6.0、約 7.0、約8.0、約9.0、約10.0 mg/kg/天或更高的濃度施用于患者時，MRCKS相關(guān)的膚展現(xiàn)出降 低的癌細(xì)胞遷移。
[003引在一個實施方案中，所述膚通過吸入膚的液體溶液或懸液，或是通過吸入膚的干 粉制劑來施用。在另一個實施方案中，所述膚通過注射膚的液體制劑或懸液來施用。在進(jìn)一 步的實施方案中，所述注射進(jìn)入原發(fā)腫瘤區(qū)中，其中所述區(qū)含有癌細(xì)胞。在進(jìn)一步的實施方 案中，所述癌細(xì)胞留駐在哺乳動物中的腫瘤中。在一個實施方案中，所述腫瘤是實體瘤。在 另一個實施方案中，所述腫瘤是非實體瘤。在一個實施方案中，本申請?zhí)峁┑腗ARCKS-抑制 化合物抑制與淋己瘤或白血病相關(guān)的癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在另一個實施方案中，所述液體制劑 是等滲的。在另一個實施方案中，所述液體制劑是經(jīng)緩沖的。
[0036]在一個實施方案中，所述轉(zhuǎn)移抑制量的膚的范圍是約0.1至約100微摩爾每毫升。 在進(jìn)一步的實施方案中，所述轉(zhuǎn)移抑制量的膚的范圍是約1至約10微摩爾每毫升。在另一個 實施方案中，所述膚在運樣的制劑中，所述制劑包含對治療癌癥有用的額外的藥物，或是經(jīng) 配制用于與額外的藥物一起施用。
[0037] 在一個方面，提供了用于在哺乳動物中治療或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方 法，其中所述方法包括對所述哺乳動物施用MARCKS-抑制性化合物。在一個實施方案中，所 述MARCKS-抑制性化合物是降低MARCKS表達(dá)或活性的多核巧酸或核酸分子。在進(jìn)一步的實 施方案中，所述MARCKS-抑制性多核巧酸是反義1?酷、311?酷、3111?酷、或11111?酷。在一個實施方 案中，所述MARCKS-抑制性多核巧酸W約IOnM至10咖，或約20nM至約500nM，或約30nM至約 300nM，或約40nM至約200nM，或約50nM至約IOOnM的量施用。在一個實施方案中，所述 MRCKS-抑制性多核巧酸是調(diào)節(jié)MRCKS表達(dá)的miRNA的模擬物。例如，在一個實施方案中，所 述MARCKS-抑制性多核巧酸是miR21的模擬物。在一個實施方案中，所述多核巧酸和核酸分 子與遞送劑一起施用，所述遞送劑如膚、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、醬醇、聚合物、轉(zhuǎn)染試劑、或本領(lǐng)域已 知的任何多核巧酸或核酸分子遞送劑。
[0038] 在一個方面，提供了用于在哺乳動物中治療或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方 法，其中所述方法包括對所述哺乳動物施用MANS相關(guān)的膚，其中在對非小細(xì)胞肺癌(NSCLC) 細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后，所述膚展示出至少約1.5，至少約1.6，至少約1.7，至少約1.8，至少約 1.9，至少約2.0，至少約2.1，至少約2.2，至少約2.3，至少約2.4，至少約2.5，至少約2.6，至 少約2.7,至少約2.8,至少約2.9,至少約3.0或更多的遷移指數(shù)。在進(jìn)一步的實施方案中， MANS 相關(guān)的膚 W 約5，10，15,20,25,30,35,40,45,50,60,70,80,90，100，125，150，175，或 200微摩爾(Wnolar)所述膚的濃度存在。在另一個實施方案中，遷移期是3,4,5,6，7,8,12， 15，20，21，22，23，或24小時。在一個實施方案中，在用50微摩爾濃度的MANS相關(guān)的膚預(yù)處理 NSCLC細(xì)胞W及約12小時的遷移期后，所述膚展示出至少約1.5的遷移指數(shù)。在另一個實施 方案中，在用至少約100微摩爾濃度的MANS相關(guān)的膚預(yù)處理NSCLC細(xì)胞W及約12小時的遷移 期后，所述膚展示出至少約2.0的遷移指數(shù)。
[0039] 在一個方面，提供了用于在對其有需要的患者中治療或預(yù)防癌癥(包括癌轉(zhuǎn)移）的 方法，所述方法包括對受試者W約O.Olmg/kg/天至約lOmg/kg/天的劑量施用MANS相關(guān)的 膚。在進(jìn)一步的實施方案中，所述MANS相關(guān)的膚W約0.1 mg/kg/天至約5.0mg/kg/天的濃度 施用。在更進(jìn)一步的實施方案中，MANS相關(guān)的膚W約0.5mg/kg/天至約2.5mg/kg/天的濃度 施用。例如，MANS相關(guān)的膚W約0.01、約0.05、約0.1、約0.5、約0.75、約1.0、約1.25、約1.5、 約 1.75、約2.0、約 2.25、約2.5、約2.75、約3.0、約3.5、約4.0、約5.0、約6.0、約 7.0、約8.0、約 9.0、約10.0 mg/kg/天或更高的劑量施用W治療或預(yù)防癌癥。
[0040] 附圖簡述
[0041] 圖1顯示了 12小時遷移期后陰性對照的細(xì)胞計數(shù)視野。
[0042] 圖2A顯示了用50微摩爾的MANS膚預(yù)處理接著是12小時的遷移時間后，所得到的細(xì) 胞計數(shù)視野。
[0043] 圖2B顯示了用100微摩爾的MANS膚預(yù)處理接著是12小時的遷移時間后，所得到的 細(xì)胞計數(shù)視野。
[0044] 圖3A顯示了用50微摩爾的RNS膚預(yù)處理接著是12小時的遷移時間后，所得到的細(xì) 胞計數(shù)視野。
[0045] 圖3B顯示了用100微摩爾的RNS膚預(yù)處理接著是12小時的遷移時間后，所得到的細(xì) 胞計數(shù)視野。
[0046] 圖4A顯示了用50微摩爾的MANS相關(guān)的膚BIO-11002預(yù)處理接著是12小時的遷移時 間后，所得到的細(xì)胞計數(shù)視野。
[0047] 圖4B顯示了用100微摩爾的MANS相關(guān)的膚BI0-11002預(yù)處理接著是12小時的遷移 時間后，所得到的細(xì)胞計數(shù)視野。
[0048] 圖5A顯示了用50微摩爾的MANS相關(guān)的膚BI0-10901預(yù)處理接著是12小時的遷移時 間后，所得到的細(xì)胞計數(shù)視野。
[0049] 圖5B顯示了用100微摩爾的MANS相關(guān)的膚BI0-10901預(yù)處理接著是12小時的遷移 時間后，所得到的細(xì)胞計數(shù)視野。
[0050] 圖6A顯示了用50微摩爾的MANS相關(guān)的膚BI0-91200預(yù)處理接著是12小時的遷移時 間后，所得到的細(xì)胞計數(shù)視野。
[0051 ] 圖6B顯示了用100微摩爾的MANS相關(guān)的膚BI0-91200預(yù)處理接著是12小時的遷移 時間后，所得到的細(xì)胞計數(shù)視野。
[0052] 圖 7A 圖示顯示了用 50 微摩爾的 MANS 膚、BI011002、BI010901、BI091200、或 RNS 膚預(yù) 處理，或無膚(對照)預(yù)處理后12小時得到的遷移細(xì)胞數(shù)。
[0053] 圖 7B 圖示顯示了用 100 微摩爾的 MANS 膚、BI011002、BI010901、BI091200、或 RNS 膚 預(yù)處理，或無膚(對照)預(yù)處理后12小時得到的遷移細(xì)胞數(shù)。
[0054] 圖8A圖示顯示了侵襲性人NS化C細(xì)胞系細(xì)胞的遷移指數(shù)，其中在用50微摩爾的本 發(fā)明的膚預(yù)處理接著是根據(jù)實驗方案的12小時處理之后遷移指數(shù)值越高表示遷移越少。
[0055] 圖8B圖示顯示了侵襲性人NS化C細(xì)胞系細(xì)胞的遷移指數(shù)，其中在用100微摩爾的本 發(fā)明的膚預(yù)處理接著是根據(jù)實驗方案的12小時處理之后遷移指數(shù)值越高表示遷移越少。
[0056] 圖9圖示顯示了用50微摩爾指定的膚和侵襲性人NSCLC細(xì)胞系進(jìn)行的實驗中MANS、 RNS、BI0-11000、或BI0-11006、或?qū)φ?無膚)各自的細(xì)胞數(shù)(左圖面)和遷移指數(shù)數(shù)值(右圖 面）。
[0057] 圖10圖示顯示了用100微摩爾指定的膚和侵襲性人NS化C細(xì)胞系進(jìn)行的實驗中 MANS、RNS、BI0-11000、或BI0-11006、BI0-91200、或?qū)φ?無膚)各自的細(xì)胞數(shù)(左圖面)和遷 移指數(shù)數(shù)值(右圖面）。
[0058] 圖 11顯示 了不用膚或用指定的測試膚(MANS、RNS、BI0-11006、BI0-11000、BI0-11002、BI0-91200、或BI0-10901)W10微摩爾（左上圖面）、25微摩爾（右上圖面)或50微摩爾 (下圖面)的膚預(yù)處理A549細(xì)胞后12小時遷移的細(xì)胞數(shù)。
[0059] 圖12顯示了在用BI0-11006處理的動物中，每只小鼠左肺、右肺、屯、臟、和隔膜中的 平均腫瘤數(shù)。BI0-11006(PBS中100山〇開始于癌細(xì)胞接種后第3天每日1次施用22天，所述施 用經(jīng)腹膜內(nèi)注射(50化)或吸入(30分鐘，噴霧器遞送系統(tǒng)(Nebulizer Delivery System)， Aeroneb Lab)。
[0060] 圖13顯示了通過用噴霧器遞送系統(tǒng)（Aeroneb Lab)在30天吸入施用BIO-11006 (PBS中100山〇的小鼠中，每只小鼠左肺、右肺、屯、臟、和隔膜中的平均腫瘤數(shù)，所述施用在相 對于注射人腺癌細(xì)胞(PC-9)第15天或第4天開始每日一次進(jìn)行。
[0061] 圖14顯示了通過用噴霧器遞送系統(tǒng)（Aeroneb Lab)在30天吸入施用BI0-11006 (PBS中IOOiiM)的小鼠中的腫瘤總數(shù)，所述施用在相對于注射PC-9細(xì)胞第15天或第4天開始 每日一次進(jìn)行。
[0062] 圖15描述了在小鼠中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的數(shù)目，所述小鼠從相對于A549癌細(xì)胞注 射第-1天或第+3天開始每隔一天用介質(zhì)對照、霧化的BIO-11006處理，或從相對于A549癌細(xì) 胞注射第-1天或第+3天開始用霧化的MANS處理。通過用噴霧器遞送系統(tǒng)(Aeroneb Lab)吸 入來施用霧化的膚(PBS中IOOiiM) D*，p<0.05,與對照組相比統(tǒng)計學(xué)上顯著;曰，在各組比較中 統(tǒng)計學(xué)上不顯著。
[0063] 圖16顯示了在PC9細(xì)胞中施用IOOnM MARCKS SiRNA或?qū)φ誗iRNA后的MARCKS蛋白 的水平。
[0064] 圖17顯示了在A549細(xì)胞中施用IOOnM MARCKS SiRNA或?qū)φ誗iRNA后的MARCKS蛋白 的水平。
[0065] 圖18顯示了用IOOnM MARCKS SiRNA或?qū)φ誗iRNA處理后PC9癌細(xì)胞的遷移。
[0066] 圖19顯示了用IOOnM MARCKS SiRNA或?qū)φ誗iRNA處理后A549癌細(xì)胞的遷移。
[0067] 圖20通過We S tern印跡顯示了用50nM陰性對照巧i Perfect介質(zhì)；泳道A)或50nM miR21抑制劑(泳道B)處理后PC9細(xì)胞中MARCKS的表達(dá)。
[006引圖21 顯示了miR21 抑制（50nM或IOOnM mir-21 抑制劑）或miR21 激活（50nM或IOOnM miR-21模擬物)后PC9癌細(xì)胞的遷移。
[0069] 發(fā)明詳述
[0070] 先前已顯示肉豆違酷化的富丙氨酸蛋白激酶C底物(MRCKS)蛋白設(shè)及多種細(xì)胞過 程。例如，已顯示MRCKS蛋白整體設(shè)及細(xì)胞分泌、脫粒、遷移和基因表達(dá)。運些研究是基于當(dāng) 在刺激之前用MANS膚預(yù)處理細(xì)胞時，與MRCKS蛋白的肉豆違酷化的N末端序列相同的膚（即 MANS膚)影響不同的細(xì)胞類型中的過程的能力。在所有運些實例中，錯義對照膚（由MANS膚 的氨基酸的隨機氨基酸序列組成，其本文稱為RNS膚)相對于MANS膚展示出的活性而言是沒 有效果的。
[0071] 在一個實施方案中，組合物包含MARCKS-抑制性化合物如本領(lǐng)域已知的任何類型 的抑制性化合物，包括膚、多膚、抗體或其片段、和多核巧酸或核酸分子，如反義多核巧酸、 適配體、小干擾RNA(SiRNA)、微小RNA(miRNA)、和短發(fā)夾RNA(ShRNA)。在一個實施方案中，所 述組合物包含一個或多個肉豆違酷化的富丙氨酸C激酶底物(MARCKS)相關(guān)的膚。在另一個 實施方案中，MARCKS相關(guān)的膚對應(yīng)于MARCKS的MH2域。在另一個實施方案中，組合物包含 MARCKS-抑制性膚，包括對應(yīng)于N末端序列的膚。
[0072] 在一個實施方案中，本申請?zhí)峁┑腗ARCKS-抑制性化合物是抗體。如本文所用的， 術(shù)語"抗體"指具有至少一個抗原結(jié)合域的結(jié)合蛋白，并且包括單克隆抗體、多克隆抗體、和 抗體片段和/或變體，包括重組多膚、融合蛋白、和免疫綴合物。本發(fā)明的抗體片段的例子包 括但不限于化b片段、Fc片段、Fv片段、dAb片段、分離的CDR區(qū)、F(ab'）2、包含兩個連接的化b 片段的二價片段、和單鏈Fv分子(SCFv)。技術(shù)人員會認(rèn)識到，本申請?zhí)峁┑目贵w或片段可W 從任何物種產(chǎn)生，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、靈長類、美洲駝(llama)和人。技術(shù)人員會進(jìn) 一步認(rèn)識到，本申請?zhí)峁┑目贵w或片段可W是嵌合的、人源化的、或完全人的。
[0073] 在一個方面，提供了用于治療或預(yù)防癌癥的組合物和方法。本申請公開的用于治 療或預(yù)防癌癥的方法包括治療或預(yù)防癌癥的所有方面，包括但不限于轉(zhuǎn)移、腫瘤生長、癌細(xì) 胞增殖、和血管生成。在一個實施方案中，提供了用于治療和預(yù)防癌癥的組合物和方法，包 括對癌細(xì)胞或?qū)υ诎┘?xì)胞的發(fā)育、維持、增殖或轉(zhuǎn)移中起作用的細(xì)胞(例如內(nèi)皮細(xì)胞)施用 MARCKS-抑制性化合物。
[0074]在一個方面，提供了用于抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的組合物和方法，其中所述方法包括施 用MARCKS-抑制性化合物。在一個實施方案中，MARCKS-抑制性化合物是MARCKS-抑制性的 膚、結(jié)合至MARCKS或MARCKS膚的抗體或其片段、或抑制MARCKS蛋白功能的多核巧酸或核酸 分子，包括反義多核巧酸、適配體、siRNA、miRNA、和shRNA。在進(jìn)一步的實施方案中，所述膚 是MANS相關(guān)的膚，其中所述膚抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在一個實施方案中，提供了MARCKS-抑制 性的膚，其抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在另一個方面，提供了用本文公開的組合物治療癌癥的方 法。在一個實施方案中，提供的方法包括使癌細(xì)胞與MARCKS-抑制性膚接觸。在進(jìn)一步的實 施方案中，所述癌細(xì)胞存在于腫瘤中。在一個實施方案中，所述MARCKS-抑制性膚是MANS相 關(guān)的膚。如本文所用的，術(shù)語"MANS相關(guān)的膚"意指MANS膚或與MANS基本上相同的膚;或含有 MANS膚中的至少四個連續(xù)氨基酸的MANS膚片段，或是與含有MANS膚中發(fā)現(xiàn)的至少四個連續(xù) 氨基酸的膚基本上相同。因此，MANS相關(guān)的膚長度為4至24個氨基酸。如本文所用的，術(shù)語 "基本上相同"意指就兩個膚的氨基酸序列的比較或兩個膚段的氨基酸序列的比較而言，膚 或膚段的氨基酸序列具有至少約75 %序列同一性、至少約80%序列同一性、至少約90%序 列同一性、或至少約95%序列同一性。優(yōu)選地，所述膚的氨基酸序列與MANS膚或MANS膚片段 具有至少約80%序列同一性。在一個實施方案中，MANS相關(guān)的膚可W包含長度為4至24個氨 基酸的膚，其與MANS膚相同或基本上相同，且還可W包含一個或多個額外的氨基酸。例如， 在一個實施方案中，MANS相關(guān)的膚包含與MANS膚相同或基本上相同的4至24個連續(xù)氨基酸， 且進(jìn)一步包含至少一個MANS膚中不存在的N末端氨基酸，例如精氨酸。
[007引在一個實施方案中，MARCKS-抑制性膚是經(jīng)化學(xué)修飾的。在一個實施方案中， MRCKS-抑