專利名稱：結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的制作方法
結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及可用于人類治療的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體。更具體而言，本發(fā)明涉及與人TNF- ot結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體以及其在治療特征 在于TNF-ot活性的病癥中的用途。發(fā)明背景胂瘤壞死因子cx (TNF-ot )是參與介導(dǎo)休克和多種人類疾病和病 癥的病理生理學(xué)的一種細(xì)胞因子，所述人類疾病和病癥包括膿毒癥、 感染、自身免疫性疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸 炎和其它腸病況、銀屑病、中毒性休克、移植排斥以及移植物抗宿主 病。TNF-oc主要由激活的巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，但在急性炎癥 反應(yīng)過程中也由嗜中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì) 胞產(chǎn)生。由于其在炎癥中的作用，在減輕炎性病癥的癥狀的努力中，TNF-a已作為重要的用于抑制的靶標(biāo)而顯露出來。已追求了多種為了疾病 的臨床治療而抑制TNF-a的方法，特別是包括可溶性TNF-a受體和特 異于TNF-a的抗體的用途。結(jié)構(gòu)域抗體結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)是抗體的最小功能性結(jié)合單元，并且相應(yīng)于抗 體的重鏈可變區(qū)(Vh)或輕鏈可變區(qū)(Vl)。結(jié)構(gòu)域抗體具有約13kDa 的分子量，或小于完整抗體大小的十分之一。與常規(guī)抗體不同，結(jié)構(gòu)域抗體在細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中良 好表達(dá)。它們的小尺寸允許更高的摩爾量/克產(chǎn)物，從而提供了效力/ 毫克劑量的顯著增加。此外，dAb可以用作構(gòu)建部件，以制備治療產(chǎn) 物例如多重耙向性的包含dAb的分子，其中兩個(gè)或更多個(gè)dAb結(jié)合至 兩個(gè)或更多個(gè)不同的分子靶，或者可以將dAb合并入為肺或口服施用 而設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)中。本發(fā)明者現(xiàn)在已設(shè)計(jì)出一種新的包含免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的結(jié) 構(gòu)域抗體構(gòu)建體，所述可變結(jié)構(gòu)域連接至包括有截短的CH1結(jié)構(gòu)域的 恒定區(qū)。推測包含恒定區(qū)有助于延長通常具有短的持續(xù)時(shí)間的dAb的 體內(nèi)半衰期。新世界靈長類免疫球蛋白進(jìn)化上遙遠(yuǎn)的靈長類，例如新世界靈長類，足夠類似于人以具有 類似于人抗體的抗體，從而使得當(dāng)衍生自此類靈長類的抗體被引入人 中時(shí)，宿主不產(chǎn)生抗抗體免疫應(yīng)答。新世界靈長類(廣鼻猴下目 (戶h0^r力//7/))包含至少53個(gè)種，其通常分成2個(gè)科狨科 (^///Mr/ci^e)和懸猴科(CeW&e)。狨科由狨和糈組成。懸 猴科包括松鼠猴、青猴、蜘蛛猴、絨毛猴、懸猴、夜或梟猴和吼猴。先前的研究已表征了表達(dá)的普通狨("http:///Mr/i 乂acc力"s)的免 疫球蛋白重鏈儲(chǔ)庫(von Budingen H-C等人，Characterization of the expressed immunoglobulin IGHV repertoire in the New World marmoset Ca/Z/^Ar/i Immunogenet ics;53: 557—563(2001))。鑒定了6個(gè)IGHV亞群，其顯示了與它們的人IGHV對(duì)應(yīng)物 的高度序列相似性。當(dāng)與互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)相比較時(shí)，構(gòu)架區(qū)是更保 守的，其中最高程度的可變性位于CDR3中。普通狨與人IGHV序列之 間的相似性程度小于舊世界靈長類與人之間的相似性程度。發(fā)明概述第一方面，本發(fā)明提供了與人TNF-a結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含(a)與人TNF-ot結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體(dAb); (b) 經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)序列；(c) 人或靈長類重鏈恒定區(qū)序列，其具有不多于20個(gè)殘基，更優(yōu) 選地不多于IO個(gè)殘基，更加優(yōu)選地不多于5個(gè)殘基和更為優(yōu)選地單個(gè) 殘基的截短的CH1結(jié)構(gòu)域，其中所述經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)序列包含缺失或者半胱氨酸殘基的單氨 基酸置換，所述半胱氨酸殘基通常促進(jìn)重和輕抗體鏈間二硫鍵的形成。第二方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明第一方面的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建 體的核酸序列。第三方面，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含編碼與人TNF-(x結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的序列，其中所述核酸分子包含與SEQ ID No: 50或SEQ ID No: 51所示的序列至少60%同一的，優(yōu)選地至少80% 同一的，更優(yōu)選地至少90%、 95%、 96°/。、 97%、 98%或99°/。同一的核酸序 列，和最優(yōu)選地包含SEQ ID No: 50或SEQ ID No: 51所示的序列。第四方面，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含編碼與人TNF-cc結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的序列，其中所述核酸分子包含與SEQ ID No: 50或SEQ ID No: 51所示核苷酸序列在高嚴(yán)緊度條件下雜交的核 酸序列。第五方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含有效量的根據(jù)第一 方面的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。 , 第六方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明第一方面的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建 體在檢測人TNF- oc的診斷應(yīng)用中的用途。第七方面，本發(fā)明提供了用于在人受試者中治療特征在于人TNF-a活性的病癥的方法，其包括給所述受試者施用根據(jù)本發(fā)明第二方面 的藥物組合物。附圖簡述圖l顯示了接納體(acceptor )dAb的氨基酸序列(SEQ ID No: 5) 和核苷酸序列(SEQ ID No: 6)。
圖2顯示了本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的優(yōu)選實(shí)施方案的結(jié)構(gòu)， 作為(A)單體和(B) 二聚體。圖3顯示了十一個(gè)(11)狨和六個(gè)(6)梟猴VK基因區(qū)段的核苷 酸和氨基酸序列。圖4顯示了接納體dAb的氨基酸序列和核普酸序列(兩條鏈)。 圖中標(biāo)示了 Kpnl和SanDI的限制性消化位點(diǎn)，其切出包含CDR2的區(qū) 域。被除去的CDR2殘基以下劃線標(biāo)示。圖5顯示了化合物170 (SEQ ID No: 11)在鼠類L929細(xì)胞生存 力測定法中中和TNF- a介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的能力。圖6顯示了，化合物170 (SEQ ID No: 11)阻止TNF-oc與人p55 或p75 TNF受體的相互作用。圖7顯示了，表達(dá)跨膜TNF-oc的NSO 27D4細(xì)胞(黑色實(shí)線)的 化合物170 (SEQ ID No: 11)染色顯現(xiàn)出比不相關(guān)特異性同種型-匹 酉己的對(duì)照、(irrelevant specificity i so type—matched control)(灰 色填充)更高的熒光強(qiáng)度。圖8顯示了在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的化合物170 (SEQ ID No: 11) 在ELISA中保持與TNF-ot的結(jié)合。圖9顯示了相對(duì)于特異性對(duì)照人IgG!而言，化合物17Q (SEQ ID No: 11)在TNF介導(dǎo)的鼠關(guān)節(jié)炎模型中的功效。以每周一次的間隔對(duì) 小鼠進(jìn)行評(píng)分(關(guān)節(jié)炎得分)U),和稱重(B)。圖IO顯示了對(duì)化合物112 (SEQ IDNo: 59 )和化合物170 ( SEQ ID No: 11 )的蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。

圖11顯示了化合物170 (SEQ ID No: 11)的非還原性SDS PAGE 分析，所述化合物170來自4 x 10 L先導(dǎo)細(xì)胞系(lead cell line) 發(fā)酵并經(jīng)蛋白A純化。泳道1 =測定法間對(duì)照；泳道2 =分子量標(biāo) 準(zhǔn)參照物；泳道3 =空白；泳道4 -經(jīng)蛋白A純化的在IO L發(fā)酵ID (運(yùn)行l(wèi))中的化合物170 (SEQ ID No: 11);泳道5 =經(jīng)蛋白A純 化的在10 L發(fā)酵ID (運(yùn)行2)中的化合物170;泳道6 =經(jīng)蛋白A 純化的在10 L發(fā)酵ID (運(yùn)行3 )中的化合物170;泳道7 -經(jīng)蛋白A
純化的在10 L發(fā)酵ID (運(yùn)行4)中的化合物170。圖12顯示了化合物170 (SEQ ID No: 11)的還原性SDS PAGE分 析，所述化合物170來自4xio L先導(dǎo)細(xì)胞系(lead cell line)發(fā) 酵并經(jīng)蛋白A純化。泳道1 =測定法間對(duì)照；泳道2 =分子量標(biāo)準(zhǔn) 參照物；泳道3 -空白；泳道4 -經(jīng)蛋白A純化的在10 L發(fā)酵ID (運(yùn)行l(wèi))中的化合物170 (SEQ ID No: 11);泳道5 -經(jīng)蛋白A純 化的在10 L發(fā)酵ID (運(yùn)行2)中的化合物170;泳道6 -經(jīng)蛋白A 純化的在10 L發(fā)酵ID (運(yùn)行3)中的化合物170;泳道7 =經(jīng)蛋白A 純化的在10 L發(fā)酵ID (運(yùn)行4)中的化合物170。發(fā)明詳述本發(fā)明者已產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其與人TNF-oc結(jié)合并且被 推測當(dāng)給人施用時(shí)展現(xiàn)出低免疫原性。該結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體包含相應(yīng) 于免疫球蛋白重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(即結(jié)構(gòu)域抗體(dAb ))的部分、 鉸鏈區(qū)和相應(yīng)于抗體重鏈恒定區(qū)的部分，但其中所述恒定區(qū)具有截短 的CH1結(jié)構(gòu)域。推測包含恒定區(qū)部分能增加dAb的體內(nèi)半衰期，以及提供效應(yīng)子 功能，所述效應(yīng)子功能被認(rèn)為是抗TNF抗體的抗炎機(jī)制的組成部分。 第一方面，本發(fā)明提供了與人TNF-ot結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含(a) 與人TNF-oc結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體(dAb);(b) 經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)序列；(c) 人或靈長類重鏈恒定區(qū)序列，其具有不多于20個(gè)殘基，更優(yōu) 選地不多于IO個(gè)殘基，更加優(yōu)選地不多于5個(gè)殘基和更為優(yōu)選地單個(gè) 殘基的截短的CH1結(jié)構(gòu)域，其中所述經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)序列包含缺失或者半胱氨酸殘基的單氨 基酸置換，所述半胱氨酸殘基通常促進(jìn)重和輕抗體鏈間二硫鍵的形成。 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，CH1結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)為 XEPKSZDKTHTCPPCPA,其中X為纈氨酸、亮氨酸或異亮苷酸，和Z不存 在或?yàn)槌腚装彼嵋酝獾钠渌被?。?yōu)選地，X為纈氨酸，和Z為 絲氨酸。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所迷dAb包含免疫球蛋白重鏈 或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中所述可變結(jié)構(gòu)域包含至少一個(gè)具有來源于新 世界靈長類的序列的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其中所述CDR選自YAATKLQS (SEQ ID No: 1) 、 YEASSLQS ( SEQ ID No: 2 ) 、 YEASKLQS ( SEQ ID No: 3)和YSASNLET ( SEQ ID No: 4 )。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述CDR為CDR2。 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，dAb具有選自下列的序列DIQMTTQSPSSLSASVGDRVTITGRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLrYSASNLETGvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqwwrpftfgqgtk:veikr (化合物145; SEQ ID No: 7)GVPSRFSGSaSGTDFrL'nSSLQPEDFATYTCQQVVWRPFTFGQGTKVinKR (化合物123; SEQ ID No: 8)VPSRFSGSGSGTDFTLT7SSU扁)FATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR (化合物100; SEQ ID No: 9)DIQMTQSPSSLSASVODRVT1TCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET (化合物196; SEQ ID No: 10)DIQMTQSPSSi;SASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKPPKLLIYSASNLirrG VPSRFSOSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEKR(化合物134; SEQ ID No: 52) <formula>formula see original document page 15</formula>(化合物137; SEQ ID No: 53)VPSKFSGSGSCJTDFrLTlSSLVPEDFATYYCQQVVWRPFTPGQGTKVEIKR (化合物121; SEQ ID No: 54);和與這些序列之一至少95%,更優(yōu)選地至少96%、 97%、 98%或99%同一的 序列。在進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述恒定區(qū)包含CH2和CH3結(jié)構(gòu)域， 其一起具有下列序列PELLGGPSVFLFPPKPKimMiSRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVE、頓 AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP1EKTISKAKGLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSl^SLSPGK; (SEQ ID NO:63)或者與其至少60%同一的，優(yōu)選地至少80%同一的，更優(yōu)選地至少90%、 95%、 96%、 97%、 98°/。或99°/。同一的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體包含與SEQ ID No: 11所示的序列至少60%同一的，優(yōu)選地至少80%同一的，更優(yōu) 選地至少90%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%同 一的氨基酸序列，和最優(yōu) 選地包含SEQ ID No: ll所示的序列。此處所用的術(shù)語"與......結(jié)合，，意指抗原被免疫球蛋白可變區(qū)以lnM或更低的解離常數(shù)(Kd)進(jìn)行結(jié)合，如使用例如BIAcoreTM表 面等離子體共振系統(tǒng)和BIAcoreTM動(dòng)力學(xué)評(píng)估軟件(例如，2. l版)通 過表面等離子體共振分析所測量的。特異性結(jié)合相互作用的親和力或 解離常數(shù)(Kd)優(yōu)選地為約500 nM或更低，更優(yōu)選地約300 nM或更 低，以及優(yōu)選地至少300 nM至50 pM, 200 nM至50 pM，和更優(yōu)選地 至少100 nM至50 pM， 75 nM至50 pM， 10 nM至50 pM。此處所用的 術(shù)語"dAb，，指與抗原特異性地結(jié)合的抗體單可變結(jié)構(gòu)域(Vh或VJ多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體與 另一個(gè)根據(jù)本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體形成同或異二聚體，二聚化能 夠增加抗原結(jié)合的強(qiáng)度，其中所述結(jié)合的強(qiáng)度與多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合 親和力總和有關(guān)。為了促進(jìn)二聚體的形成，結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的鉸鏈 區(qū)包含至少一個(gè)，和優(yōu)選地兩個(gè)半胱氨酸殘基。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體和一 個(gè)相同的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體形成同二聚體。因此，在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了與人TNF-ct結(jié)合的二聚結(jié) 構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中所述二聚體由兩個(gè)根據(jù)本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu) 建體組成。優(yōu)選的是，二聚結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體為同二聚體，并且特別優(yōu)選的 是，組成同二聚體的所述結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體包含與SEQ ID No: 11所 示的序列至少60°/。同一的，優(yōu)選地至少80%同一的，更優(yōu)逸地至少90%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%同一的氨基酸序列，和最優(yōu)選地包含SEQID No: ll所示的序列。第二方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明第一方面的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建 體的核酸序列。第三方面，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含編碼與人TNF-a結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的序列，其中所述核酸分子包含與SEQ ID No: 50或SEQ ID No: 51所示的序列至少60%同一的，優(yōu)選地至少80% 同一的，更優(yōu)選地至少90%、 95%、 96°/。、 97%、 98%或99%同一的核酸序 列，和最優(yōu)選地包含SEQ ID No: 50或SEQ ID No: 51所示的序列。第四方面，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含編碼與人TNF-oc結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的序列，其中所述核酸分子包含與SEQ ID No: 50或SEQ ID No: 51所示核苷酸序列在高嚴(yán)緊度條件下雜交的核 酸序列。在確定兩個(gè)多肽序列是否落在同 一性百分比限度內(nèi)時(shí)，本領(lǐng)域技 術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到必須進(jìn)行并列比較或者序列的多重比對(duì)。在這樣的 比較或比對(duì)中，差異將在不相同的殘基的定位中出現(xiàn)，這取決于用來
進(jìn)行比對(duì)的算法。在本文本中，提及兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列之間的 "同一性百分比"或者"相似性"應(yīng)被視為分別指所述序列之間相同 的或相似的殘基的數(shù)目，如用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)準(zhǔn)算法所測定的。例如，氨基酸序列同一性或相似性可以用GAP程序進(jìn)行計(jì)算 和/或用PI固P程序(Computer Genetics Group, Inc., University Research Park, Madison, Wisconsin, United States of America) (Devereaux等人，1984 )進(jìn)行比對(duì)。GAP程序使用了 Needleman和 Wuns ch ( 19 7 0 )的算法來使相同的/相似的殘基的數(shù)目最大化并使在比 對(duì)中序列缺口的數(shù)目和長度最小化。備選地或者另外地，當(dāng)比較多于 兩個(gè)的氨基酸序列時(shí)，可以使用Thompson等人(1994 )的Clustal W 程序。在確定兩個(gè)核苷酸序列是否落在這些百分比限度內(nèi)時(shí)，本領(lǐng)域技 術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到必須進(jìn)行并列比較或者序列的多重比對(duì)。在這樣的 比較或比對(duì)中，差異可在不相同的殘基的定位中出現(xiàn)，這取決于用來 進(jìn)行比對(duì)的算法。在本文本中，提及兩個(gè)或更多個(gè)核苷酸序列之間的 "同一性百分比，，應(yīng)被視為指所述序列之間相同的殘基的數(shù)目，如用 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)準(zhǔn)算法所測定的。例如，可以采用 BESTFIT程序或者其它合適的程序(Computer Genetics Group, Inc.， UniversUy Research Park, Madison, Wisconsin, United States of America) ( Devereaux等人，Nucl. Acids Res, ， 12: 387-395, 1984 ) 來對(duì)核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)并計(jì)算它們的同 一性。高嚴(yán)緊度優(yōu)選涉及在65C和Q.lxSSC (lxSSC = 0. 15M NaCl， 0. 015M檸檬酸鈉，pH7. 0)的條件下的雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還基于用于擴(kuò)增新世界靈長類免疫球 蛋白可變區(qū)基因的方法，例如使用對(duì)于重鏈和輕鏈可變區(qū)基因家族特 異的引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從提取自新世界靈長類淋巴細(xì)胞 的核酸中進(jìn)行擴(kuò)增。例如，關(guān)于重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域基因(分別為 Vk和VJ的邊界的信息可以用于設(shè)計(jì)PCR引物，所述引物從經(jīng)克隆的 重鏈或輕鏈編碼序列中擴(kuò)增可變結(jié)構(gòu)域，所述重鏈或輕鏈編碼序列編 碼已知與給定抗原相結(jié)合的抗體。然后，將擴(kuò)增的可變區(qū)單獨(dú)地或者 作為與另 一本發(fā)明的人或靈長類恒定區(qū)多肽序列的融合物插入合適的 表達(dá)栽體中，以產(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體。合適的表達(dá)載體將 是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。vH、 w和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域儲(chǔ)庫可以是天然存在的免疫球蛋白序列儲(chǔ)庫或合成的儲(chǔ)庫。天然存在的儲(chǔ)庫是例如從表達(dá)免疫球蛋白的細(xì)胞制 備的儲(chǔ)庫，所述表達(dá)免疫球蛋白的細(xì)胞從一種或多種靈長類中收獲。此類儲(chǔ)庫可以是原初的(na'ive)，即從新生的表達(dá)免疫球蛋白的細(xì)胞 制備，或者是重排的，即從例如成年靈長類B細(xì)胞制備。需要時(shí)，隨一步進(jìn)行篩;選，:產(chǎn);和選擇具有改善的結(jié)合"征的變; 、、、單個(gè)免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的合成儲(chǔ)庫是通過向經(jīng)克隆的可變結(jié) 構(gòu)域中人工引入多樣性來制備的?？梢酝ㄟ^例如噬菌體展示，就所希望的結(jié)合特異性和功能行為來 篩選Vh和、結(jié)構(gòu)域儲(chǔ)庫。用于構(gòu)建噬菌體展示文庫和入噬菌體表達(dá)文 庫的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。噬菌體展示技術(shù)已在本領(lǐng)域中進(jìn) 行了廣泛描述，以及用于產(chǎn)生和篩選這樣的文庫以及對(duì)它們的產(chǎn)物進(jìn)行親和力成熟的方法和化合物的例子可以在例如下列文獻(xiàn)中找到 Barbas等人，(1991) PMS 88: 7978-7982; Clarkson等人.(1991) Nature 352: 624-628; Dower等人，PCT. 91/17271，美國專利號(hào) 5, 427, 908，美國專利號(hào)5， 580， 717和EP 527， 839;Fuchs等人，(1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Garrad等人，(1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Garrard等人，PCT W0 92/09690; Gram等人，(1992) PNAS 89: 3576-3580; Griffiths等人，(1993) EMBO J 12: 725-734; Griffiths等人，美國專利號(hào)5， 885， 793和EP 589, 877; Hawkins等 人，(1992) JMol Biol 226: 889-896; Hay等人，(1992) HumAutibod Hybridomas 3: 81-85; Hoogenboom等人，(1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; Huse等人，(1989) Science 246: 1275—1281; Knappik 等人，(2000) JMol Biol 296: 57-86; Knappik等人，PCT W0 97/08320; Ladner等人，美國專利號(hào)5， 223， 409, 5, 403, 484， 5， 571， 698， 5， 837， 500和EP 436, 597; McCafferty等人，(1990) Nature 348: 552-554 ; McCafferty等人，PCT. W0 92/01047， 美國專利號(hào) 5， 969， 108和EP 589， 877; Salfeld等人，PCT WO 97/29131，美國臨 時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/126,603;和Winter等人，PCT WO 92/20791和EP 368， 684。表達(dá)VH和VL結(jié)構(gòu)域儲(chǔ)庫的重組文庫可以在微生物例如酵母或細(xì)菌 的表面上進(jìn)行表達(dá)(參見PCT公開W099/36569和98/49286 )。本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體可以通過重組方法來產(chǎn)生，包括從真 核表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生，所述真核表達(dá)系統(tǒng)包括例如酵母、高等植物、昆 蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以及真菌表達(dá)系統(tǒng)和病毒編碼的表達(dá)系統(tǒng)，如此 處所描述的或者本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體可以用S抗體編碼核酸來制備，以便 提供轉(zhuǎn)基因植物和培養(yǎng)的植物細(xì)胞(例如，但不限于，煙草和玉米)， 其在植物的某些部位中或者在由其培養(yǎng)出的細(xì)胞中產(chǎn)生這樣的構(gòu)建 體。作為非限制性的例子，表達(dá)重組蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因煙草葉已被成功 用于提供大量的重組蛋白質(zhì)，例如，釆用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(參見例如， Cramer等人，Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 1999 )和其中所引用的參考文獻(xiàn)。此外，轉(zhuǎn)基因玉米也已經(jīng)用于以商業(yè)生產(chǎn) 水平來表達(dá)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，其生物活性等價(jià)于在其他重組系統(tǒng)中生 產(chǎn)的或者從天然來源中純化的蛋白質(zhì)(參見例如，Hood等人，Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127-147 1999和其中所引用的參考文獻(xiàn))。也已從 轉(zhuǎn)基因植物種子(包括煙草種子和馬鈴薯塊莖)中大量生產(chǎn)抗體，包 括抗體片段例如單鏈抗體(scFv's)(參見例如，Conrad等人，Plant Mol. Biol. 38: 101-109， 1998和其中所引用的參考文獻(xiàn))。因此， 本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體也可以根據(jù)已知的方法用轉(zhuǎn)基因植物來生 產(chǎn)(也參見例如，F(xiàn)ischer等人，Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 99-108 October, 1999; Ma & Hein. ， Trends Biotechnol. 13: 522-7 1995; Ma等人，Plant Physiol. 109: 341-6 1995; Whitelam等人，Biochem. Soc. Trans. 22: 940-944 1994;和其中所引用的參考文 獻(xiàn)；以上每一篇參考文獻(xiàn)在此通過提及而整體合并入本文)。本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體包括天然純化的產(chǎn)物、化學(xué)合成方法 的產(chǎn)物和通過重組技術(shù)從真核宿主(包括例如酵母、高等植物、昆蟲 和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生的產(chǎn)物。取決于在重組生產(chǎn)方法中所釆用的 宿主，本發(fā)明的抗體構(gòu)建體可以是糖基化的或者非糖基化的，其中優(yōu) 選是糖基化的。這樣的方法在許多標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中已有描述， Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 笫2版， Cold Spring Harbor, N, Y. 1989，第17. 37-17. 42節(jié)；Ausubel等人， 編輯，Current Protocols in Molecular Biology 1987—1993，第10， 12， 13， 16， 18和20章；Colligan等人，Current Protocols in Protein Science, John Wi ley & Sons, NY, N. Y. 1997-2001， Protein Science,第12-14章，所有文獻(xiàn)在此通過提及而整體合并入本文。在一種表達(dá)系統(tǒng)中，在核糖體上展示重組肽/蛋白質(zhì)文庫(例如參 見Roberts, RW和Szostak, J. W. 1997. Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA. 94: 12297 - 123202以及PCT/^開號(hào)WO98/31700 )。因此，另一個(gè)例子涉 及DNA文庫(例如，優(yōu)選從經(jīng)免疫的細(xì)胞制備的抗體或衍生物的DNA 文庫，但不限于此)的產(chǎn)生和體外轉(zhuǎn)錄，翻譯該文庫，從而使得蛋白 質(zhì)和"經(jīng)免疫的，，mRM停留在核糖體上，親和力選擇(例如通過與RSP 結(jié)合)，mRNA分離，反向翻譯和后續(xù)擴(kuò)增(例如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 或相關(guān)技術(shù))。必要時(shí)可以偶聯(lián)另外的選擇和擴(kuò)增循環(huán)，以通過在這 種系統(tǒng)中引入體細(xì)胞突變或通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的其他親和力成熟方 法來進(jìn)行親和力成熟。另 一 個(gè)例子考慮應(yīng)用乳狀液區(qū)室化技術(shù)(emulsion compartmentalisation technology)以產(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體。 在乳狀液區(qū)室化中，將體外和光學(xué)分選方法與在乳狀液的油滴內(nèi)的水 相中翻譯的蛋白質(zhì)及其核苷酸編碼序列的共區(qū)室化相組合(參見PCT //^開號(hào)WO99/026711和WO00/40712 )。CDR序列可以得自幾個(gè)來源，例如數(shù)據(jù)庫，如國家生物技術(shù)信息
中心(National Centre for Biotechnology Information)蛋白質(zhì) 和核脊酸數(shù)據(jù)庫(www. ncbi. nlm. nih. gov ) ， The Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest (www, kabatdatabase. com)，或IMGT數(shù)據(jù)庫(www, imgt. cines. f r )。 備選地，可以從Vh和Vt結(jié)構(gòu)域儲(chǔ)庫預(yù)測CDR區(qū)(參見例如Kabat EA 和 Wu TT， Attempts to locate complementarity determining residues in the variable positions of light and heavy chains. Ann. NY Acad. Sci. 190:382-393 (1971)) 。 CDR序列可以是基因組 DNA或cDNA。存在許多方法可以把替代CDR嫁接到可變區(qū)序列中，并且這樣的 方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)是熟悉的。本發(fā)明的優(yōu)選方法涉及經(jīng)由 引物指導(dǎo)的誘變來替換可變區(qū)(或dAb)中的CDR2。該方法由下述步 驟組成使編碼所需突變的合成寡核苷酸與靶區(qū)域退火，其中它充當(dāng) 引物用于起始體外DNA合成；通過DNA聚合酶延伸寡核苷酸以產(chǎn)生攜 帶所需突變的雙鏈DNA;和將該序列連接并克隆到合適的表達(dá)栽體中。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，將新世界靈長類的CDR序列嫁接到 在人中具有低免疫原性的可變區(qū)序列中。術(shù)語"低免疫原性"是指結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體或其抗原結(jié)合部分在 人中不產(chǎn)生這樣的抗體應(yīng)答，即所述抗體應(yīng)答的量級(jí)足以減少以達(dá)到';厶療效果來說足夠的時(shí)間連續(xù)施用所述結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的功效.優(yōu)選地，其中嫁接入新世界靈長類CDR的可變區(qū)序列為圖1中的 "dAb接納體序列，，(命名為化合物128)。該dAb接納體序列由SEQ ID No: 5所示的氨基酸序列組成VPSRPSGSGSGTDFTl'TlSSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQCiTKLVEIKR (SEQIDNo:5)。該序列由SEQ ID No: 6所示的核苷酸序列編碼 GACATCCAGACCCAGTCTCCA'￡'CCTCT(JTGTCTTCTGGAGACCGTGTCACGATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGAT歐'丄'ATTTACATTOGTACCAGCMSAAACCAGGGAi^AGCCCCTAAGCTCATCTATA<3TTCCGAGTT<5CAAAGTC(3G(3TCCCATCACCTTTCAGTGGCACTGGATCTGGGACATTCACTCTCACCATCAGCA(iTC'丄'GCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTOTCAACAGGTTGTGCGTCCTTTTACGTTCGCJCGGGGAAATCAAA(SEQIDNo:。。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將新世界靈長類狨CDR序列 YSASNLET (SEQ ID No: 4)嫁接入該可變區(qū)dAb接納體序列中，以便 替代該dAb接納體序列的CDR2序列(YSASELQS; SEQ ID No: 55)， 從而產(chǎn)生下面的dAb (命名為化合物145): 化合物145DIQMTQSPSSLSASVGDRVTlTCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLm'SASNLETG VPS R卜—SGSGSGTDFTLTfSS LQPEDFAT YYCQQ V VWRPFEFGQGTK VEIKR (SEQIDNo:7.)。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與人TNF-ct結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體 構(gòu)建體的dAb包含SEQ ID No: 7所示的氨基酸序列。結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的可變區(qū)序列(dAb)可以進(jìn)一步經(jīng)歷親和力成 熟以便改善其抗原結(jié)合特征，這在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這可能需要對(duì) 結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的CDR1 、 CDR3或構(gòu)架區(qū)中的某些氨基酸殘基進(jìn)行修 飾。例如，如"材料和方法"中所述的，對(duì)SEQ ID No: 7進(jìn)行親和力 成熟，并就TNF-oc結(jié)合進(jìn)行測試。在進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案中，與人 TNF-a結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的可變區(qū)(dAb)包含SEQ ID No: 8 或SEQ ID No: 9的氨基酸序列。這些被分別命名為化合物123和化合 物IOO，并且它們的序列如下所示 化合物123DIQMTQSPSSLSASVGDRVTrrCRASQAlDSYLHWYQQKPGKAPKI丄IYSASNrLET G VPSRFSGSGSGTDFrLT鵬LQPEDb，ATYYCQQV V WRPFITGQGTKVEl KR (SEQ ID No:8)化合物100
VPSRFSGSGSG'lDFrLTOSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFCIQGTlCVElKR(SEQIDNo鄰。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，與人TNF-Ct結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu) 建體的可變區(qū)(dAb)包含SEQIDNo: IO的氨基酸序列。這被命名為 化合物196，并且序列提供在下面 化合物196本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的恒定區(qū)序列可 以來源于人或靈長類序列。靈長類序列可以是新世界靈長類或舊世界 靈長類序列。合適的舊世界靈長類包括黑猩猩，或其他類人猿例如大 猩猩或猩猩，它們由于其與人的緊密的系統(tǒng)發(fā)生接近性而與人恒定區(qū) 序列共享高度的同源性。優(yōu)選地，所述恒定區(qū)來源于人抗體序列。這樣的序列的例子可以在下列中找到國家生物技術(shù)信息中心蛋白質(zhì)和 核脊酸數(shù)據(jù)庫(www. ncbi. nlm. nih， gov ) , The Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest (www, kabatdatabase. com)，或IMGT數(shù)據(jù)庫(www, imgt. cines. fr )。在設(shè)計(jì)本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體中，本發(fā)明者截短了恒定(Fc ) 區(qū)的CH1結(jié)構(gòu)域。保留了最小數(shù)目的CH1結(jié)構(gòu)域殘基以便為鉸鏈區(qū)附近 的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體提供柔韌性。優(yōu)選地，保留CH1結(jié)構(gòu)域的至少20 個(gè)C-末端氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少IO個(gè)氨基酸，更加優(yōu)選地至少5 個(gè)氨基酸，更為優(yōu)選地單個(gè)氨基酸殘基。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體具有包含下列組 分的形式dAb - C末端CH1結(jié)構(gòu)域殘基_鉸鏈區(qū)-CH2結(jié)構(gòu)域-CH3結(jié) 構(gòu)域，如圖2中所示意性地圖解說明的。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體具有SEQ ID No: 11 所示的氨基酸序列。這被命名為化合物170。 化合物170 GVPSRFSGSGSGTDFTLT1SS LXPEDFAT YYCQQV V WRPFTK3QGTKVEIKRVEPKS SDK'rHTCPPCPAPEIXC'GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSirEDPEYKFN WYVDGVEVHNAKTKPR卿YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKYSMKALP APlEKTISKAKXIQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNCi 0 PENNY KTPPPVLDS DGSFFLYS KLTVDKS瞎QQGJN VFSCSVMHKALHNHYTQK SLSLSPdK (SEQ，DNo:ll)。天然存在的免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)包含半胱氨酸(C)側(cè)鏈，其促進(jìn) 重鏈CH1結(jié)構(gòu)域和輕鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域之間二硫鍵的形成。由于所述構(gòu) 建體只包含單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，從而留下一個(gè)潛在具有活性的未配對(duì)的 半胱氨酸殘基，因此將該半胱氨酸殘基用阻止二硫鍵形成的氨基酸殘 基置換。具有未配對(duì)的半胱氨酸的可能后果可以包括由于構(gòu)建體的聚 集和錯(cuò)誤折疊所導(dǎo)致的降低的蛋白質(zhì)表達(dá)。應(yīng)當(dāng)理解，來源于任何抗體類別的任何鉸鏈區(qū)序列可適合在本發(fā) 明中使用。不過，鉸鏈區(qū)優(yōu)選來自抗體亞類IgG,。優(yōu)選地，所述鉸鏈 區(qū)基于IgG!鉸鏈區(qū)的天然存在的序列，并且包含序列 EPKS旦DKTHTCPPCPA ( SEQ ID No: 12)。在此序列中，通常存在于位 置5處的Cys加下劃線的Ser殘基替代。優(yōu)選地，CH1結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸殘基來源于IgGl。更優(yōu)選地， CH1殘基為纈氨酸(V )殘基或保守氨基酸置換例如亮氨酸(L )或異亮 氨酸(I)。該殘基緊鄰鉸鏈區(qū)并且有助于增加鉸鏈區(qū)附近構(gòu)建體的靈 柔韌性。CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的序列優(yōu)選來源于Swissprot數(shù)據(jù)庫登錄號(hào) P01857:PJF丄lX3GPSVFLKPPKPKDTLMlSRTPBVTCYVVDVSHEDPFiVKFNWYVDCrVEVHN AKTKPREEQYNST YRV VS VLTV LHQDWLNG KEYKCK VSNK ALPAP1EKT1S KAKG QPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTC丄VKG h'YPSD1八VEW,GQPENN Y KTTPP V LDSDGSFFJLYSKLT VDKS RWQQGNVFSCS VMJ:舊ALHNHYTQ KSLSLS PGK (SEQTDNo:63)。所述結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體可以衍生化或與另一種功能分子連接。例 如，結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體可以通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價(jià)結(jié)合或
其他方式與一種或多種其他分子實(shí)體進(jìn)行功能上連接，所述其他分子 實(shí)體例如為另一種抗體、可檢測的試劑、細(xì)胞毒劑、藥物試劑和/或可 以介導(dǎo)所述抗體或抗體結(jié)合部分與另 一種分子(例如鏈霉抗生物素蛋 白核心區(qū)或多組氨酸標(biāo)簽)結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽。結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體可以與之衍生的有用的可檢測試劑包括熒光化 合物。示例性的熒光可檢測試劑包括熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、5-二甲基胺-l-萘磺酰氯、藻紅蛋白等。結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體還可以 用可檢測的酶進(jìn)行衍生化，例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、葡萄 糖氧化酶等。當(dāng)結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體用可檢測的酶進(jìn)行衍生化時(shí)，它通 過添加該酶用于產(chǎn)生可檢測的反應(yīng)產(chǎn)物的另外試劑來檢測。結(jié)構(gòu)域抗 體構(gòu)建體還可以用生物素進(jìn)行衍生化，并通過間接測量抗生物素蛋白 或鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合進(jìn)行檢測?？梢詫⒏鶕?jù)本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體與一種或多種分子連接，(例如，結(jié)合親和力)的損失。這些分子可以通過連接體而連接至結(jié) 構(gòu)域抗體構(gòu)建體，從而它們不干擾/在空間上阻礙抗原結(jié)合位點(diǎn)。這些 加合分子包括如美國專利申請(qǐng)20050271663所述的針對(duì)內(nèi)源分子的 dAb。通常，此類加合分子是體內(nèi)天然存在并且抵抗經(jīng)由內(nèi)源性機(jī)制的 降解或去除的多肽或多肽片段。增加半衰期的分子可以選自下列(a) 來自細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)，例如，膠原，層粘連蛋白，整聯(lián) 蛋白和纖連蛋白；(b) 在血液中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，例如纖維蛋白，oc-2巨球蛋白， 血清白蛋白，纖維蛋白原A，纖維蛋白原B，血清淀粉樣蛋白A，庚珠 蛋白(heptaglobin)，蛋白質(zhì)，泛蛋白,子宮球蛋白(uteroglobulin)， P-2微球蛋白，纖溶酶原，溶菌酶，半胱氨酸蛋白酶抑制劑C， cx-l-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制劑；(c) 免疫血清蛋白，例如IgE， IgG， IgM;(d) 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，例如視黃醇結(jié)合蛋白，oc-l微球蛋白；(e) 防衛(wèi)素，例如P-防衛(wèi)素1，嗜中性粒細(xì)胞防衛(wèi)素l、 2和3;(f )在血腦屏障處或在神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，例如黑皮質(zhì)素受體、髓磷脂、抗壞血酸轉(zhuǎn)運(yùn)體；(g) 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性配體-神經(jīng)藥物試劑融合蛋白(參見 US5977307 );腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞受體，轉(zhuǎn)鐵蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，胰 島素，胰島素樣生長因子1 ( IGF 1 )受體，胰島素樣生長因子2 ( IGF 2)受體，胰島素受體；(h) 定位于腎的蛋白質(zhì)，例如多嚢蛋白，IV型膠原，有機(jī)陰離 子運(yùn)載體Kl ， Heymann' s抗原；(i) 定位于肝的蛋白質(zhì)，例如乙醇脫氫酶，G250; (j)凝血因子X;(k) oc-l抗胰蛋白酶； (1) HNF 1 a ;(m)定位于肺的蛋白質(zhì)，例如分泌組分(結(jié)合IgA); (n)定位于心臟的蛋白質(zhì)，例如HSP 27; (o)定位于皮膚的蛋白質(zhì)，例如角蛋白；(P )骨特異性蛋白質(zhì)，例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs )，例如BMP-2、 -4、 -5、 -6、 -7 (也稱為成骨蛋白(0P-1))和-8 (0P-2);(q)腫瘤特異性蛋白質(zhì)，例如人滋養(yǎng)層抗原，赫賽汀(herceptin) 受體，雌激素受體，組織蛋白酶例如組織蛋白酶B(在肝和脾中發(fā)現(xiàn))；(r)疾病特異性蛋白質(zhì)，例如僅在活化的T-細(xì)胞上表達(dá)的抗原 包括LAG-3 (淋巴細(xì)胞活化基因)；護(hù)骨蛋白配體(0PGL )，參見Kong YY等人，Nature (1999) 402， 304-309; 0X40 ( TNF受體家族的成員， 在活化的T細(xì)胞上表達(dá)，以及為已知在產(chǎn)生人T細(xì)胞白血病病毒I型 (HTLV-1)的細(xì)胞中特異性地上調(diào)的唯一共刺激T細(xì)胞分子一一參見 PankowR等人，J. Immunol. (2000) Jul 1; 165 (1): 263-70 );金 屬蛋白酶(與關(guān)節(jié)炎/癌癥相關(guān))，包括CG6512果蠅，人截癱蛋白， 人FtsH，人AFG3L2，鼠類ftsH;血管生成生長因子，包括酸性成纖 維細(xì)胞生長因子(FGF-1)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-2)，血 管內(nèi)皮生長因子/血管通透性因子(VEGF/VPF )，轉(zhuǎn)化生長因子-ot ( TGF- oc )，腫瘤壞死因子-cc (TNF-a ),血管生成素，白介素-3 ( IL-3 )， 白介素-8 (IL-8)，血小板衍生內(nèi)皮生長因子(PD-ECGF)，胎盤生長 因子(P1GF)，中期因子(midkine)血小板衍生生長因子-BB(PDGF)， CXXXC趨化分子(fractalkine);(s )應(yīng)激蛋白質(zhì)(熱休克蛋白)；和(t)參與Fc轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還擴(kuò)展至聚乙二醇化的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其相對(duì)于非聚 乙二醇化的抗體多肽而言提供了增加的半衰期和針對(duì)降解的抗性而無 活性(例如，結(jié)合親和力)的損失。結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體可以使用本領(lǐng)域已知的方法與聚合物分子(優(yōu) 選PEG)偶聯(lián)，所述聚合物分子對(duì)于達(dá)到增加的半衰期和降解抗性性 質(zhì)是有用的?？梢栽诒景l(fā)明中使用的聚合物部分可以是合成的或天然 存在的，并且包括但不限于，直鏈或支化的聚亞烷基、聚亞烯基或聚 氧化烯聚合物，或分支或未分支的多糖例如同或雜多糖?？梢栽诒景l(fā) 明中使用的合成聚合物的優(yōu)選例子包括直鏈或支化的聚(乙二醇) (PEG)、聚(丙二醇)或聚(乙烯醇)，及其衍生物或取代的形式。用于 與結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體連接的特別優(yōu)選的取代的聚合物包括取代的 PEG,包括甲氧基(聚乙二醇)。除PEG外可以使用的，或可以代替PEG 使用的天然存在的聚合物部分包括乳糖、直鏈淀粉、葡聚糖或糖原， 以及將由本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可的其衍生物。在本發(fā)明中可用的聚合物(PEG )分子可以使用本領(lǐng)域眾所周知的 方法與結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體連接。在PEG或其他聚合物部分與本發(fā)明的 結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體連接中的第 一個(gè)步驟是用包含親電子體的官能團(tuán)替 換PEG聚合物的羥基末端基團(tuán)。特別地，將PEG聚合物與結(jié)構(gòu)域抗體 構(gòu)建體單體或多聚體中存在的半胱氨酸或賴氨酸殘基連接。所述半胱氨酸和賴氨酸殘基可以是天然存在的，或可以被改造到結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu) 建體分子中?？梢酝ㄟ^多種方法來完成本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的PEG化 (參見例如Kozlowski-A & Harris-JM (2001) Journal of Controlled Release 72:217) 。 PEG可以直接地或者通過間插性連接體與結(jié)構(gòu)域 抗體構(gòu)建體連接。用于將聚乙二醇連接至蛋白質(zhì)的無連接體系統(tǒng)已在 下列文獻(xiàn)中描述Delgado等人(1992)， Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9: 249-304; Francis等人，(1998)， Intern. J. Hematol. 68: 1-18; US 4， 002， 531; US 5， 349， 052; WO 95/06058;和WO 98/32466， 其中每一篇文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過提及而合并入本文。一種將聚乙二醇直接連接至蛋白質(zhì)的氨基酸殘基而不使用間插性 連接體的系統(tǒng)采用了三氟乙磺酸化的(tresylated) MPEG,其是通過 用三氟乙磺酰氯(tresylchloride)修飾單甲氧基聚乙二醇(MPEG) 而產(chǎn)生的。在氨基酸殘基與三氟乙磺酸化的MPEG反應(yīng)后，將聚乙二醇 直接連接至胺基團(tuán)上。因此，本發(fā)明包括通過將本發(fā)明的蛋舞質(zhì)與具 有2， 2， 2-三氯乙磺?；木垡叶挤肿舆M(jìn)行反應(yīng)而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)-聚 乙二醇綴合物。還可以使用許多不同的間插性連接體來將聚乙二醇連接至蛋白 質(zhì)。例如，US 5，612，460公開了用于將聚乙二醇連接至蛋白質(zhì)的氨基 曱酸乙酯連接體。蛋白質(zhì)-聚乙二醇綴合物(其中聚乙二醇通過連接體 連接至蛋白質(zhì))也可以通過將蛋白質(zhì)與化合物進(jìn)行反應(yīng)來產(chǎn)生，所述 化合物例如為MPEG-琥珀酰亞胺基琥珀酸酯、用1，1，-碳酰二咪唑 (1， l，-carbonyldiimidazole)活化的MPEG、 MPEG-2， 4， 5-三氟戊基 碳酸酯、MPEG-對(duì)硝基苯酚碳酸酯和各種MPEG-琥珀酸酯衍生物。許多 用于將聚乙二醇連接至蛋白質(zhì)的其他聚乙二醇衍生物和反應(yīng)化學(xué)在 W098/32466中進(jìn)行了描述，其全部z〉開內(nèi)容通過提及而合并入本文。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體通過 賴氨酸殘基直接偶聯(lián)至聚乙二醇。在本發(fā)明的另 一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中， 結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體通過半胱氨酸殘基直接偶聯(lián)至PEG。未配對(duì)的半胱 氨酸殘基可以事先存在于序列中，也可以通過在例如結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建 體的C-末端中摻入半胱氨酸殘基而添加。備選地，PEG與結(jié)構(gòu)域抗體 構(gòu)建體的連接可以通過形成二硫鍵的半胱氨酸殘基而得到促進(jìn)，如在 US20060210526中所描述的。
聚合物分子的其他衍生形式包括例如這樣的衍生物，其中存在另 外的部分或反應(yīng)性基團(tuán)以允許與本文所述的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的氨基酸殘基相互作用。此類衍生物包括N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活性酯， 琥珀酰亞胺基丙酸酯聚合物，和巰基-選擇性反應(yīng)試劑例如馬來酰亞 胺，乙烯砜和硫醇。PEG聚合物可以是線性分子，或可以是分支的，其 中多個(gè)PEG部分存在于單個(gè)聚合物中。反應(yīng)性基團(tuán)(例如，MAL、 NHS、 SPA、 VS或巰基)可以直接與PEG 聚合物連接，或可以經(jīng)由連接體分子與PEG連接。在本發(fā)明中可用的聚合物的大小可以為500 Da-60 kDa，例如， 1000 Da - 60 kDa， 10kDa-60kDa, 20kDa-60kDa, 30kDa-60kDa， 40 kDa-60 kDa，以及高達(dá)50 kDa - 60 kDa。在本發(fā)明中使用的聚合 物，特別是PEG，可以是直鏈聚合物或可以具有分支的構(gòu)象。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，根據(jù)第一方面的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體可以 是多聚化的，如例如異或同二聚體，異或同三聚體，異或同四聚體， 或更高次的異或同多聚體。多聚化可以增加抗原結(jié)合的強(qiáng)度，其中結(jié) 合的強(qiáng)度與多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合親和力總和有關(guān)。第五方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含有效量的根據(jù)第一 方面的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。"藥學(xué)上可接受的載體"包括生理學(xué)相容的任何和所有溶劑、分 散介質(zhì)、包衣劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。藥 學(xué)上可接受的載體的例子包括水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、葡萄糖、 甘油、乙醇等中的一種或多種及其組合。在許多情況下，優(yōu)選地將是 在組合物中包括等滲劑，例如糖，多元醇例如甘露醇、山梨糖醇，或 氯化鈉。藥學(xué)上可接受的物質(zhì)例如少量的輔助物質(zhì)例如濕潤或乳化劑、 防腐劑或緩沖質(zhì)。所述組合物可以是各種形式，包括液體、半固體和固體劑型，例 如液體溶液(例如可吸入的、可注射的和可輸注的溶液)，分散液或 懸浮液，片劑，丸劑，粉劑，脂質(zhì)體或栓劑。優(yōu)選地，所述組合物是 用于免疫接種的可注射溶液的形式。施用可以是靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮
下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)。通常，治療組合物必須是無菌的并且在制造和儲(chǔ)存條件下是穩(wěn)定 的。組合物可以配制為溶液、微乳液、分散體、脂質(zhì)體或其他適合于 高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。溶液的適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可以通過例如使用包衣 劑如卵磷脂和/或表面活性劑來維持。無菌可注射溶液可以通過下列方式來制備在具有一種上面所列的成分或其組合的合適溶劑中以所需 的量摻入活性化合物(即結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體)，隨后過濾滅菌。所述組合物還可以配制成用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末。在某些實(shí)施方案中，活性化合物可以用載體來制備，所述載體將 保護(hù)化合物不被快速釋放，例如受控釋放制劑，包括植入物，透皮貼 劑和微膠嚢化的遞送系統(tǒng)。可以使用相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙 烯酯，聚酐，聚乙醇酸，膠原，聚原酸酯或聚乳酸。所述組合物還可以配制用于口服施用。在這個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu) 域抗體構(gòu)建體可以封裝在硬或軟殼明膠膠嚢中，壓縮成片劑，或直接 摻入受試者的飲食內(nèi)。允許肺、直腸、透皮、鞘內(nèi)、眼內(nèi)施用的制劑將是本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟知的。還可以將補(bǔ)充的活性化合物摻入至所述組合物中。結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu) 建體可以與 一種或多種另外的治療劑例如可溶性TNF- ot受體或抑制 人TNF-a產(chǎn)生的化學(xué)試劑，或者結(jié)合其他靶標(biāo)例如細(xì)胞因子或細(xì)胞表 面分子的抗體一起共配制和/或共施用。備選地，它可以與可溶性免疫 化學(xué)試劑例如蛋白A、 C、 G或L一起共施用。有效量可以包括治療有效量或預(yù)防有效量的本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體 構(gòu)建體。治療有效量是指以必需的劑量和時(shí)間段，對(duì)于取得所希望的 治療結(jié)果而言有效的量。預(yù)防有效量是指以必需的劑量和時(shí)間段，對(duì) 于取得所希望的預(yù)防結(jié)果而言有效的量。因?yàn)轭A(yù)防劑量在發(fā)病之前或 在疾病的早期階段施用，所以預(yù)防有效量可以比治療有效量小。第六方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明第一方面的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建 體在檢測人TNF-a的診斷應(yīng)用中的用途。
例如，根據(jù)本發(fā)明的抗人TNF- a結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體可以用于檢測 例如生物樣品如血清或血漿中的人TNF-a,其中使用常規(guī)的免疫測定 法，例如酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)或 組織免疫組織化學(xué)。可以通過竟?fàn)幟庖邷y定法在生物學(xué)流體中測定才艮 據(jù)本發(fā)明的抗人TNF- ot結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中使用用可檢測物質(zhì)標(biāo) 記的重組人TNF- a標(biāo)準(zhǔn)和未標(biāo)記的抗人TNF- oc抗體。根據(jù)本發(fā)明的抗人TNF- oc結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體還可用于檢測來自 除人類以外的其他物種例如非人靈長類(包括獼猴、黑猩猩、狨、恒 河猴)和其他物種例如狗、大鼠、小鼠、兔、貓、豬、牛的TNF-a。根據(jù)本發(fā)明的抗人TNF-a結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體還可用于其中希望 抑制TNF-ot活性的細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用。第七方面，本發(fā)明提供了用于在人受試者中治療特征在于人TNF-a活性的病癥的方法，其包括給所述受試者施用根據(jù)本發(fā)明第二方面 的藥物組合物。特征在于人TNF-oc活性的病癥意欲包括這樣的疾病和其他病癥， 即其中在患有所述病癥的受試者中TNF-a的存在已顯示負(fù)責(zé)或被懷 疑負(fù)責(zé)所述病癥的病理生理學(xué)，或者已顯示是或被懷疑是促成所述病 癥惡化的因素。優(yōu)選地，特征在于人TNF-oc活性的病癥選自炎癥，炎 性疾病，膿毒癥，包括敗血癥性休克、內(nèi)毒素性休克、革蘭氏陰性膿 毒癥和中毒性休克綜合征；自身免疫性疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 幼年關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性脊推炎、強(qiáng)直性脊推炎、舍格倫綜合征、骨關(guān) 節(jié)炎和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、過敏癥、多發(fā)性硬化癥、自身免疫性糖尿病、 自身免疫性葡萄膜炎、銀屑病、類天皰瘡以及腎病綜合征；眼的炎性 病況，包括黃斑變性、葡萄膜炎、貝赫切特??；感染性疾病，包括由于感染和感染后繼發(fā)的惡病質(zhì)所引起的發(fā)熱和肌痛；移植物抗宿主?。环瘟錾L或轉(zhuǎn)移，惡性血液病(hematologic malignancies);肺部 病癥，包括哮喘、成人呼吸窘迫綜合征、休克肺、慢性肺部炎性疾病、 肺結(jié)節(jié)病、肺纖維化和矽肺；炎癥性腸病，包括克羅恩病和潰瘍性結(jié) 腸炎；心臟病癥，充血性心力衰竭；血管病癥，包括韋格納病(Wegener's disease)、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎；炎癥性骨??；中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥，例如阿 爾茨海默?。恢車窠?jīng)系統(tǒng)病癥，例如坐骨神經(jīng)痛；肝炎，凝血障礙， 燒傷，再灌注損傷，子宮內(nèi)膜異位癥，瘢痕瘤形成，和瘢痕組織形成。 在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述特征在于人TNF-a活性的病 癥是年齡相關(guān)性黃斑變性。TNF-oc參與刺激VEGF產(chǎn)生和促進(jìn)眼內(nèi)的新 血管形成(Oh-H等人，1999 Investigative Ophthalmology & Visual Science 40:1891-98 )，因此，TNF-a活性的抑制劑，例如此處所描 述的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，可用于治療與血管生成相關(guān)的眼病癥，包括 年齡相關(guān)性黃斑變性。在本說明書自始至終，單詞"包含"或者變化形式"包括"或"含 有，，應(yīng)當(dāng)理解為暗示包括所述元素、整數(shù)或步驟，或者元素、整數(shù)或 步驟的組，但不排除任何其他元素、整數(shù)或步驟，或者元素、整數(shù)或 步驟的組。本說明書中提及的所有出版物通過提及而合并入本文。本說明書 中包括的文件、行為、材料、裝置、物品等的任何討論僅用于提供本 發(fā)明的背景的目的。它不應(yīng)被視為承認(rèn)任何或所有這些內(nèi)容構(gòu)成現(xiàn)有 技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或者是在與本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域中的公知常識(shí)，就好 像它在本申請(qǐng)的每項(xiàng)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日前存在于澳大利亞或其他地 方。為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的本質(zhì)，現(xiàn)在將參考下述非限制性 實(shí)施例來描述其優(yōu)選形式。實(shí)施例1材料和方法新世#^€長類^J:厲^為、庫狨(毛狨屬(，種未知)和梟猴(夜猴( "/Wrw^^))基因組DNA分別以目錄編號(hào)85011419和90110510 獲自歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)。狨DNA來源于細(xì)胞系B95-8， 而梟猴DNA來自細(xì)胞系0MK 637-69。基于人VK前導(dǎo)序列和重組信號(hào)序列(RSS)的簡并引物得自 Walter和Tomlinson, Antibody Engineering: A Practical Approach (1996)。用于擴(kuò)增種系VK DNA的引物如下 引物VK1BLAATCKCAGGTKCCAGATG ( SEQ ID No: 13) 引物VKlBL35aGTTYRGGTKKGTAACACT (SEQ ID No: 14) 引物VKlBL35bATGMCTTGTWACACTGTG (SEQ ID No: 15)。釆用引物對(duì)VK1BL x VKlBL35a或VK1BL x VKlBL35b， 4吏用Taq 聚合酶來進(jìn)行PCR ( 30個(gè)循環(huán))。在經(jīng)克隆的序列和所使用的2套引 物之間存在重疊。將基因組PCR產(chǎn)物克隆入Invitrogen的T0P0TA克隆試劑盒(目 錄號(hào)K4500-01 )中，并用M13正向引物和pUC反向引物進(jìn)行測序。從 正和反方向?qū)π蛄羞M(jìn)行確認(rèn)。為了進(jìn)一步確認(rèn)關(guān)鍵序列沒有發(fā)生PCR 錯(cuò)誤，對(duì)于狨序列重復(fù)兩次PCR和克隆過程。核苷酸(SEQ ID No: 16 -26和SEQ ID No: 38 - 43 )和氨基酸(SEQ ID No: 27 - 37和SEQ ID No: 44 - 49 )在圖3中給出。狨序列1、 2和3得到了確認(rèn)。序列4、 5、 6、 7和8只在初始PCR中進(jìn)行了查看。序列9、 10和11只在重復(fù) (即第二次)PCR和克隆中進(jìn)行了查看。合^慕裙茅^并義發(fā)入接韻沐^/y尹四個(gè)CDR序列，即來自梟猴序列1 ( SEQ ID No: 44 )的YAATKLQS (SEQ ID No: 1)、來自梟猴序列2 (SEQ ID No: 45)的YEASSLQS (SEQ ID No: 2 )、來自狨序列1 ( SEQ ID No: 27 )的YEASKLQS ( SEQ ID No: 3)和來自狨序列2 (SEQ ID No: 28)的YSASNLET (SEQ ID NO: 4)，選自圖3中所示的氨基酸序列。發(fā)現(xiàn)梟猴序列5， YYASSLQS(SEQ
ID No: 56),與秘魯夜猴(Jofws力a/7c7邁aae) ( Ma，s夜猴)的cDNA 序列GI6176295相同，而所有其他序列是獨(dú)特的。在該表達(dá)載體(Domantis擁有專利權(quán)的載體)中的接納體可變區(qū) (抗-TNF的結(jié)構(gòu)域抗體)序列依次用Kpnl和SanDI進(jìn)行消化(25 |i g )， Kpnl和SanDI切除大部分的FR2以及CDR2，如限制性消化圖鐠(圖4 ) 上所示的。然后，凝膠純化該栽體以除去被切除的野生型FR2和CDR2 序列。通過下述方式來進(jìn)行寡核苷酸的退火將寡核苷酸對(duì)(500 pmol， 基于在圖3中所示的序列)在95"下溫育5分鐘，接著在651C下溫育 5分鐘，然后讓其在熱臺(tái)(hot block )上慢慢達(dá)到室溫。然后，在dNTP 存在下在Klenow反應(yīng)中補(bǔ)滿重疊部分。使用標(biāo)準(zhǔn)方法完成將合成的雙 鏈DNA (來源于寡核苷酸退火和末端補(bǔ)齊)分子克隆入接納體可變區(qū) 序列中。秉和力成熟通過構(gòu)建14個(gè)分開的文庫來對(duì)嫁接了狨CDR的dAb化合物145 (SEQ ID No: 7)進(jìn)行親和力成熟，其中每一個(gè)文庫在單個(gè)氨基酸殘 基處具有SEQIDNo: 7的序列多樣化。所選的殘基在下面用陰影顯示。復(fù))MTQ、S:—PSSLS 5SVGU RVTITC'RASQ霉^R,^^^QpCiKlPKLU"YS ASN1JITG WS鵬olGSG'rlFTL'nsSlfl,FATYYCQQ^^ffrFGQCiTK:VE， KR 。所述選擇基于已知在成熟的人Ig儲(chǔ)庫中多樣化的CDR1和CDR3 中的殘基，以及被觀察到在相關(guān)dAb中進(jìn)行誘變后產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì) 的構(gòu)架殘基。對(duì)于每個(gè)所選的殘基，以NKK簡并性設(shè)計(jì)互補(bǔ)的正向和 反向PCR引物對(duì)，并且進(jìn)行兩個(gè)初始PCR反應(yīng)，其中每個(gè)PCR反應(yīng)采 用單誘變引物和側(cè)翼引物。在進(jìn)行清理之后，將兩個(gè)PCR產(chǎn)物退火， 隨后使用單獨(dú)的側(cè)翼引物進(jìn)行擴(kuò)增(通過PCR的重疊延伸來進(jìn)行剪接； Lowman H. L. & Clackson T,(編輯)，Phage Display: A practical approach, Oxford University Press ， Oxford, UK)。使用固相TNF 通過ELISA對(duì)克隆進(jìn)行初次篩選，并對(duì)陽性克隆進(jìn)行測序。從最好的 克隆中純化出dAb蛋白質(zhì)，并就在受體結(jié)合測定法和L929細(xì)胞毒性測
定法中的效力進(jìn)行評(píng)價(jià)。發(fā)現(xiàn)化合物100 (SEQ IDNo: 9 )和123 ( SEQ ID No: 8)具有相對(duì)于親本dAb即化合物145 (SEQ ID No: 7)而言 改善的TNF中和作用?；衔?00和123的增強(qiáng)親和力的置換的組合產(chǎn)生了這樣的抗 -TNF dAb (化合物196; SEQ ID No: 10)，其在L929細(xì)胞毒性測定 法中具有進(jìn)一步改善的效力。將CH0K1SV細(xì)胞(Lonza Biologies, UK )，即CH0K1的懸浮變 種，在補(bǔ)充有6 mM L-谷氨酰胺(Invitrogen目錄號(hào)10743-029和 25030-081 )的CD CHO培養(yǎng)基中維持在對(duì)數(shù)生長期。培養(yǎng)物在36. 5*C 、 10% C02和于140 rpm搖動(dòng)下溫育。在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，在血細(xì)胞計(jì)數(shù) 器上通過臺(tái)盼藍(lán)排除法(Sigma目錄號(hào)T8154)來估定數(shù)目和生存力。 通過于200 xg下5分鐘來4吏8 x 106個(gè)活細(xì)胞形成粒狀沉淀，并重懸 浮于8 ml CM25培養(yǎng)基(Lonza Biologies, UK )中，所述培養(yǎng)基中補(bǔ) 充有10%熱滅活的經(jīng)透析的胎牛血清(Invitrogen目錄號(hào)26400-044 ) 和6 mM L-谷氨酰胺。將細(xì)胞以每孔500 n 1鋪于24孔板中，并于36. 5 匸、10% C02下溫育。在轉(zhuǎn)染前3小時(shí)，給培養(yǎng)基增添500jul CM25培養(yǎng)基的新鮮的等 分試樣，所述CM25培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%熱滅活的經(jīng)透析的胎牛血清和6 mM L-谷氨酰胺。就用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)對(duì)化合物112 (SEQ ID No: 50)和化合 物170 (SEQ ID No: 51)的基因序列進(jìn)行優(yōu)化，并且進(jìn)行合成。 化合物112 gacatccagatgacccagagccccagcagcctgagcgcctctgtgggcgatagagtgacc atcacctgcagagccagccaggccatcgacagctacctgcactggtatcagcagaagcct ggcaaggcccctaagctgctgatctacagcgccagcaatctggagac!cggcgtgcctagc agattcagcggcagcggctccgocact;gac!ttcacgct6accatca(3c:agcctgctgcct gaggatttcgccacctactactgccagcaggtggtgtqgagacctttcaccttcg(sccag ggcaccaaggtgoagatcaagcgggtggagcccaagagetgcgataagacccacacctgc cccccctgccctgcccccgagctgctgggcggacccagcotgttcctgttcccccccaag cctaaggacaccctgatgatcagcagaacccccgaggtgacctgcgtggtggtggivtgtg agccacgaggaccctgaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaat gccaagaccaagcccagggaggagcagtagaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctggccctgcctgcccctatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagcccagagagccc caggtgtacaccctgccccctagcagawtgagctoaccaagaaccaggtgtccctgacc tgcctggtgaagggcttctacgccagcgacatcgccgtggagtoggagagcaacggccag cccgagAacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgatggcagcttcttcctg tacagcaagctgaccgtgoacaagagcagatggcagcagggcaacgtgttcagctgcagc gtgatgcacgaggccctgcacaatcactacacccagaagagcctgagcctgtcccctggcaag <SEQIDNo:50) 化合物170gacatccagatgacccagagccccaocagcctgagcgcctctgtgggcgatagagtgaccGGCAAGGCCCCTAAGCTGOTGATCTACAGCGCCAGCAATCTOGAGACCGGCGTGCCTAGCagattcagcggcagcggctccggcaccgacttcaccqtgaccatcagcagcctgctgcct gaggatttcgccacctactactgccagcagotgotgtggagacctttcaccttcggccag ggcaccaagotggagatcaagcgggtggagcccaagagcagcgataagacccacacctgc cccccctgccctgcccccgagctgctgggcggacccagcgtgttcctgttcccccccaagCCyTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAjGGTGACCITGCGTQGTGGTGGATGTGagccacgaggaccctgaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgqacaat gccaagaccaagcccagggaggagcaotacaacagcacctaccgogtggtgtccgtgctg accgtgctgcaccac5gattggctgaacggcaaggagtadaagtgcaaggtgtccaacaag gccctgcctgcccctatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagcccagagagccc caggtotacaccctgccccctagcagagatgagctgaccaagaaccagotgtccctgacc tgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggfagtgggagagcaacggccag cccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgatggcagcttcttcctg tacagcaagctgaccgtggacaagagcagatggcagcagggcl^acotgttcagctgcagc gtgatgcacgaggccctgcacaatcactacacccagaagagcctgagcctgtcccctggcAAG (SEQIDNo:51)每個(gè)序列在5，末端側(cè)翼具有一個(gè)^'J7d III位點(diǎn)、Kozak序列 (GCCACC; SEQ ID No: 57)和人IgGK前導(dǎo)序列(氨基酸序列 MSVPTQVLGLLLLWLTDARC; SEQ ID NO: 58 )。在3，末端，給每個(gè)序列 添加兩個(gè)終止密碼子和一個(gè)AcoRI位點(diǎn)。在合成之后，將基因以克隆 入pCRScript載體(Stratagene)中的方式提供，并在合適的限制酶 緩沖液(分別為Roche Diagnostics目錄號(hào)10656313001、 10703737001 和11417967001 )中通過^/力(1111/^^^1消化而釋放。類似地，對(duì)GS 表達(dá)栽體pEE12. 4 (Lonza Biologies, UK)進(jìn)行消化，并用牛小腸堿 性磷酸酶(Roche Diagnostics目錄號(hào)10713023001 )進(jìn)行去磷酸化。 寸吏用Promega的LigaFast Rapid DNA連接系統(tǒng)(目錄號(hào)M8221 )將 每個(gè)基因連接入制備好的pEE12.4骨架中。然后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入 One Shot Top 10經(jīng)化學(xué)方法獲得的感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen目錄號(hào) C4040-03 )中，并通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來鑒定陽性克隆。使用QIAfilter中 量制備柱(QIAgen目錄號(hào)12243 )，通過過夜培養(yǎng)物的中量制備來制 備大量的所得載體(pEE12. 4-PN0621和pEE12. 4-PN0521-S114C )。 通過在含1/10體積的3M乙酸鈉(pH5. 2 )的100%乙醇(Sigma目錄號(hào) 分別為S2889和E7023 )中沉淀20 |i g來制備載體以用于轉(zhuǎn)染。在用 70%乙醇洗滌之后，將載體以0. 5jig/jil的工作濃度重懸浮于40pl T. E. pH8.0 (Sigma目錄號(hào)T9285 )中。辟染對(duì)于每次轉(zhuǎn)染，將2 m 1 Lipofectamine 2000加入至96孔平板的 一個(gè)孔中的50 |u 1 Optimem I培養(yǎng)基(Invitrogen目錄號(hào)11668-027 和31985-062 )中。在第2個(gè)孔中，將1. 6 p 1表達(dá)載體(0. 8 p g )加 入至50jal Optimem I培養(yǎng)基中。在5分鐘室溫溫育后，將所述2個(gè) 孔的內(nèi)容物混合在一起并進(jìn)一步進(jìn)行20分鐘溫育。這該第二次溫育 后，將全部轉(zhuǎn)染混合物加入至包含CH0K1SV細(xì)胞的24孔平板的孔中。 將細(xì)胞溫育至少72小時(shí)并收獲上清液。使上清液在4，000 xg下離心 5分鐘以使細(xì)胞碎片形成粒狀沉淀，并貯存于-20X:直至通過TNF ELISA 來測定化合物112 (SEQ ID No: 59)和化合物170 (SEQ ID No: 11)
的表達(dá)?；衔?12DIQMTQSPSS US AS VGDRVTITCRASQAIDS Y LHWYQQKPG K APKLLIYS ASN L已TGVPSRFSGSGSGTDFTLTISStLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQm，KVElKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCYVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP正KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD釘KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVF-WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC5JVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ED No:59)，將微量滴定板(例如Sarstedt 82.9923-148 )用ljul/mL人重組 TNF-a (Peprotech Cat# 300-01 A)在碳酸鹽/碳酸氫鹽包被緩沖液 (pH9. 6)中的溶液進(jìn)行包被，100jLil/孔。在4t:過夜溫育之后，用 含0. 05% Tween-20的PBS ( 0. 01 M, pH7. 2 )洗滌平板三次，和用PBS 洗滌三次。每個(gè)孔中加入200ju 1封閉緩沖液(含1。/4BSA[牛血清白蛋 白，Sigma Cat# A-9647]的PBS)，并在25t:下溫育1小時(shí)。如上所述洗滌平板，并向每個(gè)孔中加入100|Lll體積的稀釋于抗體稀釋劑(含1% BSA和0. 05% Tween 20的PBS)中的樣品或化合物170標(biāo)準(zhǔn)。在 25C下溫育1小時(shí)之后，如上所述洗滌平板，并向每個(gè)孔中加入100 U 1體積的以1: IOOO稀釋于抗體稀釋劑中的二抗(綴合有過氧化物酶 的山羊抗人免疫球蛋白，Zymed， Cat#81-n20)。洗滌平板，并向每 個(gè)孔中加入100 ju 1體積的ABTS底物(2， 2，-連氮基-雙(3-乙基苯并噻 唑啉-6-磺酸)二銨鹽，SigmaCat# A-1888， 0. 5 mg/mL于含0. 03% H202 的檸檬酸鹽緩沖液(pH4.4)中)。底物在室溫下顯色30分鐘，并于 405 nm (參考620 nm )處讀取吸光度。相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定樣品濃 度，并表示為相對(duì)于表達(dá)的化合物112的平均濃度。結(jié)果
逸舍減'避^在結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體中包含截短的CH1導(dǎo)致這樣的在可變結(jié)構(gòu)域 和鉸鏈之間的連接，即相比于缺少截短的CH1的連接(83. 3°/。；以1的 缺口開放罰分，使用在Vector NTI (Invitrogen)上的Align X計(jì)算 出的)，所述在可變結(jié)構(gòu)域和鉸鏈之間的連接具有更高的與常規(guī)IgG! CHl-鉸鏈連接的同源性(91.7%)。增高的同源性可能轉(zhuǎn)變?yōu)樵黾拥膶?duì) 于常規(guī)免疫球蛋白肽序列(對(duì)于其，人類患者應(yīng)當(dāng)是免疫耐受的)的 相像性，從而降低了免疫原性潛力?；衔?70可變區(qū)-截短的CHl-鉸鏈連接 TKVEIKR，KSIgGi Cfrl-鉸鏈連接(NCBI登錄號(hào)AAG00909 ): TKVDKRVEPKS化合物170可變區(qū)-鉸鏈連接(沒有截短的CJ ): TKVEIKREPKSCal序列以雙下劃線標(biāo)示。獲自NCBI蛋白盾數(shù)據(jù)庫(http: 〃www. ncbi. nlm. nih. gov )的CH1 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID No: 60) AAG00909::l STKGPSVFT L APSSKST鄉(xiāng)'I'AAI/JdLVKD YPPEFVTVSW NSGALTSOVH '."KPAVLgSSG6.1 I,YSr,SGWTV F&、SSLGT。TY ICNVNHKrSN TKVDKRVl5PK ;SCPKT1ITCPP CPAPELLGGP121 一SVfIiFPFKPK DTUMISRTPE VTCWVWfiH EDPlWKFIWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS!181 TYRWSVLTV LHQDWLN狄E YKCKVSNKAL PAPIEKT工SK AKGQPREPQV i'Ti PPSREEM241 TKNQVii^jTCL VKGFYPSD工A VEWESNGQPE NNYKTTPPVT' D,':"，GSFTLYS KLTVDKSRWQ301 UGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KS!LSLSPGK CH1 -鉸鏈連接以下劃線標(biāo)示。#和77\^-a謬導(dǎo)#勿應(yīng)## 使用鼠類L929細(xì)胞生存力測定法，對(duì)結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體化合物 170 (SEQIDNo: 11)中和TNF-a介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的能力進(jìn)行了評(píng)估。 在平底96孔板中，以50jLiL體積，制備了化合物170在含10%胎牛血 清的RPMI培養(yǎng)基(RPMI-FBS)中的系列稀釋物。向這些孔的每一個(gè)中 以360 pg/mL的濃度加入50]Li 1的重組人TNF-a( Strathmann Biotec, Hamburg, Germany),隨后加入在50 |u L中的2. 5 x 104個(gè)L929細(xì)胞 和25iuL 40lUg/mL放線菌素D，均在RPMI-FBS中制備。對(duì)照包括沒 有TNF (用于確定100%生存力)的孔、無細(xì)胞(0%生存力)的孔和范 圍為2 pg/mL至4200 pg/mL的TNF-a標(biāo)準(zhǔn)曲線的孔。培養(yǎng)板在5% C02 氣氛中于37X:溫育20小時(shí)，然后在加入25jul的3-(4，5-二曱基噻唑 -2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎮(zhèn)(MTS ) / 汾喚乙基硫酸鹽(phenazine ethosulfate， PES )( Promega， CellTiter 96 AQueous One, Madison USA)后再溫育3小時(shí)。針對(duì)630 nm的參考 波長在492 nm處測定吸光度，和使用從三次重復(fù)的測試孔計(jì)算出的平 均值來繪制生存力曲線。通過隨著化合物濃度增加而細(xì)胞生存力 增加(圖6)，表明了化合物170中和TNF-oc的能力。^希7T^-"^入/7jJ和p7J 7T^憂伴時(shí)潛合結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體化合物170 (SEQ ID No: 11)抑制TNF-oc與人 p55和p75 TNF受體結(jié)合的能力通過受體結(jié)合測定法來進(jìn)行評(píng)價(jià)。以 在碳酸鹽包被緩沖液(pH9.2)中的0. lyg/mL,通過于4C溫育過夜， 將人p55 ( RnD systems,目錄號(hào)372-RI)或p75 ( RnD systems,目 錄號(hào)762-R2 )包被到Maxisorb板(Nunc )上。在抗體稀釋劑(PBS pH7. 2， 0.05% Tween-20， 1% BSA)中制備范圍從100 |i g/mL降至3.15 ng/mL 的化合物170的系列半對(duì)數(shù)(half-log)稀釋物(和無化合物l70的 "空白，，對(duì)照)，并與等體積的在抗體稀釋劑中的60 ng/mL人TNF-ot相混合。還制備了不含PN0621和不含TNF-oc的空白以測量背景結(jié) 合。讓所有混合物在溫和攪動(dòng)下于室溫溫育正好1小時(shí)。在該溫育過 程中，經(jīng)包被的平板用PBS， 0. 05% Tween-20洗滌3次，然后用PBS
洗三次。然后，于室溫用200 ji 1/孔的PBS， 1。/。BSA封閉平板45分鐘。 在洗滌平板后，對(duì)于每個(gè)濃度的受試化合物170向三次重復(fù)的孔中加 入100ja 1的化合物170/TNF-oc混合物，以及加入所有對(duì)照。然后， 將平板于室溫下溫育1小時(shí)。在洗滌平板后，以在抗體稀釋劑中的0.6 Hg/mL，向每個(gè)孔中加入生物素化的抗人TNF-a抗體(RnD Systems, 目錄號(hào)BAF210)，并于室溫溫育l小時(shí)。在洗滌后，以在抗體稀釋劑 中的1:2000，加入鏈霉抗生物素蛋白-HRP綴合物(Zymed，目錄號(hào) 43-4323 ),并于室溫下溫育45分鐘。使用TMB底物(Invitrogen，目 錄號(hào)00-2023 )進(jìn)行顯色，在4分鐘后，用1M HC1終止反應(yīng)。然后， 使用620 nm的參照，在450 nm處測量吸光度讀數(shù)。通過計(jì)算三次重 復(fù)的平均吸光度來進(jìn)行分析。從每個(gè)吸光度值中減去非特異性結(jié)合(無 TNF-a )的平均值。結(jié)果如圖7中所示，并且顯示，化合物170阻止TNF-a與人p55 或p75 TNF受體的相互作用。勿應(yīng)潛合費(fèi)，-"#潛合使用NS0細(xì)胞系27D4對(duì)與細(xì)胞結(jié)合型(跨膜)TNF-a的結(jié)合進(jìn)行 分析，所述細(xì)胞系是用編碼缺乏TACE切割位點(diǎn)的人TNF-a蛋白的基 因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的，從而TNF-oc保持為細(xì)胞膜結(jié)合的，因?yàn)槠洳荒鼙磺懈睢?基于另一種鼠類骨髓瘤(SP2/0)的相似細(xì)胞系也已得到描述(Scalion 等人，(1995) Cytokine 7 251-259 )。在每個(gè)樣品5xl()5個(gè)活27D4細(xì)胞上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，其中 所有步驟于4X:或在冰上進(jìn)行。以100pg/mL，將細(xì)胞粒狀沉淀與受試 樣品(化合物170; SEQ ID No: 11)或不相關(guān)特異性同種型-匹配的 對(duì)照(Sigma，目錄號(hào)15154) —起重懸浮于含2% FBS的PBS中， 并在冰上溫育1小時(shí)。進(jìn)行兩次細(xì)胞洗滌循環(huán)，每次包括以1000 xg 離心10分鐘和將細(xì)胞粒狀沉淀重懸浮于PBS/2% FBS中。在又一次的 離心步驟后，將細(xì)胞粒狀沉淀重懸浮于ioo"i的二抗綴合物(抗人 Fc FITC綴合物，Sigma，目錄號(hào)F9512 )中，并溫育30分鐘。然后，
如上所述將樣品洗兩次，并將細(xì)胞粒狀沉淀重懸浮于500 iul含5 Hg/mL碘化丙錠(Sigma，目錄號(hào)P4864 )的PBS/2% FBS中。在Beckman Coulter Cell Lab Quanta流式細(xì)胞儀上對(duì)細(xì)胞的焚光染色進(jìn)行分析， 和使用WinMDI來處理數(shù)據(jù)。結(jié)果顯現(xiàn)在圖8中，并且顯示，表達(dá)跨膜TNF-ct的NSO 27D4細(xì) 胞(黑色實(shí)線)的化合物170染色顯現(xiàn)出比不相關(guān)特異性同種型-匹配 的對(duì)照(灰色填充)更高的熒光強(qiáng)度。zf或id:必合參〃0 W勿應(yīng)^ ^建ji使用在"材料和方法"部分中所描述的表達(dá)載體來建立表達(dá)化合 物170 (SEQ ID No: 11 )的穩(wěn)定的CH0K1SV細(xì)胞系。簡而言之，在40 jLi g的線性化的質(zhì)粒DNA存在下，在沒有谷氨酰胺的CDCHO無蛋白質(zhì) 培養(yǎng)基中對(duì)1><107個(gè)處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。轉(zhuǎn)染后24 小時(shí)，施加50jaM甲硫氨酸砜亞胺(methionine sulphoximine ) (Sigma)的選擇壓力，并讓抗性細(xì)胞在96孔板中形成集落。當(dāng)接近 匯合時(shí)，將單個(gè)菌落轉(zhuǎn)移至24孔板、T25瓶和隨后T"瓶。在T"瓶 中一旦匯合，就將細(xì)胞系進(jìn)展至在E125錐形瓶中的培養(yǎng)，并且經(jīng)歷6 次傳代培養(yǎng)而適應(yīng)于懸浮生長。 一旦適應(yīng)于懸浮生長，就將細(xì)胞系在 92.5% CDCH0培養(yǎng)基7. 5% DMS0的冷凍混合物中冷藏。在細(xì)胞系通過不同的孔和瓶大小進(jìn)行擴(kuò)展的同時(shí)，與細(xì)胞系進(jìn)入 下一階段的過程相平行地進(jìn)行許多生產(chǎn)率(productivity)評(píng)估。因 此，在24孔板和E125錐形瓶階段進(jìn)行了生產(chǎn)率評(píng)估。在每一情況下， 讓細(xì)胞生長14天，并且就化合物170的水平通過實(shí)施例1中所描述的 TNF ELISA方法對(duì)上清液進(jìn)行評(píng)價(jià)。將細(xì)胞系按生產(chǎn)率進(jìn)行排序，并 選擇最高的10個(gè)，以用于在Lonza Biologies的擁有專利權(quán)的補(bǔ)料-分批生產(chǎn)率評(píng)估中進(jìn)行評(píng)價(jià)。所獲得的生產(chǎn)率在700 mg/L和3371 mg/L 之間。選擇了生產(chǎn)率為2724 mg/L的先導(dǎo)細(xì)胞系，以用于在10L實(shí)驗(yàn) 室規(guī)模的發(fā)酵罐中進(jìn)行評(píng)價(jià)。運(yùn)行四個(gè)分開的10L實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵罐15天，其中基于無蛋白 質(zhì)的CDCH0培養(yǎng)基，采用先導(dǎo)細(xì)胞系和擁有專利權(quán)的通用補(bǔ)料分批工 藝。4個(gè)發(fā)酵的所得的平均生產(chǎn)率是4851 mg/L，其中最高生產(chǎn)率為 4925 mg/L(在15天的發(fā)酵中，對(duì)于非克隆細(xì)胞系，由Lonza Biologies 先前報(bào)道的最高生產(chǎn)率水平為3560 mg/L)。設(shè)計(jì)了所使用的10L實(shí) 驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵罐以模擬在高達(dá)2000L的更大規(guī)模的發(fā)酵罐中所見的 發(fā)酵條件，因此預(yù)期該先導(dǎo)細(xì)胞系適合于商業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)。確實(shí)，在 200L發(fā)酵罐中觀察到了相似的表達(dá)水平。通過蛋白A親和層析對(duì)從表達(dá)化合物170 (SEQ ID No: 70)的先 導(dǎo)細(xì)胞系的4xlOL發(fā)酵中收獲的產(chǎn)物進(jìn)行純化，并且通過在還原和非 還原條件下的SDS PAGE進(jìn)行分析。如圖11中所示的，化合物170表 達(dá)為約90 kDa的單體。該單體由兩個(gè)約40 kDa的亞基組成，它們?cè)?圖12中當(dāng)在還原條件下運(yùn)行SDS PAGE時(shí)可見。由于SDS PAGE不適合 準(zhǔn)確測定蛋白質(zhì)的大小，因而對(duì)化合物170單體作了進(jìn)一步的分析。 ESI-MS (電噴霧電離質(zhì)鐠法)將化合物170單體的大小測定為78. 739 kDa。這與2個(gè)亞基的預(yù)測的分子量(2 x 38. 058 = 76. 116 kDa )是 一致的，其中每個(gè)亞基還攜帶二天線型(biantennary)核心巖藻糖基 化的聚糖糖結(jié)構(gòu)。4#入貞長類#時(shí)長益清爭表歡以O(shè). 5、 5和50mg/kg的劑量，給獼猴皮下施用化合物170 (SEQID No: 11)，并在0. 5、 1、 2、 6和24小時(shí)，隨后在1、 2、 4、 7、10和14天抽取血液樣品。使用實(shí)施例1中所描述的抗-TNF ELISA方法，就化合物170水平的定量對(duì)這些樣品進(jìn)行分析。通過分析這些樣品中化合物170的水平來確定消除半衰期。于0. 5mg/kg，計(jì)算出110. 5±13. 9小時(shí)的消除半衰期。于5 mg/kg和50 mg/kg，計(jì)算出IIO, 9±10. 4和103. 5 ± 11. 5小時(shí)的消除半衰期。當(dāng)以50 mg/kg通過靜脈內(nèi)途徑施用化合物170時(shí)，于10、 30和60分鐘，4和24小時(shí)，2、 4、 7、 10和14天抽取血液樣品。使用實(shí)施例1中所描述的抗-TNFELISA方法，就化合物170水平的定量對(duì)這
些樣品進(jìn)行分析。通過分析這些樣品中化合物170的水平來確定消除 半衰期。在50mg/kg靜脈內(nèi)施用后，計(jì)算出109. 6 ±10. 7小時(shí)的消除 半衰期。才神W姿全'^橫^在動(dòng)物安全性和毒性研究中對(duì)按照GMP標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)的化合物170 (SEQ ID No: ll)進(jìn)行評(píng)價(jià)。 卓浙量的安全^通過皮下或靜脈內(nèi)施用途徑，以0.5、 5和50 mg/kg給不同的猴 施用單劑量的化合物170，它們未顯示與用化合物170進(jìn)行的其治療 有關(guān)的影響。在這些研究中，對(duì)一系列器官作了顯微鏡檢查，未觀察 到任何影響。遂#并萄^浙#和#^從O. 5 mg/kg的劑量(皮下或靜脈內(nèi)施用)開始，每7天給獼猴 施用逐步升高的劑量直至50 mg/kg。就各種生理學(xué)和行為參數(shù)對(duì)動(dòng)物 進(jìn)行評(píng)估，包括血液學(xué)、臨床化學(xué)、體重和器官重以及尸體剖檢后的 器官肉眼檢查。在這些研究自始至終，對(duì)于使用化合物170進(jìn)行的治 療未報(bào)告有不良反應(yīng)。在研究的劑量逐步升高階段之后，在進(jìn)一步的 4周時(shí)間內(nèi)，對(duì)那些經(jīng)皮下接受逐步升高的劑量的動(dòng)物進(jìn)一步施用4 個(gè)50mg/kg的劑量。在各種參數(shù)方面，仍未觀察到與使用化合物170進(jìn)行的治療有關(guān)的影響。 心j&f^安全遂在安裝有無線電遙測監(jiān)測器的獼猴中，評(píng)價(jià)50 mg/kg的化合物 170的心血管安全性。這些監(jiān)測器能直接從有意識(shí)的猴身上報(bào)告一系 列呼吸和心血管參數(shù)。在給予化合物170后，未報(bào)道不良的與治療有 關(guān)的臨床觀察結(jié)果。勿霧斌這在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生在前述實(shí)施例中的化合物170( SEQ ID
No: 11)。還用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)來產(chǎn)生功能性化合物170。對(duì)減去信號(hào)序列的化合物170的氨基酸序列進(jìn)行回譯和用 GeneOptimizerTM進(jìn)行優(yōu)化以用于大腸桿菌(A co//)表達(dá)，并且在 GeneArt GmbH從頭合成。將合成的基因通過Ncol和HindIII限制性 位點(diǎn)(Roche )亞克隆入pBAD glII/His-標(biāo)記的表達(dá)載體(InvUrogen ) 中，從而產(chǎn)生準(zhǔn)備用于細(xì)菌表達(dá)的栽體。通過熱休克法用所述栽體轉(zhuǎn) 化TOP10細(xì)胞(InvUrogen)，并產(chǎn)生單個(gè)菌落的甘油原種。誘導(dǎo)條 件是0. 002%的阿拉伯糖(Sigma;終濃度)和4小時(shí)的誘導(dǎo)期?；?物l70蛋白質(zhì)樣品使用在pBAD細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)手冊(cè)(Invitrogen)中詳 述的滲透壓休克法來產(chǎn)生。使用BCA測定法(Pierce)來測定樣品的 總蛋白質(zhì)濃度。在如實(shí)施例1中所述的ELISA中，就其與TNF-ct的結(jié) 合來檢測由細(xì)菌表達(dá)的化合物170。圖9顯示了在細(xì)菌系統(tǒng)中產(chǎn)生的化合物170在ELISA測定法中保 持與TNF-oc的結(jié)合。用于化合物170的細(xì)菌表達(dá)的DM序列如下:gtgagcgtgctgaccgtgctgcatcaggattggctgaacggcaaagaatacaaatgcaaa GTGTCTAACAAAGCGCTGCC9GCGCCGATTOAAAAAACCATCAGCAAAGCGAAAG(3ccagccgcgtgaaccgcaggtgtataccctgccgccgagccgtgatgaactgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgajscgatattgcggtggaatgggaaagcaa(x3gccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggtgctggatagcgatggcagctttttcctgtatagcaaactgaccgtggataaaagccgttgacagcagggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctoagcctgagcccgggtaaagcggcggcg(SEQIDNo:61)。由SEQ ID No: 61編碼的氨基酸序列如下MASTDIQMTQSPSSIiSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLiILIYSASl^ET GVPSRFSGSGSGTDFTIiTISSLLPEDFATYYCQQWWRPFTFGQGTKVEIKRVEPKSSDKEVHISrAKTKPREEQYNSTYRWSVL/rVIiHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSr/TCIjVKOFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFIjYSKIjTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAAAVDHHHHHH(SEQTDNO:62)。必合# 7"4乂 T^尸介爭W扃類^ ，乂模費(fèi)^W琳^歡^人TNF轉(zhuǎn)基因小鼠系Tgl97表現(xiàn)出失調(diào)的TNF表達(dá)，并發(fā)展出慢 性炎性多關(guān)節(jié)炎(Keffer， J.等人，(1991)， Transgenic mice expressing human tumor necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis. EMB0 Journal 10: 4025-31 )。在這些小鼠中 化合物170 (SEQ ID No: 11)的施用防止了關(guān)節(jié)炎的形成以及相關(guān)的 體重減輕(圖IOA和B) 。 8只雜合的Tgl97的組(每組包含4只雄性 和4只雌性)通過每周兩次腹膜內(nèi)注射化合物170和不相關(guān)特異性對(duì) 照人IgGi (帕利珠單抗[Synagis⑧]，Medlmmune/Abbott)(在PBS中) 進(jìn)行治療，均以10mg/kg。治療在小鼠3周齡時(shí)開始。按一周的間隔， 對(duì)小鼠進(jìn)行稱重并基于目測踝關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)(胂脹、變形和活動(dòng)程度) 進(jìn)行評(píng)分(關(guān)節(jié)炎得分)。在/么合浙J"哞&I U4^^ CW化合物112 (SEQ ID No: 59)是化合物170 (SEQ ID No: 11) 的修飾產(chǎn)物，其在位置114處包含半胱氨酸殘基而不是絲氨酸殘基，
后者存在于化合物170的這個(gè)位置上。通過與化合物170進(jìn)行比較評(píng) 價(jià)了半胱氨酸114置換為絲氨酸對(duì)于蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。通過如"材 料和方法"部分所述的使用固相TNF的ELISA,就蛋白質(zhì)表達(dá)來對(duì)用 化合物112和170的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的多個(gè)培養(yǎng)物進(jìn)行檢 測。結(jié)果顯示在圖11中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，可以對(duì)如具體實(shí)施方案中所示的本 發(fā)明進(jìn)行眾多改變和/或修飾，而不背離如廣泛描述的本發(fā)明的精神或 范圍。因此，這些實(shí)施方案在所有方面被視為舉例說明性的而非限制 性的。
權(quán)利要求
1. 與人TNF-α結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含(a)與人TNF-α結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)；(b)經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)序列；(c)人或靈長類重鏈恒定區(qū)序列，其具有不多于20個(gè)殘基的截短的CH1結(jié)構(gòu)域，其中所述經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)序列包含缺失或者至少一個(gè)半胱氨酸殘基的單氨基酸置換，所述半胱氨酸殘基通常促進(jìn)重和輕抗體鏈間二硫鍵的形成。
2. 權(quán)利要求1的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中所述具有截短的CJ結(jié) 構(gòu)域的人或靈長類重鏈恒定區(qū)序列包含不多于IO個(gè)殘基。
3. 權(quán)利要求2的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中所述具有截短的CH1結(jié) 構(gòu)域的人或靈長類重鏈恒定區(qū)序列包含不多于5個(gè)殘基。
4. 權(quán)利要求3的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中所迷具有截短的CJ結(jié) 構(gòu)域的人或靈長類重鏈恒定區(qū)序列包含不多于單個(gè)殘基。
5. 權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中CJ結(jié)構(gòu) 域和鉸鏈區(qū)的序列為XEPKSZDKTHTCPPCPA (SEQ ID No: 64)，其中X 為纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸，和Z不存在或?yàn)槌腚装彼嵋酝獾钠?他氨基酸。
6. 權(quán)利要求5的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中X為纈氨酸，和Z為絲
7. 權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中所述dAb包含免疫球蛋白重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中所述可變結(jié)構(gòu)域包含至 少一個(gè)具有來源于新世界靈長類的序列的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其中所述CDR選自YAATKLQS (SEQ ID No: 1) 、 YEASSLQS (SEQ ID No: 2)、 YEASKLQS (SEQ ID No: 3)和YSASNLET (SEQ ID No: 4)。
8. 權(quán)利要求7的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中所述CDR為CDR2。
9. 權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中所述結(jié)構(gòu) 域抗體具有選自下列的序列DlQMTQSPSSLSASVCJDRyTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKUulYSASNLETG VPSRFSGSGSGTDFTL'脂LQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR (SEQ ID No:7);DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLUYSASNLET GVPSRFSGSGSGTOFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTTCIQGTKVEIKR (SEQ ID No:8);DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETCfVPSRFSGSGSGTDFTLTISSl丄PeDFATYYCQQVVWRPHTFGQGTKVEIKR(SEQ ID N。:9);DlQMTQSPSSLSASVCmRVTITCRASQAlDSyLHWYQQKPGKAPKLUYSASNLETC;VPSRFSGSGSGTDn、LTISSLLPEDFATYYCQQVYWRPFTFGQC5TKV以KR(SEQIDNo:丄O);VPSRPSGSGSOTDFrLTISSLQPE歸TYYCQQWWRPFTFClQGTKVEIKR (SEQ ID No:52);VPSRFSGRaSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFrFGQGTKVEIKR (SEQ ID No鄰；DIQMTQSPSSLSASVGDRVTrrCRASQSlDSYLHWYQQKPGKAPKl丄lYSASNLETG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLVPEDFATYYCQQVVWRPFTK3QGTKVE1KR (S即DNo:54);和與這些序列之一至少95°/。同一的序列。
10. 權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中用絲氨 酸殘基置換在鉸鏈區(qū)內(nèi)的半胱氨酸殘基，所述半胱氨酸殘基通常促進(jìn) 重和輕抗體鏈間二硫鍵的形成。
11. 權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中所述鉸 其中所述Ch2和Ch3結(jié)枸 其中所述CH2和CH3結(jié)構(gòu)鏈區(qū)包含序列EPKSSDKTHTCPPCPA ( SEQ ID No: 12)。
12. 權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中所述恒 定區(qū)包含與SEQ ID No: 63所示序列至少60%同 一的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。
13. 權(quán)利要求12的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中所述CH2和CH3結(jié)構(gòu) 域與SEQ ID No: 63所示序列至少80%同一。
14. 權(quán)利要求13的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中所述CH2和CH3結(jié)構(gòu) 域與SEQ ID No: 63所示序列至少90°/。同一。
15. 權(quán)利要求14的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中所述CH2和CH3結(jié)構(gòu) 域與SEQ ID No: 63所示序列至少95%同一。
16. 權(quán)利要求15的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中所述CH2和CH3結(jié)構(gòu) 域與SEQ ID No: 63所示序列至少96%同一。
17. 權(quán)利要求16的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體， 域與SEQ ID No: 63所示序列至少97%同一。
18. 權(quán)利要求17的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體， 域與SEQ ID No: 63所示序列至少98%同一。
19. 權(quán)利要求18的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中所述(^2和"3結(jié)構(gòu) 域與SEQ ID No: 63所示序列至少99%同一。
20. 權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中CDR1、 CDR3或至少一個(gè)構(gòu)架區(qū)被修飾以改善抗原結(jié)合。
21. 權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)的結(jié)構(gòu)域抗體，其中所述氨基酸序 列與SEQ ID No: 11所示序列至少60%同一。
22. 權(quán)利要求21的結(jié)構(gòu)域抗體，其中所述氨基酸序列與SEQ ID No: 11所示序列至少80%同一。
23. 權(quán)利要求22的結(jié)構(gòu)域抗體，其中所述氨基酸序列與SEQ ID No: 11所示序列至少90%同一。
24. 權(quán)利要求23的結(jié)構(gòu)域抗體，其中所述氨基酸序列與SEQ ID No: 11所示序列至少95%同一。
25. 權(quán)利要求24的結(jié)構(gòu)域抗體，其中所述氨基酸序列與SEQ IDNo: 11所示序列至少96°/。同一。
26. 權(quán)利要求25的結(jié)構(gòu)域抗體，其中所述氨基酸序列與SEQ ID No: 11所示序列至少97%同一。
27. 權(quán)利要求26的結(jié)構(gòu)域抗體，其中所述氨基酸序列與SEQ IDNo: 11所示序列至少98%同一。
28. 權(quán)利要求27的結(jié)構(gòu)域抗體，其中所述氨基酸序列與SEQ IDNo: 11所示序列至少99%同一。
29. 權(quán)利要求28的結(jié)構(gòu)域抗體，其中所述氨基酸序列與SEQ IDNo: 11所示序列相同。
30. 權(quán)利要求1至29中任一項(xiàng)的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中所述結(jié) 構(gòu)域抗體在人中具有低免疫原性。
31. 與人TNF-oc結(jié)合的二聚結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中該二聚體由 兩個(gè)權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體組成。
32. 權(quán)利要求31的二聚結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中所述二聚結(jié)構(gòu)域 抗體構(gòu)建體是同二聚體。
33. 權(quán)利要求32的二聚結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中組成同二聚體的 所述結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體包含與SEQ ID No: 11所示序列至少60%同一 的氨基酸序列。
34. 權(quán)利要求33的二聚結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中組成同二聚體的 所述結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體包含與SEQ ID No: 11所示序列至少80%同一 的氨基酸序列。
35. 權(quán)利要求34的二聚結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中組成同二聚體的 所述結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體包含與SEQ ID No: 11所示序列至少90%同一 的氨基酸序列。
36. 權(quán)利要求35的二聚結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中組成同二聚體的 所述結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體包含與SEQ ID No: 11所示序列至少95°/。同一 的氨基酸序列。
37. 權(quán)利要求36的二聚結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中組成同二聚體的 所述結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體包含與SEQ ID No: 11所示序列至少96%同一 的氨基酸序列。
38. 權(quán)利要求37的二聚結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中組成同二聚體的 所述結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體包含與SEQ ID No: 11所示序列至少97%同一 的氨基酸序列。
39. 權(quán)利要求38的二聚結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中組成同二聚體的 所述結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體包含與SEQ ID No: 11所示序列至少98%同一 的氨基酸序列。
40. 權(quán)利要求39的二聚結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中組成同二聚體的 所述結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體包含與SEQ ID No: 11所示序列至少99%同一 的氨基酸序列。
41. 權(quán)利要求40的二聚結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中組成同二聚體的 所述結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體包含SEQ ID No: ll所示的氨基酸序列。
42. 分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)的結(jié)構(gòu)域 抗體構(gòu)建體。
43. 分離的核酸分子，其包含編碼與人TNF-oc結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體 構(gòu)建體的核酸序列，其中所述核酸序列與SEQ IDNo: 50或SEQ ID No: 51所示序列至少60%同一。
44. 權(quán)利要求43的分離的核酸分子，其中所述核酸序列與SEQ ID No: 50或SEQIDNo: 51所示序列至少80%同一。
45. 權(quán)利要求44的分離的核酸分子，其中所述核酸序列與SEQID No: 50或SEQIDNo: 51所示序列至少90%同一。
46. 權(quán)利要求45的分離的核酸分子，其中所述核酸序列與SEQID No: 50或SEQIDNo: 51所示序列至少95%同一。
47. 權(quán)利要求46的分離的核酸分子，其中所述核酸序列與SEQ ID No: 50或SEQIDNo: 51所示序列至少96°/。同一。
48. 權(quán)利要求47的分離的核酸分子，其中所述核酸序列與SEQID No: 50或SEQIDNo: 51所示序列至少97%同一。
49. 權(quán)利要求48的分離的核酸分子，其中所述核酸序列與SEQID No: 50或SEQIDNo: 51所示序列至少98%同一。
50. 權(quán)利要求49的分離的核酸分子，其中所述核酸序列與SEQ ID No: 50或SEQIDNo: 51所示序列至少99%同一。
51. 權(quán)利要求50的分離的核酸分子，其中所述核酸序列與SEQ ID No: 50或SEQIDNo: 51所示序列相同。
52. 分離的核酸分子，其包含編碼與人TNF-ot結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體 構(gòu)建體的核酸序列，其中所述核酸序列在高嚴(yán)緊度條件下與SEQ ID No: 50或SEQ ID No: 51所示的核苷酸雜交。
53. 藥物組合物，其包含有效量的權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)的結(jié) 構(gòu)域抗體構(gòu)建體，以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
54. 藥物組合物，其包含有效量的權(quán)利要求31至41中任一項(xiàng)的二聚結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
55. 用于檢測樣品中的人TNF-a的方法，其包括將樣品與有效量 的權(quán)利要求1至41中任一項(xiàng)的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體進(jìn)行接觸，和檢測所 結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的量。
56. 權(quán)利要求55的方法，其中所述樣品為生物樣品。
57. 用于在人受試者中治療特征在于人TNF-a活性的病癥的方 法，其包括給所述受試者施用有效量的權(quán)利要求55或權(quán)利要求56的 藥物組合物。
58. 權(quán)利要求57的方法，其中所迷特征在于人TNF-oc活性的病 癥選自炎癥，炎性疾病，膿毒癥，包括敗血癥性休克、內(nèi)毒素性休克、 年蘭氏陰性膿毒癥和中毒性休克綜合征；自身免疫性疾病，包括類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎、幼年關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性脊推炎、強(qiáng)直性脊推炎、舍格倫 綜合征、骨關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、過敏癥、多發(fā)性硬化癥、自身免 疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎、銀屑病、類天皰瘡以及腎病綜合 征；眼的炎性病況，包括黃斑變性、葡萄膜炎、貝赫切特??；感染性 疾病，包括由于感染和感染后繼發(fā)的惡病質(zhì)所引起的發(fā)熱和肌痛；移 植物抗宿主?。荒[瘤生長或轉(zhuǎn)移，惡性血液??；肺部病癥，包括哮喘、 成人呼吸窘迫綜合征、休克肺、慢性肺部炎性疾病、肺結(jié)節(jié)病、肺纖 維化和矽肺；炎癥性腸病，包括克羅恩病和潰癌性結(jié)腸炎；心臟病癥， 充血性心力衰竭；血管病癥，包括韋格納病、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎；炎癥性骨病；中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥，例如阿爾茨海默病；周圍神經(jīng)系統(tǒng)病癥， 例如坐骨神經(jīng)痛；肝炎，凝血障礙，燒傷，再灌注損傷，子宮內(nèi)膜異 位癥，瘢痕瘤形成，和瘢痕組織形成。
59. 權(quán)利要求57或權(quán)利要求58的方法，其中所迷特征在于人 TNF-a活性的病癥為血管生成相關(guān)的眼病癥。
60. 權(quán)利要求59的方法，其中所述血管生成相關(guān)的眼病癥為年齡 相關(guān)性黃斑變性。
全文摘要
本發(fā)明提供了與人TNF-α結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含(a)與人TNF-α結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)；(b)經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)序列；(c)人或靈長類重鏈恒定區(qū)序列，其具有不多于20個(gè)殘基的截短的C_H1結(jié)構(gòu)域，其中所述經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)序列包含缺失或者至少一個(gè)半胱氨酸殘基的單氨基酸置換，所述半胱氨酸殘基通常促進(jìn)重和輕抗體鏈間二硫鍵的形成。
文檔編號(hào)C07K16/24GK101400703SQ200780008370
公開日2009年4月1日 申請(qǐng)日期2007年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月1日
發(fā)明者A·G·多伊爾, B·P·伍爾文, I·M·湯姆林森, J·A·李, P·A·詹寧斯 申請(qǐng)人:阿拉納治療有限公司