抗鴨肝炎病毒轉(zhuǎn)移因子的體外制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及獸藥領(lǐng)域，更具體的說，是一種抗鴨肝炎病毒轉(zhuǎn)移因子的體外制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨病毒性肝炎簡稱鴨肝炎，是由鴨肝炎病毒引起雛鴨的一種傳播迅速和高度致死 性傳染病，是一種肝臟呈現(xiàn)出血炎癥狀態(tài)的急性烈性傳染病。該病的主要特征為肝臟腫大 呈斑點(diǎn)狀出血，膽囊腫大，膽汁顏色變淡，有出血斑點(diǎn)和神經(jīng)癥狀。在初次感染疫區(qū)，該病的 死亡率很高，可達(dá)90%以上。
[0003] 鴨病毒性肝炎主要發(fā)生于4~20日齡雛鴨，中成鴨一般不發(fā)病，雞和鵝也不能自 然發(fā)病。該病的主要傳染源是病鴨和帶毒鴨，主要通過消化道和呼吸道感染，飼養(yǎng)管理不 良，如缺乏維生素和礦物質(zhì)，鴨舍潮濕、擁擠等，均可促使本病發(fā)生。本病發(fā)生于雛鴨孵化季 節(jié)，一旦爆發(fā)，傳播很快，發(fā)病率可達(dá)100 %，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了很大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0004] 轉(zhuǎn)移因子（Transfer factor, TF)是T淋巴細(xì)胞釋放的一種能夠轉(zhuǎn)移致敏信息的 可透析小分子物質(zhì)-多肽核苷酸復(fù)合物，它能夠特異地將供體的細(xì)胞免疫信息轉(zhuǎn)移給受體 正常的淋巴細(xì)胞，從而增強(qiáng)受體的免疫功能?？梢缘挚拐婢⒉《镜确羌?xì)菌性感染，也可以 是否白介素與干擾素作用于免疫應(yīng)答過程。TF含多種成分，分子量小，無熱原，無抗原性，無 毒副作用，是一種新型而又安全的免疫制劑。此外，轉(zhuǎn)移因子無種屬特異性，動(dòng)物來源的轉(zhuǎn) 移因子可用于人體。
[0005] 目前轉(zhuǎn)移因子的生產(chǎn)工藝主要是通過研磨動(dòng)物臟器等，反復(fù)凍融并經(jīng)半透膜透析 得到，工藝復(fù)雜，無特異性，回收率低。本發(fā)明通過體外制備抗鴨肝炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子 特異性強(qiáng)、產(chǎn)出率高，對(duì)轉(zhuǎn)移因子的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)以及大范圍應(yīng)用具有很好的促進(jìn)作 用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有轉(zhuǎn)移因子技術(shù)中制備以及針對(duì)疾病沒有特異性，治療效 果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，提供一種體外免疫方法生產(chǎn)特異性強(qiáng)、成本低、產(chǎn)出率高、效果更好的抗 鴨肝炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法。
[0007] 本發(fā)明抗鴨肝炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的體外制備方法，按照以下步驟進(jìn)行：
[0008] (1)無菌環(huán)境下采取雞脾臟或雞血，用雞脾臟或外周血制備淋巴細(xì)胞單層。無菌靜 脈采取動(dòng)物全血20-30ml，加0. 8 %肝素溶液0. 3ml抗凝，靜置30-60min，用帶膠球吸管吸取 紅細(xì)胞層以上的所有血漿，特別是緊接紅細(xì)胞層上的白細(xì)胞層要盡量吸取，分裝于消毒離 心管內(nèi)，用PBS(pH為7. 2)液反復(fù)洗滌2-3次，離心速度800-1200rpm，然后用含30%犢牛 血清水解乳蛋白40ml進(jìn)行白細(xì)胞培養(yǎng)，混合均勻后分裝于容量100mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，塞緊 瓶塞，置37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中，經(jīng)2-3天，白細(xì)胞均勻貼壁，即制成淋巴細(xì)胞單層，備用；
[0009] (2)將步驟（1)制備的淋巴細(xì)胞單層進(jìn)行傳代培養(yǎng)，顯微鏡下觀察步驟（1)制備的 淋巴細(xì)胞單層，確認(rèn)其生長狀態(tài)良好即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)；
[0010] (3)鴨肝炎病毒的制備與提取：將鴨肝炎病毒接種于9-11日齡的雞胚或鴨胚尿 囊液中，33°C -37°C溫箱孵育，24h內(nèi)死亡的雞胚或鴨胚棄去，120h后收集有明顯痘斑的雞 胚或鴨胚絨毛尿囊膜，以磷酸鹽緩沖液（PBS)洗滌后，置于組織勻漿機(jī)內(nèi)制成懸液，反復(fù) 凍融3-5次后，裝入厚壁小瓶子內(nèi)，超聲15-20min，4 °C、5000rpm離心20-30min，棄去沉 淀，收集上清液，將上清液經(jīng)4°C、7000rpm離心20-30min，棄去沉淀，收集上清液，經(jīng)4°C、 25000rpm離心20-30min，棄去上清液，取沉淀，用等體積PBS溶液溶解。將上述溶液裝入 以15%、30%、45%、60%及80%的蔗糖制備的不連續(xù)梯度密度離心管，超速離心，4°〇、 15000-20000rpm尚心2_4h，根據(jù)鴨肝炎病毒的分子量確定鴨肝炎病毒所在位置，吸出并置 于-20°C--40°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?br>[0011] (4)抗鴨肝炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的制備：將步驟（2)傳代的淋巴細(xì)胞長成單層 后，用植物血凝素（終濃度為l〇〇mg/L)和步驟（3)所得鴨肝炎病毒（終濃度為1000-1500 血凝單位/ml)誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心培養(yǎng)2-3天后，8000rpm、20-30min離心細(xì)胞培養(yǎng)液，取上清 液，將其置于4°C下磁力攪拌透析18-24h，超濾除菌，即得到抗鴨肝炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子 成品。
[0012] 所述的抗鴨肝炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的體外制備方法，刺激雞脾細(xì)胞和雞血淋巴 細(xì)胞增殖的植物血凝素劑的質(zhì)量濃度為50-100mg/L。
[0013] 所述的抗鴨肝炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的體外制備方法，制備淋巴細(xì)胞單層以及細(xì) 胞培養(yǎng)均在無菌狀態(tài)下進(jìn)行。
[0014] 所述的抗鴨肝炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的體外制備方法，離心時(shí)均需在4°C進(jìn)行。
[0015] 所述的抗鴨肝炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的體外制備方法，超濾除菌所需濾膜為 0· 22 μ m 濾膜。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果是：
[0017] 1、本發(fā)明所需雞脾臟或外周血等原料較少，用植物血凝素和鴨肝炎病毒誘導(dǎo)培養(yǎng) 誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞單層即可體外生產(chǎn)出大量抗鴨肝炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的混合體。
[0018] 2、本發(fā)明的方法制備的抗鴨肝炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子無需進(jìn)一步的提純，直接將 混合體用于鴨。
[0019] 3、本發(fā)明所得到的特異性轉(zhuǎn)移因子即可起到抗鴨肝炎病毒及抗菌的作用，同時(shí)又 可以提高鴨的免疫力。
[0020] 4、本發(fā)明具有特異性強(qiáng)、成本低、產(chǎn)出率高、效果好等優(yōu)點(diǎn)，是一種較為理想的鴨 肝炎病毒轉(zhuǎn)移因子制備方法。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 本發(fā)明通過以下實(shí)施例進(jìn)一步詳述。需要說明的是：下述實(shí)施例是說明性的，不是 限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0022] 實(shí)施例1
[0023] -種抗鴨肝炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的體外制備方法，其步驟如下：
[0024] (1)無菌環(huán)境下采取雞脾臟或雞血，用雞脾臟或外周血制備淋巴細(xì)胞單層。無菌靜 脈采取動(dòng)物全血30ml，加0. 8 %肝素溶液0. 3ml抗凝，靜置60min，用帶膠球吸管吸取紅細(xì)胞 層以上的所有血漿，特別是緊接紅細(xì)胞層上的白細(xì)胞層要盡量吸取，分裝于消毒離心管內(nèi)， 用PBS (pH為7. 2)液反復(fù)洗滌3次，離心速度1200rpm，然后用含30 %犢牛血清水解乳蛋白 40ml進(jìn)行白細(xì)胞培養(yǎng)，混合均勻后分裝于容量100mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，塞緊瓶塞，置37°C細(xì)胞 培養(yǎng)箱中，經(jīng)3天，白細(xì)胞均勻貼壁，即制成淋巴細(xì)胞單層，備用；
[0025] (2)將步驟（1)制備的淋巴細(xì)胞單層進(jìn)行傳代培養(yǎng)，顯微鏡下觀察步驟（1)制備的 淋巴細(xì)胞單層，確認(rèn)其生長狀態(tài)良好即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)；
[0026] (3)鴨肝炎病毒的制備與提?。簩Ⅷ喐窝撞《窘臃N于10日齡的雞胚尿囊液中， 37°C溫箱孵育，24h內(nèi)死亡的雞胚棄去，120h后收集有明顯痘斑的雞胚絨毛尿囊膜，以磷酸 鹽緩沖液（PBS)洗滌后，置于組織勻漿機(jī)內(nèi)制成懸液，反復(fù)凍融3次后，裝入厚壁小瓶子內(nèi)， 超聲15min，4°C、5000rpm離心20min，棄去沉淀，收集上清液，將上清液經(jīng)4°C、7000rpm離心 20min，棄去沉淀，收集上清液，經(jīng)4°C、25000rpm離心20min，棄去上清液，取沉淀，用等體積 PBS溶液溶解。將上述溶液裝入以15%、30%、45%、60%及80%的蔗糖制備的不連續(xù)梯度 密度離心管，超速離心，4°C、15000離心4h，根據(jù)鴨肝炎病毒的分子量確定鴨肝炎病毒所在 位置，吸出并置于-20°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?br>[0027] (4)抗鴨肝炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的制備。將步驟（2)傳代的淋巴細(xì)胞長成單層 后，用植物血凝素（終濃度為l〇〇mg/L)和步驟（3)所得鴨肝炎病毒（終濃度為1250血凝 單位/ml)誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心培養(yǎng)3天后，8000rpm、30min離心細(xì)胞培養(yǎng)液，取上清液，將其置于 4°C下磁力攪拌透析24h，超濾除菌，即得到抗鴨肝炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子成品。
[0028] 實(shí)施例2
[0029] -種抗鴨肝炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的體外制備方法，其步驟如下：
[0030] (1)無菌環(huán)境下采取雞脾臟或雞血，用雞脾臟或外周血制備淋巴細(xì)胞單層。無菌靜 脈采取動(dòng)物全血20ml，加0. 8 %肝素溶液0. 3ml抗凝，靜置30min，用帶膠球吸管吸取紅細(xì)胞 層以上的所有血漿，特別是緊接紅細(xì)胞層上的白細(xì)胞層要盡量吸取，分裝于消毒離心管內(nèi)， 用PBS(pH為7. 2)液反復(fù)洗滌3次，離心速度800rpm，然后用含30%犢牛血清水解乳蛋白 40ml進(jìn)行白細(xì)胞培養(yǎng)，混合均勻后分裝于容量100mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，塞緊瓶塞，置37°C細(xì)胞 培養(yǎng)箱中，經(jīng)2天，白細(xì)胞均勻貼壁，即制成淋巴細(xì)胞單層，備用；
[0031] (2)將步驟（1)制備的淋巴細(xì)胞單層進(jìn)行傳代培養(yǎng)，顯微鏡下觀察步驟（1)制備的 淋巴細(xì)胞單層，確認(rèn)其生長狀態(tài)良好即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)；
[0032] (3)鴨肝炎病毒的制備與提?。簩Ⅷ喐窝撞《窘臃N于11日齡的鴨胚尿囊液中， 33°C溫箱孵育，24h內(nèi)死亡的鴨胚棄去，120h后收集有明顯痘斑的鴨胚絨毛尿囊膜，以磷酸 鹽緩沖液（PBS)洗滌后，置于組織勻漿機(jī)內(nèi)制成懸液，反復(fù)凍融5次后，裝入厚壁小瓶子內(nèi)， 超聲20min，4°C、5000rpm離心30min，棄去沉淀，收集上清液，將上清液經(jīng)4°C、7000rpm離心 30min，棄去沉淀，收集上清液，經(jīng)4°C、25000rpm離心30min，棄去上清液，取沉淀，用等體積 PBS溶液溶解。將上述溶液裝入以15%、30%、45%、60%及80%的蔗糖制備的不連續(xù)梯度 密度離心管，超速離心，4°C、2000〇 rpm離心4h，根據(jù)鴨肝炎病毒的分子量確定鴨肝炎病毒 所在位置，吸出并置于-20°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?br>[0033] (4)抗鴨肝炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的制備。將步驟（2)傳代的淋巴細(xì)胞長成單層 后，用植物血凝素（終濃度為l〇〇mg/L)和步驟（3)所得鴨肝炎病毒（終濃度為1000血凝 單位/ml)誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心培養(yǎng)2天后，8000rpm、20min離心細(xì)胞培養(yǎng)液，取上清液，將其置于 4°C下磁力攪拌透析18h，超濾除菌，即得到抗鴨肝炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子成品。
[0034] 實(shí)施例3 :
[0035