一種獸用疫苗的免疫佐劑、制備方法及其應用
【技術領域】
[0002] 本發(fā)明涉及一種疫苗佐劑，特別涉及一種獸用疫苗的免疫佐劑、制備方法及其應 用。
[0003]
【背景技術】
[0004] 佐劑作為一種非特異性免疫增強劑，可增強機體的免疫應答能力或改變免疫應答 類型。一種免疫效果確實的疫苗往往需要一種與之相匹配的佐劑才能更好地發(fā)揮疫苗抗感 染的特性。近年來隨著現代生物技術的進步，各種新型疫苗（例如：亞單位疫苗、基因工程 疫苗）的研究逐漸成為熱點問題，但免疫佐劑的研究明顯滯后，已遠遠不能滿足新型疫苗 發(fā)展的需要。傳統免疫佐劑如白油佐劑、氫氧化鋁膠佐劑等，雖然能一定程度上提高疫苗的 使用效果，但這些傳統佐劑均仍存在一定的局限性，在使用過程中不僅易出現副作用，且容 易在注射部位形成腫塊，影響畜產品品質，而且這些傳統佐劑極少產生免疫刺激性，不能提 高免疫系統的技能；此外，這些佐劑不易被機體吸收，使得有效刺激的抗原量釋放緩慢，難 以促使疫苗快速達到預期效果。因此，研發(fā)新型、高效、無毒的疫苗佐劑已成為疫苗研究的 當務之急。
[0005] 隨著現代醫(yī)學、細胞生物學及分子生物學的發(fā)展，人們逐漸認識到許多疾病的發(fā) 生、發(fā)展與機體免疫系統功能缺陷和失調有密切的聯系，治療重點已由直接殺傷外源性病 原體轉向調整機體自身功能，以提高機體免疫力、抗病力，因此免疫增強劑的應用引起人們 的關注。免疫增強劑能增強機體的非特異性免疫功能，提高機體抗病力：在單獨或與抗原 聯合使用時能增強機體特異性、非特異性免疫應答，并可降低動物對有害微生物的易感性 及防止動物發(fā)生免疫抑制，對流行性疾病防控有積極的作用。近幾年家禽養(yǎng)殖業(yè)中，由于細 菌、病毒感染引起家禽免疫功能的下降已經對畜牧業(yè)造成極大的影響，特別是免疫抑制病 的發(fā)生與傳播為家禽疫病的流行創(chuàng)造了條件，故而新型免疫調節(jié)劑的開發(fā)勢在必行。理想 的免疫增強劑應能促進抗原引起體液和細胞免疫，增強弱免疫性抗原的抗原性，無毒副作 用；能以不同途徑免疫，也能用于不同抗原：能在免疫抑制機體中發(fā)揮作用；用于食用動物 不應有藥物殘留；能有效提高免疫反應質量；使用穩(wěn)定、便宜且容易生產。天然的中藥免疫 增強劑，在解決藥殘和控制疾病方面取得了非常好的效果，新型植物免疫增強劑的研究與 開發(fā)正在成為國內畜牧行業(yè)研發(fā)的新熱點。
[0006] 多糖（Polysaccharide)是由單糖之間脫水形成糖苷鍵，并以糖苷鍵線性或分枝連 接而成的鏈狀聚合物，為一類天然大分子化合物，一般由幾百個甚至幾萬個多糖分子組成， 分子量較大，無甜味，無還原性。多糖廣泛存在于動物細胞膜、植物和微生物細胞壁中，是自 然界含量最豐富的生物多聚物，也是所有生命有機體的重要組成部分，并與維持生命所需 的多種生理功能有關。近二十年來，隨著分子生物學的發(fā)展，人們逐漸認識到糖及其復合物 分子具有極其重要的生物功能，多糖與免疫功能的調節(jié)、細胞與細胞的識別、細胞間物質的 運輸、癌癥的診斷與治療等，都有著密切的關系。然而多糖類物質作為免疫佐劑的研究僅限 于對微生物來源的脂多糖和葡萄糖。事實上，多糖是一類十分重要的免疫相關活性物質，一 些多糖分別或同時具有調節(jié)淋巴細胞、吞噬細胞、白細胞介素、抗體水平以增強免疫功能； 一些多糖可經化學修飾形成多孔微顆粒，具有濃縮和儲存抗原的作用。多糖微?？赡褪芪?腸道的降解，可發(fā)展成口服免疫載體。因此，以多糖類物質為佐劑，既可發(fā)揮其增強免疫作 用，又具有運載抗原、促進抗原提程的佐劑活性，這是研究佐劑的新趨勢。
[0007] 蜂膠能增強體液免疫和細胞免疫，對胸腺、脾臟等免疫器官進行調節(jié)，使機體免疫 功能處于最佳狀態(tài)，是一種天然高效免疫增強劑。有人發(fā)現服用蜂膠的家兔，其血中丙種球 蛋白的活性及吞噬細胞的吞噬能力都有所增強，且抗體數目和沒有服用蜂膠的家兔相比明 顯增加。對感染性疾病的療效顯著，可能有兩方面原因：一是由于它本身能抑制致病微生物 的生長和繁殖；二是由于其所具有的免疫增強作用，提高了機體的抗病能力。目前，隨著新 型疫苗的開發(fā)，迫切需要新型的疫苗佐劑與之配合使用，以增強免疫效果。
[0008]

【發(fā)明內容】

[0009] 為了滿足開發(fā)新型佐劑的需求，本發(fā)明提供了一種獸用疫苗的免疫佐劑、制備方 法及其應用。
[0010] 為了實現發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種獸用疫苗的免疫佐劑，所述佐劑由下列原料 以質量份組成：泰山松花粉多糖5-30份、蜂膠5-10份、蘆薈多糖5-10份、覆盆子多糖8-14 份、老君須多糖3-6份、打碗花多糖4-9份、親水性表面活性劑0. 1-10份、高分子膠束物質 0. 1-10份和水40-90份。
[0011] 所述親水性表面活性劑為司班80和普魯尼克121的混合物；所述司班80和普魯 尼克121的質量份數比為：司班80為1-2. 5份、普魯尼克121為1-3份。
[0012] 所述高分子膠束物質為殼聚糖和卡波姆971P的混合物；所述殼聚糖和卡波姆 971P的質量份數比為：殼聚糖為1-3份、卡波姆971P為2-3份。
[0013] 所述泰山松花粉多糖的提取方法為：將破壁后的泰山松花粉用索氏提取器在 48°C -50°C抽提脂肪2h后得產物1，產物1加入占產物1質量0. 3%的胃蛋白酶在50°C反應 2h除蛋白后，用80-KKTC熱水浸提7-10h，隨后降溫至4°C沉淀8-12h，然后取上清液一以 10000 r/min過濾離心10 min，在200 r/min和60°C條件下減壓濃縮，得濃縮液；取Sevage 試劑和濃縮液按質量比為1:3混合均勻后放置3h后，取上清液二；再將上清液二與Sevage 試劑按質量比3:1混合均勻，靜置2h后，取上清液三，然后將上清液三用無水乙醇沉淀 7-10h，將沉淀物在-15°C~-20°C冷凍干燥得到松花粉多糖。
[0014] 所述覆盆子多糖的制備方法包括以下步驟：取覆盆子洗凈干燥后將果肉粉碎制得 覆盆子干粉，加入質量為覆盆子干粉質量7~9倍的石油醚和醇濃度為95%的乙醇混合物 浸泡并超聲處理30~40 min，過濾后，得殘渣一；用相對于殘渣一質量10~15倍的醇濃 度90%~95%的乙醇浸泡，加熱回流1~2h后提取，過濾，得第一過濾液和殘渣二；殘渣二 中加入相對于殘渣二質量10~15倍的去離子水后，加入復合酶A于30-39°C、pH5-6. 5下 酶解5h-6h，酶解結束后滅酶得到提取液；將第一過濾液和提取液混合后在真空度0. 06~ 0. 09Mpa下減壓濃縮至50~60°C時相對密度為1. 04~1. 10的膏體，向膏體中加入相對于 膏體質量6-8倍的醇濃度為95%的無水乙醇，沉淀8h，高速離心后真空干燥得覆盆子多糖； 所述復合酶A為酸性木聚糖酶和0 -葡聚糖酶組成的復合酶，酸性木聚糖酶質量用量為覆 盆子干粉質量的2. 0%、0 -葡聚糖酶質量用量為覆盆子干粉質量的4. 5% ;所述石油醚和 醇濃度95 %的乙醇體積比為1:5 ; 和/或所述蘆薈多糖的制備方法包括以下步驟：取2-3年蘆薈鮮葉洗凈，在去離子水中 浸泡20-40min，以除去表皮滲出的黃色液汁，然后切去表皮，將內層凝膠剪碎，用勻漿機勻 漿后取上清液在4°C冷藏8-10h得到蘆薈汁；將蘆薈汁與去離子水按質量比1:12-15比例 混合，加入復合酶B在32-36°C、pH5. 2-6. 5下酶解5-8h，酶解結束后滅酶得提取液，將提取 液在真空度0. 06~0. 09Mpa下減壓濃縮至50~60°C時相對密度為1. 04~1. 10的膏體， 向膏體中加入相對于膏體質量5-7倍的醇濃度為95%的無水乙醇，沉淀8h，高速離心得蘆薈 多糖沉淀；再用Sevage試劑和蘆薈多糖沉淀質量比為1:3混合均勻靜置l_2h，然后取上清 液真空干燥得蘆薈多糖；所述復合酶B為酸性木聚糖酶和葡聚糖酶組成的復合酶，酸性 木聚糖酶質量用量為蘆薈汁質量的3. 0%、0 -葡聚糖酶質量用量為蘆薈汁質量的2. 5%。
[0015] 所述老君須多糖的制備方法包括以下步驟：取老君須洗凈干燥后，粉碎制得老君 須干粉，老君須干粉與去離子水按1:15-20混合，80-90°C浸提8h，減壓濃縮后離心3次， 每次離心的轉速為12000r/m，每次離心的時間為12min，每次離心的溫度為15°C，以除盡雜 質；隨后在真空度〇. 06~0. 09Mpa下減壓濃縮至50~60°C時相對密度為1. 04~1. 10的 膏體，向膏體中加入相對于膏體質量5-7倍的醇濃度為95%的乙醇，沉淀8h，高速離心得老 君須多糖沉淀；再用Sevage試劑和老君須多糖沉淀質量比為1:3混合均勻，靜置l_2h后取 上清液真空干燥得老君須多糖。
[0016] 所述打碗花多糖的制備方法包括以下步驟：取打碗花洗凈干燥后，粉碎制得打碗 花干粉，打碗花干粉與去離子水按1:18-22混合，85-95°C浸提8h，減壓濃縮后離心3次，離 心工藝參數為1 l〇〇〇r/