治療脂肪組織積聚的組合物和方法
【專利摘要】本公開涉及疾病或病癥的治療方法，所述疾病或病癥與脂肪組織積聚有關(guān)，例如肥胖、代謝綜合征、II型糖尿病等。施用包含針對(duì)抑胃肽的單克隆抗體的組合物。其導(dǎo)致重量增長率下降，并且顯著降低脂質(zhì)合成和積聚。
【專利說明】
治療脂肪組織積聚的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域
[00011 本申請(qǐng)要求于2013年12月17日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)序列No.61/917,136;于 2014年4月3日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)序列No.61/974,660;于2014年6月3日提交的美國 臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 62/007,255;于2014年9月3日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 62/045,189; 于2014年11月3日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 62/074,225;于2014年11月3日提交的美國 臨時(shí)專利申請(qǐng)No.62/074，227;以及于2014年11月3日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)No.62/074， 234的優(yōu)先權(quán)。這些申請(qǐng)的公開內(nèi)容通過引用完全并入本文。
【背景技術(shù)】
[0002] 在本文中，提交的序列表為于2014年12月17日創(chuàng)建的名稱為"MHMS200014US01_ ST25. txt"的ASCII文本文件，該文件大小為24，995字節(jié)。由此，在該文本文件中的材料在此 全部引用并入本文。
[0003] 在各種示例性實(shí)施方案中，本公開一般而言涉及利用分子拮抗劑(如單克隆抗體 (mAb))治療組織中脂肪積聚(buildup)的方法，所述分子拮抗劑與葡萄糖依賴性促胰島素 多肽(GIP)結(jié)合。脂肪組織積聚發(fā)生在幾種不同的疾病或病癥中，其可以使用此類拮抗劑/ 單克隆抗體來治療。本發(fā)明還涉及通過施用此類拮抗劑/單克隆抗體，在不需要增加血清胰 島素的情況下，通過提高葡萄糖耐量從而治療這些疾病或病癥。
[0004] 肥胖癥是這樣一種醫(yī)學(xué)病癥，其中體內(nèi)多余的脂肪積聚到對(duì)健康產(chǎn)生不利影響的 程度。在美國，當(dāng)人的體重指數(shù)(BMI)為30kg/m 2以上時(shí)，則被視為出現(xiàn)肥胖癥，該體重指數(shù) 通過該人的重量除以該人身高的平方計(jì)算。肥胖可能由多種因素的組合所誘發(fā)，包括過量 的熱量攝入、不健康的飲食、缺乏體力活動(dòng)、遺傳、年齡以及睡眠不足。肥胖會(huì)增加各種疾病 發(fā)生的可能性，所述疾病包括心臟疾病、2型糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暫停、某些癌癥和骨關(guān) 節(jié)炎。
[0005] 當(dāng)下面五種醫(yī)學(xué)病癥中的三種一起確診時(shí)則可以診斷為代謝綜合征：血壓升高、 腰部出現(xiàn)過多的體內(nèi)脂肪、空腹血糖高、血清甘油三酯高和高密度膽固醇(HDL)水平低。代 謝綜合征也增加了一些疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)，所述疾病包括2型糖尿病、冠狀動(dòng)脈心臟疾病、月旨 肪代謝障礙以及潛在的一些精神病。治療包括生活方式的改變以及藥物治療。
[0006] 高脂血癥是其中脂質(zhì)和/或脂蛋白在血液中的水平異常升高的病癥。原發(fā)性高脂 血癥通常是由于遺傳原因，而繼發(fā)性高脂血癥由其他潛在因素，如糖尿病、某些藥物的使用 和嗜酒所誘發(fā)。高脂血癥可劃分為高膽固醇血癥和高甘油三酯血癥。在美國，一般而言，當(dāng) 總膽固醇水平高于240mg/dl時(shí)則被診斷為高膽固醇血癥。在美國，通常而言，當(dāng)甘油三酯水 平高于500mg/dl時(shí)則被診斷為高甘油三酯血癥。
[0007] 當(dāng)身體的細(xì)胞不正確地響應(yīng)胰島素時(shí)，則會(huì)出現(xiàn)非胰島素依賴性（II型)糖尿病， 這是已知為一種耐受胰島素的病癥。其結(jié)果是，高血糖水平持續(xù)過長時(shí)間。主要原因是體重 過重并且鍛煉不足。長期并發(fā)癥可包括心血管疾病、中風(fēng)、腎衰竭和眼損傷。
[0008] 庫欣綜合征與長期暴露于異常高水平的激素皮質(zhì)醇有關(guān)。皮質(zhì)醇在腎上腺中產(chǎn) 生，而且通常是由促腎上腺皮質(zhì)激素誘導(dǎo)。然而，當(dāng)腎上腺是異常響應(yīng)于胃抑制肽(GIP)時(shí)， 則會(huì)出現(xiàn)食物誘導(dǎo)的庫欣綜合征。
[0009] 脂肪肝(FLD)是出現(xiàn)在成人和兒童中的全球慢性健康問題。臨床上將FLD分為兩大 類:非酒精性FLD(NAFLD)和酒精性FLDUFLDhNAFLD和AFLD的特征在于肝臟脂肪含量超過 5%至10%，唯一的區(qū)別因素是疾病的潛在病因。然而，通常難以僅基于形態(tài)特征將兩類FLD 進(jìn)行區(qū)分。一般而言，F(xiàn)LD出現(xiàn)在消耗過量酒精的人群中，具有代謝紊亂或影響脂肪酸代謝 的遺傳傾向的人群中，和/或肥胖的人群中。常見的共發(fā)病包括肥胖、2型(非胰島素依賴型） 糖尿病和高脂血癥。
[0010] FLD的核心病理包括肝性脂肪變性和會(huì)發(fā)展為肝硬化的脂肪肝炎。當(dāng)肝臟中脂質(zhì) 的含量超過5重量％至10重量％時(shí)，發(fā)生脂肪變性，其表現(xiàn)為脂質(zhì)囊泡的異常滯留以及脂肪 酸氧化的抑制。脂肪變性被認(rèn)為是可逆的，前提在于能夠確認(rèn)并解決該疾病的根本原因。 [0011]如果脂肪變性持續(xù)下去，則可能發(fā)展成非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或酒精性脂肪 性肝炎(ASH)，這取決于疾病的嚴(yán)重性和誘因。與脂肪變性不同，NASH和ASH是不可逆的，僅 可以被治療。NASH和ASH的特征在于更多的脂肪積聚、混合小葉炎癥、肝細(xì)胞氣球樣退化、糖 原化的肝細(xì)胞核以及細(xì)胞周圍纖維化。它們可發(fā)展為肝硬化，最終變成肝癌。
[0012]對(duì)于FLD當(dāng)前的療法包括：（1)遵循合理的飲食和鍛煉計(jì)劃，（2)避免通過突然體重 減輕或藥物濫用而可能發(fā)生的肝損傷的惡化，（3)降低體重，（4)服用胰島素增敏劑以降低 胰島素抵抗并控制血糖，（5)使用降血脂藥物或用于改善肝臟疾病的藥物，和(6)尋求肝移 植。
[0013]在臨床環(huán)境中，食欲抑制劑通過產(chǎn)生惡心而在某種程度上發(fā)揮作用。因此，如果 她/他愿意在減肥過程中感到不適，那么這樣的人可以減肥。然而，特別要求患者遵循減肥 方案的情況下，不希望出現(xiàn)這樣的副作用。
[0014] 期望存在對(duì)于FLD和其他涉及脂肪積聚的疾病的其他療法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本公開涉及結(jié)合胃抑制多肽(GIP)的單克隆抗體(mAb)以及使用這種mAb來治療涉 及組織中脂肪積聚的疾病的方法，GIP也被稱為葡萄糖依賴性促胰島素多肽，。
[0016] 本文在各種實(shí)施方案中公開的是治療多種不同的疾病或病癥的方法。這些疾病包 括肥胖癥、II型糖尿病、食物誘發(fā)的庫欣綜合征或代謝綜合征。本文還公開了降低肝臟組 織、網(wǎng)膜或皮下組織中脂肪積聚的方法。這些方法都包括向患者施用包含藥學(xué)上有效量的 抑胃肽(GIP)的分子拮抗劑的組合物。
[0017] 分子拮抗劑包括至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)，其與選自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32和SEQ ID N0:33構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80%同一性。
[0018] 在具體的實(shí)施方案中，所述分子拮抗劑包括具有第一CDR和第二CDR的輕鏈可變 域，各CDR與選自由SEQIDN0:20、SEQIDN0 :21、SEQIDN0:22、SEQIDN0:23和SEQID N0:24構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少95%同一性。分子拮抗劑的第一⑶R和第二⑶R通 過連接基團(tuán)相互接合。該連接基團(tuán)可以是氨基酸鏈。
[0019] 在其他實(shí)施方案中，所述分子拮抗劑包括輕鏈可變域，其具有與SEQ ID N0:20的 氨基酸序列具有至少80%同一性的第一⑶R、與SEQ ID NO: 21的氨基酸序列具有至少80% 同一性的第二⑶R和與SEQ ID N0:22的氨基酸序列具有至少85%同一性的第三⑶R。分子拮 抗劑的第一⑶R、第二⑶R和第三⑶R通過連接基團(tuán)相互接合。該連接基團(tuán)可以獨(dú)立地為氨基 酸鏈。
[0020] 在又一些實(shí)施方案中，所述分子拮抗劑包括輕鏈可變域，其與選自由SEQ ID N0: 16、SEQIDN0:17、SEQIDN0:18和SEQIDN0 :19構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80% 同一,性。
[0021] 在還一些實(shí)施方案中，所述分子拮抗劑包括重鏈可變域，其具有與SEQ ID N0:31 的氨基酸序列具有至少80%同一性的第一⑶R、與SEQ ID N0:32的氨基酸序列具有至少 80%同一性的第二⑶R和與SEQ ID N0:33的氨基酸序列具有至少80%同一性的第三⑶R。 [0022] 在一些實(shí)施方案中，所述分子拮抗劑包括重鏈可變域，其與選自由SEQ ID N0:27、 SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80%同一 性。
[0023] 在特定的實(shí)施方案中，所述分子拮抗劑包括輕鏈可變域和重鏈可變域;其中所述 輕鏈可變域包括第一CDR和第二CDR，各CDR與選自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:24構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少95%同一性;其中 所述重鏈可變域包括與SEQ ID N0:31的氨基酸序列具有至少80%同一性的第一⑶R、與SEQ ID N0:32的氨基酸序列具有至少80 %同一性的第二⑶R和與SEQ ID N0:33的氨基酸序列具 有至少80%同一性的第三⑶R。所述分子拮抗劑可以是單鏈可變片段(scFv)、F(ab'）2片段、 Fab或Fab '片段、雙價(jià)抗體、三價(jià)抗體、四價(jià)抗體或單克隆抗體。
[0024] 在其他實(shí)施方案中，所述分子拮抗劑包括輕鏈可變域和重鏈可變域;其中所述輕 鏈可變域與選自由SEQIDN0:16、SEQIDN0 :17、SEQIDN0:18和SEQIDN0:19構(gòu)成的組 中的氨基酸序列具有至少80%同一性；其中所述重鏈可變域與選自由SEQ ID N0:27、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80%同一性。 所述分子詰抗劑可以是單鏈可變片段（scFv)、F(ab'）2片段、Fab或Fab'片段、雙價(jià)抗體、三 價(jià)抗體、四價(jià)抗體或單克隆抗體。
[0025] 在具體的實(shí)施方案中，所述分子拮抗劑是具有輕鏈可變域和重鏈可變域的單克隆 抗體，所述輕鏈可變域與SEQ ID N0:18具有至少80%同一性，并且所述重鏈可變域與選自 由SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80%同 一性。
[0026] 在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述分子拮抗劑是具有輕鏈可變域和重鏈可變域的 完整單克隆抗體，所述輕鏈可變域與SEQ ID N0:18具有至少90 %同一性，并且所述重鏈可 變域與SEQ ID N0:29具有至少90%同一性。
[0027]所述分子拮抗劑可以結(jié)合GIP的氨基酸序列，所述氨基酸序列選自由SEQ ID N0: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4構(gòu)成的組中。
[0028]在特定的實(shí)施方案中，所述分子拮抗劑是包括人恒定區(qū)的完整單克隆抗體。
[0029]所述分子拮抗劑的分子量可以為約30kDa至約500kDa。該分子拮抗劑可以具有對(duì) GIP的結(jié)合親和力，特征在于IC5〇為約O.lnM至約7nM。
[0030]該組合物可以靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下施用。該組合物可以進(jìn)一步包含惰性的藥物 賦形劑，其選自緩沖劑、表面活性劑、防腐劑、填充劑、聚合物和穩(wěn)定劑組成的組中。該組合 物可以是粉末、注射劑、溶液、懸浮液或乳液的形式。
[0031 ]組合物包含的單克隆抗體詰抗劑的量可以為每升該組合物約0 . lmg至約lOOOmg。 有時(shí)，該組合物是凍干的。
[0032]脂肪肝疾病可以是酒精性脂肪肝病或非酒精性脂肪肝病。
[0033] 本文還公開了抑胃多肽(GIP)的分子拮抗劑，其可采用幾種形式，如完整單克隆抗 體和其變體。該分子詰抗劑如上所述。
[0034] 本文還公開了互補(bǔ)DNA序列，其與選自由SEQ ID N0:35、SEQ ID N0:36、SEQ ID N0:37、SEQ ID N0:38、SEQ ID N0:39、SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:41 和SEQ ID N0:42構(gòu)成的 組中DNA序列具有至少85%同一性。
[0035] 以下將更加詳細(xì)地討論本公開的這些以及其他非限制性特征。
【附圖說明】
[0036]本專利或申請(qǐng)文件包含至少一個(gè)用彩色顯示的附圖。在提出請(qǐng)求并繳納所需費(fèi)用 的基礎(chǔ)上，官方將會(huì)提供包含彩色附圖的本專利或?qū)＠暾?qǐng)公布文本的副本。
[0037]以下提供附圖的簡要說明，其用于說明本發(fā)明所公開的示例性實(shí)施方案，而不是 為了限制這些實(shí)施方案。
[0038]圖1A是表示對(duì)于三組不同的小鼠進(jìn)行15周的研究期間，小鼠體重vs.時(shí)間的圖示。 喂食高脂肪飲食的C57BL/6小鼠是飲食引起肥胖及相關(guān)代謝綜合征的確定模型。"HFD-對(duì) 照"小鼠被喂食高脂肪飲食(HFD)并且經(jīng)由腹腔注射從而施用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)Z'HFD-mAb"小鼠被喂食ΗΠ)飲食，并且經(jīng)由腹腔注射，以每周60mg/kg體重(BW)施用PBS中的抑胃肽 的單克隆抗體(GIP mAb)拮抗劑。"等熱量飲食"小鼠被喂食低脂肪等熱量的飲食，而且不進(jìn) 行治療。在ΗΠ )飲食中，總熱量的60%來自脂肪，而在等熱量飲食中，總熱量的10%左右來自 脂肪。施用GIP mAb的小鼠重量增加不太快。17周的研究期后，HFD-對(duì)照小鼠的平均重量增 量為21.5 ± 1.0g。17周的研究期后，HFD-mAb小鼠的平均重量增量為11.5 ± 0.5g。這兩組之 間的重量增量差異顯著，P值為〇.〇〇〇〇〇〇07。
[0039] 圖1B示出了三組不同的小鼠中，重量增量百分比vs.時(shí)間的圖示。施用GIP mAb的 小鼠重量增加不太快。在HFD-對(duì)照小鼠重量增量幾乎是HFD-mAb小鼠增重速度的兩倍。 [0040]圖2是表示腹膜內(nèi)（i.p.)葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT)的結(jié)果的圖示。17周的研究期 后，對(duì)來自各組的6只小鼠進(jìn)行IPGTT。腹膜內(nèi)施用葡萄糖溶液(2mg葡萄糖/kg小鼠體重)后， 在第〇分鐘、第10分鐘、第30分鐘、第60分鐘和第120分鐘收集血液，并測定葡萄糖含量。在圖 中繪制了血糖濃度相對(duì)于時(shí)間的曲線。HFD-對(duì)照小鼠比HFD-mAB小鼠或等熱量飲食小鼠在 處理腹膜內(nèi)葡萄糖負(fù)荷的能力方面的效率低。這與HFD-對(duì)照小鼠中葡萄糖耐受不良的發(fā)展 相一致，但是HFD-mAB小鼠或等熱量飲食小鼠沒有出現(xiàn)這種情況。
[0041]圖3示出了小鼠的代表性的磁共振圖像。示出的是來自HFD-對(duì)照小鼠（左）和HFD-mAb 小鼠 （右） 的代表性圖像。圖像描繪了小鼠的側(cè)視圖 ，其中小鼠的前部在圖像的上部，小 鼠的后部在圖像的下部。白色或明亮區(qū)域代表脂肪含量高的區(qū)域。
[0042]圖4示出了由弛豫補(bǔ)償脂肪分級(jí)(RCFF)MRI得到的肝臟脂肪份數(shù)。在17周的飲食期 結(jié)束時(shí)，對(duì)來自各組的6只小鼠進(jìn)行麻醉并進(jìn)行MRI。使用RCFF技術(shù)對(duì)各小鼠的肝臟脂肪份 數(shù)進(jìn)行定量評(píng)估。用每個(gè)治療組的平均肝臟脂肪份數(shù)繪圖。與利用GIP-特異性mAb(p = 0.03)治療的小鼠相比，對(duì)照動(dòng)物的肝臟內(nèi)積聚了幾乎2倍的脂肪量。
[0043] 圖5示出了 17周的飲食期后，由弛豫補(bǔ)償脂肪分級(jí)（RCFF)MRI得到的網(wǎng)膜脂肪份 數(shù)。用每個(gè)治療組的平均網(wǎng)膜脂肪份數(shù)繪圖。與利用GIP-特異性mAb治療的小鼠相比，對(duì)照 動(dòng)物積聚了幾乎3.5倍的網(wǎng)膜脂肪量(p = 0.0005)。
[0044] 圖6示出了由弛豫補(bǔ)償脂肪份數(shù)(RCFF)MRI得到的皮下脂肪份數(shù)。用每個(gè)治療組的 平均皮下脂肪份數(shù)繪圖。與利用GIP-特異性mAb治療的小鼠相比，對(duì)照動(dòng)物的積聚了大約2 倍的皮下脂肪量(P = 〇. 0002)。
[0045] 圖7示出了 17周的研究期后，來自被處死小鼠肝臟的染色組織橫截面的代表性照 片。取出肝臟并固定在福爾馬林中。將固定的組織切片，并用油紅0染色，脂溶性偶氮 (lysochrome diazo)染料用于中性甘油三酯和脂質(zhì)的染色。圖片示出了代表性樣品，示出 了與HFD-對(duì)照小鼠（左)相比，在HFD-mAb小鼠（右）的肝臟中，深紅色的脂肪滴顯著減少。 [0046]圖8是17周的研究期后，在HFD-對(duì)照小鼠（左）中與HFD-mAb小鼠（右）中找到的網(wǎng)膜 脂肪的兩張(一組)比較圖片。脂肪是白色的，在HFD對(duì)照鼠中可見到更多的脂肪。
[0047]圖9示出了在小鼠血清中測定的甘油三酯(TG)水平。在17周的飲食期結(jié)束時(shí)，處死 小鼠，收集全血，制備血清并測定血清甘油三酯。用各組中小鼠的平均血清甘油三酯水平繪 圖。在HFD-對(duì)照組小鼠中的TG水平是HFD-mAM、鼠中的TG水平的1.44倍(p = 0.02)。較高的 TG水平與肥胖和代謝綜合征相關(guān)。
[0048]圖10示出了 17周的飲食期后，在小鼠的血清中測得的總膽固醇（TC)水平。HFD-對(duì) 照組小鼠中的TC水平是HFD-mAb小鼠中TC水平的1.55倍(p = 0.006)。較高的TC水平與肥胖 和代謝綜合征相關(guān)。
[0049] 圖11示出了 17周的飲食期后，在小鼠的血清中測得的高密度脂蛋白（HDL)占總膽 固醇(TC)的比例。用各組的平均值繪圖。在HFD-mAb小鼠中HDL占總膽固醇的比例比HFD-對(duì) 照小鼠中HDL占總膽固醇的比例高2 5 % (p值=0.0 3)。期望的是HDL占總膽固醇的比例較高， 因?yàn)榈捅壤c肥胖和代謝綜合征相關(guān)。
[0050] 圖12出了 17周的飲食期后，在小鼠的血清中測得的低密度脂蛋白（HDL)水平。用各 組中小鼠的平均血清LDL水平繪圖。在HFD-對(duì)照小鼠中LDL是HFD-mAb小鼠中LDL的1.95倍(p =0.007)。較高的LDL("壞"膽固醇)水平與肥胖和代謝綜合征相關(guān)。
[0051] 圖13示出了 17周的飲食期后，在小鼠的血清中測得的胰島素水平。用來自各組的5 只小鼠的平均血清胰島素水平繪圖。在HFD-對(duì)照小鼠中的胰島素水平是HFD-mAb小鼠中胰 島素水平的2.6倍(p = 0.03)。較高的胰島素水平與肥胖、胰島素抵抗和代謝綜合征相關(guān)。請(qǐng) 注意y軸的單位為皮克/毫升。
[0052] 圖14示出了 17周的飲食期后，在小鼠的血清中測得的脂連蛋白水平。用各組中的 小鼠的平均血清脂連蛋白水平繪圖。在HFD-對(duì)照組小鼠的中脂連蛋白水平是HFD-mAb小鼠 脂連蛋白水平的1.35倍。較高的脂連蛋白水平與總體內(nèi)脂肪增加有關(guān)。請(qǐng)注意y軸的單位為 微克/_升。
[0053] 圖15示出了 17周的飲食期后，在小鼠的血清中測得的瘦素水平。用各組中的小鼠 的平均血清瘦素水平繪圖。在HFD-對(duì)照組小鼠中瘦素水平是HFD-mAb小鼠瘦素水平的5.73 倍。較高的瘦素水平與總體內(nèi)脂肪增加有關(guān)。請(qǐng)注意y軸的單位為皮克/毫升。
[0054] 圖16示出了 17周的飲食期后，在小鼠的血清中測得的胰高血糖素水平。用各組中 的小鼠的平均血清胰高血糖素水平繪圖。各組之間的血清胰高血糖素水平?jīng)]有顯著差異。 請(qǐng)注意y軸的單位為皮克/毫升。
[0055] 圖17示出了 17周的飲食期后，在小鼠的血清中測得的胰高血糖素樣肽l(GLP-l)水 平。用各組中的小鼠的平均血清GLP-1水平繪圖。各組之間的血清GLP-1水平?jīng)]有顯著差異。 請(qǐng)注意Y軸的單位為皮克/毫升。
[0056] 圖18示出了在體外中和測定中，三種用于GIP的人源化抗體、以及原始抗體、陽性 對(duì)照和陰性對(duì)照的相對(duì)活性的圖示。y軸是相對(duì)活性，并且是無單位的。
[0057]發(fā)明詳述
[0058]除非上下文中另有明確說明，否則單數(shù)形式"一"，"一個(gè)"和"該"包括其復(fù)數(shù)形式。
[0059] 如在本說明書和權(quán)利要求中所使用的，開放式過渡詞語"包含"、"包括"、"具有"、 "含有"及其變體要求存在指定成分/步驟并允許其他成分/步驟的存在。這些短語也應(yīng)理解 為公開了僅允許指定成分/步驟和不可避免的雜質(zhì)，并排除其他成分/步驟的封閉式短語 "由...組成"或"基本上由...組成"。
[0060] 本申請(qǐng)的說明書和權(quán)利要求書中的數(shù)值應(yīng)理解為包括當(dāng)保留到相同的有效數(shù)時(shí) 數(shù)值相同的值，以及與所限定的數(shù)值的差距小于本申請(qǐng)中所描述的常規(guī)測量技術(shù)會(huì)產(chǎn)生的 實(shí)驗(yàn)誤差的值。
[0061] 本文所公開的所有范圍都包括引入的端點(diǎn)值，并可以單獨(dú)組合（例如，"從2g至 1 〇g"的范圍包括端點(diǎn)2g和10g以及所有的中間值）。
[0062] 術(shù)語"約"可以用于包括在不改變值的基礎(chǔ)功能的情況下能夠變化的任意數(shù)值。當(dāng) 與范圍聯(lián)用是，"約"也公開了由兩個(gè)端點(diǎn)的絕對(duì)值所限定的范圍。例如，表述"從約2至約4" 也公開了"從2至4"的范圍。術(shù)語"約"還可以指給定值±10%。
[0063] 術(shù)語"同一性"指的是一對(duì)序列(核苷酸或氨基酸)之間的相似性。同一性是通過將 相同的殘基數(shù)除以殘基的總數(shù)，并且將商乘以1〇〇以獲得百分比從而進(jìn)行測定的。因此，完 全相同的序列的兩個(gè)拷貝具有100%的同一性，但是較少高度保守、并且具有缺失、添加或 置換的序列可能具有較低程度的同一性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到有幾種計(jì)算機(jī)程序可以 用于確定序列的同一性，例如那些采用諸如BLAST之類的算法的程序。BLAST核苷酸搜索是 使用NBLAST程序進(jìn)行，并且BLAST蛋白質(zhì)搜索是利用BLASTP程序進(jìn)行的，其中使用了各程序 的默認(rèn)參數(shù)。
[0064] 兩個(gè)不同的序列可以彼此不同，而不影響由該序列編碼的蛋白質(zhì)的整體功能。在 這方面，本領(lǐng)域已知的是化學(xué)上相似的氨基酸可以相互取代，通常功能不會(huì)發(fā)生改變。相關(guān) 屬性可以包括酸性/堿性、極性/非極性、電荷、疏水性和化學(xué)結(jié)構(gòu)。例如，堿性殘基Lys和Arg 被認(rèn)為是化學(xué)上相似的，并且經(jīng)常互相取代，還有的例子是酸性殘基Asp和Glu、羥基殘基 Ser和Thr、芳香族殘基Tyr、Phe和Trp以及非極性殘基41&、￥&1、116、1^11和1^丨。這些置換被 認(rèn)為是"保守的"。同樣地，核苷酸密碼子和可接受的變化在本領(lǐng)域中也是公知的。例如，密 碼子ACT、ACC、ACA和ACG都編碼氨基酸蘇氨酸，即第三個(gè)核苷酸可以在不改變所得到的氨基 酸的情況下進(jìn)行變化。通過相似的殘基數(shù)除以殘基的總數(shù)，在將商乘以100,以得到百份比， 從而測定相似性。注意，相似性和同一性測量不同的性質(zhì)。
[0065] "抗體"是免疫系統(tǒng)用來識(shí)別靶抗原的蛋白質(zhì)?？贵w的基本功能單位是免疫球蛋白 單體。單體由形成為γ形蛋白質(zhì)的兩個(gè)相同的重鏈和兩個(gè)相同的輕鏈構(gòu)成。每條輕鏈由一個(gè) 恒定域和一個(gè)可變域組成。對(duì)于輕鏈，恒定域也可以被稱為"恒定區(qū)"，而可變域也可以被稱 為"可變區(qū)"。每條重鏈由一個(gè)可變域和三個(gè)或四個(gè)恒定域組成。對(duì)于重鏈，恒定域一起被稱 為"恒定區(qū)"，而可變域也可以被稱為"可變區(qū)"。Υ的臂被稱為片段，抗原結(jié)合(Fab)區(qū)，每個(gè) 臂被稱為Fab片段。每個(gè)Fab片段由來自重鏈的一個(gè)恒定域和一個(gè)可變域，以及來自輕鏈的 一個(gè)恒定域和一個(gè)可變域組成。Y的基部稱為Fc區(qū)，由來自每個(gè)重鏈的兩個(gè)或三個(gè)恒定域組 成。在Fab區(qū)中的重鏈和輕鏈的可變域是抗體的結(jié)合GIP的部分。更具體地，可變域的互補(bǔ)決 定區(qū)（CDR)結(jié)合它們的抗原（即，GIP)。在每個(gè)可變域的氨基酸序列中，設(shè)置有非連續(xù)的三個(gè) ⑶R。術(shù)語"完整"在本文中用于指包含F(xiàn)ab區(qū)和Fc區(qū)的抗體。
[0066] 根據(jù)本公開的"GIP的拮抗劑"是結(jié)合GIP并干擾GIP的生物作用的分子。
[0067] 本公開涉及利用拮抗GIP的分子（即與GIP結(jié)合)來治療患者的方法。在這方面，葡 萄糖依賴性促胰島素多肽(也被稱為抑胃肽或GIP)是在餐后由腸 K-細(xì)胞釋放的促胰島素 肽。作為腸降血糖素，GIP通過響應(yīng)于食物攝入來刺激胰腺細(xì)胞從而刺激胰島素的分泌。 GIP(本文中也記載為GIP(l-42))主要作為42個(gè)氨基酸的多肽進(jìn)行循環(huán)，但也也缺乏前2個(gè)Ν 端氨基酸的形式存在(61?(3-42))。61?(1-30)-順2或61?(1-30)-€1-酰胺是61?(1-42)的合 成衍生物，其缺少最后12個(gè)C端氨基酸。GIP(l-30)-NH 2具有與GIP(l-42)相同的生物學(xué)功 能。已經(jīng)推測有天然存在的GIP( 1-30)-NH2，但還沒有在任何生物物種中被確定。
[0068] GIP通過結(jié)合靶細(xì)胞表面上的其同源受體(GIPR)來發(fā)揮作用。GIPR是具有七次跨 膜域的G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的胰高血糖素分泌素家族中的一員。天然GIP(l-42)和合成 衍生物GIP(l-30)-NH 2以高親和力結(jié)合至GIPR并且其具有激動(dòng)劑性質(zhì)。GIP受體也在脂肪細(xì) 胞中表達(dá)，其響應(yīng)于由于葡萄糖攝取的增加、脂肪酸合成以及脂肪酸進(jìn)入到脂肪細(xì)胞內(nèi)的 脂質(zhì)中而導(dǎo)致的GIP水平升高。天然GIP(l-42)和合成衍生物GIP(l-30)-NH：dil抑制由胰高 血糖素和β腎上腺素受體激動(dòng)劑(包括異丙基腎上腺素)所誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞內(nèi)脂解作用。 [0069] GIP在人（智人）（SEQ ID Ν0:1)、小鼠（小家鼠 ）（SEQ ID Ν0:2)、大鼠（褐家鼠 ）（SEQ ID N0:3)和豬(野豬）（SEQ ID N0:4)之間是高度保守的。在這四個(gè)序列之間僅存在四個(gè)置 換，所有這些都是保守的。來自這四個(gè)物種的42個(gè)氨基酸的序列如下所示：
[0074]本申請(qǐng)涉及利用包含結(jié)合GIP的分子拮抗劑的組合物來治療脂肪肝疾病(FLD)的 方法，還涉及治療與脂肪組織積聚有關(guān)的其他疾病的方法。在特定的實(shí)施方案中，所述分子 拮抗劑是完整單克隆抗體（即，GIP mAb)。在脂肪肝中，脂肪變性導(dǎo)致甘油三酯脂肪在肝細(xì) 胞內(nèi)積聚。已知的是口服葡萄糖后，血清GIP水平增加5至6倍，其刺激胰島素釋放，這促進(jìn)了 葡萄糖攝取。GIP還激活A(yù)kt/PKB，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4的膜易位，從而導(dǎo)致增強(qiáng)葡萄糖的脂 肪細(xì)胞攝取，導(dǎo)致脂肪的生產(chǎn)與儲(chǔ)存。其結(jié)果是，據(jù)推測，詰抗GIP并降低其生物活性將抑制 葡萄糖吸收，由此導(dǎo)致脂肪生產(chǎn)和儲(chǔ)存降低。本公開示出了可以通過向患者施用包含GIP單 克隆抗體拮抗劑的組合物，來減少在肝臟、網(wǎng)膜或皮下組織中的脂肪滯留。其他的分子拮抗 劑(它們?cè)趩慰寺】贵w的CDR上存在變化)也可以有效地減少脂肪組織積聚。
[0075] 本文描述的GIP分子拮抗劑也可以用于改善可以通過降低GIP表達(dá)或通過減少熱 量攝取或減肥來治療的其他疾病或病癥，如肥胖癥、代謝綜合征、高脂血癥、II型糖尿病和 食物誘導(dǎo)的庫欣綜合征。
[0076] 本公開的GIP單克隆抗體拮抗劑可以通過以下方式產(chǎn)生和分泌。具有以下氨基酸 序列的兩種肽是經(jīng)由化學(xué)合成的：
[0079] GIP(1_17)+C的氨基酸序列對(duì)應(yīng)于通常由發(fā)育成熟的人、小鼠、大鼠和豬GIP所共 享的前17個(gè)氨基酸。該序列還包含在N-末端的額外半胱氨酸殘基以促進(jìn)與鑰孔血藍(lán)蛋白 (KLH)的綴合。C+mGIP(26-42)的氨基酸序列對(duì)應(yīng)于成熟小鼠 GIP的最后17個(gè)氨基酸，當(dāng)分別 與壬GIP或者豬GIP相比是，僅由兩個(gè)氨基酸置換，當(dāng)與大鼠 GIP相比時(shí)僅有三個(gè)氨基酸置 換。該序列還包含在C-末端的額外半胱氨酸殘基以促進(jìn)于KLH的綴合。兩種肽被綴合到KLH。 然后各綴合物分別用于在四個(gè)不同場合下注入一組(4只）小鼠中。在第1周、第4周、第7周、 第10周和第24周注入，隨后收集脾臟。
[0080] 從經(jīng)免疫的小鼠中取出脾臟，并分離脾細(xì)胞，之后在體外用無限增殖的骨髓瘤細(xì) 胞融合B細(xì)胞。在該融合過程中加入聚乙二醇(PEG)，以提高效率。融合細(xì)胞或雜交瘤在次黃 嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)培養(yǎng)基中培育14天，以殺死不與B細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞。然后 用培養(yǎng)介質(zhì)稀釋雜交瘤細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到一系列96孔板。稀釋的程度為每孔大約包含一個(gè)細(xì) 胞。使雜交瘤細(xì)胞生長數(shù)天，之后收集用于篩選的調(diào)理培養(yǎng)液或上清液。
[0081 ] 利用50μ1的4μg/ml合成小鼠 GIP(l-42)(菲尼克斯制藥公司）的PBS溶液覆蓋96孔 板。然后收集雜交瘤的上清液，并加入到含有小鼠 GIP(l-42)的孔中，在37°C下保持4小時(shí)。 然后將上清液除去并洗滌以除去未結(jié)合小鼠 GIP任何抗體。接著，將用辣根過氧化物酶 (HRP)綴合的山羊抗小鼠 lgG的溶液加入到該孔中。山羊抗小鼠 IgG-HRP是從Jackson實(shí)驗(yàn)室 獲得的，并以1: 5000稀釋，在37°C下培育1小時(shí)后，除去抗體溶液，然后用0.4mg/ml BSA的 PBS溶液洗滌該孔2次。
[0082]然后將溶液加入到各孔中，所述溶液包含在0.4mg/ml的過氧化氫脲中的HRP底物 4mg/ml的鄰苯二胺二鹽酸鹽(0P0)以及0.05M的磷酸鹽-檸檬酸鹽，pH為5.0。為了量化HRP活 性，使用ELISA板讀數(shù)器測量各孔在波長為490nm的光下的吸光度。這能夠由雜交瘤鑒定出 孔內(nèi)所產(chǎn)生的將結(jié)合小鼠 GIP的單克隆抗體。
[0083]接著，在37°C下，將來自鑒定的雜交瘤的上清液隨后用4μg/ml的小鼠 GIP溶液混合 30分鐘，然后加入到如上所述覆蓋有小鼠 GIP的孔中。在37°C培育1小時(shí)后，洗滌各孔，并將 山羊抗小鼠 IgG-HRP加入到孔中。培育1小時(shí)后，洗滌樣品并向各孔中添加溶液，所述溶液包 含在0.4mg/ml的過氧化氫脲中的HRP底物4mg/ml的0P0以及0.05M的磷酸鹽-檸檬酸鹽，pH為 5.0。對(duì)各孔中的HPR活性進(jìn)行定量。在此篩選中，結(jié)合懸浮液中GIP的單克隆抗體將會(huì)是"中 性的"并且不能與固定在孔中的GIP結(jié)合。因此，具有低HPR活性的孔對(duì)應(yīng)于更有效地結(jié)合懸 浮液中GIP的單克隆抗體。使用這些標(biāo)準(zhǔn)，鑒定出五個(gè)雜交瘤，這些雜交瘤能夠最佳地產(chǎn)生 會(huì)與懸浮液中小鼠 GIP結(jié)合的單克隆抗體(mAb)。由于在小鼠 GIP和人GIP之間的同一"性高度 對(duì)應(yīng)，預(yù)期這些結(jié)合于小鼠 GIP的單克隆抗體也將結(jié)合人GIP。
[0084]接著，使用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)雜交瘤上清液中和GIP并抑制配體-受體相互作用、受 體激活和受體依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力進(jìn)行測試。該系統(tǒng)中使用了報(bào)道細(xì)胞(LGIPR2細(xì)胞）， 其具有受環(huán)磷酸腺苷（cAMP-)響應(yīng)啟動(dòng)子控制的lacZ基因，并且在細(xì)胞表面上表達(dá)大鼠 GIPR。向這些細(xì)胞中添加 GIP導(dǎo)致GIPR的活化，誘導(dǎo)致使cAMP積聚的信號(hào)級(jí)聯(lián)，誘導(dǎo)lacZ基 因并合成β半乳糖苷酶。在添加試樣并培育4小時(shí)后，用比色測定法來測量細(xì)胞裂解物中β半 乳糖苷酶含量。色度的改變與β半乳糖苷酶的活性水平成正比。β半乳糖苷酶的活性水平是 取決于試樣中游離的具有生物活性的GIP的量。
[0085]利用小鼠或人GIP以1:1和1:20分別稀釋來自培養(yǎng)物中生長的五個(gè)雜交瘤克?。ㄋ?們?cè)趹腋y定中被評(píng)分為陽性)的上清液，然后將混合物加入到LGIPR2細(xì)胞并培育，之后洗 滌并對(duì)β半乳糖苷酶進(jìn)行測定。當(dāng)以1:1稀釋時(shí)，五個(gè)上清液中的三個(gè)顯示出對(duì)于小鼠 GIP的 顯著抑制，當(dāng)以1:20稀釋時(shí)，三個(gè)上清液中的兩個(gè)顯示出對(duì)于小鼠 GIP的顯著抑制。
[0086]為了證明單克隆抗體對(duì)GIP具有特異性，用O.lnM的人類胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)溶液以1:1稀釋五個(gè)雜交瘤(它們?cè)趹腋y定中被評(píng)分為陽性）的上清液。然后將混合物 加入到LGLP-1R細(xì)胞。LGLP-1R細(xì)胞類似于LGIPR2細(xì)胞，不同之處在于它們表達(dá)GLP-1受體， 而不是GIPR。將細(xì)胞在37°C下培育4小時(shí)，之后去除混合物，將細(xì)胞洗滌，并測定β半乳糖苷 酶含量。沒有上清液抑制天然GLP-1，表明單克隆抗體對(duì)GIP具有特異性。
[0087] 接著，將兩個(gè)雜交瘤擴(kuò)增，并收集~5Χ 105個(gè)細(xì)胞，利用購自41]113；[011(1^^91160118- 4PCR，Life Technologies)的試劑盒制備總RNA，其中所述兩個(gè)雜交瘤產(chǎn)生當(dāng)以1:20稀釋時(shí) 顯示出對(duì)小鼠 GIP顯著抑制的上清液。用2微克的總RNA，利用購自Life Technologies的 cDNA合成用Suprscript III第一鏈系統(tǒng)來制作第一鏈cDNA。所得的cDNA用于在兩個(gè)單獨(dú)的 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中擴(kuò)增編碼重鏈和輕鏈可變序列的cDNA。
[0088] 為了擴(kuò)增重鏈可變序列，將具有序列CAGTCGAAGC TTTGAGGAGA CGGTGACCGTG GTCCCTTGGC CCCAG(SEQ ID如:43)的寡核苷酸用作反向引物，并將具有序列0六六(^六66八丁 CCAGGTSMAR CTGCAGSAGT CWGG(SEQ ID N0:44)的寡核苷酸序列作為正向引物。反向引物在 其5 '端含有序列AAGCTT (SEQ ID N0:45)，這是限制性內(nèi)切酶Hindm的識(shí)別序列。正向引物 在其5'端含有序列GGATCC(SEQ ID N0:46)，這是限制性內(nèi)切酶BamHI的識(shí)別序列。PCR的所 得產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Hindll I和BamHI消化，然后連接到也用限制性內(nèi)切酶Hindll I和 BamHI消化的質(zhì)粒pUC18中。使用購自Epicentre的Fast-Link試劑盒進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反 應(yīng)用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a細(xì)菌細(xì)胞(Life Technologies)。在含有50微克/毫升(μg/ml)羧 芐青霉素的瓊脂板上篩選攜帶質(zhì)粒的細(xì)菌。挑取在羧芐青霉素瓊脂板上生長的菌落并使其 在2ml培養(yǎng)基中生長16小時(shí)。收集細(xì)菌并用堿裂解小量制備法分離質(zhì)粒DNA。用限制性內(nèi)切 酶BamHI和HindllI消化純化的質(zhì)粒DNA，之后通過在Tris-硼酸鹽緩沖液中的1.2%瓊脂糖 凝膠中，通過電泳將DNA解析(re so 1 ve)。在凝膠中的DNA片段用溴化乙錠染色，并使用紫外 燈觀察。使用購自Eurofins MWG Operon(Huntsville，AL)的裝置，對(duì)產(chǎn)生了具有大約374個(gè) 堿基對(duì)分子大小的限制性片段的質(zhì)粒進(jìn)行測序。
[0089] 為了擴(kuò)增輕鏈可變序列，大體按照如上所述進(jìn)行了相同的步驟。主要的不同點(diǎn)在 于，將具有序列：CAGTCGAAGC TTGTTAGATC TCCAGCTTG GTCCC(SEQ ID N0:47)的寡核苷酸用 作正向向引物，并將具有序列CAACTAGGAT CCGACATTCA GCTGACCCAG TCTCCA(SEQ ID NO: 48)的寡核苷酸用作反向引物。正向引物仍然包含HindIII的識(shí)別序列（SEQ ID NO:45)，反 向引物包含BamHI的識(shí)別序列（SEQ ID N0:46)。使用購自Eurofins MWG Operon (HuntSVille，AL)的裝置，對(duì)產(chǎn)生了具有大約355個(gè)堿基對(duì)分子大小的限制性片段的質(zhì)粒進(jìn) 行測序。
[0090] 使用上述步驟鑒定而得到的mAb為小鼠抗體。通過形成嵌合抗體，從而將這些小鼠 抗體部分地人源化，該嵌合抗體具有分別融合到人重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的小鼠重鏈可 變域和輕鏈可變域。這是通過利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增重鏈和輕鏈可變序列來完成 的。PCR中使用的模板是pUC18衍生物，其包含對(duì)應(yīng)的可變重鏈cDNA序列或可變輕鏈cDNA序 列。使用具有序列TCACGAATTC TCAGGTCCAG CTGCAGGAGT(SEQ ID N0:49)的寡核苷酸作為正 向引物，具有序列TTGGTGCTAG CTGAGGAGAC GGTGACCGT(SEQ ID N0:50)的寡核苷酸作為反 向引物，擴(kuò)增重鏈可變區(qū)。正向引物在其5 '端含有序列GAATTC(SEQ ID NO: 51)，這是限制性 內(nèi)切酶EcoRI的識(shí)別序列。反向引物在其5 '端含有序列GCTAGC(SEQ ID N0:52)，這是限制內(nèi) 切酶Nhel的識(shí)別序列。PCR擴(kuò)增后，將DNA片段用EcoRI和Nhel消化并連接到也用限制性內(nèi)切 酶EcoRI和Nhel消化的質(zhì)粒pFUSEss-CHIg-hGl 中。質(zhì)粒pFUSEss-CHIg-hGl是購自 InvivoGen (San Diego，CA)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。將可變重鏈cDNA序列克隆到該質(zhì)粒中，從而產(chǎn)生編 碼由小鼠可變區(qū)和人可變區(qū)構(gòu)成的嵌合重鏈的基因。使用購自Epicentre的Fast-Link試劑 盒進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a細(xì)菌細(xì)胞(Life Technologies)。在含有 50μg/ml博來霉素的瓊脂板上篩選攜帶質(zhì)粒的細(xì)菌。挑取在博來霉素瓊脂板上生長的菌落 并使其在2ml培養(yǎng)基中生長16小時(shí)。收集細(xì)菌并用堿裂解小量制備法分離質(zhì)粒DNA。用限制 性內(nèi)切酶EcoRII和Nhel消化純化的質(zhì)粒DNA，之后通過在Tri s-硼酸鹽緩沖液中的1.2 %瓊 脂糖凝膠中，通過電泳將DNA解析。在凝膠中的DNA片段用溴化乙錠染色，并使用紫外燈觀 察。通過鑒定出具有373個(gè)堿基對(duì)分子大小的DNA片段，從而確認(rèn)克隆成功。
[0091] 使用具有序列GTCACGAATTCAGACATTCAGCTGACCCAG(SEQ ID N0:55)的寡核苷酸作 為正向引物，使用具有序列AGCCACCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCA(SEQIDN0 :53)作 為反向引物擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)，正向引物序列含有限制性內(nèi)切酶EcoRI的識(shí)別序列（SEQ ID NO: 51)。反向引物在其5 '端含有序列CGTACG(SEQ ID NO: 54)，這是限制內(nèi)切酶BsiWI的識(shí)別 序列。PCR擴(kuò)增后，將DNA片段用EcoRI和BswiI消化，并連接到也用限制性內(nèi)切酶EcoRI和 BswiI消化的質(zhì)粒pFUSE2ss_CLIg-hK中。質(zhì)pFUSE2ss_CLIg-hK是購自 InvivoGen( San Diego，CA)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。將可變輕鏈cDNA序列克隆到該質(zhì)粒中，從而產(chǎn)生編碼由小 鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)構(gòu)成的嵌合輕鏈的基因。使用購自Epicentre的Fast-Link試劑盒進(jìn)行 連接反應(yīng)。連接反應(yīng)用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a細(xì)菌細(xì)胞(Life Technologies)。在含有50yg/ ml殺稻痕素(blastocidin)的瓊脂板上篩選攜帶質(zhì)粒的細(xì)菌。挑取在殺稻痕素瓊脂板上生 長的菌落并使其在2ml培養(yǎng)基中生長16小時(shí)。收集細(xì)菌并用堿裂解小量制備法分離質(zhì)粒 DNA。用限制性內(nèi)切酶EcoRII和BsiWI消化純化的質(zhì)粒DNA，之后通過在Tris-硼酸鹽緩沖液 中的1.2%瓊脂糖凝膠中，通過電泳將DNA分離。在凝膠中的DNA片段用溴化乙錠染色，并使 用紫外燈觀察。通過鑒定出具有353個(gè)堿基對(duì)分子大小的DNA片段，從而確認(rèn)克隆成功。
[0092] 為了表達(dá)含有克隆自雜交瘤的可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合載體，將分別包含可變重 鏈和可變輕鏈序列的pFUSEss-CHIg-hGl和pFUSE2ss-CLIg-hK衍生物引入到中國倉鼠卵巢 (CH0-1)細(xì)胞中培養(yǎng)。質(zhì)粒DNA通過使用陽離子脂質(zhì)試劑Turbofect(Thermo Scientific， Pittsburgh，PA)轉(zhuǎn)染引入，從而有利于DNA進(jìn)入到培養(yǎng)的細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后兩天，收集細(xì)胞上 清液并對(duì)GIP中和活性進(jìn)行分析。為了證明嵌合mAb中和GIP的能力，將細(xì)胞上清液與等體積 的2X 10、hGIP混合，之后在培養(yǎng)中添加 LGIPR2細(xì)胞。在37°C下培育4小時(shí)后，將細(xì)胞裂解 并測定β半乳糖苷酶活性。在該測定中，包含來自指定為l〇gl〇雜交瘤的可變輕鏈序列和可 變重鏈序列的質(zhì)粒組合在基于細(xì)胞的報(bào)道分析中具有中和GIP的活性。
[0093] 保留使用上述公開的步驟制作并鑒定的mAb的可變區(qū)，并用人恒定區(qū)替換上述恒 定區(qū)。可選地，可以使用轉(zhuǎn)基因小鼠來制造 GIP mAb拮抗劑，從而產(chǎn)生"全"人mAb，或者也可 以使用其他技術(shù)。例如，可以用在人抗體中保守的氨基酸來替換在小鼠抗體中保守的可變 域的氨基酸。
[0094] 由此得到的單克隆抗體拮抗劑與GIP結(jié)合。在特定的實(shí)施方案，在本公開的組合物 中使用的分子拮抗劑可以結(jié)合到選自由SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3和SEQ ID NO :4構(gòu)成的組中的氨基酸序列。換句話說，拮抗劑(例如單克隆抗體)結(jié)合包含在這四個(gè)序 列中的表位。
[0095] 在各種實(shí)施方案中，該分子拮抗劑的分子量為約30kDa至約500kDa，包括約120kDa 至500kDa。在其他實(shí)施方案中，該分子拮抗劑具有對(duì)GIP的結(jié)合親和力，特征在于IC5Q為約 O.lnM 至約 7nM。
[0096] 如前所述，結(jié)合GIP的單克隆抗體拮抗劑具有結(jié)合GIP的輕鏈可變域以及重鏈可變 域，或者更具體地說是結(jié)合GIP的輕鏈可變域的CDR以及重鏈可變域的CDR。通常設(shè)想的是， 本公開的分子拮抗劑包含至少一個(gè)結(jié)合GIP的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)。更具體地，分子拮抗劑包 含至少一個(gè)與選自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32和SEQ ID N0:33構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少 80%同一性的⑶R。通過在上述提到的10gl0雜交瘤中識(shí)別的輕鏈和重鏈中的可變域的各種 修改，從而識(shí)別這些⑶R。這些修改都將在下面的實(shí)施例部分更詳細(xì)地進(jìn)行討論。更理想的 是，所述（多個(gè))CDR與這些氨基酸序列有/具有至少85%、或至少90%、或至少95%或至少 100%的同一性。在更具體的實(shí)施方案中，分子拮抗劑包含兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè) ⑶R，這些⑶R與上述組中的兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)不同氨基酸具有必要同一性。
[0097] 在更具體的實(shí)施方案中，分子拮抗劑包括具有第一CDR和第二CDR的輕鏈可變域， 各CDR與選自由SEQIDN0:20、SEQIDN0 :21、SEQIDN0:22、SEQIDN0:23和SEQIDN0: 24構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少95%同一性。在輕鏈的可變域中識(shí)別出這些⑶R。更理 想的是，所述⑶R與這些氨基酸序列具有100 %的同一性。
[0098]在其他特定的實(shí)施方案中，分子拮抗劑包括輕鏈可變域，其具有與SEQ ID N0:20 的氨基酸序列具有至少80%同一性的第一⑶R、與SEQ ID N0:21的氨基酸序列具有至少 80%同一性的第二⑶R和與SEQ ID N0:22的氨基酸序列具有至少80%同一性的第三⑶R。含 有這三個(gè)CDR的組合的可變域被鑒定為具有非常高的GIP結(jié)合親和力。更理想的是，所述三 個(gè)⑶R與這些氨基酸序列具有至少85%、或至少90%、或至少95%的同一性、或100%的同一 性。
[0099]在另外的實(shí)施方案中，分子拮抗劑包括重鏈可變域，其具有與SEQ ID N0:31的氨 基酸序列具有至少80%同一性的第一⑶R、與SEQ ID NO: 32的氨基酸序列具有至少80%同 一性的第二⑶R和與SEQ ID N0:33的氨基酸序列具有至少80%同一性的第三⑶R。含有這三 個(gè)CDR的組合的可變域被鑒定為具有非常高的GIP結(jié)合親和力。更理想的是，所述三個(gè)CDR與 這些氨基酸序列具有至少85%、或至少90%、或至少95%的同一性、或100%的同一性。
[0100] 通常設(shè)想的是，這些可變域包含兩個(gè)或三個(gè)如上規(guī)定的⑶R，并且⑶R通過連接基 團(tuán)相互接合。連接基團(tuán)通?？梢允窃试SCDR結(jié)合GIP的任意基團(tuán)。例如，所述連接基團(tuán)可以是 氨基酸鏈，如存在于抗體的天然可變域內(nèi)的那樣。氨基酸可以具有任何所需的長度。
[0101]在特定的實(shí)施方案中，分子拮抗劑包括輕鏈可變域，其與選自由SEQ ID N0:16、 SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18和SEQ ID N0:19構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80%同一 性。更理想地，輕鏈可變域與這些氨基酸序列之一具有至少85%、或至少90%、或至少95% 或者100%的同一性。這些可變域包含與氨基酸連接在一起的SEQ ID N0:20、SEQ ID N0: 21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:24的輕鏈CDR的各種組合。
[0102] 在其他實(shí)施方案中，分子拮抗劑包括重鏈可變域，其與選自由SEQ ID NO:27、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80%同一性。 更理想地，重鏈可變域與這些氨基酸序列之一具有至少85 %、或至少90 %、或至少95 %或者 100%的同一性。這些可變域包含與氨基酸連接在一起的SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的重鏈CDR的各種組合。
[0103] 還考慮了具有上述公開的輕鏈可變域和重鏈可變域的任何組合的分子拮抗劑。更 具體地，一些分子拮抗劑僅包含一個(gè)輕鏈可變域和一個(gè)重鏈可變域。其他分子拮抗劑包含 多個(gè)輕鏈可變域和重鏈可變域;在這些實(shí)施方案中，通常而言，多個(gè)輕鏈可變域是相同的， 并且多個(gè)重鏈可變域是相同的。
[0104] 在一些具體的實(shí)施方案中，分子拮抗劑包含一個(gè)輕鏈可變域和重鏈可變域。所述 輕鏈可變域包括第一CDR和第二CDR，各CDR與選自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:24構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少95%同一性;并且 所述重鏈可變域包括與SEQ ID N0:31的氨基酸序列具有至少80%同一性的第一⑶R、與SEQ ID N0:32的氨基酸序列具有至少80 %同一性的第二⑶R和與SEQ ID N0:33的氨基酸序列具 有至少80%同一性的第三⑶R。輕鏈可變域可以與所列出的氨基酸序列之一具有100%的同 一性。更具體地，重鏈可變域與所列出的氨基酸序列之一具有至少85%、或至少90%、或至 少95%或者具有100%的同一性。
[0105] 在一些其他具體的實(shí)施方案中，分子拮抗劑包括輕鏈可變域和重鏈可變域。所述 輕鏈可變域與選自由SEQIDN0:16、SEQIDN0 :17、SEQIDN0:18和SEQIDN0:19構(gòu)成的 組中的氨基酸序列具有至少80%同一性;并且所述重鏈可變域與選自由SEQ ID N0:27、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80%同一性。 更具體地，所述輕鏈可變域和/或所述重鏈可變域與它們列出的氨基酸序列之一具有至少 85%、或至少90%、或至少95%或者具有100%的同一性。
[0106] 在還一些更具體的實(shí)施方案中，分子拮抗劑包括與SEQ ID N0:18具有至少80%同 一性的輕鏈可變域，以及與選自由SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30構(gòu)成的組 中的氨基酸序列具有至少80%同一性的重鏈可變域。此外，這些可變域能夠與它們列出的 氨基酸序列之一具有至少85%、或至少90%、或至少95%或者具有100%的同一性。
[0107]在特別有利的實(shí)施方案中，分子拮抗劑包括與SEQ ID N0:18具有至少90%同一性 的輕鏈可變域，以及與SEQ ID N0:29具有至少90%同一性的重鏈可變域。在更具體的實(shí)施 方案中，這些可變域能夠與它們列出的氨基酸序列之一具有至少95%或者能夠具有100% 的同一性。
[0108] 在一些不同的實(shí)施方案中，本公開的分子拮抗劑具有如上所述的輕鏈可變域和重 鏈可變域。特別預(yù)期的是，分子拮抗劑可以是單鏈可變片段（scFv)、F(ab'） 2片段、Fab或 Fab '片段、雙價(jià)抗體、三價(jià)抗體、四價(jià)抗體或單克隆抗體，這些可變域?yàn)樯鲜鲞@些的一部分。
[0109] 單鏈可變片段(scFv)包括輕鏈可變域和重鏈可變域，通常通過連接基團(tuán)接合在一 起，該連接基團(tuán)通常的長度為約10至約25個(gè)氨基酸（雖然它不必一定在此范圍內(nèi)）。一個(gè)可 變域的N-末端被連接到其他可變域的C末端。如果需要的話，所述scFv可以被PEG化(用聚乙 二醇），以增加其大小，如利用certolizumab單抗那樣。兩個(gè)scFv可以利用另一連接基團(tuán)接 合在一起，以產(chǎn)生串聯(lián)scFv。
[0110] 如果輕鏈可變域和重鏈可變域通過短的連接基團(tuán)接合在一起以形成scFv，那么這 兩個(gè)可變域不能折疊在一起，scFv將發(fā)生二聚化以形成二價(jià)抗體。甚至更短的連接基團(tuán)也 可能導(dǎo)致形成三聚體(即，三價(jià)抗體)和四聚體(即，四價(jià)抗體）。
[0111] 完整單克隆抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈形成。再次，每個(gè)輕鏈和每個(gè)重鏈包含一 個(gè)可變域。每條輕鏈與重鏈結(jié)合。兩個(gè)重鏈在鉸鏈區(qū)接合在一起。如果去除鉸鏈區(qū)以下的重 鏈恒定區(qū)，則產(chǎn)生了包含總共四個(gè)可變域的F(ab'）2片段。該F(ab'）2片段可以被分成兩個(gè) Fab'片段。Fab'片段包含來自鉸鏈區(qū)的巰基。當(dāng)去除鉸鏈區(qū)以上的重鏈恒定區(qū)時(shí)，形成Fab 片段，并且不包含來自鉸鏈區(qū)的巰基。然而，所有這些片段都包含輕鏈可變域和重鏈可變 域。
[0112] 在下面描述的實(shí)驗(yàn)中探討的所期望的實(shí)施方案中，分子拮抗劑是由上述具有可變 區(qū)/域的輕鏈和重鏈與人恒定區(qū)一起形成的完整單克隆抗體。重鏈恒定區(qū)可以是任何人類 同種型，包括IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4或IgM。人輕鏈恒定區(qū)可以是κ或λ 同種型。在具體的實(shí)施方案中，重鏈恒定區(qū)是IgGl同種型，且輕鏈恒定區(qū)是κ同種型。
[0113]在特定的實(shí)施方案中，分子拮抗劑是具有輕鏈可變域和重鏈可變域的單克隆抗 體，所述輕鏈可變域與SEQ ID N0:18具有至少80 %同一性，并且所述重鏈可變域與選自由 SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80%同一 性。這些可變域能夠與它們列出的氨基酸序列之一具有至少85%、至少90%、至少95%或者 能夠具有100%的同一性。
[0114] 在其他特定的實(shí)施方案中，分子拮抗劑是具有輕鏈可變域和重鏈可變域的完整單 克隆抗體，所述輕鏈可變域與SEQ ID N0:18具有至少90%同一性，并且所述重鏈可變域與 SEQ ID N0:29具有至少90%同一性。這些可變域能夠與它們列出的氨基酸序列之一具有至 少95 %或者能夠具有100 %的同一性。
[0115] 然后，能夠?qū)IP的分子拮抗劑(其特定形式為單克隆抗體）用在向患者施用的組 合物中。該組合物包含藥學(xué)上有效量的GIP的分子拮抗劑。在特定實(shí)施方案中，組合物的分 子拮抗劑的量為約0.1至約1000毫克/毫升組合物(w/V)。
[0116] 包含GIP的分子拮抗劑的藥物組合物通常是通過胃腸外（即皮下、肌內(nèi)、，靜脈內(nèi)、 腹膜內(nèi)、胸腔內(nèi)、囊內(nèi)或鞘內(nèi)）途徑施用，根據(jù)藥物和疾病需要進(jìn)行選擇。在特定的制劑或應(yīng) 用中使用的劑量將由疾病特定狀態(tài)的要求，并通過載體材料的能力特性所帶來的限制因素 來確定。預(yù)期的是在最有利的形式中，組合物將以靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下施用。
[0117] 藥物組合物可以包括藥學(xué)上可接受的載體。該載體充當(dāng)用于遞送分子拮抗劑的媒 介。藥學(xué)上可接受的載體的實(shí)例包括分子拮抗劑可以溶解或懸浮于其中的液體載體(如水、 油和醇）。
[0118] 藥物組合物還可以包括賦形劑。具體的賦形劑包括緩沖劑、表面活性劑、防腐劑、 填充劑、聚合物和穩(wěn)定劑，它們對(duì)于這些分子的拮抗劑而言是有用的。緩沖劑用于控制組合 物的pH值。表面活性劑用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)、抑制蛋白質(zhì)聚集、抑制蛋白質(zhì)吸附到表面上，并協(xié) 助蛋白質(zhì)重折疊。示例性的表面活性劑包括吐溫80、吐溫20、Brij 35、Triton X-10、 PlUr〇nicF127和十二烷基硫酸鈉。防腐劑用于抑制微生物生長。防腐劑的實(shí)例包括苯甲醇、 間甲酚和苯酚。在凍干過程中使用填充劑，從而增加體積。親水性聚合物(如葡聚糖、羥乙基 淀粉、聚乙二醇、明膠)可用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。具有非極性部分的聚合物(如聚乙二醇聚合物） 也可以用作表面活性劑。蛋白穩(wěn)定劑可包括多元醇類、糖類、氨基酸類、胺類和鹽類。合適的 糖類包括蔗糖和海藻糖。氨基酸類包括組氨酸、精氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、賴氨酸、谷 氨酸，以及它們的混合物。如人血清白蛋白之類的蛋白質(zhì)也可以競爭性地吸附到表面上，并 且降低蛋白質(zhì)樣分子拮抗劑的聚集。應(yīng)當(dāng)注意的是，特定的分子可用于多種目的。例如，組 氨酸可作為緩沖劑和抗氧化劑。甘氨酸可以用作緩沖劑和填充劑。
[0119] 藥物組合物可以是粉末、注射劑、溶液、懸浮液或乳液的形式。可以設(shè)想的是該組 合物將通過注射遞送。有時(shí)，GIP的分子拮抗劑可以使用本領(lǐng)域已知的那些標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)凍干。 然后可以利用（例如)合適的稀釋劑(如生理鹽水、無菌水、冰醋酸、醋酸鈉，它們的組合和類 似物)將凍干的拮抗劑重構(gòu)。
[0120] 劑量將取決于多種因素，包括藥物的治療指數(shù)、疾病類型、患者年齡、患者體重和 耐受性。通常選擇的劑量為達(dá)到患者體內(nèi)約〇. lμg/ml至1000μg/ml的血清濃度。對(duì)于具體患 者的劑量可以由有經(jīng)驗(yàn)的臨床醫(yī)生通過使用鑒于上述因素的標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)方法來確定。對(duì)治 療的反應(yīng)可通過葡萄糖或胰島素水平的血液或體液水平分析進(jìn)行監(jiān)測，或者通過在患者中 監(jiān)測脂肪水平。有經(jīng)驗(yàn)的臨床醫(yī)生將基于這些測量結(jié)果所揭示的對(duì)于治療的響應(yīng)效果從而 調(diào)整劑量。單獨(dú)施用通?？勺阋援a(chǎn)生治療效果，但可以預(yù)期的可以進(jìn)行多次施用，從而確保 在長時(shí)間內(nèi)的持續(xù)響應(yīng)。由于本文所公開的分子拮抗劑的蛋白樣性質(zhì)，所以據(jù)信，該在體內(nèi) 拮抗劑將具有長的半衰期，所以組合物將僅需要一月施用一次或兩次，或可能地一周一次。 分子拮抗劑的循環(huán)濃度應(yīng)足以中在進(jìn)食過程中以及進(jìn)食后生成的GIP。
[0121] 可以使用含有本公開的GIP分子拮抗劑的藥物組合物來治療脂肪肝病或涉及脂肪 在組織中積聚的其他疾病。術(shù)語"治療"用于指減緩疾病的進(jìn)程、使疾病消退、和/或預(yù)防性 地用于減少疾病出現(xiàn)的可能性。這可以以幾種不同的方式，諸如經(jīng)由肝臟脂肪份數(shù)、網(wǎng)膜脂 肪份數(shù)或皮下脂肪份數(shù)來測定。
[0122] 對(duì)于肥胖者，據(jù)信，GIP分子拮抗劑會(huì)抑制GIP結(jié)合其腸上皮細(xì)胞內(nèi)受體，通過抑制 GIP-誘導(dǎo)的鈉/葡萄糖由細(xì)胞質(zhì)向管腔膜的轉(zhuǎn)運(yùn)(SGLT1)，從而降低餐后葡萄糖吸收。GIP誘 導(dǎo)的來自胰腺辟田胞的胰島素分泌也將衰減，降低了與升高的胰島素響應(yīng)相關(guān)的養(yǎng)分存儲(chǔ)。 抑制GIP與其脂肪細(xì)胞中受體的結(jié)合應(yīng)當(dāng)也降低了 GIP誘導(dǎo)的葡萄糖攝取進(jìn)入脂肪細(xì)胞，并 且阻止了 GIP抑制脂解的作用?？傮w來說，這將導(dǎo)致低效率的養(yǎng)分吸收和存儲(chǔ)，促進(jìn)體重減 輕。這些效果也有益于代謝綜合征或高脂血癥患者。
[0123] 對(duì)于患有II型糖尿病的患者，抑制GIP與其腸上皮細(xì)胞內(nèi)受體結(jié)合將降低餐后葡 萄糖吸收并降低血糖。吃得過飽的患者也將受益于中和GIP所帶來的體重降低的效果。
[0124] 對(duì)于患者易患或罹患脂肪肝病的患者，抑制GIP與其細(xì)胞內(nèi)的受體結(jié)合將降低餐 后胰島素分泌，從而降低在肝臟中由胰島素誘導(dǎo)的脂肪積聚。
[0125] 對(duì)于罹患由食物誘導(dǎo)的庫欣綜合征患者，抑制GIP與其腎上腺細(xì)胞內(nèi)的受體結(jié)合 將減少或防止食物攝入后的GIP誘導(dǎo)的皮質(zhì)醇分泌增加。
[0126] 本發(fā)明將進(jìn)一步在以下非限制性的三組工作實(shí)施例中進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，這些 實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明而不是用于限制在本文中所引用的材料、條件、工藝參數(shù)等。除非 另有說明，否則所有比例都是基于重量計(jì)算的。 實(shí)施例
[0127] 實(shí)施例1
[0128] 如上所述，使用雜交瘤產(chǎn)生并篩選單克隆抗體，以在懸浮液中鑒定對(duì)于抑胃肽 (GIP)具有高親和性的單克隆抗體。由此鑒定出10gl0單克隆抗體。
[0129] 10gl0輕鏈可變域具有SEQ ID N0:16的氨基酸序列。輕鏈可變域的第一⑶R具有 SEQ ID N0:25的氨基酸序列。輕鏈可變域的第二⑶R域具有SEQ ID N0:26的氨基酸序列。輕 鏈可變域的第三⑶R具有SEQ ID ^):22的氨基酸序列。編碼1(^10輕鏈可變域的(^嫩具有 SEQ ID N0:35的核苷酸序列。
[0130] 10gl0重鏈可變域具有SEQ ID N0: 27的氨基酸序列。重鏈可變域的第一⑶R具有 SEQ ID N0:31的氨基酸序列。重可變域的第二⑶R域具有SEQ ID N0:34的氨基酸序列。重鏈 可變域的第三⑶R具有SEQ ID N0:33的氨基酸序列。編碼10gl0重鏈可變域的cDNA具有SEQ ID N0:39的核苷酸序列。
[0131] 為了進(jìn)行比較，鑒定出對(duì)于GIP沒有結(jié)合親和性的14B9抗體。10gl0輕鏈可變域具 有SEQ ID N0:16的氨基酸序列。14B9輕鏈可變域的第一⑶R具有SEQ ID N0:7的氨基酸序 列。該輕鏈可變域的第二⑶R域具有SEQ ID N0:26的氨基酸序列。該輕鏈可變域的第三⑶R 具有SEQIDN0:10的氨基酸序列。編碼14B9輕鏈可變域的cDNA具有SEQIDN0:8的核苷酸 序列。
[0132] 14B9重鏈可變域具有SEQ ID N0:11的氨基酸序列。該重鏈可變域的第一⑶R具有 SEQ ID N0:13的氨基酸序列。該重鏈可變域的第二⑶R域具有SEQ ID N0:14的氨基酸序列。 該重鏈可變域的第三⑶R具有SEQ ID勵(lì)：15的氨基酸序列。編碼1489重鏈可變域的(^嫩具 有SEQ ID N0:12的核苷酸序列。
[0133] 實(shí)施例2
[0134] 材料和方法
[0135] 30只九周齡的雄性C57BL/6小鼠購自Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，ME)。在研究的 第一天，每只小鼠的稱重結(jié)果為19至25克之間。隨后將小鼠隨機(jī)分成三組，每組10只小鼠。
[0136] 所有小鼠在整個(gè)研究過程中自由獲取食物和水。將小鼠全部安置在動(dòng)物籠中，該 動(dòng)物籠保持在22 ± 2 °C下，進(jìn)行12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗循環(huán)。飼養(yǎng)在每個(gè)籠子中的小鼠五 只為一組，直到它們各自的體重達(dá)到25克。然后按照每籠兩只到三只動(dòng)物進(jìn)行飼養(yǎng)。
[0137] 高脂肪飲食(HFD)(目錄號(hào)TD.06414)和低脂肪等熱量飲食（目錄號(hào)TD.08806)購自 Harlan-Teklad(Indianapolis，IN)。以重量計(jì)，HFD由約23 · 5% 的蛋白質(zhì)、27 · 3% 的碳水化 合物和34.3 %的脂肪組成。ΗΠ )提供的總熱量18.4%來自蛋白質(zhì)，21.3 %來自碳水化合物， 并且60.3%來自脂肪，且該總熱量為5.1千卡/克。以重量計(jì)，等熱量飲食由約18.6%的蛋白 質(zhì)、62.6 %的碳水化合物和4.2 %的脂肪組成。等熱量飲食提供的總熱量20.5%來自蛋白 質(zhì)，69.1 %來自碳水化合物，并且10.4 %來自脂肪，且該總熱量為3.6千卡/克。
[0138] 一組10只小鼠（HFD-對(duì)照組)喂食HFD 17周并通過腹膜內(nèi)（i.p.)每周注射5次施用 0. lmL磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。
[0139] 第二組10只小鼠（HFD-mAb組）喂食HFD 17周并且每周施用在PBS中的lOglOGIP mAb五次。在星期一至星期四，通過通過腹膜內(nèi)注射，從而施用包含在PBS中的0.2mg/mL mAb 的0 . lmL溶液。在每個(gè)星期五，通過腹膜內(nèi)注射，從而施用包含在PBS中的0.4mg/mL mAb的 O.lmL溶液。這使得對(duì)于研究的每周來說，一周中有四天施用了 10mg/kg BW的GIP mAb，并且 有一天施用了20mg/kg BW的GIP mAb。在整個(gè)研究過程中持續(xù)使用該給藥方案。
[0140]第三組10只小鼠（等熱量飲食組)喂食等熱量飲食17周。對(duì)該組不進(jìn)行注射。
[0141] 在研究的持續(xù)過程中，每個(gè)星期一的晚上測量每個(gè)小鼠的重量并進(jìn)行記錄。另外， 在整個(gè)研究過程中，還測量了各組小鼠對(duì)于食物的消耗量并進(jìn)行記錄。
[0142] 結(jié)果
[0143] HFD-對(duì)照組的體重增加接近HFD-mAb組或等熱量飲食組的體重增加率的2倍。
[0144] 在圖1A中示出了總體重隨時(shí)間變化的圖。在圖1B中示出了每周的重量增量百分 比。特殊飲食一周后，兩個(gè)高脂肪食物(HFD)組(施用和沒施用GIPmAb)獲得了大約為其體重 10%的增重。兩個(gè)HFD組的重量增量直到第4周前的重量增量基本保持相等，在第4周，HFD-mAb 的重量增量開始緩慢下降 ，而 HFD-對(duì)照組的重量穩(wěn)定增加。在第 7 周，重量增量的差異變 得非常顯著(P〈〇.001)。在整個(gè)研究周期中，等熱量飲食組的小鼠體重以較慢的速率增加。 HFD-mAb組和等熱量飲食組在17周之后具有幾乎相同的重量增量。GIP mAb拮抗劑的使用對(duì) 于小鼠的重量增加具有顯而易見的效果。
[0145] 基于圖1B，看起來GIP mAb的影響不是即刻的，而是需要持續(xù)給藥一段時(shí)間。在第1 至4周的實(shí)驗(yàn)中，兩組喂食ΗΠ )的小鼠經(jīng)歷了幾乎相同的重量增加。僅在第5周，相比于HFD-對(duì)照組而言，HFD-mAb組的重量增量開始以較慢的速率增加。
[0146] MRI
[0147] 材料和方法
[0148] 特殊飲食17周之后，將從ΗΠ )對(duì)照組隨機(jī)選擇六只小鼠以及從HFD-mAb組隨機(jī)選擇 的六只小鼠用于磁共振成像(MRI)。在凱斯西儲(chǔ)大學(xué)(Case Western Reserve University) 的成像研究核心設(shè)施中成像之前，將所有小鼠麻醉。
[0149] 在Bruker Biospec 7T小動(dòng)物MRI掃描儀（Bruker Biospin，Billerica，MA)上通過 弛豫增強(qiáng)(aRARE)序列快速采集二維T1-加權(quán)的非對(duì)稱回波(TR=1087ms，TE = 9.1ms，F(xiàn)0V = lOOx 50mm，512x 256矩陣，4個(gè)平均，回波串長度=4,切片厚度= lmm)。該aRARE序列提供給 用戶可選擇的回聲延遲，從而實(shí)現(xiàn)脂肪和水之間V6、5jt/6和3V2弧度的變化(在7T下，79、 396和714微秒的回波變化）。
[0150] aRARE采集獲得的MR圖像通過更改的7T a用IDEAL圖像重構(gòu)技術(shù)產(chǎn)生單獨(dú)的脂肪 像和水像，并能夠用于確定小鼠體內(nèi)的脂質(zhì)生物分布。在這方面，肥胖癥、代謝綜合征和 NAFLD不只是依賴于總體重，它們也取決于過量的脂肪儲(chǔ)存的位置。
[0151] 結(jié)果
[0152] 圖3示出了來自HFD-對(duì)照小鼠（左)和HFD-mAb小鼠（右）的代表性的磁共振圖像。圖 像描繪了小鼠的側(cè)視圖，其中小鼠的前部在圖像的上部，小鼠的后部在圖像的下部。白色或 明亮區(qū)域代表脂肪含量高的區(qū)域。相比于HFD-mAb小鼠，HFD-對(duì)照小鼠具有更多的脂肪。
[0153] 圖4示出了由弛豫補(bǔ)償脂肪份數(shù)(RCFF)MRI得到的肝臟脂肪份數(shù)。與HFD-mAb組的 小鼠相比，HFD-對(duì)照組肝臟內(nèi)積聚了 2倍的脂肪量。
[0154] 圖5示出了弛豫補(bǔ)償脂肪份數(shù)(RCFF)MRI得到的網(wǎng)膜脂肪份數(shù)。與HFD-mAb組的小 鼠相比，HFD-對(duì)照組的動(dòng)物積聚了幾乎3.5倍多的網(wǎng)膜脂肪量。
[0155] 圖6示出了弛豫補(bǔ)償脂肪份數(shù)(RCFF)MRI得到的皮下脂肪份數(shù)。與HFD-mAb組的小 鼠相比，HFD-對(duì)照組積聚了大約2倍多的皮下脂肪量。
[0156] 圖7示出了來自被處死小鼠肝臟的染色組織橫截面的代表性照片。取出肝臟并固 定在福爾馬林中。然后，將固定的組織切片，并用油紅〇染色，脂溶性偶氮（lysochrome diazo)染料用于中性甘油三酯和脂質(zhì)的染色。HFD-對(duì)照組肝臟在左側(cè)，HFD-mAb組肝臟在右 偵L與HFD-mAb組肝臟相比，HFD-對(duì)照組的肝臟中具有更多紅色染色(深色）的脂肪滴。此外， 在HFD-對(duì)照組肝臟中的脂肪滴尺寸大于HFD-mAb組肝臟的脂肪滴。這表明當(dāng)施用GIP mAb 時(shí)，在肝臟中積聚的脂肪減少。這些結(jié)果與圖4的肝臟脂肪份數(shù)量相一致。
[0157] 圖8是在HFD-對(duì)照小鼠（左）中與HFD-mAb小鼠（右）中找到的網(wǎng)膜脂肪的兩張（一 組)比較圖片。脂肪是白色的，在HFD對(duì)照鼠中可見到更多的脂肪。
[0158] 綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，結(jié)合GIP的單克隆抗體拮抗劑的施用顯著降低了喂食高 脂肪飲食小鼠的體內(nèi)儲(chǔ)存的脂肪量。這包括儲(chǔ)存在肝臟、網(wǎng)膜和皮膚下的脂肪。
[0159] 葡萄糖耐量試驗(yàn)
[0160] 材料和方法
[0161] 特殊飲食17周之后，從每個(gè)飲食組隨機(jī)選擇六只小鼠用于腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn) (IPGTT)。所有動(dòng)物最初禁食6小時(shí)，之后從各小鼠的尾靜脈采集約2yL的血液。在IPGTT曲線 上，這些第一樣品表示基線血糖水平或時(shí)間為零。使用Truetest?血糖儀（NIPR0 Diagnostics，F(xiàn)ort Lauderdale，F(xiàn)L)測定血糖。
[0162 ]然后對(duì)各小鼠通過腹膜內(nèi)注射施用約2毫克/千克體重的葡萄糖。葡萄糖以20 %的 水溶液被遞送。施用后，在第10、30、60和120分鐘從各小鼠的尾靜脈采集約2yL的血液。測定 血糖濃度水平并進(jìn)行記錄。
[0163] 結(jié)果
[0164] 結(jié)果示于圖2中。相比于HFD-mAb小鼠和等熱量飲食小鼠，HFD-對(duì)照小鼠中的血清 葡萄糖水平升高至高得多的濃度。另外，在HFD-mAb小鼠和等熱量飲食小鼠中的血清葡萄糖 水平更早開始下降。這與在HFD-對(duì)照小鼠中的葡萄糖耐量的進(jìn)展相一致，但與HFD-mAb小鼠 或等熱量飲食小鼠不同。
[0165] 血清測定
[0166] 材料和方法
[0167] 特殊飲食17周后，將三組小鼠處死。收集全血，制備血清，測定許多不同組分的水 平。
[0168] 結(jié)果
[0169] 圖9示出了各組小鼠的血清中測得的甘油三酯（TG)水平。在HFD-對(duì)照組小鼠中的 TG水平是HFD-mAb小鼠中的TG水平的1.44倍。較高的TG水平與肥胖和代謝綜合征相關(guān)。
[0170] 圖10示出了各組小鼠的血清中測得的總膽固醇(TC)水平。HFD-對(duì)照組小鼠中的TC 水平是HFD-mAb小鼠中TC水平的1.55倍。較高的TC水平與肥胖和代謝綜合征相關(guān)。
[0171] 圖11示出了各組小鼠的血清中測得的高密度脂蛋白（HDL)占總膽固醇(TC)的平均 比例。在HFD-對(duì)照小鼠中HDL占總膽固醇的比例比HFD-mAb小鼠中HDL占總膽固醇的比例低 20% ADL占總膽固醇的比例低與肥胖和代謝綜合征相關(guān)。
[0172] 圖12出了在各組小鼠的血清中測得的平均低密度脂蛋白（HDL)水平。在HFD-對(duì)照 小鼠中LDL是HFD-mAb小鼠中LDL的1.95倍。較高的LDL( "壞"膽固醇)水平與肥胖和代謝綜合 征相關(guān)。
[0173] 圖13示出了在各組小鼠的血清中測得的平均胰島素水平。在HFD-對(duì)照小鼠中的胰 島素水平是HFD-mAb小鼠中胰島素水平的2.6倍。較高的胰島素水平與肥胖、胰島素抵抗和 代謝綜合征相關(guān)。
[0174] 圖14示出了在各組小鼠的血清中測得的平均脂連蛋白水平。在HFD-對(duì)照小鼠中的 脂連蛋白水平是HFD-mAb小鼠中脂連蛋白水平的1.35倍。較高的脂連蛋白水平與總體內(nèi)脂 肪增加有關(guān)。
[0175] 圖15示出了在各組小鼠的血清中測得的平均瘦素水平。在HFD-對(duì)照小鼠中的瘦素 水平是HFD-mAb小鼠中瘦素水平的5.73倍。較高的瘦素水平與總體內(nèi)脂肪增加有關(guān)。
[0176] 圖16示出了在各組小鼠的血清中測得的胰高血糖素水平。各組之間的血清胰高血 糖素水平?jīng)]有顯著差異。
[0177] 圖17示出了在各組小鼠的血清中測得的胰高血糖素樣肽l(GLP-l)水平。各組之間 的血清GLP-1水平?jīng)]有顯著差異。
[0178] 綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，結(jié)合GIP的單克隆抗體拮抗劑的施用顯著改善了與肥胖 和代謝綜合癥相關(guān)的所有標(biāo)志物。該數(shù)據(jù)表明，mAb的施用可以減少與肥胖和代謝綜合癥相 關(guān)的并發(fā)癥。在血清胰高血糖素或GLP-1水平?jīng)]有變化的事實(shí)表明，mAb是特異于GIP的，并 且表明對(duì)于胰高血糖素或GLP-1的抑制而言僅有很小副作用（如果有副作用的話），胰高血 糖素或GLP-1與GIP共享一些共同的生物途徑，但是它們還具有不與GIP共有的一些其他生 物效果。
[0179] 討論
[0180]這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，腹膜內(nèi)遞送的結(jié)合GIP的單克隆抗體可以顯著降低脂肪組 織積聚以及肝臟中的脂肪積聚。喂食高脂肪食物(HFD)，同時(shí)接受GIP mAb的小鼠明顯比HFD 對(duì)照小鼠的脂肪含量少。脂肪含量的減少可見于在肝臟、網(wǎng)膜和皮下脂肪部分中。這表明， 適量的GIP mAb拮抗劑可通過抑制GIP減少或防止組織中的脂肪積聚。GIP的抑制降低腸的 葡萄糖攝取，降低腸肽的吸收，降低餐后胰島素分泌，降低脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取，增加脂 肪分解，并抑制營養(yǎng)吸收。與肥胖和代謝綜合癥相關(guān)的標(biāo)記物的血清水平的變化也表明GIP mAb拮抗劑能夠用于抵抗這些病癥獲得健康結(jié)果。
[0181] 實(shí)施例3:抗體的修飾
[0182] 通過用在人抗體中保守的特定氨基酸置換在小鼠抗體中保守的特定氨基酸，從而 對(duì)lOglOmAb的輕鏈可變區(qū)進(jìn)行進(jìn)一步修飾。在這樣做是為了使輕鏈可變區(qū)"人源化"，以使 其與更加相似于人的可變區(qū)，并增加了人免疫系統(tǒng)不將"人源化"單克隆抗體識(shí)別為異源物 質(zhì)的概率。為了使輕鏈可變區(qū)人源化，化學(xué)合成了寡核苷酸。除了特定的堿基改變之外，該 寡核苷酸的序列類似于lOglOmAb輕鏈可變區(qū)的序列。據(jù)推測，可當(dāng)序列被翻譯成蛋白質(zhì)時(shí)， 堿基對(duì)改變將改變輕鏈可變變區(qū)的特定氨基酸。使用DNA合成反應(yīng)以產(chǎn)生雙鏈(ds)DNA。合 成三種不同的雙鏈寡核苷酸，然后用限制性核酸內(nèi)切酶Hindm和Notl進(jìn)行消化，之后連接 入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包含信號(hào)序列和人輕鏈的恒定區(qū)。Ds-寡核苷酸 以這樣的方式連入載體，當(dāng)可變區(qū)和恒定區(qū)表達(dá)為mRNA并隨后翻譯成蛋白質(zhì)時(shí)，將產(chǎn)生抗 體輕鏈。
[0183] 在此，三個(gè)所得的人源化輕鏈被稱為LC1、LC2和LCSICI的氨基酸序列是SEQ ID N0:17，并且LCl的cDNA序列是SEQIDN0:36。LC2的氨基酸序列SEQIDN0 :18，并且LCl的 cDNA序列是SEQ ID如：37。1^：3的氨基酸序列是SEQ ID N0:19，并且LCl的cDNA序列是SEQ ID N0：38〇
[0184] 還可以同樣的方式對(duì)lOglOmAb的重鏈可變區(qū)進(jìn)行進(jìn)一步修飾。再次推測，當(dāng)序列 被翻譯成蛋白質(zhì)時(shí)，堿基對(duì)改變將改變重鏈可變變區(qū)的特定氨基酸。合成三種不同的ds-寡 核苷酸鏈，然后連入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包含信號(hào)序列和人重鏈的恒 定區(qū)。Ds-寡核苷酸以這樣的方式連入載體，當(dāng)可變區(qū)和恒定區(qū)表達(dá)為mRNA并隨后翻譯成蛋 白質(zhì)時(shí)，將產(chǎn)生抗體重鏈。
[0185] 在此，三個(gè)所得的人源化重鏈被稱為HC1、HC2和HC3AC1的氨基酸序列是SEQ ID N0:28,并且HC1的cDNA序列是SEQ ID ^):40。此2的氨基酸序列SEQ ID N0:29,并且HC1的 cDNA序列是SEQ ID如:41。此3的氨基酸序列是SEQ ID N0:30,并且HC1的cDNA序列是SEQ ID N0：42〇
[0186] 在CH0細(xì)胞中產(chǎn)生含有人源化輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的單克隆抗體(mAb)。利用 具有編碼抗體重鏈的序列的哺乳動(dòng)物載體共轉(zhuǎn)染具有編碼抗體輕鏈的序列的哺乳動(dòng)物載 體。將共9個(gè)獨(dú)特組合轉(zhuǎn)染到CH0細(xì)胞中：LC1/HC1、LC1/HC2、LC1/HC3、LC2/HC1、LC2/HC2、 LC2/HC3、LC3/HC1、LC3/HC2和LC3/HC3。將從這些組合衍生的單克隆抗體與lOglOmAb進(jìn)行了 比較。
[0187] 利用哺乳動(dòng)物表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染的CH0細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長，并收集上清液。通過直 接結(jié)合ELISA，從而對(duì)上清液中是否存在結(jié)合GIP的mAb進(jìn)行評(píng)價(jià)。人GIP被固定到96孔板的 孔的底部。將上清液的一系列稀釋液加入到96孔板的不同孔中。一小時(shí)的培育后，用PBS洗 滌孔兩次，之后將與人IgG特異性結(jié)合的二級(jí)抗體加入到各孔中。用辣根過氧化物酶(HRP) 綴合特異性結(jié)合人I gG的抗體。培育1小時(shí)后，用PBS洗滌孔，之后加入HRP底物。如果在孔中 存在HRP，則底物被轉(zhuǎn)化為有色化合物。使用分光光度計(jì)讀取顏色強(qiáng)度的量。產(chǎn)生的顏色量 與各孔殘留的HRP抗體綴合物的量成正比。產(chǎn)生的顏色的量也與各孔中結(jié)合hGIP的mAb的量 成正比。
[0188] 該評(píng)價(jià)的結(jié)果表明，輕鏈/重鏈載體的各種組合遵循以下順序（由最高親和性到最 低親和性）結(jié)合人 GIP:LC2/HC1、LC2/HC2、LC3/HC2、LC1/HC2、LC2/HC3、LC3/HC1、LC1/HC1、 10gl0、LCl/HC3和LC3/HC3。
[0189] 使用蛋白A瓊脂糖，對(duì)利用LC2/HC1、LC2/HC2和LC2/HC3的表達(dá)載體組合共轉(zhuǎn)染的 100ml的CH0細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)物中產(chǎn)生的抗體進(jìn)行純化。
[0190]接著，使用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)這三個(gè)純化的mAb中和hGIP并防止配體-受體相互作 用，受體激活和受體依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力進(jìn)行測試。該系統(tǒng)中使用了報(bào)道細(xì)胞(LGIPR3a細(xì) 胞），其具有受環(huán)磷酸腺苷(cAMP)響應(yīng)啟動(dòng)子控制的lacZ基因，并且在細(xì)胞表面上表達(dá)大鼠 GIPR。向這些細(xì)胞中添加 GIP導(dǎo)致GIPR的活化，誘導(dǎo)致使cAMP積聚的信號(hào)級(jí)聯(lián)，誘導(dǎo)lacZ基 因并合成β半乳糖苷酶。在添加試樣并培育4小時(shí)后，用比色測定法來測量細(xì)胞裂解物中β半 乳糖苷酶含量。色度的改變與β半乳糖苷酶的活性水平成正比。β半乳糖苷酶的活性水平取 決于試樣中游離的具有生物活性的GIP的量。
[0191] 將mAb與DMEM培養(yǎng)基中的人GIP(hGIP)溶液混合，在該培養(yǎng)基中mAb的終濃度為 25g/ml，hGIP的終濃度為0.1 nM。然后將混合物加入到LGIPR3a細(xì)胞中并培育，之后洗滌用于 β半乳糖苷酶分析。結(jié)果示于圖18中。10gl0代表原始小鼠 mAb AIP充當(dāng)陽性對(duì)照。Fc表示純 化的人Fc片段，其充當(dāng)陰性對(duì)照。
[0192] 結(jié)果表明，人源化抗體在體外中和hGIP類似于10gl0小鼠人源化抗體 是三種人源化mAb中最有效的。它也比原始小鼠 mAb更有效。在此需要的是較低的相對(duì)活性， 而LC2/HC2具有0.0035的相對(duì)活性，而10gl0小鼠 mAb的相對(duì)活性為0.0055。
[0193] 也確定了六種人源化輕鏈(LC1、LC2、LC3)和重鏈(HC1、HC2、HC3)的可變區(qū)互補(bǔ)決 定區(qū)（CDRhLCl具有SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:22的031^1X2具有SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21 和SEQ ID N0:22的031^1X3具有SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:24和SEQ ID N0:22的CDILHCUHC2和HC3具有相同的CDR，它們是SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32和SEQ ID N0：33〇
[0194] 盡管具體的實(shí)施方案已被描述，然而對(duì)于
【申請(qǐng)人】或其他本領(lǐng)技術(shù)人員而言，可能 存在或目前無法預(yù)見上述實(shí)施方案的替代、修改、變化、改進(jìn)和實(shí)質(zhì)等效物。因此，提交的所 附的權(quán)利要求以及可能被修改的權(quán)利要求旨在涵蓋所有這樣的替代、修改、變化、改進(jìn)和實(shí) 質(zhì)等效物。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種治療肥胖的方法，包括： 向患者施用包含藥學(xué)上有效量的抑胃肽(GIP)的分子拮抗劑的組合物， 其中所述分子拮抗劑包括輕鏈可變域和重鏈可變域； 其中所述輕鏈可變域具有第一⑶R，其與SEQ ID N0:20的氨基酸序列具有至少80%同 一性;第二⑶R，其與SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少80%同一性；以及第三⑶R，其與 SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少85%同一性;并且 其中所述重鏈可變域具有第一⑶R，其與SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少80%同 一性;第二⑶R，其與SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少80%同一性；以及第三⑶R，其與 SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少80%同一性。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述輕鏈可變域的第一⑶R、第二⑶R和第三CDR通 過連接基團(tuán)相互接合。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述連接基團(tuán)獨(dú)立地為氨基酸鏈。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述重鏈可變域的所述第一 CDR、所述第二CDR和所 述第三⑶R通過連接基團(tuán)相互接合。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述連接基團(tuán)獨(dú)立地為氨基酸鏈。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分子拮抗劑是單鏈可變片段(scFv)、F(ab'）2片 段、Fab或Fab '片段、雙價(jià)抗體、三價(jià)抗體、四價(jià)抗體或單克隆抗體。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述分子拮抗劑是具有輕鏈可變域和重鏈可變域的單 克隆抗體，所述輕鏈可變域與SEQ ID NO: 18具有至少80%同一性，并且所述重鏈可變域與 選自由SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少 80 %同一性。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述分子拮抗劑是具有輕鏈可變域和重鏈可變域的完 整單克隆抗體，所述輕鏈可變域與SEQ ID NO: 18具有至少90%同一性，并且所述重鏈可變 域與SEQ ID NO:29具有至少90%同一性。9. 一種治療肥胖的方法，包括： 向患者施用包含藥學(xué)上有效量的抑胃肽(GIP)的分子拮抗劑的組合物， 其中所述分子拮抗劑包括至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)，該互補(bǔ)決定區(qū)與選自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32和SEQ ID N0:33構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80%同一性。10. -種治療II型糖尿病的方法，包括： 向患者施用包含藥學(xué)上有效量的抑胃肽(GIP)的分子拮抗劑的組合物， 其中所述分子拮抗劑包括至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)，該互補(bǔ)決定區(qū)與選自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32和SEQ ID N0:33構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80%同一性。11. 一種治療食物誘導(dǎo)的庫欣綜合征的方法，包括： 向患者施用包含藥學(xué)上有效量的抑胃肽(GIP)的分子拮抗劑的組合物， 其中所述分子拮抗劑包括至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)，該互補(bǔ)決定區(qū)與選自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32和SEQ ID N0:33構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80%同一性。12. -種治療代謝綜合征的方法，包括： 向患者施用包含藥學(xué)上有效量的抑胃肽(GIP)的分子拮抗劑的組合物， 其中所述分子拮抗劑包括至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)，該互補(bǔ)決定區(qū)與選自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32和SEQ ID N0:33構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80%同一性。13. -種減少肝臟中脂肪組織積聚的方法，包括： 向患者施用包含藥學(xué)上有效量的抑胃肽(GIP)的分子拮抗劑的組合物， 其中所述分子拮抗劑包括至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)，該互補(bǔ)決定區(qū)與選自由SEQ ID N0:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80%同一性。14. 一種減少網(wǎng)膜中脂肪組織積聚的方法，包括： 向患者施用包含藥學(xué)上有效量的抑胃肽(GIP)的分子拮抗劑的組合物， 其中所述分子拮抗劑包括至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)，該互補(bǔ)決定區(qū)與選自由SEQ ID N0:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80%同一性。15. -種減少皮下脂肪組織積聚的方法，包括： 向患者施用包含藥學(xué)上有效量的抑胃肽(GIP)的分子拮抗劑的組合物， 其中所述分子拮抗劑包括至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)，該互補(bǔ)決定區(qū)與選自由SEQ ID N0:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80%同一性。16. 根據(jù)權(quán)利要求9至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分子拮抗劑包括具有第一 CDR 和第二CDR的輕鏈可變域，各CDR與選自由 SEQ ID N0:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少95%同一性。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述分子拮抗劑的第一 CDR和第二CDR通過連接 基團(tuán)相互接合。18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述連接基團(tuán)是氨基酸鏈。19. 根據(jù)權(quán)利要求9至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分子拮抗劑包括輕鏈可變域， 該輕鏈可變域具有與SEQ ID NO: 20的氨基酸序列具有至少80%同一性的第一⑶R、與SEQ ID N0:21的氨基酸序列具有至少80%同一性的第二⑶R和與SEQ ID N0:22的氨基酸序列具 有至少85 %同一性的第三⑶R。20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述分子拮抗劑的所述第一 CDR、所述第二CDR和 所述第三⑶R通過連接基團(tuán)相互接合。21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述連接基團(tuán)獨(dú)立地為氨基酸鏈。22. 根據(jù)權(quán)利要求9至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分子拮抗劑包括輕鏈可變域， 該輕鏈可變域與選自由SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19構(gòu)成 的組中的氨基酸序列具有至少80 %同一性。23. 根據(jù)權(quán)利要求9至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分子拮抗劑包括重鏈可變域， 該重鏈可變域具有與SEQ ID NO: 31的氨基酸序列具有至少80%同一性的第一⑶R、與SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少80%同一性的第二⑶R和與SEQ ID NO:33的氨基酸序列具 有至少80 %同一性的第三⑶R。24. 根據(jù)權(quán)利要求9至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分子拮抗劑包括重鏈可變域， 該重鏈可變域與選自由SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30構(gòu)成 的組中的氨基酸序列具有至少80 %同一性。25. 根據(jù)權(quán)利要求9至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分子拮抗劑包括輕鏈可變域和 重鏈可變域； 其中所述輕鏈可變域包括第一⑶R和第二⑶R，各⑶R與選自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:24構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少 95 %同一性;并且 其中所述重鏈可變域包括與SEQ ID N0:31的氨基酸序列具有至少80%同一性的第一 ⑶R、與SEQ ID N0:32的氨基酸序列具有至少80%同一性的第二⑶R和與SEQ ID N0:33的氨 基酸序列具有至少80%同一性的第三⑶R。26. 根據(jù)權(quán)利要求9至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分子拮抗劑包括輕鏈可變域和 重鏈可變域； 其中所述輕鏈可變域與選自由SEQIDN0:16、SEQIDN0:17、SEQIDN0 :18和SEQID NO: 19構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80%同一性;并且 其中所述重鏈可變域與選自由SEQIDN0:27、SEQIDN0:28、SEQIDN0 :29和SEQID NO: 30構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80 %同一性。27. 根據(jù)權(quán)利要求25至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分子拮抗劑是單鏈可變片段 (scFv)、F(ab '）2片段、Fab或Fab '片段、雙價(jià)抗體、三價(jià)抗體、四價(jià)抗體或單克隆抗體。28. 根據(jù)權(quán)利要求9至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分子拮抗劑是具有輕鏈可變域 和重鏈可變域的單克隆抗體，所述輕鏈可變域與SEQ ID NO: 18具有至少80%同一性，并且 所述重鏈可變域與選自由SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30構(gòu)成的組中的氨基 酸序列具有至少80 %同一性。29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述分子拮抗劑是具有輕鏈可變域和重鏈可變 域的完整單克隆抗體，所述輕鏈可變域與SEQ ID NO: 18具有至少90%同一性，并且所述重 鏈可變域與SEQ ID NO:29具有至少90%同一性。30. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分子拮抗劑會(huì)結(jié)合GIP的氨基 酸序列，所述氨基酸序列選自由SEQIDN0 :1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3和SEQIDN0:4構(gòu) 成的組中。31. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分子拮抗劑是包括人恒定區(qū)的 單克隆抗體。32. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分子拮抗劑的分子量為約 30kDa 至約 500kDa。33. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分子拮抗劑具有對(duì)GIP的結(jié)合 親和力，特征在于IC5Q為約0· InM至約7nM。34. 根據(jù)權(quán)利要求9至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物是靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮 下施用的。35. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物還包含選自緩沖劑、表 面活性劑、防腐劑、填充劑、聚合物和穩(wěn)定劑組成的組中的藥物賦形劑。36. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物是粉末、注射劑、溶液、 懸浮液或乳液的形式。37. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物包含的單克隆抗體拮抗 劑的量為每升所述組合物約〇. lmg至約lOOOmg。38. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物是凍干的。39. -種抑胃多肽(GIP)的分子拮抗劑，包括至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)，該互補(bǔ)決定區(qū) 與選自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32和SEQ ID N0:33構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80%同一性。40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的分子拮抗劑，包括具有第一 CDR和第二CDR的輕鏈可變域，各 CDR與選自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:24 構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少95 %同一性。41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的分子拮抗劑，其中所述第一 CDR和所述第二CDR通過連接基 團(tuán)相互接合。42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的分子拮抗劑，其中所述連接基團(tuán)是氨基酸鏈。43. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的分子拮抗劑，包括輕鏈可變域，該輕鏈可變域具有與SEQ ID NO: 20的氨基酸序列具有至少80%同一性的第一⑶R、與SEQ ID NO: 21的氨基酸序列具有至 少80%同一性的第二⑶R和與SEQ ID N0:22的氨基酸序列具有至少85%同一性的第三⑶R。44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的分子拮抗劑，其中所述第一 CDR、所述第二CDR和所述第三 ⑶R通過連接基團(tuán)相互接合。45. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的分子拮抗劑，其中所述連接基團(tuán)獨(dú)立地為氨基酸鏈。46. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的分子拮抗劑，包括輕鏈可變域，該輕鏈可變域與選自由SEQ IDN0:16、SEQIDN0 :17、SEQIDN0:18和SEQIDN0:19構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至 少80 %同一'性。47. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的分子拮抗劑，包括重鏈可變域，該重鏈可變域具有與SEQ ID N0:31的氨基酸序列具有至少80%同一性的第一⑶R、與SEQ ID N0:32的氨基酸序列具有至 少80%同一性的第二⑶R和與SEQ ID N0:33的氨基酸序列具有至少80%同一性的第三⑶R。48. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的分子拮抗劑，包括重鏈可變域，該重鏈可變域與選自由SEQ ID N0:27、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至 少80 %同一'性。49. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的分子拮抗劑，包括輕鏈可變域和重鏈可變域； 其中所述輕鏈可變域包括第一⑶R和第二⑶R，各⑶R與選自由SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:24構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少 95 %同一性;并且 其中所述重鏈可變域包括與SEQ ID N0:31的氨基酸序列具有至少80%同一性的第一 ⑶R、與SEQ ID N0:32的氨基酸序列具有至少80%同一性的第二⑶R和與SEQ ID N0:33的氨 基酸序列具有至少80%同一性的第三⑶R。50. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的分子拮抗劑，包括輕鏈可變域和重鏈可變域； 其中所述輕鏈可變域與選自由SEQIDN0:16、SEQIDN0:17、SEQIDN0 :18和SEQID NO: 19構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80%同一性;并且 其中所述重鏈可變域與選自由SEQIDN0:27、SEQIDN0:28、SEQIDN0 :29和SEQID NO: 30構(gòu)成的組中的氨基酸序列具有至少80 %同一性。51. 根據(jù)權(quán)利要求49至50中任一項(xiàng)所述的分子拮抗劑，其中所述輕鏈可變域和重鏈可 變域是單鏈可變片段(80?￥)、？(&13'）2片段、？313或?313'片段、雙價(jià)抗體、三價(jià)抗體、四價(jià)抗體 或單克隆抗體的一部分。52. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的分子拮抗劑，其中所述拮抗劑是具有輕鏈可變域和重鏈可 變域的單克隆抗體，所述輕鏈可變域與SEQ ID NO: 18具有至少80%同一性，并且所述重鏈 可變域與選自由SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30構(gòu)成的組中的氨基酸序列具 有至少80 %同一性。53. 根據(jù)權(quán)利要求52所述的分子拮抗劑，其中所述拮抗劑是具有輕鏈可變域和重鏈可 變域的完整單克隆抗體，所述輕鏈可變域與SEQ ID NO: 18具有至少90%同一性，并且所述 重鏈可變域與SEQ ID NO:29具有至少90%同一性。54. 根據(jù)權(quán)利要求39至53中任一項(xiàng)所述的分子拮抗劑，其中所述分子拮抗劑結(jié)合GIP的 氨基酸序列，所述氨基酸序列選自由SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3和SEQ ID NO :4構(gòu)成的組中。55. 根據(jù)權(quán)利要求39至53中任一項(xiàng)所述的分子拮抗劑，其中所述拮抗劑是包括人恒定 區(qū)的完整單克隆抗體。56. 根據(jù)權(quán)利要求39至53中任一項(xiàng)所述的分子拮抗劑，其中所述拮抗劑的分子量為約 30kDa 至約 500kDa。57. 根據(jù)權(quán)利要求39至53中任一項(xiàng)所述的分子拮抗劑，其中所述拮抗劑具有對(duì)GIP的結(jié) 合親和力，特征在于IC5Q為約0· InM至約7nM。58· -種互補(bǔ)DNA序列，其與選自由SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID N0:38、SEQ ID N0:39、SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:41 和SEQ ID N0:42構(gòu)成的組中的DNA 序列具有至少85 %同一性。
【文檔編號(hào)】A61P3/10GK106068125SQ201480075779
【公開日】2016年11月2日
【申請(qǐng)日】2014年12月17日 公開號(hào)201480075779.1, CN 106068125 A, CN 106068125A, CN 201480075779, CN-A-106068125, CN106068125 A, CN106068125A, CN201480075779, CN201480075779.1, PCT/2014/70901, PCT/US/14/070901, PCT/US/14/70901, PCT/US/2014/070901, PCT/US/2014/70901, PCT/US14/070901, PCT/US14/70901, PCT/US14070901, PCT/US1470901, PCT/US2014/070901, PCT/US2014/70901, PCT/US2014070901, PCT/US201470901
【發(fā)明人】M·邁克爾·沃爾芬, 邁克爾·O·博伊蘭
【申請(qǐng)人】Mhs克爾創(chuàng)新有限責(zé)任公司