專(zhuān)利名稱：TNFα高親和力嵌合抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)與計(jì)算機(jī)輔助合理設(shè)計(jì)方法結(jié)合篩選獲得的人腫瘤壞死因子(hTNF-α)高親和力嵌合抗體(本發(fā)明中命名為CH22)。
背景技術(shù)：
人腫瘤壞死因子α(hTNFα)是一種由單核、巨噬、T淋巴、中性粒、肥大或內(nèi)皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子，可介導(dǎo)多種生物學(xué)活性。當(dāng)hTNF-α在體內(nèi)的大量產(chǎn)生和釋放可引起機(jī)體免疫平衡失調(diào)，并可與其它炎癥因子一起產(chǎn)生多種病理?yè)p傷，例如惡病質(zhì)和敗血癥休克所致的多器官功能衰竭、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎(AS)、多發(fā)性硬化癥(MS)、炎癥性腸病(IBD)、移植物抗宿主病(GVHD)和骨髓造血紊亂綜合癥(MDS)等多種疾病。因此，通過(guò)應(yīng)用中和hTNF-α活性的抗體，可阻斷因hTNF-α水平異常增高導(dǎo)致的機(jī)體病理性損傷，最終達(dá)到對(duì)疾病的有效治療目的。美國(guó)Centocor公司研制生產(chǎn)的抗hTNF-α嵌合抗體(商品名Remicade)，美國(guó)FDA、歐盟和日本相繼已批準(zhǔn)用于RA、結(jié)腸Crohn病和AS的臨床治療。
本研究組于上世紀(jì)八十年代已經(jīng)制備得到抗hTNFα鼠源單克隆抗體(McAb)Z12(黎燕等，生物工程學(xué)報(bào)，1991，7(2)，121-126)，具有中和hTNFα細(xì)胞毒性功能，其親和力在Ka＝8×107L/mol。在其人源化過(guò)程中，抗體的親和力又有顯著地降低。本發(fā)明嘗試借助鏈替換(Chain Shuffling)方法，以鼠源抗體Z12為母本，通過(guò)噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)親和篩選，借助計(jì)算機(jī)合理設(shè)計(jì)獲得高親和力嵌合抗體，以期達(dá)到在保持抗體中和活性的同時(shí)顯著提高抗體親和力的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于原有的母本鼠源抗體Z12，采用一種新的策略(即噬菌體抗體庫(kù)鏈替換技術(shù)與計(jì)算機(jī)輔助合理設(shè)計(jì)相結(jié)合)獲得高親和性抗體。
首先，在母本鼠源抗體Z12基礎(chǔ)上，通過(guò)鏈替換方法對(duì)構(gòu)建的噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得潛在的具有較高中和活性的嵌合抗體。
利用同源模建方法對(duì)篩選的嵌合抗體可變區(qū)空間構(gòu)象進(jìn)行合理分析，在理論指導(dǎo)下將其與母本抗體Z12空間構(gòu)象進(jìn)行結(jié)構(gòu)、表觀性征的比較；通過(guò)分子對(duì)接方法構(gòu)建抗體與hTNFα相互作用的復(fù)合物空間構(gòu)象，借助相關(guān)理論方法對(duì)復(fù)合物的穩(wěn)定性、結(jié)合強(qiáng)弱以及相互作用區(qū)域進(jìn)行理論分析，確定具有高親和活性的嵌合抗體。通過(guò)生物學(xué)試驗(yàn)獲得該抗體，借助功能性試驗(yàn)對(duì)其中和活性進(jìn)行驗(yàn)證。
本發(fā)明通過(guò)以下步驟獲得了一株高親和力抗TNFα嵌合抗體。
1、利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)篩選TNFα高親和力嵌合抗體構(gòu)建供鏈替換(Chain Shuffling)應(yīng)用的抗體文庫(kù)，通過(guò)親和富集篩選獲得陽(yáng)性噬菌體抗體克隆，基因測(cè)序獲得抗體可變區(qū)基因序列。
2、計(jì)算機(jī)輔助合理預(yù)測(cè)抗hTNFα高親和力嵌合抗體利用同源模建方法對(duì)抗體庫(kù)篩選獲得的抗體可變區(qū)的空間構(gòu)象進(jìn)行模擬，在分子力學(xué)及動(dòng)力學(xué)條件下，選擇CVFF、Amber力場(chǎng)對(duì)其優(yōu)勢(shì)構(gòu)象進(jìn)行分析。在距離幾何學(xué)、計(jì)算機(jī)圖形學(xué)基礎(chǔ)上對(duì)篩選的抗體可變區(qū)三維構(gòu)象與母本抗體Z12空間構(gòu)象進(jìn)行比較，初步分析篩選抗體可變區(qū)構(gòu)象與母本抗體Z12構(gòu)象的差異。
通過(guò)分子對(duì)接方法獲得抗體與抗原h(huán)TNFα相互作用的復(fù)合物模型，借助計(jì)算機(jī)圖形學(xué)技術(shù)、反應(yīng)自由能理論、分子間氫鍵形成理論對(duì)篩選的抗體可變區(qū)與抗原TNFα作用模式進(jìn)行比較，同時(shí)借助建立的母本抗體Z12與TNFα相互作用的數(shù)學(xué)模型，確定具有高親和性的嵌合抗體。
本發(fā)明通過(guò)上述策略獲得了一株具有高親和力(Ka＝6×1010L/mol)的抗hTNFα嵌合抗體CH22。顯而易見(jiàn)的是，本發(fā)明的嵌合抗體的抗原結(jié)合部分也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
3、高親和性嵌合抗體CH22生物學(xué)效應(yīng)評(píng)價(jià)借助理論預(yù)測(cè)結(jié)果，通過(guò)生物學(xué)方法對(duì)嵌合抗體CH22生物學(xué)功能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析嵌合抗體CH22能夠特異性結(jié)合hTNFα，其抗原識(shí)別的主要表位hTNFα141-146表位，相對(duì)于母本抗體Z12，CH22親和力提高750倍，中和活性TNFα的能力提高10倍；比Remicade(Infliximab，F(xiàn)DA批準(zhǔn)用于臨床治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的嵌合抗體)親和力高6倍。它們識(shí)別TNFα的功能表位不同，但中和TNFα活性的能力相同。通過(guò)功能試驗(yàn)表明，抗體CH22具有同時(shí)識(shí)別重組和天然hTNFα的能力，具有良好的臨床應(yīng)用前景。


圖1.3.1.1 EILSA測(cè)定免疫小鼠血清效價(jià)。
圖1.3.1.2 小鼠脾淋巴細(xì)胞總RNA的電泳圖譜。
圖1.3.2.1 RT-PCR擴(kuò)增得到抗體基因文庫(kù)。
1Fd片段的PCR產(chǎn)物；2DNA標(biāo)記(DL2000)；3輕鏈PCR產(chǎn)物圖1.3.3.1 噬菌體抗體表達(dá)載體p3MH(示意圖)。
Lac啟動(dòng)子；OmpA和PelB信號(hào)序列；9E10編碼McAb 9E10識(shí)別的表位；His6組胺酸尾圖1.3.3.2 噬菌體抗體表達(dá)載體p3MH酶切位點(diǎn)的鑒定。
1p3MH； 2p3MH/SacI；3p3MH/XbaI；4p3MH/XhoI；5p3MH/SpeI圖1.3.3.3 p3MH/Z12L酶切鑒定圖譜。
1DNA標(biāo)記(DL2000)；2-4p3MH/Z12L/SacI+XbaI；5p3MH/SacI+XbaI圖1.3.3.4 p3MH/Z12L序列測(cè)定結(jié)果。
圖1.3.3.5 p3MH/Z12H酶切鑒定圖譜。
1DNA標(biāo)記(DL2000)；2p3MH/XhoI+SpeI；3p3MH/Z12H/XhoI+SpeI圖1.3.3.6 p3MH/Z12H序列測(cè)定結(jié)果。
圖1.3.5.1 噬菌體抗體H22、Ke、Kg與Z12比較對(duì)rh-TNFα相對(duì)親和力。
圖2.2.1.1 pGEM-T Easy/噬菌體抗體克隆酶切鑒定圖譜。
1DNA標(biāo)記(DL2000)；2-5pGEM-T Easy/噬菌體抗體基因/EcoRI圖2.2.1.2 抗體克隆H22重鏈Fd部分基因測(cè)序報(bào)告。
圖2.2.1.3 抗體克隆Ke輕鏈基因測(cè)序報(bào)告。
圖2.2.2.1 抗體可變區(qū)基因的翻譯。
圖2.2.2.2 抗體可變區(qū)基因FR、CDR區(qū)分類(lèi)。
圖2.2.3.1 抗體A2H可變區(qū)空間構(gòu)象示意圖。
圖2.2.3.2 抗體C2H可變區(qū)空間構(gòu)象示意圖。
圖2.2.3.3 抗體H22可變區(qū)空間構(gòu)象示意圖。
圖2.2.4.1 抗體A2H可變區(qū)與TNFα作用的復(fù)合物空間構(gòu)象。
圖2.2.4.2 抗體A4H可變區(qū)與TNFα作用的復(fù)合物空間構(gòu)象。
圖2.2.4.3 抗體H22可變區(qū)與TNFα作用的復(fù)合物空間構(gòu)象。
圖3.3.1.1 嵌合抗體表達(dá)載體PWS3示意圖。
圖3.3.1.2 重組表達(dá)質(zhì)粒PWS3H22的構(gòu)建和鑒定。
(A)PWS3H22的酶切消化1HindIII/XhoI消化的PWS3H22；2BamHI/XbaI消化的PWS3H22；3DL2000標(biāo)記(B)在1％瓊脂糖凝膠上PCR鑒定PWS3H221H22重鏈可變區(qū)產(chǎn)物；2H22輕鏈可變區(qū)產(chǎn)物；3DNA標(biāo)記(DL2000)圖3.3.2.1 CH22對(duì)TNF-α結(jié)合特異性檢測(cè)。
AELISA檢測(cè)CH22對(duì)TNF-α的特異性結(jié)合，1.陽(yáng)性對(duì)照(Z12)；2.CH22；3.陰性對(duì)照(人IgG)；B蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)CH22對(duì)TNF-α的特異性結(jié)合，1.PBS；2.陰性對(duì)照(人IgG)；3.陽(yáng)性對(duì)照(Z12)；4.CH22圖3.3.3.1純化抗體分子SDS-PAGE電泳圖。
1.2.CH22；3.Z12；4.Remicade；5.人IgG圖3.3.4.1 幾種不同抗hTNFα抗體抗原識(shí)別位點(diǎn)比較。
圖4本發(fā)明的高親和力嵌合抗體構(gòu)建流程圖。
具體實(shí)施例方式
1、噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建及親和篩選1.1 材料菌株和質(zhì)粒本發(fā)明中使用的生物材料包括大腸桿菌JM109菌，XLI-Blu菌(Invitrogen)；噬菌體抗體庫(kù)Fab段表達(dá)載體p3MH(Barbas CF 3rd，KangAS，Lerner RA，Benkovic SJ.Proc Natl Acad Sci USA.1991 Sep15；88(18)7978-82)工具酶、試劑限制性內(nèi)切酶購(gòu)自New England Biolabs公司；T4 DNA連接酶、pGEM-T Easy載體試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司；Pyrobest DNA聚合酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000購(gòu)自TaKaRa公司；TRIzol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；二磷酸腺苷(ADP)為Biopool產(chǎn)品；DNA片段回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGABIO-TEK公司；質(zhì)?；厥赵噭┖匈?gòu)自天為時(shí)代公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的anti-M13抗體購(gòu)自amersham pharmacia公司；其他常用化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純；1.2方法1.2.1小鼠脾臟分離制備淋巴細(xì)胞小鼠眼球除血，泡至75％乙醇中。取出小鼠放置平板上，俯臥位。用鑷子夾起左側(cè)皮毛部，剪開(kāi)皮膚、腹膜，分離脾臟，放置平皿中。輕柔剪去脾臟兩側(cè)系膜及周?chē)M織，于平皿中加入1-2ml生理鹽水，輕搖平皿洗滌。用平扁齒鑷子輕擠壓脾臟包膜，將脾臟細(xì)胞擠至平皿中，形成細(xì)胞懸液。預(yù)先于試管中加入3ml小鼠淋巴細(xì)胞分離液，再加入6ml細(xì)胞懸液加入時(shí)沿管壁緩緩加入，形成不同的液面層。室溫離心2000rpm 30分鐘，輕輕環(huán)繞吸取液面細(xì)胞，加入生理鹽水6-8ml混勻洗滌。離心1500rpm 5分鐘棄上清，所得沉淀即為淋巴細(xì)胞。
1.2.2脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞總RNA的提取取淋巴細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，按1×107細(xì)胞分裝入EP管中，1500rpm離心5分鐘，棄生理鹽水，留細(xì)胞沉淀。在每管中分別加入1ml TRIzol，用手反復(fù)搖勻至細(xì)胞碎片完全被裂解。室溫靜置幾分鐘后，每管加入0.2ml氯仿，在手中反復(fù)振蕩搖勻，室溫靜置10分鐘。將EP管置于高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，4℃，12000rpm離心30分鐘。小心吸取上層液相置于另一無(wú)菌EP管中，于管中加入等體積異丙醇，室溫沉淀10分鐘。4℃，12000rpm離心20分鐘，棄上清，沉淀用75％乙醇洗一遍。沉淀的RNA在室溫自然干燥，切勿抽干。每管用30ml無(wú)RNA酶的純水重懸干燥后的RNA。立即置于冰浴用于cDNA合成或置-70℃長(zhǎng)期保存。
1.2.3 RNA甲醛變性電泳電泳膠0.3g瓊脂糖、21.6ml無(wú)RNA酶的去離子水，微波爐加熱融化后，再加3ml 10×mops，5.4ml甲醛。
樣品處理5μl RNA樣品，5μl 10×mops，25μl甲酰胺，9μl甲醛混勻后，56℃反應(yīng)15分鐘后，加上樣緩沖液進(jìn)行電泳。
電極緩沖液(10×)0.4M mops，0.1M醋酸鈉，0.01M EDTA。
電泳結(jié)束后，EB染色，紫外觀察。
1.2.4 PCR引物本發(fā)明引物主要用于擴(kuò)增抗體IgG重鏈Fd部分、輕鏈κ鏈的全長(zhǎng)基因，具體如下。
用于擴(kuò)增抗體重鏈Fd基因引物A(正義)5’-CCAGTTCGGAGCTCGTTGTGACTCAGGAATCT-3’(SEQ ID NO9)B(正義)5’-CCAGTTCCGAGCTCGTGTTGACGCAGCCGCCC-3’(SEQ ID NO10)C(正義)5’-CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA-3’(SEQ ID NO11)D(正義)5’-CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTATCCA-3’(SEQ ID NO12)E(正義)5’-CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA-3’(SEQ ID NO13)
F(正義)5’-CCAGATGTGAGCTCGTCATGACCCAGTCTCCA-3’ (SEQ ID NO14)G(正義)5’-CCAGTTCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCA-3’ (SEQ ID NO15)H(反義)5’-CCGACTAGTTCATTTCAGCTCCAGCCAGGTG-3’ (SEQ ID NO16)I(反義)5’-CTCGACACTAGTTTTGCGCTCAACTGTCTT-3’(SEQ ID NO17)J(反義)5’-TGTGTGACTAGTGTCACCAAGTGGGGTTTT-3’(SEQ ID NO18)K(反義)5’-GCATGAACTAGTTGGGGGACCATATTTGGA-3’(SEQ ID NO19)用于擴(kuò)增抗體輕鏈全長(zhǎng)基因引物L(fēng)(正義)5’-AGGTCTCGAGCTCGAGTCTGG-3’ (SEQ ID NO20)M(正義)5’-AGGTCTCGAGCTCGAGTCAGG-3’ (SEQ ID NO21)N(正義)5’-AGGTCTCGAGTCCGAGTCTGG-3’ (SEQ ID NO22)O(正義)5’-AGGTCTCGAGTTCGAGTCAGG-3’ (SEQ ID NO23)P(正義)5’-AGGTCTCGAGGCTGAGTCTGG-3’ (SEQ ID NO24)Q(正義)5’-AGGTCTCGAGCGTAAGTCTGG-3’ (SEQ ID NO25)R(正義)5’-AGGTCTCGAGGGAAAGTCAGG (SEQ ID NO26)S(反義)5’-GACTTGGTCTAGACGAGACGGTGAC-3’ (SEQ ID NO27)*劃線部分分別是XhoI、SpeI、SacI、xbaI的酶切位點(diǎn)。
1.2.5抗體輕、重鏈基因文庫(kù)的建立(RT-PCR)取10μg總RNA，依次加入AMV 5×緩沖液10μl，Oligo(dT)(500ng/μl)2μl，10mmol/L dNTPs4μl，Rnasin(50U/μl)1μl，去離子水補(bǔ)至50μl、反轉(zhuǎn)錄酶100U，42℃延伸1小時(shí)。70℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶15分鐘，置冰浴中，產(chǎn)物為cDNA第一鏈。然后在100μl PCR反應(yīng)體系中，分別加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μl，Pyrobest酶10×buffer 10μl，上下游引物各1μl，10mmol/L dNTPs 1μl，加Pyrobest酶2-5U，去離子水補(bǔ)至100μl。95℃變性5分鐘，循環(huán)參數(shù)為94℃1分鐘，50℃1分鐘，72℃1分鐘，共35個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10分鐘。
1.2.6 DNA片段的純化用OMEGABIO-TEK公司的DNA片段純化試劑盒，純化按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用0.8％普通瓊脂糖凝膠電泳，分離出欲回收的DNA片段，在長(zhǎng)波紫外光下切下含目的DNA片段的膠塊，放入離心管中，加入三倍膠體積的化膠液，55℃水浴完全溶解膠塊。然后加入DNA回收柱，室溫放置2分鐘，10,000rpm離心30秒，洗滌緩沖液1ml分別把沉淀洗兩次，離心棄廢液，用50μl去離子水加到柱中，室溫放置2分鐘后，離心，純化的DNA片段在水溶液里。
1.2.7載體P3MH/Z12L和P3MH/Z12H的構(gòu)建從已克隆抗體Z12輕鏈全長(zhǎng)及重鏈Fd段的載體pGEM-Teasy/Z12L和pEM-Teasy/Z12H中，通過(guò)PCR的方法，重新獲得抗體基因。將載體P3MH和純化的PCR產(chǎn)物分別按照相對(duì)應(yīng)地酶切消化以后，連接、轉(zhuǎn)化XLI-Blu宿主菌，最后經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建P3MH/Z12L和P3MH/Z12H載體。
1.2.8載體DNA和純化PCR產(chǎn)物的酶切抗體庫(kù)基因克隆中的雙酶切

酶切反應(yīng)按常規(guī)進(jìn)行，一般在37℃水浴至少3-4小時(shí)，也可過(guò)夜消化，最長(zhǎng)不要超過(guò)20小時(shí)。載體DNA用量與PCR產(chǎn)物用量比為10∶1。酶切反應(yīng)后需進(jìn)行電泳以純化所需的片段，方法如1.2.6所述。
1.2.9電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)菌XLI-Blu的制備在LB-四環(huán)素平皿中挑選一個(gè)XLI-Blu單菌落，接種入10ml四環(huán)素抗性的2×YT培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取上述菌液作1∶50稀釋?zhuān)臃N入500ml2×YT培養(yǎng)液，其中含有10ml 20％葡萄糖和5ml1mol/L氯化鎂，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.7-0.8。將上述細(xì)菌培養(yǎng)液體置于冰浴15分鐘，4000rpm 4℃離心20分鐘。棄上清，加入250ml預(yù)冷的10％甘油，4000rpm 4℃離心20分鐘。棄上清重復(fù)上一步。棄上清，用總量為20ml預(yù)冷的10％甘油，重懸細(xì)胞沉淀，冰浴靜置30分鐘，3500rpm 4℃離心20分鐘。棄上清，加入1ml10％甘油重懸細(xì)胞，分裝小管，立即使用或-70℃長(zhǎng)期保存。
1.2.10噬菌體抗體庫(kù)(κ/Z12)和噬菌體抗體庫(kù)(H/Z12)的構(gòu)建取酶切消化后純化回收的載體DNA 2μg，預(yù)酶切輕鏈或重鏈基因文庫(kù)各500ng，加入2μl高濃度連接酶，加相應(yīng)的連接緩沖液，16℃連接12-16小時(shí)。取事先制備好的電轉(zhuǎn)感受態(tài)菌XLI-Blu 400μl加入上述連接產(chǎn)物置冰浴中。另取空隙為0.2cm電轉(zhuǎn)杯一個(gè)，將上述每管混合物沿管壁輕輕加入，注意無(wú)氣泡，置電轉(zhuǎn)杯于電轉(zhuǎn)儀中，設(shè)置電轉(zhuǎn)時(shí)的電壓為2.5KV，電擊30秒-1分鐘。電轉(zhuǎn)后立于每個(gè)電轉(zhuǎn)杯中加入2ml SOC培養(yǎng)液，然后立即轉(zhuǎn)入細(xì)菌培養(yǎng)箱中，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。從中取10至50μl培養(yǎng)液，稀釋成不同濃度后，分別涂于含有Amp的2×YT平皿中，以檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率及計(jì)算庫(kù)容量，其余菌液轉(zhuǎn)入一三角瓶，加入10ml新鮮含有Amp的2×YT培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。加入100ml含有Amp和四環(huán)素雙抗的2×YT培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。加入1012pfu輔助噬菌體VSCM13，37℃振蕩培養(yǎng)2小時(shí)。加入50μg/ml卡那霉素，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將上述細(xì)菌培養(yǎng)液4000rpm 4℃離心20分鐘。將上清置另一個(gè)無(wú)菌三角瓶，加入4％PEG8000和3％NaCl溶解后，放置于冰浴中，沉淀30分鐘。然后9000rpm 4℃離心20分鐘。用2ml無(wú)菌PBS(pH＝7.4)重懸噬菌體沉淀，瞬時(shí)離心。上清即為噬菌體抗體庫(kù)，將此抗體庫(kù)分裝成小管，待用或存放-20℃。
1.2.11 噬菌體抗體庫(kù)的親和富集篩選將用于篩選特異性抗體的抗原(rhTNFα)用0.1mol/LpH9.6碳酸鈉一碳酸氫鈉溶液做一定量稀釋后包被96孔板，4℃過(guò)夜。次日洗去板內(nèi)未吸附抗原，用3％BSA-PBS或用10％小牛血清37℃封閉1小時(shí)。棄封閉液，在每孔中加入50-70μl噬菌體抗體庫(kù)，37℃孵育2小時(shí)。棄孔中未結(jié)合噬菌體，用TBS/Tween20(pH7.5的50mmol/Ltris-HCl，150mmol/L氯化鈉，0.5％Tween20)洗液洗每一孔，共洗10～20遍，使充分洗去非特異性吸附噬菌體。用蒸餾水洗兩遍，將每孔的液體吸干凈。加入3～5μl 2mol/L tris堿，使溶液的pH值在7左右，以中和洗脫下來(lái)的噬菌體溶液。立即加入2ml新鮮制備的OD600＝1左右的XLI-Blu菌，室溫孵育15-20分鐘。轉(zhuǎn)入一200ml三角瓶中，加入10ml含有Amp和四環(huán)素雙抗的2×YT培養(yǎng)液，立即取10μl噬菌體溶液，稀釋成不同濃度以滴定洗脫下來(lái)的噬菌體，其余部分37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。加入100ml含有Amp和四環(huán)素雙抗的2×YT培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。加入1012pfu輔助噬菌體VSCM13，37℃振蕩培養(yǎng)2小時(shí)。加入50μg/ml卡那霉素，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。收集培養(yǎng)后的噬菌體如1.2.10所述。重復(fù)以上富集篩選步驟，直至投入產(chǎn)出比不再上升，經(jīng)多輪富集篩選后，將洗脫下來(lái)的噬菌體感染新鮮制備的XLI-Blu菌，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，保存長(zhǎng)有單個(gè)菌落的平皿于4℃待用。
1.2.12輔助噬菌體毒種制備從平皿中挑取單個(gè)XLI-Blu菌落接種入10ml含有四環(huán)素的2×YT培養(yǎng)液中。37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將上述過(guò)夜培養(yǎng)菌1∶500稀釋入10ml含有四環(huán)素的2×YT培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。從噬菌體培養(yǎng)皿中挑取單個(gè)噬菌體病毒空斑，接種入上述10ml菌液中，37℃振蕩培養(yǎng)2小時(shí)。加入含有10μg/ml四環(huán)素和50μg/ml卡那霉素的2×YT培養(yǎng)液，總量至500ml，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。3500-4000rpm 4℃離心15分鐘。取上清，70℃裂解20分鐘，再次離心。取上清，無(wú)菌分裝小管中，存放4℃至少可使用半年，半年后需依此方法重新制備。
1.2.13噬菌體毒種的滴定準(zhǔn)備不含任何抗生素的LB培養(yǎng)平皿5-6個(gè)。用普通LB培養(yǎng)基制0.7％瓊脂糖，即為表層瓊脂糖，冷至42℃并在42℃保存。將上述噬菌體溶液作10-6、10-7、10-8、10-9、10-10稀釋。取稀釋的XLI-Blu菌，OD600＝1左右，分裝小試管，100μl/小試管，標(biāo)明10-6至10-10稀釋度。加入前步驟中依次稀釋的噬菌體到每個(gè)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)稀釋度的試管中，37℃緩慢振蕩反應(yīng)20分鐘。加入表層瓊脂糖3ml至每個(gè)試管中，立即轉(zhuǎn)入事先準(zhǔn)備好的平皿置37℃培養(yǎng)過(guò)夜。計(jì)算平皿中的空斑數(shù)，與稀釋倍數(shù)相乘，即為噬菌體的計(jì)數(shù)單位-pfu(particle formingunit)。
1.2.14 ELISA比較抗體相對(duì)親和力將rh-TNFα溶解于包被液(碳酸鹽緩沖液pH9.6，4μg/ml稀釋)，100μl/孔包被ELISA親和96孔板，4℃放置8小時(shí)后，10％小牛血清37℃封閉1小時(shí)。PBST洗板三次，按50μl/孔加入不同濃度的噬菌體抗體，室溫90分鐘，PBST洗板三次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)抗體(HRP-antiM13，50μl/孔)，室溫40分鐘后，PBST洗板三次，以O(shè)PD顯色系統(tǒng)顯色，測(cè)OD492nm吸光度值。根據(jù)ELISA結(jié)果最終篩選得到與rh-TNFα結(jié)合活性大于Z12的噬菌體抗體克隆。
1.3 結(jié)果1.3.1 rh-TNFα免疫小鼠血清效價(jià)測(cè)定、總RNA提取從ELISA測(cè)定免疫小鼠血清效價(jià)的結(jié)果(圖1.3.1.1)可以看到，經(jīng)r-TNFα皮下、腹腔多點(diǎn)多次注射后的五只小鼠得到成功免疫，免疫血清效價(jià)平均達(dá)到1∶200000左右。
依照小鼠脾淋巴細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)方法及TRIzol Reagent提取細(xì)胞總RNA試驗(yàn)手冊(cè)(Invitrogen公司提供)，提取成功免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞總RNA(圖1.3.1.2)。
1.3.2噬菌體抗體基因文庫(kù)的獲得從小鼠脾淋巴細(xì)胞中提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，添加特異引物，用高保真DNA聚合酶擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，可以得到約660bp的清晰條帶，分別為抗體重鏈Fd段基因文庫(kù)和輕鏈全長(zhǎng)基因文庫(kù)(圖1.3.2.1)。
1.3.3 噬菌體抗體表達(dá)載體P3MH的鑒定、P3MH/Z12L和P3MH/Z12H重組質(zhì)粒的構(gòu)建借助噬菌體抗體表達(dá)載體P3MH的構(gòu)建示意圖(圖1.3.3.1)，通過(guò)酶切電泳結(jié)果(圖1.3.3.2)顯示，載體p3MH被SacI、XbaI、XhoI及SpeI四種酶單酶切后，與空載體相比均呈線性化，表明載體p3MH上的SacI、XbaI、XhoI及SpeI四個(gè)酶切位點(diǎn)均完好無(wú)損，可以用于Fd和輕鏈全長(zhǎng)基因的克隆。
用SacI、XbaI雙酶切pGEM-T Easy/Z12κ，獲得抗體的輕鏈全長(zhǎng)基因。將其與經(jīng)過(guò)SacI、XbaI雙酶切的p3MH載體連接。經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑克隆，提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定(圖1.3.3.3)，結(jié)果表明，樣品2、3、4(圖1.3.3.3)中的克隆經(jīng)過(guò)SacI和XbaI的雙酶切后，均得到660bp的輕鏈基因，而并未得到1.2Kb的片段，說(shuō)明輕鏈基因已經(jīng)克隆到p3MH載體上；將其進(jìn)行測(cè)序(圖1.3.3.4)，結(jié)果正確，表明成功構(gòu)建P3MH/Z12L重組質(zhì)粒。
采用同樣的方法，將經(jīng)過(guò)XhoI、SpeI雙酶切的p3MH載體與上述從pGEM-T Easy/Z12Fd經(jīng)XhoI、SpeI酶切得到的抗體重鏈Fd基因進(jìn)行連接，構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒P3MH/Z12H。經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑克隆，提質(zhì)粒，進(jìn)行鑒定(圖1.3.3.5)，并測(cè)序(圖1.3.3.6)成功，表明成功構(gòu)建P3MH/Z12H重組質(zhì)粒。
根據(jù)鏈替換(chain shuffling)原理實(shí)驗(yàn)的方法，將通過(guò)PT-PCR擴(kuò)增得到的抗體重鏈基因文庫(kù)和重組質(zhì)粒p3MH/Z12L構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)(H/Z12κ)；同時(shí)，將抗體輕鏈基因文庫(kù)和重組質(zhì)粒p3MH/Z12H構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)(κ/Z12H)。通過(guò)噬菌體毒種滴定確定抗體庫(kù)的庫(kù)容，根據(jù)噬菌體毒種滴定確定噬菌體抗體庫(kù)(κ/Z12H)和(H/Z12κ)均達(dá)到了1×107。
1.3.4噬菌體抗體庫(kù)(κ/Z12H)和噬菌體抗體庫(kù)(H/Z12κ)親和富集篩選噬菌體抗體庫(kù)的親和富集篩選一般以投入產(chǎn)出比(O/I ratio)作為親和富集指標(biāo)。良好的富集篩選，經(jīng)過(guò)每一輪篩選過(guò)后，投入產(chǎn)出比會(huì)以指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。當(dāng)其投入產(chǎn)出比不再增長(zhǎng)，或者甚至出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)時(shí)，親和富集篩選過(guò)程即可停止，否則，親和富集篩選過(guò)程可以一直進(jìn)行，直到出現(xiàn)上述情況為止(表1.3.4.1)。
表1.3.4.1 噬菌體抗體庫(kù)親和富集篩選

1.3.5通過(guò)ELISA比較噬菌體篩選抗體的相對(duì)親和力將親和富集篩選后得到的單個(gè)克隆噬菌體，通過(guò)侵染宿主菌得到噬菌體抗體，與噬菌體抗體Z12比較對(duì)r-TNFα的結(jié)合力。采用ELISA比較各噬菌體抗體與r-TNFα相對(duì)親和力得到的陽(yáng)性克隆(部分陽(yáng)性結(jié)果見(jiàn)圖1.3.5.1)，通過(guò)這種方法共篩選了108個(gè)噬菌體抗體克隆，其中得到18個(gè)抗體相對(duì)親和力高于Z12的噬菌體抗體(見(jiàn)表1.3.5.1)。
表1.3.5.1噬菌體抗體鑒定結(jié)果

2、計(jì)算機(jī)輔助篩選潛在高親和力嵌合抗體2.1 方法
2.1.1 噬菌體抗體陽(yáng)性克隆的序列測(cè)定將P140Fab抗體基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別克隆至pGEM-T Easy載體上，經(jīng)酶切鑒定無(wú)誤后(圖2.2.1.1)，交與測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。
2.1.2 嵌合抗體可變區(qū)三維構(gòu)象的模擬利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank，PDB)，通過(guò)序列比對(duì)(選擇Fasta3、Blastp程序)、Kabat分析，確定其母本模型。借助同源模建(Homology)方法對(duì)測(cè)定的抗體可變區(qū)進(jìn)行空間構(gòu)象的模擬。在CVFF、Amber力場(chǎng)下，選擇分子力學(xué)、動(dòng)力學(xué)動(dòng)態(tài)模擬對(duì)其構(gòu)象進(jìn)行能量?jī)?yōu)化(依次經(jīng)過(guò)最陡下降(收斂判據(jù)0.05KJ/mol，收斂步驟5000步)、共軛梯度(收斂判據(jù)0.01KJ/mol，收斂步驟10000步))。
2.1.3 嵌合抗體可變區(qū)與TNFα相互作用復(fù)合物空間構(gòu)象的模擬借助TNFα晶體結(jié)構(gòu)模型(PDB號(hào)1tnf)，利用分子對(duì)接程序?qū)η逗峡贵w與TNFα相互作用的復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行探討。遵循“結(jié)構(gòu)互補(bǔ)、靜電匹配”原則，在CVFF、Amber力場(chǎng)下，經(jīng)分子力學(xué)、動(dòng)力學(xué)動(dòng)態(tài)模擬對(duì)嵌合抗體與TNFα相互作用模式的最佳匹配程度進(jìn)行理論預(yù)測(cè)。
2.1.4 高中和活性嵌合抗體的確定結(jié)合反應(yīng)自由能理論、分子間氫鍵形成理論，借助母本抗體Z12與TNFα相互識(shí)別模式，確定具有高中和活性、高親和力的抗體。
2.2結(jié)果2.2.1 利用噬菌體抗體庫(kù)篩選的陽(yáng)性抗體的克隆、測(cè)序?qū)140Fab抗體基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別克隆至pGEM-T Easy載體上，經(jīng)酶切鑒定無(wú)誤后(圖2.2.1.1)，交與測(cè)序公司。共得到全新抗體輕鏈全長(zhǎng)基因序列信息4個(gè)，重鏈Fd段基因序列信息14個(gè)。部分測(cè)序結(jié)果如下由于抗體基因序列信息較多，測(cè)序結(jié)果僅以抗體H22重鏈Fd段基因和抗體Ke輕鏈全長(zhǎng)基因序列為例(圖2.2.1.2和2.2.1.3)。
2.2.2 抗體可變區(qū)序列分析利用www.expasy.ch對(duì)測(cè)序獲得的抗體可變區(qū)堿基序列進(jìn)行翻譯，獲得其氨基酸序列(圖2.2.2.1)。通過(guò)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)抗體可變區(qū)序列進(jìn)行FR、CDR分類(lèi)分析(圖2.2.2.2)。
2.2.3 抗體可變區(qū)空間構(gòu)象的獲得在圖形工作站Octane2(R12000)上，利用InsightII2000程序包構(gòu)建篩選抗體可變區(qū)空間構(gòu)象。圖2.2.3.1、圖2.2.3.2、圖2.2.3.3分別給出了抗體可變區(qū)A2H、A4H、CH22空間構(gòu)象示意圖。
2.2.4 抗原一抗體作用復(fù)合物的構(gòu)建、高親和力抗體的確定圖2.2.4.1、圖2.2.4.2、圖2.2.4.3分別給出了抗體可變區(qū)A2H、A4H、H22與TNFα相互作用的復(fù)合物模型。表2.2.4.1列出了抗體可變區(qū)與TNFα相互作用模式及識(shí)別區(qū)域。通過(guò)相互作用的自由能、分子間氫鍵形成數(shù)目及識(shí)別區(qū)域確定CH22具有高于母本抗體Z12親和能力的理想抗體。
表2.2.4.1 抗體—抗原作用模式分析抗體 分子間氫鍵相互作用能(KJ) 主要識(shí)別區(qū)域Z12 31-413.88135-150H22 36-425.37136-149A2H 19-289.5486-97A4H 24-345.21137-145利用阿侖紐斯公式計(jì)算，可以初步得出，CH22抗體的親和能力較母本抗體Z12親和能力高～120倍。
通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助分析，確定嵌合抗體CH22識(shí)別的hTNF-α功能表位141-146位；同時(shí)確定嵌合抗體CH22保持其生物學(xué)效應(yīng)的56個(gè)重要?dú)埢?抗體重鏈可變區(qū)VH26-31，48-52，90-95，66-68；抗體輕鏈可變區(qū)VL26-33，52-65，72-76，98-106)。
3、高親和力抗體CH22的生物學(xué)功能測(cè)定3.1 材料菌株和質(zhì)粒大腸桿菌JM109菌、XLI-Blu菌、BL21菌(Invitrogen)，單鏈抗體表達(dá)載體PET32-c(Novagen)，CHO細(xì)胞(ATCC，美國(guó))，PWS3載體(白銀，俞莉章，呂英謙，艾軍魁等，中華醫(yī)學(xué)雜志，2003，83(4)333-338)工具酶、試劑限制性內(nèi)切酶NcoI、BssHII、BstEII、XhoI、XbaI、BamHI、HindIII及EcoRV購(gòu)自New England Biolabs公司；T4 DNA連接酶、WizardDNA純化試劑盒、pGEM-T Easy載體試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；DNA片段回收試劑盒、Taq DNA聚合酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000購(gòu)自TaKaRa公司；焦炭酸二乙酯(DEPC)為Sigma產(chǎn)品；HisTrap(鎳離子螯合柱)購(gòu)自Novagen公司；Lipfectamine2000為GIBCO公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、羊抗鼠Fab多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgGFc(美國(guó)Sigma)，其他常用化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。限制性內(nèi)切酶購(gòu)自New England Biolabs公司；T4 DNA連接酶、pGEM-T Easy載體試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司；PyrobestDNA聚合酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000購(gòu)自TaKaRa公司；TRIzolReagent購(gòu)自Invitrogen公司；二磷酸腺苷(ADP)為Biopool產(chǎn)品；DNA片段回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGABIO-TEK公司；質(zhì)粒回收試劑盒購(gòu)自天為時(shí)代公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的anti-M13抗體購(gòu)自amershampharmacia公司；其他常用化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。
3.2方法3.2.1 真核表達(dá)載體PWS3H22的構(gòu)建及表達(dá)由于通過(guò)抗體庫(kù)獲得的抗體基因不具有前導(dǎo)肽序列，所以首先根據(jù)BLAST分析，設(shè)計(jì)出最優(yōu)化的抗體前導(dǎo)肽序列。結(jié)合分析表達(dá)載體PWS3的順式作用元件后，重新設(shè)計(jì)引物，將分別克隆在pGEM-TEasy載體H22重鏈和輕鏈可變區(qū)基因通過(guò)PCR擴(kuò)增出來(lái)，克隆到PWS3表達(dá)載體中，構(gòu)建PWS3H22真核表達(dá)載體，進(jìn)行真核轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染基本參數(shù)包括(1)CHO細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，在轉(zhuǎn)染前一天接種到直徑100mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜，(2)當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％貼壁時(shí)，將完全培養(yǎng)液移去，換無(wú)血清培養(yǎng)基孵育2-8小時(shí)，(3)將經(jīng)酶切鑒定無(wú)誤的表達(dá)載體4μg，10μl脂質(zhì)體分別溶于250μl無(wú)抗生素、無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中，充分混勻后，室溫放置5分鐘，再將兩種溶液充分混勻，室溫放置30分鐘。同時(shí)用無(wú)抗生素、無(wú)血清DMEM洗滌待轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞兩次，向DNA-脂質(zhì)體混合物中加入2.5ml無(wú)抗生素、無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，混合后加入培養(yǎng)細(xì)胞中。將培養(yǎng)瓶放入37℃孵箱孵育6小時(shí)后吸去培養(yǎng)液，(4)將轉(zhuǎn)染液棄去，(5)加入5ml含抗生素和10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)約24小時(shí)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，換成無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基。(6)60小時(shí)收上清，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入穩(wěn)定表達(dá)，加壓篩選。
3.2.2嵌合抗體CH22純化含嵌合抗體CH22培養(yǎng)液用0.1mol/LpH8.0PB透析過(guò)夜后，上樣于Protein A Sephorase CL-4B層析柱，用相同緩沖液洗脫雜蛋白后，用pH6.0檸檬酸緩沖液洗脫CH22，收集洗脫峰并濃縮。
3.2.3 CH22與TNF-α特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)分別將hTNF-α以一定濃度包被ELISA親和96孔板及SDS-PAGE分離，ELISA及Western blot試驗(yàn)分析鑒定ScFv-H22與TNF-α特異性結(jié)合。ELISA、Western blot試驗(yàn)基本操作見(jiàn)(《分子克隆》)。
3.2.4 CH22抗原識(shí)別表位確定實(shí)驗(yàn)將含有hTNF-α、hTNF-αD141-146的超聲上清，用包被液稀釋成10μg/ml進(jìn)行包被。100μl/孔包被ELISA親和96孔板，4℃放置8小時(shí)后，2％BSA封閉過(guò)夜。PBST洗板三次，加入CH22按100μl/孔進(jìn)行ELISA檢測(cè)。室溫90分鐘，PBST洗板三次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)抗體(HRP-GAH，購(gòu)自PIERCE公司)50μl/孔，室溫40分鐘后，PBST洗板三次，以O(shè)PD顯色系統(tǒng)顯色，測(cè)A492nm吸光度值。
3.2.5 L929細(xì)胞毒中和實(shí)驗(yàn)L929是小鼠成纖維細(xì)胞系，它對(duì)于TNF-α高度敏感，生長(zhǎng)環(huán)境中存在ng水平的TNF-α即可以導(dǎo)致L929細(xì)胞大量死亡。本試驗(yàn)首先取生長(zhǎng)旺盛的L929細(xì)胞，按照TNF-α生物學(xué)活性測(cè)定方法確定其活性單位(IU)，然后以10IUTNF-α與不同濃度的抗TNF-α抗體混合并與L929細(xì)胞(3×104、孔)一同加入96孔培養(yǎng)板，同時(shí)加放線菌素D(0.1μg/孔)，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)20小時(shí)，用結(jié)晶紫染色后，加入33％乙酸，自動(dòng)酶聯(lián)儀測(cè)定A570nm。
3.2.6嵌合抗體CH22親和力測(cè)定按照經(jīng)典測(cè)定抗體親和力方法—Scatchard分析的方法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，首先將抗原(hTNF-α)濃度固定，按照一定濃度稀釋抗體(CH22)，得到抗體CH22與hTNF-α結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在此基礎(chǔ)上，在抗體與抗原結(jié)合的飽和濃度范圍內(nèi)，取若干濃度作為抗體親和力測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)，測(cè)定結(jié)合抗體及未結(jié)合抗體的濃度，根據(jù)公式B/F＝Ka(S-B)；其中B代表結(jié)合抗體濃度，F(xiàn)代表游離抗體濃度，S代表抗體總濃度3.2.7嵌合抗體CH22、Remicade識(shí)別位點(diǎn)、親和能力、中和活性比較為了進(jìn)一步確定嵌合抗體CH22的生物學(xué)效應(yīng)，選擇已經(jīng)通過(guò)FDA批準(zhǔn)的臨床治療抗體Remicade作為對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。利用hTNF缺失突變體(hTNF23-89[表示缺失23-89位殘基]、hTNF53-92、hTNF141-146)對(duì)二者的識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行分析，利用ELISA及細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)對(duì)二者的親和能力、中和活性進(jìn)行比較。
3.3 結(jié)果3.3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒PWS3H22的構(gòu)建及鑒定取測(cè)序分析正確的克隆，分別用XbaI、BamHI消化pGEM-TEasy/H22VκS，用XhoI、HindIII消化pGEM-T Easy/H22VHS，入膠回收純化后，將H22VκS和H22VHS片段分別克隆在經(jīng)酶切(BamHI/XbaI、XhoI/HindIII)的PWS3表達(dá)載體上(圖3.3.1.1和圖3.3.1.2)。
3.3.2 CH22與hTNF-α特異性結(jié)合的檢測(cè)分別通過(guò)ELISA和Western blot試驗(yàn)證明經(jīng)過(guò)真核表達(dá)和純化后得到的CH22能夠與hTNF-α特異性結(jié)合，證明通過(guò)以上方法篩選得到的抗體保留了母本抗體Z12的識(shí)別特異性。(圖3.3.2.1)3.3.3 CH22抗體分子鑒定含嵌合抗體CH22真核細(xì)胞表達(dá)上清，經(jīng)過(guò)Protein ASephorase CL-4B層析柱純化后，SDS-PAGE電泳分析，得到分子量為155kDa蛋白條帶(圖3.3.3.1)，與人IgG和Remicade嵌合抗體分子量相同。
3.3.4 CH22抗原識(shí)別表位確定試驗(yàn)理論預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，抗體CH22的抗原識(shí)別表位與母本抗原Z12保持一致，我們將hTNFαD29-88缺失突變體、hTNFαD53-91缺失突變體、hTNFαD141-146缺失突變體、hTNF分別進(jìn)行原核表達(dá)，并將表達(dá)上清包被在親和96孔板中，通過(guò)ELISA檢測(cè)幾種不同的抗hTNFα抗體與其二者識(shí)別差異，從而確定抗體的抗原識(shí)別位點(diǎn)，并與Remicade抗體和Enbrel識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行比；結(jié)果顯示，Z12和CH22抗原識(shí)別位點(diǎn)保持一致，而與Remicade(經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市的抗hTNFα嵌合抗體)和Enbrel不同。(圖3.3.4.1)3.3.5 L929細(xì)胞毒中和實(shí)驗(yàn)Z12具有良好的中和hTNF-α細(xì)胞毒的能力，L929細(xì)胞毒中和試驗(yàn)結(jié)果表明，(表3.3.5.1)抗體CH22保持了Z12的中和功能，并且在此基礎(chǔ)上有所提高，提示其具有良好的臨床應(yīng)用前景。
表3.3.5.1抗TNF-α抗體中和細(xì)胞毒比較

*滴度定義為抑制10U/ml TNF-α的細(xì)胞毒效應(yīng)的最高樣品稀釋度的倒數(shù)。
3.3.6 嵌合抗體CH22親和力測(cè)定根據(jù)經(jīng)典測(cè)定抗體親和力方法-Scatchard分析的方法測(cè)定的結(jié)果，將測(cè)得的數(shù)據(jù)擬合成一條直線，求得這條直線的負(fù)斜率即為抗體CH22親和常數(shù)(Ka)結(jié)果見(jiàn)圖3.3.5.1。
序列表<110>北京天廣實(shí)生物技術(shù)有限公司<120>TNFα高親和力嵌合抗體及其用途<130>1040003<160>27<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>223<212>蛋白質(zhì)<213>小鼠<400>1Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Val Leu His Trp Leu Gln Pro Lys Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Val Tyr Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Gln Tyr Asn Glu Arg Phe50 55 60Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Asp Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Trp Leu Gln Arg Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser115 120 125Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val130 135 140Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu145 150 155 160Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala165 170 175Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr180 185 190Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro195 200 205Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Ser Gly Pro210 215 220<210>2<211>212<212>蛋白質(zhì)<213>小鼠<400>2Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Asn Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr35 40 45Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Ser Pro Thr85 90 95Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr100 105 110Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala115 120 125Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val130 135 140Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser145 150 155 160Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr165 170 175Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys180 185 190Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn195 200 205
Arg Asn Glu Cys210<210>3<211>10<212>蛋白質(zhì)<213>小鼠<400>3Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Leu His1 5 10<210>4<211>17<212>蛋白質(zhì)<213>小鼠<400>4Tyr Val Tyr Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Gln Tyr Asn Glu Arg Phe Arg1 5 10 15Gly<210>5<211>12<212>蛋白質(zhì)<213>小鼠<400>5Gly Trp Leu Gln Arg Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val1 5 10<210>6
<211>10<212>蛋白質(zhì)<213>小鼠<400>6Asn Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr1 5 10<210>7<211>7<212>蛋白質(zhì)<213>小鼠<400>7Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser1 5<210>8<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>小鼠<400>8Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Ser Pro Thr1 5<210>9<211>32<212>DNA<213>合成的<400>9ccagttcgga gctcgttgtg actcaggaat ct 32<210>10<211>32<212>DNA
<213>合成的<400>10ccagttccga gctcgtgttg acgcagccgc cc32<210>11<211>32<212>DNA<213>合成的<400>11ccagttccga gctcgtgctc acccagtctc ca32<210>12<211>32<212>DNA<213>合成的<400>12ccagttccga gctccagatg acccagtatc ca32<210>13<211>32<212>DNA<213>合成的<400>13ccagatgtga gctcgtgatg acccagactc ca32<210>14<211>32<212>DNA<213>合成的<400>14ccagatgtga gctcgtcatg acccagtctc ca32<210>15<211>32
<212>DNA<213>合成的<400>15ccagttccga gctcgtgatg acacagtctc ca32<210>16<211>31<212>DNA<213>合成的<400>16ccgactagtt catttcagct ccagccaggt g 31<210>17<211>30<212>DNA<213>合成的<400>17ctcgacacta gttttgcgct caactgtctt 30<210>18<211>30<212>DNA<213>合成的<400>18tgtgtgacta gtgtcaccaa gtggggtttt 30<210>19<211>30<212>DNA<213>合成的<400>19gcatgaacta gttgggggac catatttgga 30<210>20
<211>21<212>DNA<213>合成的<400>20aggtctcgag ctcgagtctg g21<210>21<211>21<212>DNA<213>合成的<400>21aggtctcgag ctcgagtcag g21<210>22<211>21<212>DNA<213>合成的<400>22aggtctcgag tccgagtctg g21<210>23<211>21<212>DNA<213>合成的<400>23aggtctcgag ttcgagtcag g21<210>24<211>21<212>DNA<213>合成的<400>24aggtctcgag gctgagtctg g21
<210>25<211>21<212>DNA<213>合成的<400>25aggtctcgag cgtaagtctg g21<210>26<211>21<212>DNA<213>合成的<400>26aggtctcgag ggaaagtcag g21<210>27<211>25<212>DNA<213>合成的<400>27gacttggtct agacgagacg gtgac2權(quán)利要求
1.抗人腫瘤壞死因子的抗體或其抗原結(jié)合部分，其識(shí)別人腫瘤壞死因子的135-147位氨基酸，在標(biāo)準(zhǔn)體外L929檢測(cè)中以高于1×10-7M的IC50中和人TNF細(xì)胞毒性。
2.權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分，它是嵌合抗體或其抗原結(jié)合部分。
3.權(quán)利要求2的抗體或其抗原結(jié)合部分，其含有重鏈CDR1、CDR3域，該域包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3的抗體或其抗原結(jié)合部分，其含有輕鏈CDR1、CDR3域，該域包含SEQ ID NO1的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求4的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中SEQ ID NO1或SEQID NO2中有一個(gè)或者多個(gè)氨基酸缺失、增加或者被其他氨基酸置換，但抗體或其抗原結(jié)合部分的功能保持不變。
6.權(quán)利要求5的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中SEQ ID NO1中位置1、3、4、5、7、8、12、75或80的一個(gè)或者多個(gè)氨基酸被其他氨基酸置換，但抗體或其抗原結(jié)合部分的功能保持不變。
7.權(quán)利要求5或6的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中SEQ ID NO2中位置2、3、4、6、7、9、10、12、45或70的一個(gè)或者多個(gè)氨基酸被其他氨基酸置換，但抗體或其抗原結(jié)合部分的功能保持不變。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分用于中和人腫瘤壞死因子的用途。
9.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分在制備治療多器官功能衰竭、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎、多發(fā)性硬化癥、炎癥性腸病、移植物抗宿主病和骨髓造血紊亂綜合癥的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的人腫瘤壞死因子(hTNF－α)高親和力嵌合抗體和其用途。本發(fā)明利用抗體庫(kù)篩選結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助分析獲得一株具有高親和力的嵌合抗體，識(shí)別hTNF的141－146位，較上市的抗體Remicade具有更高的親和力、一致的中和活性，識(shí)別位點(diǎn)不同。本發(fā)明的抗體可用于治療與TNF－α相關(guān)的疾病。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1704432SQ20041004603
公開(kāi)日2005年12月7日 申請(qǐng)日期2004年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月2日
發(fā)明者沈倍奮, 黎燕, 馮建男, 林周, 張巍 申請(qǐng)人:北京天廣實(shí)生物技術(shù)有限公司