一種噬菌體抗體庫及其在禽流感免疫檢測(cè)中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗體庫，是在Pcomb3載體的Xba和Sac酶切位點(diǎn)間插入一段免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)VL基因序列，以及Spe和Xho內(nèi)切酶切位點(diǎn)間插入一段免疫球蛋白重鏈可變區(qū)VH基因序列，其特征在于：所述的兩段基因片段包含了抗體可變區(qū)輕鏈和重鏈的可能組合，可以與禽流感病毒的抗原親和富集，可應(yīng)用于禽流感的免疫檢測(cè)中。其優(yōu)點(diǎn)是：可以不經(jīng)動(dòng)物免疫獲得高親和力抗體，制備周期短，此抗體庫以小鼠天然免疫球蛋白可變區(qū)輕鏈和重鏈基因?yàn)閬碓礃?gòu)建的噬菌體抗體庫，理論上包含小鼠體內(nèi)所有可能的抗體，通過篩選可以直接獲得不同禽流感病毒的特異性抗體庫，其篩選具有效率高、通量高、選擇基數(shù)大、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，使其在禽流感等動(dòng)物性疫病檢測(cè)方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種噬菌體抗體庫及其在禽流感免疫檢測(cè)中的應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種噬菌體抗體庫及其應(yīng)用，尤其是一種能檢測(cè)不同亞型禽流感病毒的抗體庫及其在禽流感免疫檢測(cè)中的應(yīng)用，屬于一種利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建的抗體庫并將其用于禽流感免疫檢測(cè)的范疇。
【背景技術(shù)】:
[0002]禽流感等動(dòng)物疫病的免疫檢測(cè)技術(shù)是目前國內(nèi)外防范動(dòng)物疫病傳播的一項(xiàng)廣泛應(yīng)用的技術(shù)，與核酸檢測(cè)一同構(gòu)成目前動(dòng)物疫病防治的主要方法。免疫檢測(cè)具有操作簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、樣品需要量少等優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物疫病檢測(cè)方面取得了豐碩的成果。其中，抗體的制備是核心內(nèi)容，目前抗體的制備和快速發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)呈現(xiàn)緊密結(jié)合的形式。
[0003]從天然或免疫的小鼠脾細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞提取抗體基因，以改建的噬菌體為載體構(gòu)建抗體庫，與ELISA法相結(jié)合，從已構(gòu)建的展示庫中篩選具有針對(duì)禽流感等疫病的特異性抗體已成為解決傳統(tǒng)抗體制備不易的最具應(yīng)用潛力的途徑，即對(duì)禽流感等動(dòng)物疫病特異性抗原包被在酶標(biāo)板上，然后加入以構(gòu)建好的帶篩選的噬菌體抗體庫，根據(jù)抗原抗體親和性的大小，經(jīng)過吸附-洗脫-擴(kuò)增的篩選過程，從而得到針對(duì)禽流感等動(dòng)物疫病的高親和抗體。
[0004]目前國內(nèi)外動(dòng)物疫病檢測(cè)由分離培養(yǎng)疫病病原發(fā)展到直接使用分子生物學(xué)方法快速高效檢測(cè)，主要包括了核酸和蛋白免疫檢測(cè)兩方面內(nèi)容，，免疫檢測(cè)的高效、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)已得到廣泛認(rèn)同，但隨著各種高通量免疫檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，要求制備更多特異性和通用性好的抗體，傳統(tǒng)的雜交瘤細(xì)胞制備已無法滿足各種高通量檢測(cè)需求的發(fā)展，抗體庫技術(shù)跳過雜交瘤步驟直接從所需抗體的基因到蛋白，既做到了抗體表型和基因型的統(tǒng)一，增強(qiáng)了抗體的特異性，又具備大量篩選抗體的庫容，滿足高通量免疫檢測(cè)的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于，利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建一種噬菌體抗體庫及其在流感等動(dòng)物疫病免疫檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種噬菌體抗體庫，是在Pcomb3載體的Xba 1、SacI酶切位點(diǎn)間插入抗體λ基因片段，在Spe 1、Xho I酶切位點(diǎn)間插入抗體K基因片段得到Fab基因片段載體，其特征在于:所述的Fab基因片段包含了抗體的全套重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，可與流感類病毒抗原親和富集，篩選后得到特異性抗體。
[0007]在本發(fā)明涉及的噬菌體抗體庫中:所述的Fab基因片段是這樣構(gòu)建的:
[0008]a)流感疫苗免疫小鼠后，提取小鼠脾細(xì)胞總RNA，以其為模板，Oligo (dT) 15為引物合成cDNA第一鏈；
[0009]b)以cDNA第一鏈為模板，利用設(shè)計(jì)的多組λ鏈引物以近等摩爾的所有引物擴(kuò)增輕鏈基因片段，大小700bp左右，用設(shè)計(jì)的 多組K鏈引物以近等摩爾的所有引物擴(kuò)增重鏈基因片段，大小700bp左右；
[0010]C)將輕鏈基因片段在Pcomb3載體的Xba 1、Sac I酶切位點(diǎn)間插入，然后將重鏈基因片段在Pcomb3載體的Spe 1、Xho I酶切位點(diǎn)間插入，在Xba I和Xho I酶切位點(diǎn)間為Fab片段的序列。
[0011]將得到的含F(xiàn)ab片段的重組載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化擴(kuò)增。
[0012]在本發(fā)明涉及的噬菌體抗體庫中:所述的以近等摩爾的所有引物擴(kuò)增輕鏈基因片段是指:將5條前引物以等摩爾混合后作為前引物，與I條后引物量相等，然后作為前后引物用于擴(kuò)增；所述的以近等摩爾的所有引物擴(kuò)增重鏈基因片段是指:將2條前引物以等摩爾混合后作為前引物，將2條后引物以等摩爾混合后作為后引物，前后引物量相等用于擴(kuò)增。所述的輕鏈前引物含有Xba I酶切位點(diǎn)，所述的輕鏈前引物含有Sac I酶切位點(diǎn)，所述的重鏈前引物含有Spe I酶切位點(diǎn)，所述的重鏈后引物含有Xho I酶切位點(diǎn)。
[0013]在本發(fā)明涉及的噬菌體抗體庫中:輕鏈基因片段在Pcomb3載體中的插入是指:將純化定量后的輕鏈基因與pComb3載體分別以Xba 1、Sac I進(jìn)行雙酶切，純化后進(jìn)行連接；重鏈基因片段在Pcomb3載體中的插入是指:將純化定量后的輕鏈基因與重組入輕鏈基因片段的載體分別以Spe 1、Xho I進(jìn)行雙酶切，純化后進(jìn)行連接；所述的轉(zhuǎn)化是指:a)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞XLl-Blue中；b)先用ImlSOC (無抗生素)液體培養(yǎng)基37°C、200rpm培養(yǎng)lh，然后取100 μ I涂氨芐板，其余加入50mlS0C液體培養(yǎng)基(含amp和tet)中37°C、200rpm過夜培養(yǎng)；c)次日計(jì)算平板上克隆數(shù)，估算庫容；d)將轉(zhuǎn)化后的菌液加入1012pfu的VCSM13輔助噬菌體感染，37°C振蕩培養(yǎng)2h后加入卡那霉素至濃度70mg/L，然后37°C震蕩過夜，離心取上清移入另一離心管，加入PEG8000和NaCl，搖勻5min再冰浴30min沉淀菌體，以2mL的1% BSA-PBS工作液懸浮沉淀，4°C條件下14000r/min離心5min，所得上清即為噬菌體抗體庫。
[0014]一種如本發(fā)明所述噬菌體抗體庫在流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于:
[0015]a)以禽流感病毒為抗原包被固相篩選ELISA板，洗滌，加封閉液，洗滌，加入噬菌體抗體庫抗體，洗去未結(jié)合的噬菌體抗體；采用宿主菌直接洗脫法對(duì)所建噬菌體抗體庫進(jìn)行篩選，洗脫特異性結(jié)合的噬菌體抗體，感染增殖，輔助噬菌體超感染；重復(fù)以上步驟，共進(jìn)行4輪親和洗脫；
[0016]b)用經(jīng)過4輪淘篩后的噬菌體抗體庫感染XLl-Blue菌，涂布2XYT-AT平板，隨即選取平板上96個(gè)單克隆抗體培養(yǎng)，VCSMl3感染后，振搖培養(yǎng)，離心，培養(yǎng)基重懸沉淀，振搖培養(yǎng)過夜。離心取上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，測(cè)定每孔450nm和630nm吸光度值，按A450-A630計(jì)算每孔吸光度值；當(dāng)P/N(陽性/陰性)值大于2.1時(shí)，判為陽性株；
[0017]c)將陽性單克隆噬菌體感染非抑制型大腸桿菌HB2151，在含IPTG和Amp的2XYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其上清中富含抗體分子，可獲得可溶性抗體；
[0018]d)表達(dá)的可溶性抗體對(duì)a步驟中禽流感病毒抗原具有親和性。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:可以不經(jīng)動(dòng)物免疫獲得高親和力抗體，制備周期短，此抗體庫以小鼠天然免疫球蛋白可變區(qū)輕鏈和重鏈基因?yàn)閬碓礃?gòu)建的噬菌體抗體庫，理論上包含小鼠體內(nèi)所有可能的抗 體，通過篩選可以直接獲得不同禽流感病毒的特異性抗體庫，其篩選具有效率高、通量高、選擇基數(shù)大、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，使其在禽流感等動(dòng)物性疫病檢測(cè)方面具有廣泛的應(yīng)用前景?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0020]圖1是在pComb3載體的Xba 1、Sac I酶切位點(diǎn)插入輕鏈基因片段和在Xba 1、SacI酶切位點(diǎn)插入重鏈基因片段的構(gòu)件示意圖。
[0021]圖2是輕鏈基因和重鏈基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖；
[0022]圖3是重組輕鏈?zhǔn)删w載體的栓酶切驗(yàn)證；
[0023]圖4是重組重鏈?zhǔn)删w載體的栓酶切驗(yàn)證；
[0024]圖5是噬菌體抗體ELISA法的建立
【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1
[0026]噬菌體抗體庫的構(gòu)建
[0027]材料:
[0028]8周齡的小鼠Balb/c5只，體重20_25g，均購自北京維通利華公司。
[0029]XLl-Blue感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞、抗生素氨芐和四環(huán)素購自北京鼎國生物技術(shù)公司、Pcomb3噬菌粒載體和輔助噬菌體VCSM13均購自Pharmacia公司；抗M13-HRP標(biāo)記抗體購自GE-Healthcare公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒、ExTaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶(Xba1、Sac1、Xho1、SpeI)、T4DNA連接酶、均購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；蛋白胨、酵母提取物購自O(shè)xoids公司。
[0030]引物設(shè)計(jì):
[0031]參照Parmley等(1989)、Essono等(2003)和數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)(曹亞,2003)設(shè)計(jì)了四組小鼠IgG類抗體引物P1、P2、P3、P4，其中P1、P2為輕鏈基因前后引物含有Xba1、SacI酶切位點(diǎn)，P3、P4為重鏈基因引物含有Xho1、SpeI酶切位點(diǎn)。
[0032]輕鏈基因前后引物(含酶切位點(diǎn))
[0033]
【權(quán)利要求】
1.一種噬菌體抗體庫，是在Pcomb3載體的Xba和Sac酶切位點(diǎn)間插入一段免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)VL基因序列，以及Spe和Xho內(nèi)切酶切位點(diǎn)間插入一段免疫球蛋白重鏈可變區(qū)VH基因序列，其特征在于:所述的兩段基因片段包含了抗體可變區(qū)輕鏈和重鏈的可能組合，可以與禽流感病毒的抗原親和富集。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所屬的噬菌體抗體庫，其特征在于:所述的VL和VH基因片段是這樣構(gòu)建的: a)SPF級(jí)Balb/c小鼠提取脾細(xì)胞總RNA，使用Oligo (dT) 15和隨機(jī)引物合成cDNA第一鏈； b)根據(jù)設(shè)計(jì)的一組VL弓丨物經(jīng)RT-PCR法擴(kuò)增抗體輕鏈可變區(qū)VL基因，大小在700bp左右； c)根據(jù)設(shè)計(jì)的另一組組VH引物經(jīng)RT-PCR法擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)VH基因，大小在700bp左右；將獲得的輕鏈VL和VH片段與Pcomb3載體連接與轉(zhuǎn)化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的噬菌體抗體庫，其特征在于:VL基因片段先和Pcomb3載體連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XLl-Blue擴(kuò)增后驗(yàn)證，驗(yàn)證連接成功的重組載體再和VH基因片段連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述德爾噬菌體抗體庫，其特征在于:所述構(gòu)建的VL基因與Pcomb3載體連接是指:將純化后定量的VL基因分別以Xba I和Sac I內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切消化，純化定量后與同樣雙酶切的Pcomb3載體連接；所述的轉(zhuǎn)化是指:a)冰上放置30min，42°C熱激90s，冰上放置3min轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XLl-Blue ；b)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入2 X YT培養(yǎng)基后37°C振蕩培養(yǎng)lh，5倍梯度稀釋將菌液涂布于LBamp瓊脂板上，37°C培養(yǎng)過夜，其余的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入含四環(huán)素和氨芐青霉素 的SOC液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)；c)次日收集菌體驗(yàn)證連接率為87%。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的噬菌體抗體庫，其特征在于:所述的VH基因片段和重組載體連接是指:將純化后定量的VH基因分別以Spe I和Xho I內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切消化，純化定量后與同樣雙酶切的權(quán)利要求4所述的重組載體連接；所述的轉(zhuǎn)化是指:a)冰上放置30min，42°C熱激90s，冰上放置3min轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XLl-Blue ；b)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入2 X YT培養(yǎng)基后37°C振蕩培養(yǎng)lh，5倍梯度稀釋將菌液涂布于LBamp瓊脂板上，37°C培養(yǎng)過夜，其余的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入含四環(huán)素和氨芐青霉素的SOC液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)；c)次日計(jì)算平板上的克隆數(shù)，d)將轉(zhuǎn)化后菌液加入輔助噬菌體VCSM13超感染，加入kana37°C過夜培養(yǎng)，離心沉淀菌體，取上清加入PEG和NaCl離心棄上清，以BSA-PBS工作液懸浮沉淀，4°C離心所得上清即為Fab噬菌體表面展示文庫。
6.—種如權(quán)利要求1所述噬菌體抗體庫在禽流感疫病免疫檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于: a)用禽流感H5N1全病毒抗原包被固相篩選ELISA板，洗滌，加封閉液，洗滌，加入噬菌體抗體庫抗體，洗滌去除未結(jié)合的噬菌體抗體；重復(fù)以上步驟，共進(jìn)行四輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”富集篩選； b)將最后一輪篩選增殖得到的曬菌體稀釋后鋪于培養(yǎng)板上培養(yǎng)過夜，挑取96個(gè)單菌落于XLl-Blue細(xì)胞培養(yǎng)板中,振蕩培養(yǎng)過夜；從第一塊板各孔中分別轉(zhuǎn)移10 μ I菌液至第二塊板，振蕩培養(yǎng)；加輔助噬菌體VCSM13超感染，振蕩培養(yǎng)；離心后培養(yǎng)基重懸沉淀，培養(yǎng)過夜。離心取上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)；iP/N值大于2.1時(shí)，該菌株判為陽性單克隆噬菌體菌株; c)將陽性單克隆噬菌體感染非抑制型E.coliHB2151細(xì)胞在含IPTG和Amp的2XYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其上清中富含抗體分子，獲得可溶性抗體； d)表達(dá)的可溶性抗體對(duì)a步驟中抗原相對(duì)應(yīng)的禽流感病毒H5N1具有親和性。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所訴的噬菌體抗體庫在禽流感免疫檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于:所述的禽流感病毒是指含有HN蛋白的不同亞型的禽流感病毒。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103806110SQ201210436740
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月6日
【發(fā)明者】汪琳, 邢佑尚, 張燦, 秦奕, 柏亞鐸, 周琦, 劉艷華, 任魯風(fēng), 蒲靜, 張玉紅, 齊瑋, 王緒敏, 張偉, 張沫琦 申請(qǐng)人:北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 中國科學(xué)院北京基因組研究所, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所