shí)。4000r/m離心10分鐘，重懸沉淀于200ml 2×YTAK(100μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素，不含葡萄糖)，置于500ml三角瓶中，30℃振蕩過夜培養(yǎng)。
(3)加入1/5體積噬菌體沉淀液(20％PEG8000，2.5M NaCl)，4℃30分鐘，9000r/m離心20分鐘，用2mlPBS重懸沉淀，建立噬菌體抗體庫，4℃保存。
(4)4取1μl上清液1∶10，1∶100，1∶1000連續(xù)稀釋后感染A600＝1的感受態(tài)TG1，室溫放置15min后鋪2×YTAG平板，30℃過夜培養(yǎng)，計(jì)數(shù)菌落數(shù)以計(jì)算抗體庫滴度(菌落數(shù)/ml×稀釋倍數(shù))。
(5)所得噬菌體抗體可根據(jù)抗原的不同使用常用的酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)技術(shù)進(jìn)行率先、純化、檢測。
引物核苷酸序列表
權(quán)利要求
1、人源化重組噬菌體抗體庫方法，其特征在于它采用如下步驟
(1)從人外周血或脾、淋巴結(jié)等組織中分離B淋巴細(xì)胞，提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；
(2)根據(jù)人類免疫球蛋白基因序列，設(shè)計(jì)一組數(shù)對帶有簡并序列的抗體重鏈和輕鏈引物，根據(jù)抗體庫的需要PCR技術(shù)擴(kuò)增全套或特定的Ig基因片段；
(3)構(gòu)建噬菌體載體，并將克隆的Ig基因表達(dá)于載體中，構(gòu)成全套抗體庫，絲狀噬菌體、噬菌粒是常用的載體；
(4)經(jīng)過多輪的抗原親合吸附一洗脫一擴(kuò)增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆，然后轉(zhuǎn)化宿主使目標(biāo)抗體表達(dá)；
(5)利用免疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)(如酶聯(lián)免疫反應(yīng)技術(shù))，對純化后的抗體進(jìn)行體內(nèi)活性鑒定。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述人源化重組噬菌體抗體庫方法，其特征在于該方法采用的引物具有下列堿基序列
VH15’-CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT-3’
VH25’-CAG GTC ACC TTG AAG GAG TCT-3’
VH35’-GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT-3’
VH45’-CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG-3’
VH55’-GAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT-3’
VH65’-CAG GTA CAG CTG CAG CAG TC-3’
VH75’-CAG GTG CAG CTG GTG CAA TCT-3’
CH 5’-GAC CGA TGG GCC CTT GGT GG-3’
VL15’-GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CC-3’
VL25’-GAT GTT GTG ATG ACT CAG TCT CC-3’
VL35’-GAA ATT GTG TTG ACG CAG TCT CC-3’
VL45’-GAC ATC GTG ATG ACC CAG TCT CC-3’
VL55’-GAA ACG ACA CTC ACG CAG TCT CC-3’
VL65’-GAA ATT GTG CTG ACT CAG TCT CC-3’
CL 5’-GAA GAC AGA TGG TGC AGC CAC AGT-3’
Sfi I-VH15’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCT-3’
Sfi I-VH25’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCACCTTGAAGGAGTCT-3’
Sfi I-VH35’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT-3’
Sfi I-VH45’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCG-3’
Sfi I-VH55’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCT-3’
Sfi I-VH65’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTC-3’
Sfi I-VH75’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAATCT-3’
Not I-CL 5’-CAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGT-3’
linker CH5’-TCCACCAAGGGCCCATCGCTCACCTCGAGTGGTGG-3’
linkerVL15’-GGAGACTGGGTCATCTGGATGTCCTGTGCACTACCGCC-3’
linkerVL25’-GGAGACTGAGTCATCACAACATCCTGTGCACTACCGCC-3’
linkerVL35’-GGAGACTGCGTCAACACAATTTCCTGTGCACTACCGCC-3’
linkerVL45’-GGAGACTGGGTCATCACGATGTCCTGTGCACTACCGCC-3’
linkerVL55’-GGAGACTGCGTGAGTGTCGTTTCCTGTGCACTACCGCC-3’
linkerVL65’-GGAGACTGAGTCAGCACAATTTCCTGTGCACTACCGCC-3’
全文摘要
本發(fā)明屬于一種合成完全人源化抗體的人源化噬菌體抗體庫方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)原理，就是用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)從人類免疫細(xì)胞中擴(kuò)增出整套的抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因，克隆到噬菌體載體上，并以融合蛋白的形式表達(dá)在其外殼蛋白表面。然后利用抗原-抗體特異性結(jié)合而篩選出所需要的抗體，并進(jìn)行克隆性擴(kuò)增，使抗體基因通過宿主以分泌的方式表達(dá)，獲得可溶性抗體片段。本發(fā)明所采用的技術(shù)省去了傳統(tǒng)單克隆抗體抗制備中的細(xì)胞融合，可不經(jīng)免疫直接利用抗原從抗體庫中篩選完全人源化的特異性抗體。
文檔編號C40B40/10GK101294308SQ20071011319
公開日2008年10月29日 申請日期2007年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月22日
發(fā)明者明 侯, 冀學(xué)斌, 軍 彭, 張麗萍, 艷 石, 平 秦, 張愛軍, 劉新光 申請人:明 侯, 冀學(xué)斌, 軍 彭