專利名稱：高復(fù)雜度哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及哺乳動(dòng)物多肽展示文庫(kù)、特別是哺乳動(dòng)物的全長(zhǎng)抗體展示文庫(kù)的構(gòu)建和篩選。
背景技術(shù)：
通過(guò)細(xì)胞表面展示技術(shù)，包括噬菌體展示、核糖體/mRNA展示和酵母展示，有可能進(jìn)行特異性結(jié)合靶抗原的抗體的高通量篩選。(Hoogenboom等，Nature Biotechnology (2005)，23 (9) 1105-1116)。盡管這些篩選平臺(tái)各自具有其特殊的優(yōu)點(diǎn)，但它們都基于抗體在不同于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的環(huán)境中的表達(dá)。在那些系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的相比，蛋白質(zhì)折疊、糖基化、二硫鍵形成和/或修飾可能不同。為了避免這些問(wèn)題，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了基于抗體在其自然環(huán)境、即哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的篩選平臺(tái)。例如，通過(guò)研究，已開(kāi)發(fā)了允許在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面上展示免疫球蛋白小型文庫(kù)的抗體展示技術(shù)。參見(jiàn)例如Higuchi等，J. Immun. Methods (1997) 202 :193-204。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中執(zhí)行抗體篩選的一個(gè)主要缺點(diǎn)是能夠篩選的抗體的數(shù)量受限。因?yàn)槊總€(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞在轉(zhuǎn)染過(guò)程中能夠攝取編碼不同抗體的大量不同多核苷酸，從產(chǎn)生抗體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞分離出編碼抗體的多核苷酸既困難又繁瑣。因此，在哺乳動(dòng)物展示領(lǐng)域的嘗試集中于建立的哺乳動(dòng)物展示系統(tǒng)在每個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在較少量不同多核苷酸。例如， W005/063817公開(kāi)了一種篩選全長(zhǎng)抗體小型文庫(kù)的方法。在將單基因拷貝均勻整合到每個(gè)細(xì)胞中之后，將群體通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分揀，以獲得表達(dá)具有高結(jié)合親和性抗體的細(xì)胞。 也參見(jiàn)US2005/0059082和W008/070367。大多數(shù)目前可用的哺乳動(dòng)物展示技術(shù)不能用于篩選編碼大量不同抗體的多核苷酸的高度復(fù)雜的文庫(kù)。盡管噬菌體展示技術(shù)允許在單次淘選循環(huán)中篩選IOltl至甚至IO15個(gè)克隆，但現(xiàn)有方法中的哺乳動(dòng)物展示篩選程序的通量限于同時(shí)分析約IO6至IO7個(gè)克隆。因此，對(duì)于允許高復(fù)雜度哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)篩選的篩選方法和系統(tǒng)，存在著需求。在本文中提到的所有出版物、專利、專利申請(qǐng)和公布的專利申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容，在此以其全文引為參考。發(fā)明概述本發(fā)明提供了篩選哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)的方法，其包括編碼具有所需性質(zhì)的多肽的多核苷酸的篩選方法、編碼具有所需性質(zhì)的多肽的多核苷酸的富集方法、含有編碼具有所需性質(zhì)的多肽的多核苷酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分離方法、含有編碼具有所需性質(zhì)的多肽的多核苷酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的篩選方法、具有所需性質(zhì)的多肽的鑒定方法以及獲得具有所需性質(zhì)的多肽的方法。在某些實(shí)施方案中，方法包含a)從用多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染) 的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群；b)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)；c)從用多核苷酸的子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群。在某些實(shí)施方案中，將步驟b)和c)重復(fù)一次以上。在某些實(shí)施方案中，方法還包含a)將從哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸子文庫(kù)，其中細(xì)胞亞群通過(guò)從用多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞初始群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞來(lái)獲得；b)從用多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群。在某些實(shí)施方案中，方法包含從用多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群，其中子文庫(kù)通過(guò)將從哺乳動(dòng)物細(xì)胞的中間群體提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA以產(chǎn)生多核苷酸子文庫(kù)來(lái)產(chǎn)生，其中細(xì)胞的中間群體通過(guò)從用多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞初始群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞來(lái)獲得。在某些實(shí)施方案中，多肽是異聚蛋白。在某些實(shí)施方案中，多肽是抗體。在某些實(shí)施方案中，提供了編碼具有所需性質(zhì)的多肽的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a)從用多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群；b)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)；c) 從用多核苷酸的子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群；以及d)從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群分離出編碼具有所需性質(zhì)的多肽的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，初級(jí)文庫(kù)中的多核苷酸編碼至少I(mǎi)O9種(包括例如約101(1、 10"、1012、1013、1014、1015和IO"5種中的任一個(gè)數(shù)量)不同多肽。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體在群體中的各個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠攝取約100個(gè)以上、例如約103、104、105 或IO6個(gè)中的任一個(gè)數(shù)量以上的不同多核苷酸拷貝的條件下，用初級(jí)文庫(kù)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。在某些實(shí)施方案中，步驟C)中的篩選條件比步驟a)的條件更嚴(yán)緊。在某些實(shí)施方案中，提供了編碼具有所需性質(zhì)的異聚蛋白的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a)從哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的異聚蛋白的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體用編碼第一種多肽和第二種多肽的多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)，并且其中第一種多肽和第二種多肽在細(xì)胞表面上形成異聚蛋白；b)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)；c)從隨后的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體篩選出展示具有所需性質(zhì)的異聚蛋白的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群，其中所述隨后的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體用編碼第一種多肽和第二種多肽的多核苷酸的子文庫(kù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并且其中第一種多肽和第二種多肽形成異聚蛋白；以及d)從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群分離出編碼具有所需性質(zhì)的多肽的多核苷酸。
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在某些實(shí)施方案中，提供了編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸的分離方法， 所述方法包含a)從用編碼抗體的多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群； b)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)；c)從用多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群；以及d)從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群分離出編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，初級(jí)文庫(kù)中的多核苷酸編碼至少I(mǎi)O9種不同抗體。在某些實(shí)施方案中，步驟a)包含(i)將哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體在適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合條件下與抗原相接觸；以及(ii)回收與抗原結(jié)合的哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群。在某些實(shí)施方案中，步驟c)包含(i)將富集的哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)在適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合條件下與抗原相接觸；以及(ii)回收與抗原結(jié)合的哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群。在某些實(shí)施方案中，步驟d)包含i)從細(xì)胞亞群分離mRNA，ii)將mRNA擴(kuò)增成cDNA ；iii)將cDNA克隆到克隆載體中；以及iv)測(cè)定DNA的序列。在某些實(shí)施方案中，提供了編碼特異性識(shí)別特定抗原的抗體的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a)篩選出用編碼輕鏈的第一個(gè)多核苷酸初級(jí)文庫(kù)和編碼重鏈的第二個(gè)初級(jí)文庫(kù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、并在細(xì)胞表面上展示由所述多核苷酸編碼的抗體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體，以獲得哺乳動(dòng)物細(xì)胞的亞群；b)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)；c)篩選出用多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染并在細(xì)胞表面上展示由所述多核苷酸編碼的抗體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體，以獲得哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群；以及d)從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群分離出編碼特異性識(shí)別特定抗原的抗體的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，在步驟d)之前將步驟b)和c)重復(fù)至少一次。在某些實(shí)施方案中，在步驟d)之前將步驟b)和c)重復(fù)不超過(guò)約3次。在某些實(shí)施方案中，初級(jí)文庫(kù)中的多核苷酸編碼至少I(mǎi)O9種不同抗體。在某些實(shí)施方案中，步驟a)包含(i)將哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體在適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合條件下與抗原相接觸；以及(ii)回收與抗原結(jié)合的哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群。在某些實(shí)施方案中，步驟c)包含(i)將富集的哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)在適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合條件下與抗原相接觸；以及(ii)回收與抗原結(jié)合的哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群。在某些實(shí)施方案中，步驟d)包含i)從細(xì)胞亞群分離mRNA，ii)將mRNA擴(kuò)增成cDNA;iii)將cDNA 克隆到克隆載體中；以及iv)測(cè)定DNA的序列。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體在群體中的各個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠攝取約100個(gè)以上、例如約103、104、105或IO6個(gè)中的任一個(gè)數(shù)量以上的不同多核苷酸拷貝的條件下，用初級(jí)文庫(kù)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。在某些實(shí)施方案中，方法還包含將多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體中。在某些實(shí)施方案中，提供了編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸的分離方法， 所述方法包含a)從用編碼輕鏈的第一個(gè)多核苷酸初級(jí)文庫(kù)和編碼重鏈的第二個(gè)多核苷酸初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞， 并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群；b)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生編碼輕鏈的第一個(gè)多核苷酸子文庫(kù)和編碼重鏈的第二個(gè)多核苷酸子文庫(kù)；c)從用第一個(gè)多核苷酸子文庫(kù)和第二個(gè)多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群；d)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生編碼輕鏈和重鏈的第三個(gè)多核苷酸子文庫(kù)；e)從用第三個(gè)多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第三個(gè)亞群；以及f)從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第三個(gè)亞群分離編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸。另一方面，提供了用編碼抗體的多核苷酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體，其中多核苷酸總計(jì)編碼至少約IO9種不同重組抗體。還提供了用于執(zhí)行本文描述的方法的文庫(kù)和試劑盒。還提供了在篩選過(guò)程中產(chǎn)生的子文庫(kù)和從本文描述的方法獲得的多核苷酸/多肽。附圖簡(jiǎn)述

圖1提供了示意圖，其顯示了本文描述的示例性篩選方法。圖2提供了示意圖，其顯示了示例性的單盒表達(dá)載體。酶1-3是指能夠被不同限制性酶識(shí)別(例如識(shí)別非回文序列的限制性酶)的限制性酶切割位點(diǎn)，其中用所述限制性酶切割所產(chǎn)生的每個(gè)片段的末端不自連。圖3提供了構(gòu)建單盒表達(dá)載體pDGB-HC-TM的程序的示意圖。HC-TM片段通過(guò) RT-PCR擴(kuò)增和PCR裝配產(chǎn)生。在PCR反應(yīng)過(guò)程中將限制性酶識(shí)別序列合并到片段中。將片段插入到載體PCDNA5-FRT中以形成過(guò)渡載體。然后從過(guò)渡載體刪除潮霉素表達(dá)盒，以形成載體 pDGB-HC-TM。圖4顯示了載體pDGBHC-TM的限制性酶消化結(jié)果。將載體用5種限制性酶以四種方式進(jìn)行消化，并通過(guò)在瓊脂糖凝膠中電泳來(lái)分析。Μ:11Λ以上DNA分子量梯 (Invitrogen) ；A =Nhel+Xhol ；B =Sfil ；C =BsmBI ；D :BstXI。圖5A提供了構(gòu)建雙盒表達(dá)載體的程序的示意圖。通過(guò)PCR擴(kuò)增4個(gè)片段，并通過(guò)四路G-way)連接將它們連接在一起，以形成載體pDGB4。然后將FCS插入到載體中以形成載體 pDGB4-FCS。圖5B顯示了載體pDGB4的限制性酶消化結(jié)果。將pDGB4的16號(hào)克隆的純化質(zhì)粒 DNA用3種限制性酶以5種方式進(jìn)行消化，并在1 %瓊脂糖-TBE凝膠中進(jìn)行電泳分析。M DNA 分子量梯；1 =SfiI I ；2 =BstX I ；3 =BsmB I ；4 =BstX I+Sfi I ；5 =BsmB I+Sfi I。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了從哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)篩選出具有所需性質(zhì)的多肽的高效方法。方法是基于下述事實(shí)，即盡管用外來(lái)DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的每個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠含有多達(dá)IO6個(gè)質(zhì)?？截悾挥幸恍〔糠?例如約IO2-IO3個(gè)拷貝)質(zhì)粒被轉(zhuǎn)錄成mRNA并表達(dá)成多肽。因此，來(lái)自從哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)篩選中獲得的陽(yáng)性細(xì)胞的mRNA，與那些細(xì)胞中的DNA相比，復(fù)雜度明顯更低(例如復(fù)雜度低至少1000倍)。本發(fā)明的方法利用了這種復(fù)雜度的降低。在從原始哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)中對(duì)展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞進(jìn)行初始篩選并獲得富集有那些細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群后，從哺乳動(dòng)物細(xì)胞的富集亞群分離mRNA并通過(guò)方法例如RT_PCR(反轉(zhuǎn)錄酶PCR)進(jìn)行擴(kuò)增，以產(chǎn)生多核苷酸的合并物(子文庫(kù))。將該多核苷酸合并物繼而導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞并進(jìn)行另一輪文庫(kù)篩選。第二輪篩選過(guò)程可以重復(fù)例如一次、兩次或多次。本文描述的方法允許對(duì)哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)進(jìn)行高效篩選，使得能夠以至少I(mǎi)O9的多樣性篩選哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)。本文提供的方法特別適合于篩選異聚蛋白。例如，提供了篩選抗體的方法。在一個(gè)示例性方法中，將抗體輕鏈的初級(jí)文庫(kù)和抗體重鏈的初級(jí)文庫(kù)共轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，允許在細(xì)胞表面上展示抗體。在對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行初始篩選以獲得富集有表達(dá)所需抗體的細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群后，從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取mRNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增并克隆到適合的載體中，以產(chǎn)生重鏈的子文庫(kù)和輕鏈的子文庫(kù)。將重鏈和輕鏈的子文庫(kù)繼而導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，并進(jìn)行另一輪文庫(kù)篩選。第二輪篩選可以重復(fù)例如一次、兩次或多次。 在篩選方法的最后階段，將抗體輕鏈和重鏈克隆到雙表達(dá)盒載體中，以產(chǎn)生單一抗體文庫(kù) (與兩個(gè)不同文庫(kù)相反)。然后將單一文庫(kù)進(jìn)行最后一輪篩選，以獲得編碼所需抗體的多核苷酸。圖1進(jìn)一步提供了示意圖，其顯示了篩選抗體展示文庫(kù)的示例性方法。因此，一方面，本發(fā)明提供了篩選哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)的方法或利用哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)篩選來(lái)分離編碼具有所需性質(zhì)的多肽(例如抗體)的多核苷酸的方法。另一方面，提供了用編碼多肽(例如抗體)的多核苷酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體，其中所述多核苷酸在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面上總計(jì)編碼至少I(mǎi)O9種不同的重組多肽。另一方面，提供了產(chǎn)生用于哺乳動(dòng)物展示篩選的多核苷酸文庫(kù)的方法，其中所述多核苷酸總計(jì)編碼至少I(mǎi)O9種不同的重組多肽(例如抗體)。還提供了用于執(zhí)行本文描述的方法的試劑盒。還提供了通過(guò)本文描述的方法分離的多核苷酸和由所述多核苷酸編碼的多肽。應(yīng)該理解，前面的一般性描述和下面的詳細(xì)描述都僅僅是實(shí)例性和解釋性的，并且不對(duì)本文描述的組合物和方法構(gòu)成限制。在本申請(qǐng)中，除非另外特別指明，否則單數(shù)形式的使用包括了復(fù)數(shù)形式。此外，“或”的使用意味著“和/或”，除非指明不是如此。同樣地， “包含”和“包括”不打算是限制性的。應(yīng)該理解，本文描述的本發(fā)明的方面和實(shí)施方案包括“由方面和實(shí)施方案構(gòu)成”和 /或“基本上由方面和實(shí)施方案構(gòu)成”。定義當(dāng)在本文中使用時(shí)，下列術(shù)語(yǔ)和詞組打算具有下列含義“展示”或“哺乳動(dòng)物展示”是指在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表面上呈遞不同的重組多肽。本文中使用的“文庫(kù)”是指多核苷酸的多樣化集合體或混合物，其包含編碼不同重組多肽的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，多核苷酸文庫(kù)可以在給定的多核苷酸集合體內(nèi)包含至少I(mǎi)O6UO7UO8UO9UOiqUOiiUOi2UO13UO14UO15種或更多的不同多核苷酸。典型地， 文庫(kù)中的不同多核苷酸是相關(guān)的，例如它們?cè)醋杂趩我粍?dòng)物物種(例如人、小鼠、兔、山羊、 馬)、組織類型、器官或細(xì)胞類型。“文庫(kù)”可以包含共同屬類的多核苷酸。例如，屬類可以是編碼某一型和類的免疫球蛋白亞基多肽的多核苷酸，例如，文庫(kù)可以編碼抗體μ、Y 1、Y2、 Υ3, γ4、α 1、α 2、ε或δ重鏈，或抗體κ或λ輕鏈。盡管本文描述的任一文庫(kù)的每個(gè)成員可能編碼相同的重鏈或輕鏈恒定區(qū)，但文庫(kù)可以總計(jì)包含至少106、107、108、109、101(1、 10"、1012、1013、1014或IO15種不同的可變區(qū)，即與共同恒定區(qū)相伴的“多種”可變區(qū)。“哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)”是指包含編碼能夠展示在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的不同重組多肽的多核苷酸的文庫(kù)。在某些情形中，術(shù)語(yǔ)還通常用于包括用多核苷酸文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。文庫(kù)的“多樣性”是指文庫(kù)中由多核苷酸編碼的不同重組多肽的數(shù)量。本文中使用的“篩選”是指對(duì)包含所需物質(zhì)的合并物進(jìn)行可以檢測(cè)到所需物質(zhì)的測(cè)定、然后回收或獲得其中所需物質(zhì)被檢測(cè)到并任選被富集的合并物的等份試樣的方法。
本文中使用的“回收”是指將所需物質(zhì)與合并物的不需要的其余部分粗略分離。篩選條件的“嚴(yán)緊性”是指用于篩選方法的測(cè)定條件。例如，當(dāng)執(zhí)行與特定結(jié)合配偶體的結(jié)合測(cè)定時(shí)，篩選條件的嚴(yán)緊性是指結(jié)合測(cè)定條件的嚴(yán)緊性。“哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體”是指其中可以導(dǎo)入并展示多核苷酸文庫(kù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群。 盡管優(yōu)選情況下細(xì)胞群體是單一培養(yǎng)物，即群體中的每個(gè)細(xì)胞是相同細(xì)胞類型的，但也設(shè)想了細(xì)胞的混合培養(yǎng)物。細(xì)胞可以是黏附的，即附著于固相基質(zhì)生長(zhǎng)的細(xì)胞，或供選地，細(xì)胞可以處于懸浮狀態(tài)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是源自于原發(fā)腫瘤的細(xì)胞、源自于轉(zhuǎn)移腫瘤的細(xì)胞、初級(jí)細(xì)胞、已經(jīng)失去接觸抑制的細(xì)胞、轉(zhuǎn)化的初級(jí)細(xì)胞、永生化的初級(jí)細(xì)胞、可以經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞，以及從它們衍生的細(xì)胞系?！翱贵w”是免疫球蛋白分子，其能夠通過(guò)位于所述免疫球蛋白分子可變區(qū)中的至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)與靶例如糖類、多核苷酸、脂類、多肽等結(jié)合。當(dāng)在本文中使用時(shí)，該術(shù)語(yǔ)不僅涵蓋完整的多克隆或單克隆抗體，而且包含其片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、單鏈(ScFv)、其突變體、天然存在的變體、包含具有所需特異性的抗原識(shí)別位點(diǎn)的抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、嵌合抗體，以及包含具有所需特異性的抗原識(shí)別位點(diǎn)的免疫球蛋白分子的任何其他修飾構(gòu)型。“人源化”抗體是指這樣的分子，其具有基本上源自于非人類物種免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點(diǎn)，并且分子的其余免疫球蛋白結(jié)構(gòu)是基于人類免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和/或序列。 抗原結(jié)合位點(diǎn)可以包含融合到恒定結(jié)構(gòu)域上的完整可變結(jié)構(gòu)域，或只含有嫁接到可變結(jié)構(gòu)域中適合的構(gòu)架區(qū)上的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。抗原結(jié)合位點(diǎn)可以是野生型，或可以通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代加以修飾，例如被修飾成與人類免疫球蛋白更類似。某些形式的人源化抗體保留了所有CDR序列(例如包含來(lái)自于小鼠抗體的所有6個(gè)CDR的人源化小鼠抗體)。其他形式的人源化抗體具有相對(duì)于原始抗體來(lái)說(shuō)改變的一個(gè)或多個(gè)CDR(1、2、3、4、5、6個(gè))， 其也被稱為“源自于” 一個(gè)或多個(gè)⑶R的一個(gè)或多個(gè)⑶R?！扒逗峡贵w”是指這樣的抗體，其中重鏈和輕鏈的每個(gè)氨基酸序列的一部分與源自于特定物種或?qū)儆谔囟愋偷目贵w的相應(yīng)序列同源，而鏈的其余區(qū)段與與另一種抗體的相應(yīng)序列同源。典型地，在這些嵌合抗體中，輕鏈和重鏈兩者的可變區(qū)都模擬源自于一個(gè)哺乳動(dòng)物物種的抗體的可變區(qū)，而恒定區(qū)部分與源自于另一物種的抗體中的序列同源。這種嵌合形式的一個(gè)明顯優(yōu)點(diǎn)是，例如，可以使用來(lái)自非人類宿主生物的容易獲得的雜交瘤或B 細(xì)胞，從當(dāng)前已知的來(lái)源方便地產(chǎn)生可變區(qū)，并與源自于例如人類細(xì)胞制備物的恒定區(qū)組合。在可變區(qū)具有容易制備的優(yōu)點(diǎn)、并且特異性不受其來(lái)源影響的同時(shí)，當(dāng)注射抗體時(shí)，人類的恒定區(qū)與來(lái)自于非人類來(lái)源的恒定區(qū)相比，引發(fā)人類對(duì)象的免疫應(yīng)答的可能性更低。 然而，定義不限于該具體實(shí)例?？贵w的“可變區(qū)”是指單獨(dú)或組合的抗體輕鏈可變區(qū)或抗體重鏈可變區(qū)。重鏈和輕鏈可變區(qū)各由四個(gè)構(gòu)架區(qū)(FR)構(gòu)成，所述架構(gòu)區(qū)通過(guò)三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、也稱為超變區(qū)相連。每條鏈中的CDR由FR保持緊鄰在一起，并且與來(lái)自另一條鏈的CDR共同促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成。至少存在兩種確定CDR的技術(shù)(1)基于物種交叉序列變異性的方法(艮口 Kabat等，《免疫重要的蛋白質(zhì)的序歹lj》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)(第五版，1991，National Institutes of Health, Bethesda MD))；以及(2)基于抗原-抗體復(fù)合物的晶體學(xué)研究的方法(ΑΙ-lazikani等，(1997) J. Molec. Biol. 273 927-948)。當(dāng)在本文中使用時(shí)，CDR可以是指由任一種方法或兩種方法的組合定義的CDR?？贵w的“恒定區(qū)“是指單獨(dú)或組合的抗體輕鏈恒定區(qū)或抗體重鏈恒定區(qū)?？贵w或多肽與抗原或靶“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”，是指它的結(jié)合與它對(duì)其他物質(zhì)的結(jié)合相比親和性、親合力更高、更容易結(jié)合和/或持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。通過(guò)閱讀本定義，應(yīng)該理解，與第一個(gè)靶特異性或優(yōu)先結(jié)合的抗體或多肽，可以或不可以與第二個(gè)靶特異性或優(yōu)先結(jié)合。因此，“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”不是必定要求(盡管可以包括)排他性結(jié)合。一般來(lái)說(shuō)，但不是必需的，結(jié)合是指優(yōu)先結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“全長(zhǎng)抗體”、“完整抗體”或“整個(gè)抗體”在本文中可互換使用，是指抗體處于其基本上完整的形式而不是抗體片段。具體來(lái)說(shuō)，該術(shù)語(yǔ)是指具有包含F(xiàn)c區(qū)的重鏈的抗體。全長(zhǎng)抗體可以是天然序列的抗體或抗體變體?！翱贵w片段“只包含完整抗體的一部分，一般包括完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，從而保留了結(jié)合抗原的能力。本定義涵蓋的抗體片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，其具有VL、CL、 VH和CHl結(jié)構(gòu)域；(ii) Fab'片段，其是在CHl結(jié)構(gòu)域的C-端具有一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CHl結(jié)構(gòu)域；(iv)Fd'片段，其具有VH和CHl結(jié)構(gòu)域并在CHl結(jié)構(gòu)域的C-端具有一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基；(v)Fv片段，其具有單個(gè)抗體的VL 和VH結(jié)構(gòu)域；(vi)dAb片段，其由VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；(vii)分離的CDR區(qū)；(viii)F(ab' )2片段，其是二價(jià)片段，包含在鉸鏈區(qū)由二硫橋相連的兩個(gè)Fab'片段；(ix)單鏈抗體分子(例如單鏈Fv ；scFv) ； (χ)具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的“雙抗體(diabodies) ”，其包含連接在同一個(gè)多肽鏈中的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL) ； (xi) “線性抗體“，其包含一對(duì)串聯(lián)的Fd區(qū)段(VH-CH1-VH-CH1)，與互補(bǔ)的輕鏈多肽一起形成了一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“重鏈”是指較大的免疫球蛋白亞基，其通過(guò)氨基端區(qū)域與免疫球蛋白輕鏈結(jié)合。重鏈包含可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域。恒定結(jié)構(gòu)域還包含CH1、鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。在IgE、IgM和IgY的情況下，重鏈包含CH4結(jié)構(gòu)域但是不具有鉸鏈結(jié)構(gòu)域。詞組“免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域”是指CH1、鉸鏈、CH2、CH3、CH4結(jié)構(gòu)域或其任何組合。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“輕鏈”是指較小的免疫球蛋白亞基，其與重鏈的氨基端區(qū)域結(jié)合。與重鏈相同，輕鏈包含可變區(qū)和恒定區(qū)。存在兩種不同類型的輕鏈，κ和λ，其在本文中被稱為“免疫球蛋白輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域”。一對(duì)輕鏈可以與一對(duì)任一種的各種重鏈結(jié)合，形成免疫球蛋白分子。在輕鏈的意義中還涵蓋了具有與κ恒定區(qū)(C-K)相連的λ可變區(qū) (V-λ)或與λ恒定區(qū)(C-λ)相連的Κ可變區(qū)(V-K)的輕鏈。術(shù)語(yǔ)“抗體變體”當(dāng)在本文中使用時(shí)，是指在重鏈和/或輕鏈中具有單個(gè)或多個(gè)突變的抗體。在某些實(shí)施方案中，突變存在于可變區(qū)中。在某些實(shí)施方案中，突變存在于恒定區(qū)中。當(dāng)在本文中使用時(shí)，“核酸”或“多核苷酸”或語(yǔ)法等價(jià)物是指共價(jià)連接在一起的至少兩個(gè)核苷酸。核酸和多核苷酸是任何長(zhǎng)度的聚合物，包括例如200、300、500、1000、2000、 3000、5000、7000、10，000等。本文描述的核酸一般含有磷酸二酯鍵，盡管在某些情況下包括了可以具有至少一個(gè)不同鍵例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或0-甲基氨基磷酸酯鍵以及肽核酸骨架和鍵的核酸類似物?？梢灾圃焯烊淮嬖诘暮怂岷皖愃莆锏幕旌衔?； 或者，可以制造不同核酸類似物的混合物以及天然存在的核酸和類似物的混合物。
當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“多肽”是指氨基酸殘基的聚合物。當(dāng)在本文中使用時(shí)， 術(shù)語(yǔ)“多肽”包含蛋白、肽和異聚蛋白。術(shù)語(yǔ)多肽還適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在氨基酸的人造化學(xué)模擬物的聚合物，以及含有修飾殘基的天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。在本發(fā)明的情形中，術(shù)語(yǔ)“多肽”涵蓋異聚蛋白，例如抗體(例如全長(zhǎng)抗體)。本文中使用的“異聚蛋白”是指具有至少兩個(gè)多肽鏈的蛋白，其中至少兩個(gè)多肽鏈彼此不同。例如，異聚蛋白可以是具有輕鏈和重鏈的抗體。在某些實(shí)施方案中，異聚蛋白是 T細(xì)胞受體。在某些實(shí)施方案中，異聚蛋白是本文所述的抗體樣肽體(peptibody)。本文中使用的“肽體”是指其中多肽與抗體的重鏈或輕鏈恒定區(qū)的N-端融合的嵌合分子。例如，多肽可以融合到抗體重鏈的Fc區(qū)?；蛘?，多肽可以融合到重鏈的全長(zhǎng)恒定區(qū)。多肽也可以融合到抗體輕鏈的CL區(qū)。本文中的術(shù)語(yǔ)“重組”多核苷酸是指正常情況下在其天然環(huán)境中不能發(fā)現(xiàn)的多核苷酸。應(yīng)該理解，當(dāng)重組多核苷酸被制造并重新導(dǎo)入宿主細(xì)胞或生物體后，它將非重組地復(fù)制，即使用宿主細(xì)胞的體內(nèi)細(xì)胞機(jī)制而不是體外操作；然而，這種核酸一旦重組產(chǎn)生后，盡管隨后非重組地復(fù)制，但出于本發(fā)明的目的仍被當(dāng)作是重組的。術(shù)語(yǔ)“重組多肽”是使用重組技術(shù)、例如通過(guò)如上所述的重組核酸的表達(dá)所制造的多肽。術(shù)語(yǔ)“異源的”當(dāng)用于指稱核酸的部分時(shí)，表示核酸包含兩個(gè)或多個(gè)正常情況下彼此不能發(fā)現(xiàn)相同的關(guān)系的子序列。例如，核酸典型通過(guò)重組產(chǎn)生，使得兩個(gè)或多個(gè)來(lái)自于例如不相關(guān)基因的序列、例如來(lái)自一個(gè)來(lái)源的啟動(dòng)子和來(lái)自另一個(gè)來(lái)源的編碼區(qū)進(jìn)行排列以制造新功能性核酸。同樣地，異源蛋白經(jīng)常是指兩個(gè)或多個(gè)彼此不能發(fā)現(xiàn)相同關(guān)系的子序列，例如融合蛋白?！皢?dòng)子”典型是一批指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸控制序列。當(dāng)在本文中使用時(shí)，啟動(dòng)子包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的必需核酸序列，例如II型聚合酶啟動(dòng)子情況下的TATA元件。啟動(dòng)子還任選包括遠(yuǎn)處的增強(qiáng)子或阻遏子元件，其可位于距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)多達(dá)幾千堿基對(duì)的位置?！敖M成型”啟動(dòng)子是在大多數(shù)環(huán)境和發(fā)育條件下有活性的啟動(dòng)子。“誘導(dǎo)型”啟動(dòng)子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)控下有活性的啟動(dòng)子?！翱刹僮鬟B接的”是指兩個(gè)或多個(gè)組分的并置，其中所描述的組分處于允許它們以所打算的方式起作用的關(guān)系下。例如，啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子如果以順式起作用控制或調(diào)節(jié)相連編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則其與編碼序列是可操作連接的。一般來(lái)說(shuō)，但不是必需地，“可操作連接的”DNA序列是鄰接的，在需要連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)時(shí)或在分泌前導(dǎo)區(qū)的情況下，是鄰接并且同閱讀框的。然而，盡管可操作連接的啟動(dòng)子一般位于編碼序列的上游，但它不是必需與其鄰接的。聚腺苷化位點(diǎn)如果位于編碼序列的下游末端，使得轉(zhuǎn)錄經(jīng)過(guò)編碼序列進(jìn)入聚腺苷化序列，則聚腺苷化位點(diǎn)與編碼序列可操作連接。連接通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域已知的重組方法實(shí)現(xiàn)，例如使用PCR方法、通過(guò)退火、或通過(guò)在方便的限制性位點(diǎn)連接。如果不存在方便的限制性位點(diǎn)，那么按照常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸適配體或接頭。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”是指將外源核酸轉(zhuǎn)移或?qū)氲剿拗骷?xì)胞中的過(guò)程。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞包括對(duì)象的初級(jí)細(xì)胞及其后代。宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌、 酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞。
當(dāng)在本文中使用時(shí)，“細(xì)胞表面束縛結(jié)構(gòu)域(tether domain) ”是指賦予多肽與宿主細(xì)胞外膜相連的能力的氨基酸序列，并且其有時(shí)不總是天然存在于目標(biāo)蛋白中。正如在本文中所述，細(xì)胞表面束縛結(jié)構(gòu)域包括例如跨膜結(jié)構(gòu)域或糖基化磷脂酰肌醇(GPI)信號(hào)序列。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”是指自我復(fù)制的多核苷酸，并且在本發(fā)明中， 包含表達(dá)構(gòu)建物。表達(dá)載體將包含至少一個(gè)復(fù)制原點(diǎn)(也稱為“復(fù)制起點(diǎn)”)。復(fù)制原點(diǎn)賦予在宿主中復(fù)制的能力，并可以是病毒、真核或原核生物的。表達(dá)載體可用于穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞系，或可用于原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。表達(dá)載體可以存在于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體中的染色體之外。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體中，表達(dá)載體可以作為游離體載體繁殖，或者可以整合到宿主細(xì)胞染色體中。本發(fā)明的表達(dá)載體可以進(jìn)一步包含至少一個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以便于原核或真核轉(zhuǎn)染體的識(shí)別。當(dāng)在本文中使用時(shí)，表達(dá)載體可以包括真核和原核的復(fù)制起點(diǎn)。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“信號(hào)肽”是指介導(dǎo)蛋白通過(guò)包圍ER的膜插入的疏水序列。I型跨膜蛋白也包含信號(hào)序列。當(dāng)在本文中使用時(shí)，“信號(hào)序列”是氨基端疏水序列， 其通常在一部分或整個(gè)蛋白通過(guò)ER膜插入到ER腔中之后被酶切除。因此，在本技術(shù)領(lǐng)域中已知序列的信號(hào)前體形式可以作為蛋白前體形式的一部分存在，但是在蛋白的成熟形式中一般不存在。當(dāng)?shù)鞍妆环Q為包含信號(hào)序列時(shí)，應(yīng)該理解為盡管蛋白的前體形式包含信號(hào)序列，但蛋白的成熟形式將可能不包含信號(hào)序列。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有功能的信號(hào)肽或序列的實(shí)例包括下列美國(guó)專利No. 4，965，195中描述的白介素_7(IL_7)的信號(hào)序列；Cosman等((1984)，Nature 312 :768)中描述的白介素_2受體的信號(hào)序列；歐洲專利 No. O 367 566中描述的白介素-4受體的信號(hào)肽；美國(guó)專利No. 4，968，607中描述的I型白介素-1受體的信號(hào)序列；歐洲專利No. O 460 846中描述的II型白介素_1受體的信號(hào)肽；人類IgG的信號(hào)序列(其是METDTLLLWVLLLWVPGSTG)；以及人類生長(zhǎng)激素的信號(hào)序列 (MATGSRTSLLLAFGLLCLPffLQEGSA) 0許多其他信號(hào)序列在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的。在某些實(shí)施方案中，信號(hào)肽可以是目標(biāo)蛋白的天然存在的信號(hào)肽，或者它可以是異源信號(hào)肽。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合配偶體”在本文中以其最廣的含義使用，是指兩個(gè)或多個(gè)在體外/體內(nèi)條件下能夠互相結(jié)合的多肽序列。這種結(jié)合配偶體的實(shí)例包括但不限于抗體與抗原、配體與受體、酶與底物。當(dāng)在本文中使用時(shí)，除非另有指明，否則不帶具體數(shù)量指稱的名詞可以是指單數(shù)或復(fù)數(shù)(即可以是指一個(gè)或多個(gè))。本發(fā)明的方法本發(fā)明提供了篩選哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)的方法，其包括編碼具有所需性質(zhì)的多肽的多核苷酸的篩選方法、編碼具有所需性質(zhì)的多肽的多核苷酸的富集方法、含有編碼具有所需性質(zhì)的多肽的多核苷酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分離方法、含有編碼具有所需性質(zhì)的多肽的多核苷酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的篩選方法、具有所需性質(zhì)的多肽的鑒定方法以及獲得具有所需性質(zhì)的多肽的方法。方法一般需要將從以前的文庫(kù)篩選中回收的哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的 mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)。該步驟可以重復(fù)一次或多次。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法包含a)從用多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染 (例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞，
12并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群；b)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)；c)從用多核苷酸的子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群。在某些實(shí)施方案中，將步驟b)和c)重復(fù)一次以上。在某些實(shí)施方案中，方法包含a)將從哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸子文庫(kù)，其中細(xì)胞亞群通過(guò)從用多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞初始群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞來(lái)獲得；b)從用多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群。在某些實(shí)施方案中，方法包含從用多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群，其中子文庫(kù)通過(guò)將從哺乳動(dòng)物細(xì)胞的中間群體提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA以產(chǎn)生多核苷酸子文庫(kù)來(lái)產(chǎn)生，其中細(xì)胞的中間群體通過(guò)從用多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞初始群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞來(lái)獲得。在某些實(shí)施方案中，多肽是異聚蛋白。在某些實(shí)施方案中，多肽是抗體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼具有所需性質(zhì)的多肽的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a)從用多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群；b)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)；c)從用多核苷酸的子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群；以及d)從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群分離出編碼具有所需性質(zhì)的多肽的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，初級(jí)文庫(kù)中的多核苷酸編碼至少I(mǎi)O9種不同多肽。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體在群體中的各個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠攝取約100個(gè)以上、例如約103、104、105或IO6個(gè)中的任一個(gè)數(shù)量以上的不同多核苷酸拷貝的條件下，用初級(jí)文庫(kù)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。在某些實(shí)施方案中，步驟c)中的篩選條件比步驟a)的條件更嚴(yán)緊。在某些實(shí)施方案中，在步驟d)之前將步驟b)和C)重復(fù)至少一次。在某些實(shí)施方案中，在步驟d)之前將步驟b)和c)重復(fù)不超過(guò)約3次。在某些實(shí)施方案中，方法還包含將多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體中。在某些實(shí)施方案中，步驟b)還包含將所述多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。 在某些實(shí)施方案中，步驟b)中cDNA的擴(kuò)增通過(guò)PCR執(zhí)行。在某些實(shí)施方案中，cDNA使用一組引物通過(guò)PCR擴(kuò)增。在步驟b)和C)被重復(fù)至少一次的某些實(shí)施方案中，后面步驟中的測(cè)定條件可以比前面步驟中的條件更嚴(yán)緊。在方法的后面步驟中高嚴(yán)緊性的篩選條件允許多核苷酸在后來(lái)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群中進(jìn)一步富集并便于分離。在某些實(shí)施方案中，提供了編碼具有所需性質(zhì)的多肽的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a)將從哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)，其中細(xì)胞亞群通過(guò)從用多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染) 的哺乳動(dòng)物細(xì)胞初始群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞來(lái)獲得；b)從用多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群；以及C)從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群分離出編碼具有所需性質(zhì)的多肽的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，提供了編碼具有所需性質(zhì)的多肽的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a)從用多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的亞群，其中子文庫(kù)通過(guò)將從哺乳動(dòng)物細(xì)胞的中間群體提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA以產(chǎn)生多核苷酸子文庫(kù)來(lái)產(chǎn)生，其中細(xì)胞的中間群體通過(guò)從用多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞初始群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞來(lái)獲得；以及b)從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群分離出編碼具有所需性質(zhì)的多肽的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，提供了篩選哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)的方法，其中方法包含a)從用多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群；b)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)；c)從用多核苷酸的子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群。在某些實(shí)施方案中，提供了篩選哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)的方法，其中方法包含a)將從哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸子文庫(kù)，其中細(xì)胞亞群通過(guò)從用多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞初始群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞來(lái)獲得；b)從用多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群。在某些實(shí)施方案中，提供了篩選哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)的方法，其中方法包含從用多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群，其中子文庫(kù)通過(guò)將從哺乳動(dòng)物細(xì)胞的中間群體提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA以產(chǎn)生多核苷酸子文庫(kù)來(lái)產(chǎn)生，其中細(xì)胞的中間群體通過(guò)從用多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞初始群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞來(lái)獲得。在某些實(shí)施方案中，所需性質(zhì)是與結(jié)合配偶體的特異性結(jié)合。例如，在某些實(shí)施方案中，提供了編碼識(shí)別結(jié)合配偶體的多肽的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a)從用多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體中篩選出展示識(shí)別結(jié)合配偶體的多肽的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的亞群；b)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)；c)從用多核苷酸的子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示識(shí)別結(jié)合配偶體的多肽的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群；以及d)從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群分離編碼具有所需性質(zhì)的多肽的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，步驟a)包含i)將哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體與結(jié)合配偶體相接觸；以及ii)回收與結(jié)合配偶體結(jié)合的哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群。在某些實(shí)施方案中，步驟c)包含i)將哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體與結(jié)合配偶體相接觸；以及ii)回收與結(jié)合配偶體結(jié)合的哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群。在某些實(shí)施方案中，步驟c)中的結(jié)合條件比步驟a)中的更嚴(yán)緊。在步驟b)和c)被重復(fù)至少一次的某些實(shí)施方案中，后面步驟中的結(jié)合條件比前面步驟中的條件更嚴(yán)緊。在某些實(shí)施方案中，方法被用于分離編碼異聚蛋白的多核苷酸。例如，在某些實(shí)施方案中，提供了編碼具有所需性質(zhì)的異聚蛋白的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a) 從哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的異聚蛋白的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的亞群，其中將哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體用編碼第一種多肽和第二種多種的多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)，并且其中第一種多肽與第二種多肽在細(xì)胞表面上形成異聚蛋白；b)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述 cDNA,以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)；c)從隨后的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的異聚蛋白的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群，其中將所述隨后的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體用編碼第一種多肽和第二種多肽的多核苷酸的子文庫(kù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并且其中第一種多肽與第二種多肽形成異聚蛋白；以及d)從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群分離出編碼具有所需性質(zhì)的多肽的多核苷酸。編碼異聚蛋白中不同多肽的多核苷酸可以存在于單一載體中(例如雙盒表達(dá)載體)或分開(kāi)的載體上。因此，在某些實(shí)施方案中，上面描述的方法中的步驟a)包含對(duì)用編碼第一種多肽的第一個(gè)多核苷酸初級(jí)文庫(kù)和編碼第二種多肽的第二個(gè)初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞初始群體進(jìn)行篩選。在某些實(shí)施方案中，方法還包含將編碼第一種多肽的第一個(gè)初級(jí)文庫(kù)和編碼第二種多肽的第二個(gè)初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體中，其中第一種多肽和第二種多肽在細(xì)胞表面上形成異聚蛋白。在某些實(shí)施方案中，第一個(gè)初級(jí)文庫(kù)和第二個(gè)初級(jí)文庫(kù)一起編碼了至少I(mǎi)O9種不同的異聚蛋白。在某些實(shí)施方案中，上面描述的方法中的步驟b)包含擴(kuò)增所述cDNA以產(chǎn)生編碼第一種多肽的第一個(gè)多核苷酸子文庫(kù)和編碼第二種多肽的第二個(gè)多核苷酸子文庫(kù)。在某些實(shí)施方案中，步驟b)還包含將兩個(gè)多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中。在某些實(shí)施方案中，步驟a)和步驟c)都涉及用兩種(或多種)不同的多核苷酸文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。正如在下面更詳細(xì)討論的， 可以使用兩個(gè)不同的引物組來(lái)分別擴(kuò)增編碼第一種多肽的多核苷酸和編碼第二種多肽的多核苷酸，從而允許將這些多核苷酸克隆到不同載體中。在不同水平的篩選循環(huán)中使用不同的多核苷酸文庫(kù)，增加了展示在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的異聚蛋白的多樣性。例如，通過(guò)使用多樣性為IO4的第一個(gè)初級(jí)文庫(kù)和多樣性為IO5的第二個(gè)初級(jí)文庫(kù)，可以呈遞在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面上的不同異聚蛋白的總數(shù)將為至少109。如果異聚蛋白可以具有兩種以上不同的多肽鏈，多樣性可能甚至更高。同樣地，使用第一個(gè)子文庫(kù)和第二個(gè)子文庫(kù)允許進(jìn)行改組。例如，通過(guò)將第一個(gè)子文庫(kù)與第二個(gè)子文庫(kù)相組合，可以在異聚蛋白中產(chǎn)生多肽的新組合。這可以允許產(chǎn)生具有更好的所需性質(zhì)的異聚蛋白。本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員可以理解，當(dāng)步驟b)和C)被重復(fù)至少一次時(shí)，一輪 RT-PCR能夠產(chǎn)生兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸子文庫(kù)，而另一輪RT-PCR能夠產(chǎn)生多核苷酸的單一子文庫(kù)。例如，盡管在篩選的早期階段期間適宜使用不同的載體以增加多樣性，但在后面輪的篩選中有時(shí)優(yōu)選使用編碼第一種多肽和第二種多肽兩者的單一載體，以便最終分離到的多核苷酸將能編碼這兩種所需多肽。例如，在某些實(shí)施方案中，提供了編碼具有所需性質(zhì)的異聚蛋白的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a)從哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的異聚蛋白的細(xì)胞并獲得哺乳動(dòng)物細(xì)胞的亞群，其中將哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體用編碼第一種多肽和第二種多肽的多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)，并且其中第一種多肽和第二種多肽在細(xì)胞表面上形成異聚蛋白；b)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生編碼第一種多肽的第一個(gè)多核苷酸子文庫(kù)和編碼第二種多肽的第二個(gè)多核苷酸子文庫(kù)；C)從隨后的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的異聚蛋白的細(xì)胞并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群， 其中將所述隨后的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體用編碼第一種多肽的第一個(gè)多核苷酸子文庫(kù)和編碼第二種多肽的第二個(gè)多核苷酸子文庫(kù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其中第一種多肽和第二種多肽形成異聚蛋白；d)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA， 以產(chǎn)生編碼第一種多肽和第二種多肽的第三個(gè)多核苷酸子文庫(kù)；e)從用第三個(gè)子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的異聚蛋白的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第三個(gè)亞群；以及f)從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第三個(gè)亞群分離出編碼具有所需性質(zhì)的異聚蛋白的多核苷酸。正如在本文中進(jìn)一步討論的，在某些實(shí)施方案中，展示在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面上的多肽可以部分或完全從哺乳動(dòng)物細(xì)胞釋放。這允許在功能研究中對(duì)多肽進(jìn)行進(jìn)一步分析。本文中描述的方法可應(yīng)用于任何種類的多肽的篩選，并且特別適合于篩選異聚蛋白。方法特別適合于例如生產(chǎn)蛋白復(fù)合物，例如抗體、τ-細(xì)胞受體、I類和II類MHC分子、 整合蛋白、CD8、CD28和VIII因子分子。還設(shè)想了篩選具有所需性質(zhì)的新異聚蛋白的系統(tǒng)和方法。在某些實(shí)施方案中，將不同多肽與二聚化結(jié)構(gòu)域融合，并允許配成對(duì)以形成異聚蛋白。通過(guò)按照本文描述的方法， 可以鑒定具有所需性質(zhì)的異聚蛋白。因此，在某些實(shí)施方案中，提供了包含異源多肽與二聚化結(jié)構(gòu)域融合的融合蛋白。在某些實(shí)施方案中，融合蛋白還包含膜束縛結(jié)構(gòu)域。二聚化結(jié)構(gòu)域可以是抗體恒定區(qū)。例如，在某些實(shí)施方案中，提供了抗體樣肽體，即包含多肽與輕鏈恒定區(qū)融合和多肽與重鏈恒定區(qū)融合的多聚體肽體，其中重鏈和輕鏈恒定區(qū)二聚化以產(chǎn)生抗體樣分子。例如，在某些實(shí)施方案中，抗體樣肽體含有兩個(gè)多肽與輕鏈恒定區(qū)融合的和兩個(gè)多肽與重鏈恒定區(qū)融合?？贵w樣肽體中的多肽可以是不同或相同的。在下面的部分中，提供了對(duì)抗體的詳細(xì)描述。然而，本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員應(yīng)該理解，該描述同樣適用于其他類型的多肽。因此，例如，關(guān)于抗體輕鏈和重鏈的討論同等地適用于T細(xì)胞受體的α和β鏈，或抗體樣肽體的不同多肽鏈。還應(yīng)該理解，在某些實(shí)施方案中，下面的描述也可以適用于抗體片段(包括Fab、Fab'、Fd、Fd'、Fv、dAb、分離的 ⑶R區(qū)；F(ab' )2、scFv)、雙抗體、線性抗體和嵌合抗體。同樣地，盡管下面提供的描述聚焦于分離編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸，但方法同等地適用于分離編碼具有其他所需性質(zhì)的多肽(例如抗體)的多核苷酸，所述的其他所需性質(zhì)包括例如與配偶體特異性結(jié)合、對(duì)結(jié)合配偶體更高的結(jié)合親和性、抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)、激動(dòng)劑或拮抗劑功能、凋亡的誘導(dǎo)或抑制、血管發(fā)生、增殖、信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制的活化。多種性質(zhì)可以同時(shí)或獨(dú)立地進(jìn)行篩選。用于這些所需性質(zhì)的測(cè)定方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的。篩選抗體的方法本部分更詳細(xì)描述了篩選哺乳動(dòng)物抗體展示文庫(kù)的方法。方法包括但不限于編碼具有所需性質(zhì)(例如與抗原特異性結(jié)合)的抗體的多核苷酸的篩選方法、編碼具有所需性質(zhì)(例如與抗原特異性結(jié)合)的抗體的多核苷酸的富集方法、含有編碼具有所需性質(zhì)(例如與抗原特異性結(jié)合)的抗體的多核苷酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分離方法、含有編碼具有所需性質(zhì)(例如與抗原特異性結(jié)合)的抗體的多核苷酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的篩選方法、具有所需性質(zhì)(例如與抗原特異性結(jié)合)的抗體的鑒定方法、以及獲得具有所需性質(zhì)(例如與抗原特異性結(jié)合)的抗體的方法。在某些實(shí)施方案中，方法包含a)從用抗體的初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞初始群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)(例如與抗原特異性結(jié)合)的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群；b)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA 并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生抗體的子文庫(kù)；c)從用所述多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)(例如與抗原特異性結(jié)合)的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群。在某些實(shí)施方案中，步驟b)和c)重復(fù)一次以上。在某些實(shí)施方案中， 方法包含a)將從哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生抗體的子文庫(kù)，其中所述細(xì)胞亞群通過(guò)從用多核苷酸初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞原始群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)(例如與抗原特異性結(jié)合)的抗體的細(xì)胞來(lái)獲得；b)從用多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)(例如與抗原特異性結(jié)合)的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群。在某些實(shí)施方案中，方法包含從用多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示具有所需性質(zhì) (例如與抗原特異性結(jié)合)的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群，其中子文庫(kù)通過(guò)將從哺乳動(dòng)物細(xì)胞的中間群體提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)來(lái)產(chǎn)生，其中細(xì)胞的中間群體通過(guò)從用多核苷酸初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞原始群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)(例如與抗原特異性結(jié)合)的抗體的細(xì)胞來(lái)獲得。在某些實(shí)施方案中，多肽是全長(zhǎng)抗體。在某些實(shí)施方案中，提供了編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸的分離方法， 所述方法包含a)從用編碼抗體的多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞原始群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群；b) 將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)；c)從用所述多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群；以及d)從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群分離出編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，初級(jí)文庫(kù)中的多核苷酸編碼至少I(mǎi)O9種不同抗體。在某些實(shí)施方案中，在步驟d)之前將步驟b)和C)重復(fù)至少一次。在某些實(shí)施方案中，在步驟d)之前將步驟b)和c)重復(fù)不超過(guò)約3次。在某些實(shí)施方案中，方法還包含將多核苷酸初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的原始群體中。在某些實(shí)施方案中，步驟b)還包含將所述多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。在某些實(shí)施方案中，步驟a)包含i)將哺乳動(dòng)物細(xì)胞的原始群體與抗原相接觸， 以及ii)回收與抗原結(jié)合的哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群。在某些實(shí)施方案中，步驟c)包含i)將哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體與抗原相接觸，以及ii)回收與抗原結(jié)合的哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群。在某些實(shí)施方案中，步驟c)中用于抗原結(jié)合的條件比步驟a)中的更嚴(yán)緊。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)步驟b)和c)被重復(fù)至少一次時(shí)，在后面步驟中用于結(jié)合的條件比前面步驟中的更嚴(yán)緊。在某些實(shí)施方案中，提供了分離特異性識(shí)別抗原的抗體的方法，所述方法包含a) 將從哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)，其中細(xì)胞亞群通過(guò)從用多核苷酸初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞原始群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞來(lái)獲得；b)從用多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群；以及C)從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群分離出編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，提供了編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸的分離方法， 所述方法包含a)從用多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群，其中子文庫(kù)通過(guò)將從哺乳動(dòng)物細(xì)胞的中間群體提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)來(lái)產(chǎn)生，其中細(xì)胞的中間群體通過(guò)從用多核苷酸初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞原始群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞來(lái)獲得，以及b)從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群分離出編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，提供了篩選哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)的方法，其中方法包含a)從用抗體的初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞原始群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群；b)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的 mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)；c)從用所述多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群。在某些實(shí)施方案中，提供了篩選哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)的方法，其中方法包含a)將從哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)，其中細(xì)胞亞群通過(guò)從用多核苷酸初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞原始群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞來(lái)獲得；b)從用多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群。在某些實(shí)施方案中，提供了篩選哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)的方法，其中方法包含從用多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群，其中子文庫(kù)通過(guò)將從哺乳動(dòng)物細(xì)胞的中間群體提取的 mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)來(lái)產(chǎn)生，其中細(xì)胞的中間群體通過(guò)從用多核苷酸初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞原始群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞來(lái)獲得。在某些實(shí)施方案中，提供了編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸的分離方法， 所述方法包含a)從用編碼輕鏈和重鏈的多核苷酸初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞原始群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群；b)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)；c)從用編碼輕鏈和重鏈的多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群；以及d)從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群分離出編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，提供了編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸的分離方法， 所述方法包含a)從用編碼輕鏈的第一個(gè)多核苷酸初級(jí)文庫(kù)和編碼重鏈的第二個(gè)多核苷酸初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞原始群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群；b)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)；c)從用編碼輕鏈和重鏈的多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群；以及d)從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群分離出編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，第一個(gè)初級(jí)文庫(kù)和第二個(gè)初級(jí)文庫(kù)允許在細(xì)胞表面上表達(dá)和展示至少I(mǎi)O9種不同抗體。在某些實(shí)施方案中，提供了編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸的分離方法， 所述方法包含a)從用編碼輕鏈的第一個(gè)多核苷酸初級(jí)文庫(kù)和編碼重鏈的第二個(gè)多核苷酸初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞原始群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群；b)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生編碼輕鏈的第一個(gè)多核苷酸子文庫(kù)和編碼重鏈的第二個(gè)多核苷酸子文庫(kù)；c)從用第一個(gè)多核苷酸子文庫(kù)和第二個(gè)多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群；以及d)從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群分離出編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，提供了編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸的分離方法， 所述方法包含a)從用編碼輕鏈的第一個(gè)多核苷酸初級(jí)文庫(kù)和編碼重鏈的第二個(gè)多核苷酸初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞原始群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群；b)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生編碼輕鏈的第一個(gè)多核苷酸子文庫(kù)和編碼重鏈的第二個(gè)多核苷酸子文庫(kù)；c)從用第一個(gè)多核苷酸子文庫(kù)和第二個(gè)多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群；d)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA 并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生編碼輕鏈和重鏈的第三個(gè)多核苷酸子文庫(kù)；e)從用第三個(gè)多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第三個(gè)亞群；以及f)從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第三個(gè)亞群分離出編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸。編碼抗體的多核苷酸初級(jí)文庫(kù)本文提供的方法適合于本技術(shù)領(lǐng)域已知的任何哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)。或者，可以使用本文描述的方法構(gòu)建初級(jí)文庫(kù)(特別是高復(fù)雜度初級(jí)文庫(kù))。在某些實(shí)施方案中，初級(jí)文庫(kù)是未接觸過(guò)抗原的抗體文庫(kù)。在某些實(shí)施方案中，初級(jí)文庫(kù)是從用抗原免疫接種的個(gè)體產(chǎn)生的抗體文庫(kù)。在某些實(shí)施方案中，初級(jí)文庫(kù)是人類抗體文庫(kù)。在某些實(shí)施方案中，初級(jí)文庫(kù)是編碼人源化抗體的多核苷酸的文庫(kù)。在某些實(shí)施方案中，初級(jí)文庫(kù)是嵌合抗體文庫(kù)。 在某些實(shí)施方案中，初級(jí)文庫(kù)是來(lái)自其他哺乳動(dòng)物物種、包括但不限于小鼠、兔、山羊和馬的抗體文庫(kù)。在某些實(shí)施方案中，初級(jí)文庫(kù)從任何免疫組織產(chǎn)生，所述組織包括例如骨髓、 脾臟、淋巴結(jié)、淋巴細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，初級(jí)文庫(kù)是合成的。在某些實(shí)施方案中，初級(jí)文庫(kù)包含編碼抗體輕鏈的第一個(gè)多核苷酸初級(jí)文庫(kù)和編碼抗體重鏈的第二個(gè)多核苷酸初級(jí)文庫(kù)。在某些實(shí)施方案中，由多核苷酸編碼的重鏈的3’ 末端與細(xì)胞表面束縛結(jié)構(gòu)域融合。細(xì)胞表面束縛結(jié)構(gòu)域可以是任何跨膜結(jié)構(gòu)域或膜連接序列。適合的細(xì)胞表面束縛結(jié)構(gòu)域包括但不限于PDGFR跨膜結(jié)構(gòu)域、B7-1跨膜結(jié)構(gòu)域、唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)跨膜結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞表面束縛結(jié)構(gòu)域是GPI信號(hào)序列，其引導(dǎo)免疫球蛋白通過(guò)GPI接頭錨定到細(xì)胞表面上。在某些實(shí)施方案中，GPI信號(hào)序
19列來(lái)自于人類DAF。在某些實(shí)施方案中，十四烷基化序列可以用作細(xì)胞表面束縛結(jié)構(gòu)域。本技術(shù)領(lǐng)域中已知的大多數(shù)抗體文庫(kù)含有scFV片段，或使用單一載體在雙盒中表達(dá)重鏈和輕鏈兩者。建立如同在噬菌體展示中那樣多樣性為IO9的SCFV文庫(kù)是可行的。 按照使用噬菌體展示所顯示的，有可能建立多樣性為IO9的scFV文庫(kù)以在細(xì)菌中表達(dá)Fab， 盡管更加困難和耗時(shí)。能夠做到建立多樣性為IO7的雙盒表達(dá)文庫(kù)以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)全長(zhǎng)抗體，盡管與噬菌體展示文庫(kù)相比要更加困難得多。然而，由于篩選哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示文庫(kù)的難度，多樣性為IO9或更大的哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)還沒(méi)有市售的。本發(fā)明的方法使得篩選多樣性等于或高于IO9的哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)成為可能，從而提供了制造具有這樣的高多樣性哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)的理由。因此，本發(fā)明還提供了構(gòu)建編碼抗體的多核苷酸文庫(kù)的方法，其中多核苷酸總計(jì)編碼至少約109、包括例如至少約101(1、 IOiiUO12UO13, IO14或IO15種不同重組抗體。文庫(kù)中的每個(gè)多核苷酸可以編碼輕鏈和重鏈兩者。或者，可以將編碼輕鏈的第一個(gè)多核苷酸文庫(kù)與編碼重鏈的第二個(gè)多核苷酸文庫(kù)相組合。一旦轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中之后，重鏈和輕鏈可以在細(xì)胞內(nèi)配對(duì)，從而產(chǎn)生高度多樣性的不同抗體。因此，在某些實(shí)施方案中，提供了構(gòu)建編碼抗體的多核苷酸文庫(kù)的方法，所述方法包含將輕鏈文庫(kù)與重鏈文庫(kù)相組合，以使多核苷酸總計(jì)編碼至少約IO9種不同重組抗體。在某些實(shí)施方案中，初級(jí)文庫(kù)源自于單一個(gè)體。因此，在某些實(shí)施方案中，提供了編碼來(lái)自單一個(gè)體的抗體的多核苷酸文庫(kù)的構(gòu)建方法，其中多核苷酸總計(jì)編碼至少約109、 包括例如至少約101Q、IOllUO12,1013、IO14或IO15種不同重組抗體。因此，在某些實(shí)施方案中， 提供了編碼來(lái)自單一個(gè)體的抗體的多核苷酸文庫(kù)的構(gòu)建方法，所述方法包含將個(gè)體的輕鏈文庫(kù)與個(gè)體的重鏈文庫(kù)相組合，以使多核苷酸總計(jì)編碼至少約IO9種不同重組抗體。在某些實(shí)施方案中，多核苷酸存在于質(zhì)粒載體中。在某些實(shí)施方案中，提供了在表面上展示至少約109、包括例如至少約IOiciUOiiUO12UO13UO14或IO15種不同重組抗體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體。在某些實(shí)施方案中，提供了用多核苷酸文庫(kù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體，其中多核苷酸總計(jì)編碼至少約 ο9、包括例如至少約Ioi0UoiiUo12Uo13Uo14或 ο15種不同重組抗體。在某些實(shí)施方案中，提供了用編碼抗體輕鏈的第一個(gè)多核苷酸文庫(kù)和編碼抗體重鏈的第二個(gè)多核苷酸文庫(kù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體，其中多核苷酸總計(jì)編碼至少約 ο9、包括例如至少約IoiqUoiiUo12Uo13Uo14或 ο15種不同重組抗體。在某些實(shí)施方案中，提供了從上述哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出編碼具有所需性質(zhì)(例如與抗原特異性結(jié)合)的抗體的多核苷酸。此外，在本發(fā)明中提供了編碼抗體樣肽體的多核苷酸文庫(kù)的構(gòu)建方法，其中多核苷酸總計(jì)編碼至少約109、包括例如至少約101(1、IOllUO12, ο13、 ο14或 ο15種不同重組肽體。 在某些實(shí)施方案中，提供了在表面上展示至少約 ο9、包括例如至少約IoiciUo11Uo12Uo1^ IOw或 ο15種不同的重組抗體類肽體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體。在某些實(shí)施方案中，提供了用多核苷酸文庫(kù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體，其中多核苷酸總計(jì)編碼至少約 ο9、包括例如至少約ιο1(ι、 ο11、 ο12、 ο13、 ο14或 ο15種不同的重組抗體樣肽體。正如上面所討論的，盡管本文中的討論主要聚焦于抗體，但該描述在適合時(shí)也適用于抗體樣肽體。本申請(qǐng)還涵蓋了本文中所述的抗體樣肽體文庫(kù)的篩選方法。有各種各樣的技術(shù)可用于有效產(chǎn)生免疫球蛋白文庫(kù)，包括在下列文獻(xiàn)中描述或提到的技術(shù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(Molecular Cloning ；A Laboratory Manual)第三版 (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York，2001)、《ifLfijftf^ 方法》(Current Protocols in Molecular Biology) (John Wiley &amp ;Sons)、美國(guó)專利 No. 6. 403，312、美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)09/782，004、美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)09/927，790、美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)10/218，102,PCT WO 01/40091和PCT WO 02/25588，其每個(gè)在此以其全文引為參考。這樣的方法包括但不限于基因裝配方法、基于PCR的方法和使用PCR的變化形式的方法、基于連接酶鏈反應(yīng)的方法、合并的寡核苷酸方法例如在合成改組中使用的方法、易錯(cuò)擴(kuò)增方法和使用具有隨機(jī)突變的寡核苷酸的方法、經(jīng)典的位點(diǎn)定向誘變方法、盒式誘變方法以及其他擴(kuò)增和基因合成方法。各種可商購(gòu)的用于基因裝配、誘變、載體亞克隆等的試劑盒和方法，可用于產(chǎn)生編碼免疫球蛋白氨基酸序列的核酸。用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面上表達(dá)抗體(特別是全長(zhǎng)抗體)的載體，可以按照本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備。在某些實(shí)施方案中，將編碼免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的多核苷酸以其3’末端融合到編碼細(xì)胞表面束縛結(jié)構(gòu)域的多核苷酸上，允許將所表達(dá)的免疫球蛋白展示在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面上。在某些實(shí)施方案中，在重鏈恒定區(qū)與膜束縛結(jié)構(gòu)域之間存在酶切割位點(diǎn)，其切割允許將免疫球蛋白酶法除去，從而能夠?qū)⒈磉_(dá)的免疫球蛋白從膜結(jié)合形式轉(zhuǎn)變成可溶形式。被切的抗體可以直接用于進(jìn)一步功能分析，從而免去了將膜錨定形式轉(zhuǎn)變成可溶形式的步驟。在某些實(shí)施方案中，在重鏈恒定區(qū)與細(xì)胞表面束縛結(jié)構(gòu)域之間存在弗林蛋白酶切割位點(diǎn)。弗林蛋白酶是一種存在于真核細(xì)胞的高爾基反面網(wǎng)絡(luò)中的蛋白酶。它的功能是剛好在將蛋白遞送到其最終細(xì)胞目的地之前的步驟中切割蛋白。弗林蛋白酶識(shí)別共有氨基酸序歹Ij RXRR(SEQ ID NO :1)、RXRK (SEQ ID NO 2)或 KXKR(SEQ ID NO :3)(其中 X 是任何氨基酸)，并在含有這些序列的蛋白到達(dá)反面高爾基網(wǎng)時(shí)切開(kāi)它們。參見(jiàn)美國(guó)專利 No. 7，223，390 ；Poole 等，J. Biol. Chem. 2003, Vol. 278(38) :36183-36190 ；Chen 等，2001， Proc. Natl. Acad. Sci.，vol. 98(13) :7218_7223。所表達(dá)的含有弗林蛋白酶切割位點(diǎn)的蛋白典型地經(jīng)歷其正常的折疊和裝配加工，以獲得其天然構(gòu)型。在從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出后，蛋白沿著分泌途徑移動(dòng)，達(dá)到細(xì)胞表面。當(dāng)?shù)鞍椎竭_(dá)高爾基反面網(wǎng)絡(luò)時(shí)，它被弗林蛋白酶切割。因?yàn)楦チ值鞍酌盖懈钍遣糠滞瓿傻?，一部分抗體將釋放到介質(zhì)中，而其余部分抗體將保持附著在細(xì)胞膜上。這種構(gòu)型允許對(duì)被切抗體進(jìn)行功能測(cè)定，同時(shí)維持抗體與表達(dá)抗體的細(xì)胞之間的連接。適合用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)重組多肽的啟動(dòng)子包括但不限于SV40啟動(dòng)子、 小鼠乳腺腫瘤病毒啟動(dòng)子、人類HIV長(zhǎng)末端重復(fù)序列啟動(dòng)子、莫洛尼病毒啟動(dòng)子、鳥(niǎo)白血病病毒啟動(dòng)子、Epstein-Barr病毒立即早期啟動(dòng)子、勞氏(Rous)肉瘤病毒啟動(dòng)子、人類肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、人類血紅蛋白啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、人類EF-I α啟動(dòng)子或人類肌肉肌氨酸啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中，載體包含與編碼免疫球蛋白重鏈的第一種多核苷酸操作性連接的第一個(gè)啟動(dòng)子以及與編碼免疫球蛋白輕鏈的第二種多核苷酸操作性連接的第二個(gè)啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中，免疫球蛋白輕鏈和重鏈存在于兩種不同的載體中，所述載體各自具有與免疫球蛋白輕鏈和重鏈可操作連接的不同啟動(dòng)子。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞用于文庫(kù)篩選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可源自于任何真核物種，包括但不限于來(lái)自大鼠、 小鼠、牛、豬、綿羊、山羊和人類的細(xì)胞。細(xì)胞可以按照本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)維持。適合的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括HeLa細(xì)胞(HeLa S3細(xì)胞，ATCCCCL2. 2)、Jurkat 細(xì)胞、Raji 細(xì)胞、Daudi 細(xì)胞、人類胚胎腎細(xì)胞(293-HEK ；ATCC 293cl8，ATCC CRL 1573)、 非洲綠猴腎細(xì)胞(CV-I ；Vero ；ATCC CRL 1587)、SV40轉(zhuǎn)化的猴腎細(xì)胞(C0S-I ；ATCC CRL 1650)、狗腎細(xì)胞(MDCK ；ATCC CCL 34)、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21，BHK-570 ；ATCC CRL 8544， ATCC CRL 10314)、中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CH0-K1 ；ATCC CCL61 ；CHO DG44(Chasin等，1986，Som Cell Molec Genet, 12,555))以及其他嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系例如NS0、SP2/0、GH1 (ATCC CCL82)、 H-4-II-E (ATCC CRL 1548)、NIH-3T3 (ATCC CRL 1658)。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自293-HEK、Hela、Jurkat、Raji、Daudi、C0S或CV-I細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是上面描述的細(xì)胞的衍生物。可以使用適合的手段將哺乳動(dòng)物細(xì)胞用多核苷酸轉(zhuǎn)化，并將所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)在根據(jù)適合于誘導(dǎo)啟動(dòng)子而修改的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中。這類方法的代表性實(shí)例包括使用磷酸鈣沉淀進(jìn)行轉(zhuǎn)染、脂類介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、將多核苷酸直接微注射到完整靶細(xì)胞中、以及電穿孔。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞被瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。用于細(xì)胞的適合培養(yǎng)條件例如溫度和pH，是公知的。在本文描述的方法的不同步驟中使用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以相同或不同。應(yīng)該指出，盡管在傳統(tǒng)的篩選方法中應(yīng)當(dāng)(并且有時(shí)是關(guān)鍵的)控制細(xì)胞所攝取的載體的拷貝，但在本發(fā)明的方法的初始步驟中，優(yōu)選每個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以攝取盡可能多的載體拷貝。例如，轉(zhuǎn)染條件可以被優(yōu)化成使得每個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞攝取至少約20個(gè)、例如至少約50、100、200、300、400、500、1000個(gè)或更多的質(zhì)粒直到每個(gè)細(xì)胞IO6UO7個(gè)質(zhì)粒中的任一種數(shù)量?？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)整參數(shù)例如細(xì)胞密度、載體 DNA的濃度、不同初級(jí)文庫(kù)(當(dāng)可用時(shí))的比率、轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染程序，來(lái)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。因此，一方面，本發(fā)明提供了哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體，其至少某些(例如50%、60%、 70%,80%,90%,99%)在每個(gè)細(xì)胞中包含至少約20個(gè)、例如至少約50、100、200、300、400、 500、1000個(gè)或更多直到IO6或IO7個(gè)...不同多核苷酸中的任一種數(shù)量。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞被瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。初始篩選在將多核苷酸文庫(kù)導(dǎo)入細(xì)胞中之后，允許抗體展示在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞表面上?！霸试S展示”是指允許已被導(dǎo)入到細(xì)胞中的載體經(jīng)歷多肽的轉(zhuǎn)錄和翻譯，并將抗體運(yùn)輸?shù)侥け砻嫔?。允許表達(dá)所需的條件和時(shí)間將隨著宿主細(xì)胞的選擇和載體的選擇而變，正如本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員所公知的。在某些實(shí)施方案中，隨后將在表面上表達(dá)抗體的細(xì)胞通過(guò)允許抗原與所需抗體結(jié)合的方法與抗原相接觸，由此允許將表達(dá)抗體的細(xì)胞與不結(jié)合抗原的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。初始篩選步驟允許回收到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第一個(gè)亞群?！盎厥铡笔侵笇⑺杞M分與不需要的組分分離。本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員應(yīng)該理解，盡管哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群富集有展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，但亞群中的大多數(shù)細(xì)胞可能是非特異性結(jié)合細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，初始篩選在低嚴(yán)緊條件下進(jìn)行，以最大化捕獲到展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞的可能性。初始篩選可以使用下列方法中的任一種執(zhí)行熒光活化細(xì)胞分揀(FACS)、基于珠子的分揀例如基于磁珠的分揀(MACS)、其組合或其他固相淘選技術(shù)。其他可以使用的技術(shù)也是本技術(shù)領(lǐng)域已知的。例如，如果細(xì)胞處于懸液中并且抗原附著于固相基質(zhì)，那么特異性結(jié)合抗原的細(xì)胞將被捕獲在固相基質(zhì)上，允許不結(jié)合抗原的細(xì)胞被洗掉，并且隨后能夠回收結(jié)合的細(xì)胞?；蛘撸绻?xì)胞附著于固相基質(zhì)，并且通過(guò)與抗原特異性結(jié)合而導(dǎo)致從基質(zhì)上釋放，則可以從細(xì)胞上清液回收它們。抗原可以直接或間接附著于固相基質(zhì)(例如磁珠)。例如，在某些實(shí)施方案中，固相基質(zhì)可以用鏈親和素包被，其允許與生物素相連的抗原通過(guò)鏈親和素與生物素的相互作用附著到固相基質(zhì)上。也可以使用其他結(jié)合對(duì)。在某些實(shí)施方案中，抗原可以表達(dá)并呈遞在細(xì)胞表面?？乖蔬f細(xì)胞與結(jié)合抗原的細(xì)胞之間的相互作用允許分離出結(jié)合抗原的細(xì)胞(例如表達(dá)所需抗體的細(xì)胞)。例如，可以利用FACS分離細(xì)胞復(fù)合物。在某些實(shí)施方案中，抗原呈遞細(xì)胞與結(jié)合抗原的細(xì)胞之間的相互作用能夠誘導(dǎo)可檢測(cè)的信號(hào)(在抗原呈遞細(xì)胞或結(jié)合抗原的細(xì)胞內(nèi))，其允許分離出結(jié)合抗原的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，將細(xì)胞與用熒光標(biāo)記物(例如熒光素-5-異硫氰酸酯(FITC)) 直接或間接標(biāo)記的抗原溫育。與帶熒光標(biāo)簽的抗原結(jié)合的抗體表達(dá)細(xì)胞可以通過(guò)熒光活化細(xì)胞分揀(FACS)來(lái)選擇，從而允許將特異性結(jié)合抗原的細(xì)胞與不結(jié)合抗原的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。
在某些實(shí)施方案中，可以將一種或多種上述技術(shù)進(jìn)行組合。例如，固相淘選可以與 FACS的使用組合，反之亦然。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)使用所需親和性作為篩選基礎(chǔ)時(shí)，可以使用ELISA測(cè)定法來(lái)確定分離的免疫球蛋白對(duì)靶抗原的結(jié)合親和性。正如上面討論的，在某些實(shí)施方案中，抗體可以從融合的束縛結(jié)構(gòu)域上部分或完全切下，并可用于進(jìn)一步測(cè)定和/或驗(yàn)證所需性質(zhì)。子文庫(kù)的產(chǎn)生和篩選本文描述的方法涵蓋了產(chǎn)生和篩選本文中所述的子文庫(kù)的方法。在回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始亞群后，從細(xì)胞提取總mRNA。將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，并擴(kuò)增(例如通過(guò)PCR)抗體基因或抗體基因的部分(例如抗體基因的VH和VL區(qū))。與其中需要引物混合物來(lái)擴(kuò)增抗體可變區(qū)的產(chǎn)生初級(jí)抗體文庫(kù)的傳統(tǒng)方法不同， 用于子文庫(kù)中多核苷酸的引物可以基于初級(jí)文庫(kù)的載體序列。例如，可以基于載體中的序列設(shè)計(jì)引物，以擴(kuò)增輕鏈和重鏈序列二者。在某些實(shí)施方案中，將抗體序列的VH和VL區(qū)克隆到分別含有CH和CL區(qū)的骨架載體中，以構(gòu)建兩個(gè)子文庫(kù)——重鏈和輕鏈子文庫(kù)。隨后將兩個(gè)子文庫(kù)轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。該步驟允許在細(xì)胞中進(jìn)行重鏈和輕鏈的改組，其可以增加具有較高表達(dá)以及較高親和性的抗體的分離機(jī)會(huì)。在這樣的實(shí)施方案中，至少一個(gè)用于擴(kuò)增輕鏈的引物與用于擴(kuò)增重鏈的引物不同，以便可以將輕鏈和重鏈分別克隆到不同載體中，并分成不同子文庫(kù)?？梢詫U(kuò)增的抗體序列(例如VH和VL序列)返回克隆到在初級(jí)文庫(kù)中使用的相同載體中或克隆到不同載體中。例如，在某些實(shí)施方案中，初級(jí)文庫(kù)包含初級(jí)輕鏈文庫(kù)和不同的第二個(gè)初級(jí)重鏈文庫(kù)，其中輕鏈和重鏈在不同載體上(例如質(zhì)粒載體)。在初始篩選后，將擴(kuò)增的輕鏈和重鏈序列克隆到單一雙盒載體中。在某些實(shí)施方案中，載體與在 Higuchi等，J. Immun. Methods (1997) 202 :193-204中使用的載體類似。在某些實(shí)施方案中， 使用不同的文庫(kù)進(jìn)行幾輪篩選，然后將輕鏈和重鏈克隆在單一雙重表達(dá)載體中。在篩選的最后階段克隆雙重表達(dá)載體，允許同時(shí)鑒定具有所需性質(zhì)(例如與抗原特異性結(jié)合)的抗體的成對(duì)抗體輕鏈和重鏈。在隨后的篩選步驟中使用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以與第一輪篩選中使用的類型相同， 或者可以是不同的細(xì)胞，只要它們能夠在細(xì)胞表面上表達(dá)多肽即可。篩選可以使用任何上面對(duì)初始篩選所描述的任何方法來(lái)進(jìn)行。本文中描述的RT-PCR和篩選步驟可以重復(fù)至少1、2、3、4、5、6或7次。在某些實(shí)施方案中，步驟被重復(fù)不超過(guò)約3次。不同篩選循環(huán)的嚴(yán)緊性可以相同或不同，以便于分離多核苷酸。例如，在接近篩選循環(huán)結(jié)束中使用較高嚴(yán)緊性的條件，以減少?gòu)母患膩喨韩@得的多核苷酸的多樣性。在方法的各個(gè)步驟過(guò)程中可以評(píng)估子文庫(kù)的多樣性。如果多樣性低于約1000至10000個(gè)信號(hào)，則可以按照下面的描述執(zhí)行分離步驟。編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸的分離為了分離抗體序列，從最終的子細(xì)胞合并物分離總mRNA。將相關(guān)的區(qū)域進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增、限制性酶消化，并克隆到穩(wěn)定的表達(dá)載體中。然后在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞僅具有每個(gè)細(xì)胞一個(gè)表達(dá)載體的條件下，將DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。例如，可以使用滴定步驟稀釋用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒的濃度，以減少在同一個(gè)細(xì)胞中表達(dá)多個(gè)編碼不同免疫球蛋白的載體的概率。或者，可以使用flip-in系統(tǒng)，例如FLP-in 系統(tǒng)(Invitrogen，he.)。可以通過(guò)例如上面描述的方法來(lái)分離表達(dá)所需抗體的細(xì)胞。可以分離并測(cè)序編碼所需抗體的多核苷酸。單盒表達(dá)載體和雙盒表達(dá)載體本發(fā)明還提供了在本文描述的方法中使用的特定表達(dá)載體。這些表達(dá)載體提供了高的克隆效率，并特別適用于構(gòu)建高復(fù)雜度蛋白質(zhì)文庫(kù)例如本文中描述的高復(fù)雜度抗體文庫(kù)，并供在篩選文庫(kù)的方法、例如本文所描述的方法中使用。本文提供的載體可用于快速構(gòu)建任何抗體文庫(kù)、重鏈、輕鏈、嵌合和甚至融合蛋白，并用于這些抗體蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面上的高表達(dá)，以有效篩選和選擇(例如當(dāng)與 FACS偶聯(lián)時(shí))?？梢栽谳d體中摻入兩個(gè)或多個(gè)獨(dú)特的核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列，用于插入和取出目標(biāo)基因。使用這樣的載體，可以容易地構(gòu)建大小為至少I(mǎi)O6復(fù)雜度的載體。CMV啟動(dòng)子， 一種常用于蛋白在各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高表達(dá)的啟動(dòng)子，可用于驅(qū)動(dòng)所插入基因(例如抗體基因)的表達(dá)。為了將表達(dá)的抗體錨定在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面上，可以將來(lái)自于PDGFR 的跨膜結(jié)構(gòu)域與重鏈一致區(qū)的C-端同框融合。本文還提供了雙盒表達(dá)載體。這樣的載體可以包含雙重哺乳動(dòng)物表達(dá)盒，用于一步插入重鏈和輕鏈基因兩者，以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面上展示全長(zhǎng)二價(jià)抗體。這可以通過(guò)將來(lái)自PDGFR的跨膜結(jié)構(gòu)域融合到重鏈恒定區(qū)的C-端來(lái)實(shí)現(xiàn)。我們也可以在恒定區(qū)與PDGFR 跨膜結(jié)構(gòu)域之間摻入弗林蛋白酶切割位點(diǎn)，以獲得分泌抗體。結(jié)果，抗體可以同時(shí)以膜錨定形式表達(dá)在細(xì)胞表面上以用于通過(guò)FACS分析進(jìn)行篩選和選擇，以及以分泌形式表達(dá)在條件培養(yǎng)基中以用于功能分析。使用該程序，我們能夠在僅僅幾天內(nèi)快速構(gòu)建大小為IO6的抗體文庫(kù)。這種新的一步式雙表達(dá)哺乳動(dòng)物展示系統(tǒng)對(duì)于快速篩選具有高親和性的生物活性的人類單克隆抗體來(lái)說(shuō)，特別有用。因此，在某些實(shí)施方案中，提供了包含側(cè)翼帶有一對(duì)可以被限制性酶(例如識(shí)別非回文序列的限制性酶)識(shí)別的切割位點(diǎn)的開(kāi)放閱讀框的表達(dá)載體，其中用所述限制性酶切割所產(chǎn)生的每個(gè)片段的末端不自連。在某些實(shí)施方案中，開(kāi)放閱讀框編碼抗體重鏈。在某些實(shí)施方案中，抗體重鏈與跨膜結(jié)構(gòu)域融合。在某些實(shí)施方案中，在抗體重鏈與跨膜結(jié)構(gòu)域之間存在酶切割位點(diǎn)(例如弗林蛋白酶切割位點(diǎn))。在某些實(shí)施方案中，開(kāi)放閱讀框編碼抗體輕鏈。在某些實(shí)施方案中，載體還包含可以被不同限制性酶(例如識(shí)別非回文序列的限制性酶)識(shí)別的第二對(duì)切割位點(diǎn)，其中用所述第二種限制性酶切割所產(chǎn)生的每個(gè)片段的末端不自連。在某些實(shí)施方案中，第二對(duì)切割位點(diǎn)位于開(kāi)放閱讀框側(cè)翼。在某些實(shí)施方案中， 第二對(duì)切割位點(diǎn)中的一個(gè)位于開(kāi)放閱讀框側(cè)翼，其中第二對(duì)切割位點(diǎn)中的另一個(gè)位于開(kāi)放閱讀框內(nèi)。例如，在某些實(shí)施方案中，開(kāi)放閱讀框包含抗體重鏈，并且第二對(duì)切割位點(diǎn)中的一個(gè)位于可變區(qū)與恒定區(qū)之間。這樣的載體可能適合于例如克隆抗體可變區(qū)。同樣地，在某些實(shí)施方案中，開(kāi)放閱讀框包含抗體輕鏈，并且第二對(duì)切割位點(diǎn)中的一個(gè)位于可變區(qū)與恒定區(qū)之間。這樣的載體可能適合于例如克隆抗體可變區(qū)。在某些實(shí)施方案中，限制性酶選自Sfil、BstXI和BsmBl。應(yīng)該理解，也可以使用具有類似性質(zhì)的其他酶。在某些實(shí)施方案中，載體還包含與所述開(kāi)放閱讀框可操作連接的啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中，載體具有圖2中顯示的限制性圖譜。在某些實(shí)施方案中，載體具有圖3中所顯示的限制性圖譜。在某些實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含第二個(gè)開(kāi)放閱讀框。因此，例如，在某些實(shí)施方案中，提供了雙表達(dá)盒載體，其包含1)側(cè)翼帶有可以被限制性酶(例如識(shí)別非回文序列的限制性酶)識(shí)別的第一對(duì)切割位點(diǎn)的第一個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中用所述限制性酶切割所產(chǎn)生的每個(gè)片段的末端不自連；以及幻側(cè)翼帶有可以被限制性酶(例如識(shí)別非回文序列的限制性酶)識(shí)別的第二對(duì)切割位點(diǎn)的第二個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中用所述第二種限制性酶切割所產(chǎn)生的每個(gè)片段的末端不自連。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)開(kāi)放閱讀框編碼抗體重鏈。在某些實(shí)施方案中，將抗體重鏈與跨膜結(jié)構(gòu)域融合。在某些實(shí)施方案中，在抗體重鏈與跨膜結(jié)構(gòu)域之間存在酶切割位點(diǎn)(例如弗林蛋白酶切割位點(diǎn))。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)開(kāi)放閱讀框編碼抗體輕鏈。因此，例如，在某些實(shí)施方案中，提供了雙表達(dá)盒載體，其包含1)編碼抗體重鏈的第一個(gè)開(kāi)放閱讀框，其側(cè)翼帶有可以被限制性酶(例如識(shí)別非回文序列的限制性酶) 識(shí)別的第一對(duì)切割位點(diǎn)，其中用所述限制性酶切割所產(chǎn)生的每個(gè)片段的末端不自連；以及 2)表達(dá)抗體輕鏈的第二個(gè)開(kāi)放閱讀框，其側(cè)翼帶有可以被限制性酶(例如識(shí)別非回文序列的限制性酶)識(shí)別的第二對(duì)切割位點(diǎn)，其中用所述第二種限制性酶切割所產(chǎn)生的每個(gè)片段的末端不自連。還提供了從所述切割產(chǎn)生的片段，其可用于通過(guò)四路連接來(lái)克隆所需序列 (例如抗體序列)。還提供了使用雙盒表達(dá)載體表達(dá)全長(zhǎng)抗體以及使用所述載體克隆所需序列的方法。在某些實(shí)施方案中，雙盒表達(dá)載體還包含能夠被第三種限制性酶(例如識(shí)別非回文序列的第三種限制性酶)識(shí)別的第三對(duì)限制性酶切割位點(diǎn)，其中用所述第三種限制性酶切割所產(chǎn)生的每個(gè)片段的末端不自連。在某些實(shí)施方案中，第三對(duì)切割位點(diǎn)中的一個(gè)位于載體上一個(gè)開(kāi)放閱讀框的側(cè)翼，并且其中第三對(duì)切割位點(diǎn)中的另一個(gè)位于同一個(gè)開(kāi)放閱讀框內(nèi)。例如，在某些實(shí)施方案中，一個(gè)開(kāi)放閱讀框包含抗體重鏈，并且第三對(duì)切割位點(diǎn)中的一個(gè)位于可變區(qū)與恒定區(qū)之間。同樣地，在某些實(shí)施方案中，一個(gè)開(kāi)放閱讀框包含抗體輕鏈，并且第三對(duì)切割位點(diǎn)中的一個(gè)位于可變區(qū)與恒定區(qū)之間。在某些實(shí)施方案中，雙盒表達(dá)載體還包含可以被第三種限制性酶(例如識(shí)別非回文序列的第三種限制性酶)識(shí)別的第四對(duì)限制性酶切割位點(diǎn)，其中用所述第三種限制性酶切割所產(chǎn)生的每個(gè)片段的末端不自連。在某些實(shí)施方案中，第四對(duì)切割位點(diǎn)中的一個(gè)位于載體上一個(gè)開(kāi)放閱讀框的側(cè)翼，并且其中第四對(duì)切割位點(diǎn)中的另一個(gè)位于同一開(kāi)放閱讀框內(nèi)部。設(shè)想了第三對(duì)切割位點(diǎn)和第四對(duì)切割位點(diǎn)可以各自位于雙盒表達(dá)載體中不同開(kāi)放閱讀框的側(cè)翼(或位于內(nèi)部)。例如，在某些實(shí)施方案中，一個(gè)開(kāi)放閱讀框包含抗體重鏈，并且第三對(duì)切割位點(diǎn)中的一個(gè)位于可變區(qū)與恒定區(qū)之間，而另一個(gè)開(kāi)放閱讀框包含抗體輕鏈， 并且第四對(duì)切割位點(diǎn)中的一個(gè)位于可變區(qū)與恒定區(qū)之間。在某些實(shí)施方案中，限制性酶選自Sfil、BstXI和BsmBl。在某些實(shí)施方案中，載體還包含與所述第一個(gè)開(kāi)放閱讀框可操作連接的第一個(gè)啟動(dòng)子以及與所述第二個(gè)開(kāi)放閱讀框可操作連接的第二個(gè)啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中，載體具有如圖5A中顯示的限制性圖
■i並曰O試劑盒、文庫(kù)、子文庫(kù)、多核苷酸和多肽還提供了用于執(zhí)行本文描述的方法的文庫(kù)和試劑盒。此外，提供了在篩選過(guò)程中產(chǎn)生的子文庫(kù)和從本文描述的方法獲得的多核苷酸/多肽。在某些實(shí)施方案中，提供了編碼抗體輕鏈的多核苷酸文庫(kù)和編碼抗體重鏈的多核苷酸文庫(kù)，其中兩個(gè)文庫(kù)允許表達(dá)至少109、包括例如IO10、IOllUO12,1013、1014、1015、IO"5、IO17 種或更多種中至少任一數(shù)量的不同抗體。在某些實(shí)施方案中，抗體輕鏈包含(i)輕鏈恒定區(qū)，(ii)免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和(iii)信號(hào)肽。在某些實(shí)施方案中，抗體重鏈包含(i) 至少一個(gè)抗體重鏈恒定區(qū)，(ii)免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，以及(iii)信號(hào)肽。在某些實(shí)施方案中，抗體重鏈還包含位于重鏈恒定區(qū)C-末端的細(xì)胞表面束縛結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，抗體重鏈還包含重鏈恒定區(qū)與細(xì)胞表面束縛結(jié)構(gòu)域之間的弗林蛋白酶切割位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，在試劑盒中提供了兩個(gè)文庫(kù)，其存在于分開(kāi)的容器或同一個(gè)容器中。在某些實(shí)施方案中，試劑盒還包含引物、試劑、細(xì)胞和用于執(zhí)行本文描述的方法的說(shuō)明書(shū)。例如，在某些實(shí)施方案中，提供了試劑盒，其包含1)編碼多種免疫球蛋白重鏈的多核苷酸的第一個(gè)質(zhì)粒文庫(kù)，幻編碼多種免疫球蛋白輕鏈的多核苷酸的第二個(gè)質(zhì)粒文庫(kù)。 在某些實(shí)施方案中，試劑盒還包含能夠表達(dá)免疫球蛋白分子的細(xì)胞群體。在某些實(shí)施方案中，試劑盒還包含用于RT-PCR的酶和引物。在某些實(shí)施方案中，第一和第二個(gè)質(zhì)粒文庫(kù)包含在分開(kāi)的容器中。在某些實(shí)施方案中，試劑盒還提供了用于執(zhí)行本文描述的一種或多種方法的說(shuō)明書(shū)。在某些實(shí)施方案中，提供了試劑盒，其包含1)用于產(chǎn)生初級(jí)文庫(kù)(例如抗體初級(jí)文庫(kù))的引物組，2)用于瞬時(shí)和/或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的載體組；以及3)用于產(chǎn)生子文庫(kù)(例如抗體子文庫(kù))的引物組。在某些實(shí)施方案中，試劑盒還提供了用于執(zhí)行本文描述的方法的說(shuō)明書(shū)。還提供了本文描述的方法所獲得的多核苷酸以及由這些多核苷酸編碼的多肽。多核苷酸和多肽可用作例如研究試劑、診斷試劑和用于治療疾病的治療劑。
還提供了通過(guò)本文描述的RT-PCR方法產(chǎn)生的子文庫(kù)。例如，在某些實(shí)施方案中， 提供了編碼多種多肽的多核苷酸子文庫(kù)，其中子文庫(kù)通過(guò)將從哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體提取的 mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA來(lái)產(chǎn)生，其中細(xì)胞群體通過(guò)從用多核苷酸初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染(例如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞原始群體中篩選出展示具有所需性質(zhì)的多肽的細(xì)胞來(lái)獲得。還提供了包含表達(dá)載體、例如本文中描述的單盒和雙盒表達(dá)載體的試劑盒。試劑盒可以包含整個(gè)載體或載體可直接用于連接(例如四路連接)的線性片段。下面的實(shí)施例為本發(fā)明提供了說(shuō)明而不是限制。實(shí)施例1本實(shí)施例顯示了可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)表面錨定形式和分泌形式的抗體的載體的構(gòu)建。為了從哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)抗體用于篩選，重要的是設(shè)計(jì)和構(gòu)建特定的表達(dá)載體， 其能夠1.以足夠供檢測(cè)和分析的高水平在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)抗體；2.同時(shí)將抗體分子表達(dá)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面上和表達(dá)成分泌形式；3.容易在細(xì)菌中擴(kuò)增并從細(xì)菌純化；4.以高效率遞送到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。為此目的，使用來(lái)自^witrogen的載體pcDNA 3. 1作為起始材料。載體尺寸為 5. 41Λ，含有用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)蛋白的大多數(shù)必需組分。為了增加轉(zhuǎn)染效率(從每個(gè)細(xì)胞來(lái)看的拷貝數(shù))，將1.81Λ Neo基因表達(dá)盒刪除以減小載體尺寸。為了便于插入目的基因，對(duì)MCS(多克隆位點(diǎn))進(jìn)行了修改以包含BstX I和Ml I。適合的載體形式具有約 3. 2kb的大小。將該3. 2kb載體用作骨架載體，用來(lái)構(gòu)建抗體表達(dá)文庫(kù)。當(dāng)目的基因被插入到該載體的MCS中時(shí)，在載體被遞送到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，基因表達(dá)。為了表達(dá)被展示的重鏈，對(duì)載體進(jìn)一步修改，以將PDGFR編碼序列插入在重鏈恒定區(qū)的3’ -末端。為了同時(shí)表達(dá)展示和分泌形式的抗體，將弗林蛋白酶切割位點(diǎn)(FCS)插入到重鏈與PDGFR之間。下面的圖顯示了表達(dá)載體中重鏈中的組分的關(guān)系啟動(dòng)子——V-------C--------FCS—PDGFR實(shí)施例2本實(shí)施例描述了用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)表面錨定形式和分泌形式的抗體的載體的構(gòu)建。為了從單一載體表達(dá)重鏈和輕鏈兩者，構(gòu)建了雙重表達(dá)載體。將另一個(gè)表達(dá)盒插入到載體PCDNA3. 1中。將Ch和Cl基因序列插入到該載體中不同的表達(dá)盒處。這兩個(gè)表達(dá)盒的關(guān)系顯示如下，其中啟動(dòng)子1和啟動(dòng)子2是相同或不同的。啟動(dòng)子1-—Ch或Cl-—PolyA——啟動(dòng)子2-—Cl或Ch-—PolyA——選擇標(biāo)記為了表達(dá)細(xì)胞表面展示的抗體，對(duì)載體進(jìn)一步修改以將PDGFR編碼序列插入到重鏈恒定區(qū)的3’ -末端。
為了同時(shí)表達(dá)展示和分泌形式的抗體，將弗林蛋白酶切割位點(diǎn)(FCS)插入到重鏈與PDGFR之間。實(shí)施例3本實(shí)施例描述了全長(zhǎng)人類抗體哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)的構(gòu)建。本實(shí)施例顯示了具有IO9或更大多樣性的全長(zhǎng)人類抗體哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)的建造。使用在實(shí)施例1中構(gòu)建的載體作為骨架用于構(gòu)建文庫(kù)。使用在書(shū)籍《噬菌體展示》(PhageDisplay (Carles 等，Cold Spring Harbor Laboratory Pr.))中描述的引物，通過(guò)PCR從人類免疫組織(骨髓、脾臟和外周血淋巴細(xì)胞)的即用cDNA(BioChain, South San Francisco, CA USA)擴(kuò)增了人類抗體重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域基因(Vh和VI)。對(duì)PCR條件進(jìn)行優(yōu)化，以確保Vh和Vl的有效準(zhǔn)確的擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物用與克隆載體匹配的適合的限制性酶消化。在消化后使用PCR純化試劑盒 (Qiagen)純化產(chǎn)物。對(duì)于重鏈表達(dá)來(lái)說(shuō)，將IgGl的重鏈恒定區(qū)(Ch)、FCS和PDGFR序列克隆到實(shí)施例 1的載體的MCS中。然后使用T4連接酶將Vh混合物同框插入到載體中Ch區(qū)之前。在將連接混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，通過(guò)測(cè)量轉(zhuǎn)化體數(shù)量來(lái)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率和文庫(kù)大小，以確保文庫(kù)大小為10e5以上。通過(guò)對(duì)100個(gè)以上個(gè)體克隆進(jìn)行序列分析，對(duì)文庫(kù)的多樣性進(jìn)行更精確的分析和計(jì)算。如果只需要在細(xì)胞表面上表達(dá)抗體，F(xiàn)CS區(qū)不必包含在載體中。對(duì)于輕鏈表達(dá)來(lái)說(shuō)，將κ (或λ )鏈恒定區(qū)(Cl)克隆到實(shí)施例1的載體的MCS中。 然后使用Τ4連接酶將Vl混合物同框插入到載體中Cl區(qū)之前。在將連接混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，通過(guò)測(cè)量轉(zhuǎn)化體數(shù)量來(lái)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率和文庫(kù)大小，以確保文庫(kù)大小為10e4以上。通過(guò)對(duì)100個(gè)以上個(gè)體克隆進(jìn)行序列分析，對(duì)文庫(kù)的多樣性進(jìn)行更精確的分析和計(jì)算。重鏈和輕鏈文庫(kù)載體兩者可以容易地在細(xì)菌中擴(kuò)增，并安全地儲(chǔ)存在-20°C下。該文庫(kù)是初級(jí)的、未接觸過(guò)抗原的全長(zhǎng)人類抗體文庫(kù)，其潛在多樣性> =10e9。從該文庫(kù)表達(dá)的抗體可以錨定在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面上，直接用于親和性和功能篩選和選擇。 同時(shí)，一部分抗體作為可溶分子表達(dá)在條件培養(yǎng)基中，其可以直接用于抗體的進(jìn)一步功能分析和特征分析，而不用將抗體從膜錨定形式轉(zhuǎn)變成可溶形式，加快了篩選和選擇。實(shí)施例4本實(shí)施例描述了哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示的抗體文庫(kù)的表達(dá)和篩選以及選擇抗體候選物。從實(shí)施例3構(gòu)建的文庫(kù)是載體DNA并可以被擴(kuò)增。為了擴(kuò)增載體文庫(kù)，將載體DNA 轉(zhuǎn)化到細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞中。收集抗生素抗性菌落，并使用max-prep試劑盒^jiagen)從細(xì)菌純化載體DNA。將四3細(xì)胞培養(yǎng)在增補(bǔ)有10% FBS并且不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen) 中。使用轉(zhuǎn)染優(yōu)化試劑盒(Biocompare，S. San Francisco，CA)，在細(xì)胞密度、載體DNA劑量、 重鏈和輕鏈文庫(kù)的比率、轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染步驟方面對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化。為了制備用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，根據(jù)需要將293細(xì)胞分開(kāi)，并接種到包被有聚賴氨酸的T225培養(yǎng)瓶中。使用優(yōu)化條件，將DNA文庫(kù)混合物轉(zhuǎn)染到T225培養(yǎng)瓶中的293細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)，使用解離緩沖液(Invitrogen)將細(xì)胞解離，并將其以Ie6-le7/ml的密度
28懸浮在染色緩沖液中(含有2% FBS的PBS)。將細(xì)胞用PE-標(biāo)記的小鼠抗人IgGl重鏈和 FITC-標(biāo)記的抗人κ鏈恒定區(qū)抗體(lug/ml)進(jìn)行雙重染色。然后通過(guò)FACS分析細(xì)胞表面上抗體的表達(dá)。通常，與陰性對(duì)照相比，90%以上的細(xì)胞被陽(yáng)性染色。這是初級(jí)細(xì)胞文庫(kù)。為了從文庫(kù)篩選特定抗體，將選定的抗原(針對(duì)特異性，參見(jiàn)其他實(shí)施例)用生物素標(biāo)記，然后用于對(duì)符合如上所述的抗體陽(yáng)性細(xì)胞群體進(jìn)行染色。將鏈親和素結(jié)合的磁珠(Dynal/Invitrogen)與抗原染色的細(xì)胞群體混合。特異性抗體陽(yáng)性細(xì)胞被磁珠捕獲，并按照產(chǎn)品手冊(cè)中的描述通過(guò)磁場(chǎng)進(jìn)行收集。因?yàn)樘禺愋钥贵w基因的百分率非常低，在細(xì)胞合并物中表達(dá)特異性抗體的細(xì)胞數(shù)量稀少。在該步驟中，施加低嚴(yán)緊性結(jié)合條件以確保所有與抗原的結(jié)合物都可以被捕獲。 這里，目的是富集結(jié)合物，而純度可以忽略。在一個(gè)富集循環(huán)中，即使純度僅僅為萬(wàn)分之一 (1/I0e4)，與=> 10e9的文庫(kù)多樣性相比，已經(jīng)富集了至少10e5倍。下面的步驟對(duì)于從高度多樣性的文庫(kù)成功分離抗原特異性抗體來(lái)說(shuō)是重要的，因?yàn)榧词股厦娴母患赡芤呀?jīng)高達(dá)10e5倍，但合并物中的大多數(shù)細(xì)胞仍表達(dá)非特異性抗體。1.為了進(jìn)一步富集特異性結(jié)合物，從上述富集步驟的細(xì)胞子合并物提取總mRNA。 通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增總mRNA中抗體基因的Vh和Vl區(qū)，并將其分別克隆到含有Ch和Cl區(qū)的骨架載體中，以構(gòu)建兩個(gè)子文庫(kù)——重鏈和輕鏈子文庫(kù)。2.將這些子文庫(kù)的混合物轉(zhuǎn)染到新鮮的293細(xì)胞中，并分析細(xì)胞表面上的抗體表達(dá)。3.如同對(duì)初級(jí)細(xì)胞文庫(kù)所做的，富集特異性抗原結(jié)合物。將上述步驟1至3重復(fù)所需的循環(huán)數(shù)。每個(gè)循環(huán)使用的結(jié)合條件的嚴(yán)緊性越來(lái)越高，以分離親和性越來(lái)越高的結(jié)合物。細(xì)胞合并物的純度變得越來(lái)越高，在2-4個(gè)富集循環(huán)后，大多數(shù)細(xì)胞應(yīng)該為特異性抗原染色陽(yáng)性。這種重復(fù)的篩選不僅富集了結(jié)合物，而且改組了細(xì)胞中的重鏈和輕鏈，其可以增加分離到具有較高表達(dá)以及較高親和性的抗體的機(jī)會(huì)。為了使用FACS分析細(xì)胞合并物，將細(xì)胞用FITC結(jié)合的抗輕鏈抗體或PE結(jié)合的特異性抗原或兩者進(jìn)行染色。對(duì)初級(jí)細(xì)胞合并物和細(xì)胞子合并物進(jìn)行FACS分析，以計(jì)算富集效率。為了分離抗體基因，從最終的細(xì)胞子合并物提取總mRNA。對(duì)Vh和Vl區(qū)進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增、限制性酶消化和純化。將獲得的Ch和Cl插入到實(shí)施例2的穩(wěn)定表達(dá)載體中并與其恒定配偶體同框，以形成全長(zhǎng)重鏈基因和全長(zhǎng)輕鏈基因，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的子文庫(kù)。在該載體中，重鏈和輕鏈對(duì)是固定的，并且如果只有一個(gè)載體被整合在基因組中，那么只表達(dá)一種類型的抗體。將穩(wěn)定表達(dá)的子文庫(kù)轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中。為了確保每個(gè)細(xì)胞基因組中整合一個(gè)載體，對(duì)轉(zhuǎn)染條件的多個(gè)參數(shù)包括DNA劑量、與不同量的非表達(dá)載體混合以及轉(zhuǎn)染程序進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)FACS分析抗體的表達(dá)水平和特異性結(jié)合親和性。通過(guò)單細(xì)胞FACS分揀分離出表現(xiàn)出高表達(dá)和高親和性的單個(gè)細(xì)胞。在擴(kuò)增后，對(duì)這些單細(xì)胞群體進(jìn)一步進(jìn)行下列分析1.細(xì)胞表面上的抗原競(jìng)爭(zhēng)分析。
2.抗體與其他物種抗原的交叉反應(yīng)。3.使用條件培養(yǎng)基的功能分析。4.使用純化抗體的功能分析。從這些單細(xì)胞群體中通過(guò)RT-PCR克隆特異性抗體基因，并測(cè)序驗(yàn)證它們是單一克隆?？梢詫⑦x定的抗體基因進(jìn)行大規(guī)模表達(dá)用于進(jìn)一步分析。實(shí)施例5本實(shí)施例描述了全長(zhǎng)小鼠-人類嵌合抗體哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)的構(gòu)建。為了構(gòu)建文庫(kù)，使用了與實(shí)施例3中描述的相同的策略。使用在書(shū)籍《噬菌體展示》(PhageDisplay (Carles 等，Cold Spring Harbor Laboratory Pr.))中描述的引物，通過(guò)PCR從小鼠免疫組織(骨髓、脾臟和外周血淋巴細(xì)胞)的即用cDNA(BioChain，South San Francisco, CA USA)擴(kuò)增了小鼠抗體重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域基因(Vh和VI)。對(duì)PCR條件進(jìn)行優(yōu)化，以確保Vh和Vl的有效準(zhǔn)確的擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物用與克隆載體匹配的適合的限制性酶消化。在消化后使用PCR純化試劑盒 (Qiagen)純化產(chǎn)物。對(duì)于小鼠-人類嵌合重鏈表達(dá)來(lái)說(shuō)，將人類IgGl的重鏈恒定區(qū)(Ch)、FCS和PDGFR 序列克隆到實(shí)施例1的載體的MCS中。然后使用T4連接酶將小鼠Vh混合物同框插入到載體中Ch區(qū)之前。在將連接混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，通過(guò)測(cè)量轉(zhuǎn)化體數(shù)量來(lái)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率和文庫(kù)大小，以確保文庫(kù)大小為10e5以上。通過(guò)對(duì)100個(gè)以上個(gè)體克隆進(jìn)行序列分析，對(duì)文庫(kù)的多樣性進(jìn)行更精確的分析和計(jì)算。如果只需要在細(xì)胞表面上表達(dá)抗體，F(xiàn)CS區(qū)不必包含在載體中。對(duì)于小鼠-人類嵌合輕鏈表達(dá)來(lái)說(shuō)，將人類κ (或λ)鏈恒定區(qū)(Cl)克隆到實(shí)施例1的載體的MCS中。然后使用Τ4連接酶將小鼠Vl混合物同框插入到載體中Cl區(qū)之前。 在將連接混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，通過(guò)測(cè)量轉(zhuǎn)化體數(shù)量來(lái)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率和文庫(kù)大小，以確保文庫(kù)大小為10e4以上。通過(guò)對(duì)100個(gè)以上個(gè)體克隆進(jìn)行序列分析，對(duì)文庫(kù)的多樣性進(jìn)行更精確的分析和計(jì)算。重鏈和輕鏈文庫(kù)載體兩者可以容易地在細(xì)菌中擴(kuò)增，并安全地儲(chǔ)存在-20°C下。該文庫(kù)是初級(jí)的、未接觸過(guò)抗原的全長(zhǎng)小鼠-人類嵌合抗體文庫(kù)，其潛在多樣性 >=10e9。從該文庫(kù)表達(dá)的抗體可以錨定在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面上，直接用于親和性和功能篩選和選擇。同時(shí)，一部分抗體作為可溶分子表達(dá)在條件培養(yǎng)基中，其可以直接用于抗體的進(jìn)一步功能分析和特征分析，而不用將抗體從膜錨定形式轉(zhuǎn)變成可溶形式，加快了篩選和選擇。為了構(gòu)建全長(zhǎng)小鼠抗體展示文庫(kù)，使用小鼠的重鏈和輕鏈恒定區(qū)代替載體中的人類對(duì)應(yīng)部分。實(shí)施例6本實(shí)施例描述了抗體樣二價(jià)肽體哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)的構(gòu)建。使用在上面實(shí)施例中描述的方法，構(gòu)建了抗體樣、二價(jià)的、可以哺乳動(dòng)物展示的肽體文庫(kù)。在體外合成了多肽基因文庫(kù)。文庫(kù)的DNA序列具有36-72個(gè)核苷酸的大小，側(cè)翼在兩端帶有限制性酶識(shí)別序列，用于將文庫(kù)克隆到表達(dá)載體中。構(gòu)建了兩個(gè)不同的肽體文庫(kù)。在一個(gè)文庫(kù)中，多肽與人類Ch融合，在另一個(gè)文庫(kù)中，多肽與人類Cl融合。兩個(gè)文庫(kù)的大小都=> 10e5。將這兩個(gè)DNA文庫(kù)以等量的分子混合，并轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞(CH0細(xì)胞)中。因?yàn)樵诩?xì)胞中離體配對(duì)，潛在的文庫(kù)大小能夠達(dá)到10e5以上。通過(guò)實(shí)施例4中描述的方法篩選出選定抗原的特異性結(jié)合物。在該抗體樣肽體中可能存在多達(dá)4種不同的多肽，兩種來(lái)自于重鏈融合，兩種來(lái)自于輕鏈融合。進(jìn)一步的篩選和下游開(kāi)發(fā)例如在帶有雙表達(dá)盒的載體中配對(duì)，能夠最終鑒定到帶有成對(duì)多肽、具有所需功能的候選物。實(shí)施例7本實(shí)施例顯示了用于快速構(gòu)建抗體文庫(kù)和在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面表達(dá)抗體蛋白的單表達(dá)盒載體的構(gòu)建。表達(dá)載體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建限制性酶SfiI識(shí)別非回文序列并形成3個(gè)堿基的突出末端。因?yàn)槟┒诉@三個(gè)位置中的每個(gè)可以是四種核苷酸G、A、T、C的任一種，因此末端序列總共可以具有64種不同可能性。因此有可能在片段的兩端設(shè)計(jì)不同切割序列，其在連接過(guò)程中將不自連。這種特點(diǎn)在文庫(kù)構(gòu)建中對(duì)于增加連接和轉(zhuǎn)化效率來(lái)說(shuō)是非常有用的。BstXI和BsmBI具有類似特點(diǎn)，并且各自能夠形成256種可能的末端。為了靈活插入抗體重鏈、輕鏈或重鏈的可變結(jié)構(gòu)域，設(shè)計(jì)了一種通用載體，并且已經(jīng)將上面列出的三種酶導(dǎo)入到載體中。選擇了 CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)該載體中插入基因的表達(dá)。表1、用于載體構(gòu)建的引物
權(quán)利要求
1.一種編碼特異性識(shí)別特定抗原的抗體的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a)篩選用編碼輕鏈的第一個(gè)多核苷酸初級(jí)文庫(kù)和編碼重鏈的第二個(gè)初級(jí)文庫(kù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、并在細(xì)胞表面上展示由所述多核苷酸編碼的抗體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞初始群體，以獲得哺乳動(dòng)物細(xì)胞的亞群；b)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生多核苷酸的子文庫(kù)；c)篩選用所述多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染、并在細(xì)胞表面上展示由所述多核苷酸編碼的抗體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體，以獲得哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群；以及d)從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群分離編碼特異性識(shí)別特定抗原的抗體的多核苷酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟d)之前將步驟b)和c)重復(fù)至少一次。
3.權(quán)利要求2的方法，其中在步驟d)之前將步驟b)和c)重復(fù)不超過(guò)約3次。
4.權(quán)利要求1的方法，其中初級(jí)文庫(kù)中的多核苷酸編碼至少I(mǎi)O9種不同抗體。
5.權(quán)利要求1的方法，其中將哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體在群體中的各個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠攝取約1000以上個(gè)多核苷酸拷貝的條件下用初級(jí)文庫(kù)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
6.權(quán)利要求1的方法，其還包含將多核苷酸的初級(jí)文庫(kù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體中。
7.權(quán)利要求1的方法，其中步驟a)包含(i)將哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體在適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合條件下與抗原相接觸；以及 ( )回收與抗原結(jié)合的哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群。
8.權(quán)利要求7的方法，其中回收通過(guò)FACS、磁珠或其組合來(lái)進(jìn)行。
9.權(quán)利要求1的方法，其中步驟c)包含(i)將富集的哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)在適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合條件下與抗原相接觸；以及 ( )回收與抗原結(jié)合的哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群。
10.權(quán)利要求9的方法，其中步驟(i)中的結(jié)合條件比權(quán)利要求7中步驟(i)的結(jié)合條件更嚴(yán)緊。
11.權(quán)利要求1的方法，其中步驟d)包含i)從細(xì)胞亞群分離mRNA；ii)將mRNA擴(kuò)增成cDNA；iii)將cDNA克隆到克隆載體中；以及iv)測(cè)定DNA的序列。
12.權(quán)利要求1的方法，其中初始哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)從骨髓、脾臟、淋巴結(jié)和淋巴細(xì)胞的任一種產(chǎn)生。
13.權(quán)利要求1的方法，其中初始哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)從人產(chǎn)生。
14.權(quán)利要求1的方法，其中抗體是全長(zhǎng)抗體。
15.權(quán)利要求14的方法，其中步驟a)包含篩選用編碼輕鏈的第一個(gè)多核苷酸初級(jí)文庫(kù)和編碼重鏈的第二個(gè)初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染、并在細(xì)胞表面上展示全長(zhǎng)抗體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的初始群體。
16.一種編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a)從用編碼輕鏈的第一個(gè)多核苷酸初級(jí)文庫(kù)和編碼重鏈的第二個(gè)多核苷酸初級(jí)文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞初始群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群；b)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA，以產(chǎn)生編碼輕鏈的第一個(gè)多核苷酸子文庫(kù)和編碼重鏈的第二個(gè)多核苷酸子文庫(kù)；c)從用第一個(gè)多核苷酸子文庫(kù)和第二個(gè)多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群；d)將從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第二個(gè)亞群提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增所述cDNA， 以產(chǎn)生編碼輕鏈和重鏈的第三個(gè)多核苷酸子文庫(kù)；e)從用第三個(gè)多核苷酸子文庫(kù)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體中篩選出展示特異性識(shí)別抗原的抗體的細(xì)胞，并回收哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第三個(gè)亞群；以及f)從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第三個(gè)亞群分離出編碼特異性識(shí)別抗原的抗體的多核苷酸。
17.—種構(gòu)建編碼抗體的多核苷酸文庫(kù)的方法，其中多核苷酸總計(jì)編碼至少約IO9種不同的重組抗體。
18.一種用編碼抗體的多核苷酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體，其中多核苷酸總計(jì)編碼至少約IO9種不同的重組抗體。
19.一種表達(dá)載體，其包含側(cè)翼帶有一對(duì)可被限制性酶識(shí)別的切割位點(diǎn)的開(kāi)放閱讀框， 其中用所述限制性酶切割所產(chǎn)生的每個(gè)片段的末端不自連。
20.一種雙表達(dá)盒載體，所述載體包含1)側(cè)翼帶有可被限制性酶識(shí)別的第一對(duì)切割位點(diǎn)的第一個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中用所述限制性酶切割所產(chǎn)生的每個(gè)片段的末端不自連；以及2)側(cè)翼帶有可被限制性酶識(shí)別的第二對(duì)切割位點(diǎn)的第二個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中用所述第二種限制性酶切割所產(chǎn)生的每個(gè)片段的末端不自連。
全文摘要
本發(fā)明提供了利用哺乳動(dòng)物展示文庫(kù)篩選來(lái)分離出編碼具有所需性質(zhì)的多肽例如抗體的多核苷酸的方法以及產(chǎn)生編碼多肽例如抗體的多核苷酸文庫(kù)的方法，其中多核苷酸總計(jì)編碼至少109種不同多肽。還提供了用于執(zhí)行本發(fā)明描述的方法的試劑盒、通過(guò)本發(fā)明描述的方法分離到的多核苷酸、編碼不同物種包括人、小鼠、兔的抗體庫(kù)的文庫(kù)，以及由所述多核苷酸編碼的多肽。
文檔編號(hào)C12P19/34GK102282266SQ200980154588
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2009年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月21日
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