巨噬細(xì)胞β-抑制蛋白-1在制備預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及巨噬細(xì)胞β-抑制蛋白-1在制備預(yù)防或治療動(dòng) 脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] β_抑制蛋白（β-arrestins)是一組多功能的小分子蛋白質(zhì)，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)扮演著非常重要的角色。其經(jīng)典作用是參與G蛋白偶聯(lián)受體的脫敏和內(nèi)吞（參考文獻(xiàn) I.Shenoy SKjLefkowitz RJ.β-Arrestin-mediated receptor trafficking and signal transduction.Trends Pharmacol Sci 2011；32:521-533.)〇
[0003] 近年研究發(fā)現(xiàn)，β-arrestins特別是β-arrestin-l蛋白作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的"交通員"， 也參與了許多非G蛋白偶聯(lián)受體激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在蛋白酶體降解、細(xì)胞凋亡以及多種細(xì)胞 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用（參考文獻(xiàn)2.DeWi reSM，AhnS，LefkowitzRJ，Shenoy SK.Beta-arrestins and cell signaling.Annu Rev Physiol 2007；69:483-510.； 3.Patwari PjLee RT.An expanded family of arrestins regulate metabolism.Trends Endocrinol Metab 2012；23:216-222)〇
[0004] β-抑制蛋白參與調(diào)節(jié)多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。對(duì)于β-抑制蛋白在動(dòng)脈粥樣硬 化的作用，目前僅有文獻(xiàn)報(bào)道:平滑肌細(xì)胞中的β-a^estin-l通過(guò)抑制平滑肌增殖、迀移降 低新生內(nèi)膜增生，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展（參考文獻(xiàn)4.1^111 <1，21^1^1，？叩?61 KjWu JHjZidar DA,et al.Beta-arrestins regulate atherosclerosis and neointimal hyperplasia by controlling smooth muscle cell proliferation and migration.Girc Res 2008;103:70-79)〇
[0005] 巨噬細(xì)胞是粥樣斑塊中泡沬細(xì)胞的主要來(lái)源，然而目前，尚無(wú)巨噬細(xì)胞β-抑制蛋 白在對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化具有保護(hù)作用方面的任何報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供巨噬細(xì)胞β-抑制蛋白_1(巨噬細(xì)胞β-arrestin-l)的新用 途。
[0007] 本發(fā)明提供的巨噬細(xì)胞β-arrestin-l在制備預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物或保 健品中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明涉及的巨噬細(xì)胞β-arrestin-l在制備預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物或保 健品中的應(yīng)用，具體的是巨噬細(xì)胞β-arrestin-l可用于制備動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)藥物。
[0009] 本發(fā)明涉及的巨噬細(xì)胞β-arrestin-l在制備預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物或保 健品中的應(yīng)用，具體的是提高巨噬細(xì)胞β-arrestin-l表達(dá)量的試劑。
[0010] 所述的提高巨細(xì)胞β-arrestin-l表達(dá)量的試劑包括以下任一：
[0011] Α)巨噬細(xì)胞β-抑制蛋白-1;
[0012 ] B)巨噬細(xì)胞β-抑制蛋白-1的編碼基因；
[0013] C)含有巨噬細(xì)胞β-抑制蛋白-1編碼基因的重組載體；
[0014] D)含有巨噬細(xì)胞β-抑制蛋白-1編碼基因的重組病毒。
[0015] 具體的給藥方式可采取直接裸DNA注射法、脂質(zhì)體包裹DNA直接注射法、金包被DNA 基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒DNA法、復(fù)制缺陷腺病毒攜帶目的DNA法、PEG修飾蛋 白藥物注射法、脂質(zhì)體包裹蛋白靜脈注射法、蛋白微球制劑皮下注射法等。
[0016] 所述的巨細(xì)胞β-arrestin-l，包括其基因、蛋白。所述的巨細(xì)胞β-arrestin-l 基因在對(duì)象體內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯為β-arrestin-l蛋白產(chǎn)物。
[0017] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明：通過(guò)骨髓移植的方法構(gòu)建AP 〇 E^ A背景下巨噬細(xì)胞β-arrest in-1特異性髓系基因敲除小鼠（ApoEv^-arr_lf imLysMcre)及其野生對(duì)照小鼠 (ApoE+e-arr-l+/+)，經(jīng)過(guò)8周的骨髓重建后，給予12周的高脂飼料喂養(yǎng)（西方飲食)后檢測(cè) 其血清總膽固醇含量、主動(dòng)脈整體斑塊面積及主動(dòng)脈根部的斑塊面積，發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠 組相比，ApoE v13-arr-lfimLysMcre小鼠的血清總膽固醇含量顯著增加，通過(guò)油紅0染色發(fā) 現(xiàn)其主動(dòng)脈整體斑塊面積及主動(dòng)脈根部的斑塊面積與野生型小鼠組相比都顯著增大。此 外，在小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞上轉(zhuǎn)染β-arrestin-l表達(dá)干擾或過(guò)表達(dá)病毒，給予 Di 1-oxLDL刺激后檢測(cè)吞噬率變化，發(fā)現(xiàn)干擾β-arrestin-l表達(dá)后，吞噬Di l-oxLDIiMfiK 例增加，過(guò)表達(dá)β-arrestin-l后，吞噬Dil-oxLDL細(xì)胞比例降低。這些結(jié)果說(shuō)明巨噬細(xì)胞β-arrestin-1基因?qū)?dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度及預(yù)后都起著保護(hù)作用。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"動(dòng)脈粥樣硬化"是動(dòng)脈硬化中最常見(jiàn)的一種，其共同特點(diǎn)是動(dòng) 脈管壁增厚、失去彈性及管腔縮小。動(dòng)脈粥樣硬化的特點(diǎn)是受累動(dòng)脈的病變從內(nèi)膜開(kāi)始，并 先后合并多種病變，包括動(dòng)脈內(nèi)膜局部的脂質(zhì)和復(fù)合糖類(lèi)沉積、纖維組織增生機(jī)鈣質(zhì)沉積 形成粥樣斑塊，并伴有動(dòng)脈中層的漸進(jìn)性退變。動(dòng)脈粥樣硬化的臨床轉(zhuǎn)歸分為慢性和急性， 慢性病變?yōu)槁灾鲃?dòng)脈縮窄或堵塞，繼發(fā)心肌缺血或慢性心肌梗死;急性病變多為斑塊內(nèi) 出血、斑塊破裂及急性斑塊脫落造成局部血栓形成，引起急性心血管事件，嚴(yán)重危及生命。 動(dòng)脈粥樣硬化的病理分期現(xiàn)在普遍認(rèn)為主要分為四期，包括:脂質(zhì)條紋期、纖維斑塊期、粥 樣斑塊期和繼發(fā)改變期。粥樣斑塊分為穩(wěn)定斑塊和不穩(wěn)定斑塊，其中，穩(wěn)定斑塊的病理特點(diǎn) 為厚纖維帽、小脂質(zhì)核心，而不穩(wěn)定斑塊的的病理特點(diǎn)為薄纖維帽、大脂質(zhì)核心，容易破裂 造成急性心血管事件。
[0019] 本發(fā)明中，所述的巨噬細(xì)胞β-抑制蛋白-1是人體巨噬細(xì)胞內(nèi)存在的一種內(nèi)源性蛋 白，巨·細(xì)胞β-arrestin-l可以從Novoprotein Scientific公司或Abcam公司購(gòu)得。
[0020] 本發(fā)明中，巨噬細(xì)胞β-arrestin-l特異性髓系基因敲除小鼠（f3-arr-lfl/ fILysMcre)的基因敲除手段是通過(guò)Cre-Loxp重組酶系統(tǒng)獲得，即通過(guò)Cre小鼠（購(gòu)自 Jackson實(shí)驗(yàn)室，貨號(hào)004781)和Loxp小鼠（獲自中科院上海生命科學(xué)研究院，由該院自行培 育）由本發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室自行交配繁殖培養(yǎng)獲得。RAW264.7細(xì)胞系(購(gòu)自上海中科院細(xì)胞 庫(kù)，由該院自行培育）用于觀察巨噬細(xì)胞在高脂刺激下的脂質(zhì)吞噬情況，β-arrestin-l的干 擾、過(guò)表達(dá)慢病毒及其對(duì)照慢病毒(購(gòu)自和元生物技術(shù)股份有限公司，貨號(hào):干擾慢病毒對(duì) 照Y004、干擾慢病毒Y2019、過(guò)表達(dá)慢病毒對(duì)照H101、過(guò)表達(dá)慢病毒H2070)用于調(diào)節(jié)細(xì)胞中 β-arrestin-l 的表達(dá)。
[0021] 相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明提供了巨噬細(xì)胞β-arrestin-l 在制備預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物或保健品中的應(yīng)用，由于巨噬細(xì)胞β-arrestin-l是機(jī) 體內(nèi)源性蛋白質(zhì)，因此作為藥物的安全性很高。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1.特異性髓系β-抑制蛋白-1基因敲除后發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的血清總膽固 醇含量顯著增加。**表示和野生型相比較，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(ρ〈〇.01)。圖2.特異性髓系 抑制蛋白-1基因敲除后發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的主動(dòng)脈整體斑塊面積顯著增加。a為野 生對(duì)照小鼠（ApοΕ+β-arr-1+Λ); b為巨噬細(xì)胞β-arre st in-1特異性髓系基因敲除小鼠 (ApoE-Ap-Brr-IfVflLysMcre)。
[0023] 圖3.特異性髓系β-抑制蛋白-1基因敲除后發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的主動(dòng)脈根部 斑塊面積顯著增加。a為野生對(duì)照小鼠（ApoE+0-arr-l +/+) ;b為巨·細(xì)胞β-arrestin-l特異 性髓系基因敲除小鼠（ApoE-/-f3-arr-lfVflLysMcre)。
[0024] 圖4.改變巨噬細(xì)胞β-arrestin-l基因表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)的影響。a為干擾 巨噬細(xì)胞β-arrestin-l表達(dá)后與空白組、對(duì)照轉(zhuǎn)染組的脂質(zhì)吞噬情況比較;b為過(guò)表達(dá)巨噬 細(xì)胞β-arrestin-l表達(dá)后與空白組、對(duì)照轉(zhuǎn)染組的脂質(zhì)吞噬情況比較;**表示和空白組、對(duì) 照轉(zhuǎn)染組相比較，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P〈〇.01)。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。
[0026] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商 所建議的條件。
[0027] 實(shí)施例1:巨噬細(xì)胞β-arrestin-l基因?qū)Πl(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化后血清總膽固醇含量 的影響。
[0028] 巨噬細(xì)胞β-arrestin-l特異性髓系基因敲除小鼠（β-arr-lfl/f ILysMcre)的基因 敲除手段是通過(guò)Cre-Loxp重組酶系統(tǒng)獲得，即通過(guò)Cre小鼠（購(gòu)自美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室（The Jackson Laboratory，貨號(hào)004781，https